Évolution du test ORAC au sein du laboratoire ... - Biogenouest
Évolution du test ORAC au sein du laboratoire ... - Biogenouest
Évolution du test ORAC au sein du laboratoire ... - Biogenouest
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Témoignage d’une collaboration entre une entreprise<br />
prestataire analytique (AGROBIO), différentes plateformes<br />
et un équipementier (TECAN)
I. Présentation d’AGROBIO-Rennes<br />
II. Le <strong>test</strong> <strong>ORAC</strong> et collaboration avec<br />
TECAN<br />
III.TECAN : Robotique et lecteur de<br />
microplaques<br />
Bénédicte LEBAS<br />
Frédérique GAUTIER-GALETTO<br />
ZAC des trois marches<br />
3, Impasse de La Jonchée<br />
F - 35132 VEZIN LE COQUET<br />
Tel : +33 (0)2 99 14 70 50<br />
Fax +33 (0)2 99 14 70 51<br />
Sites : http//www.agrobio-rennes.com
- Prestations et expertises analytiques,<br />
- Conseils analytiques<br />
- Développements-optimisations et validation de<br />
méthodes à façon<br />
- Compléments alimentaire, aliments fonctionnels,<br />
aliments santé<br />
- Parapharmacie, cosmétiques, agroalimentaire<br />
- Nutrition humaine ou animale<br />
ZAC des trois marches<br />
3, Impasse de La Jonchée<br />
F - 35132 VEZIN LE COQUET<br />
Tel : +33 (0)2 99 14 70 50 / Fax +33 (0)2 99 14 70 51<br />
Sites : http//www. labo-nutrinov.com<br />
http//www.<strong>laboratoire</strong>sagrobio.fr
POLES DE SPECIALITES<br />
Chimie alimentaire traditionnelle (protéines, lipides, glucides<br />
(valeurs et déclaration nutritionnelle) et spécialisée<br />
- cartographie des sucres plus ou moins complexes, fibres (FOS,<br />
inuline, βglycans, lactulose, polydextrose), condroïtine-glucosamine<br />
sulfate<br />
- spécialité pour protéines laitières, répartition des poids<br />
moléculaires, acides aminés libres, tot<strong>au</strong>x, soufrés<br />
- conservateurs, minér<strong>au</strong>x, contaminants et pesticides, lactones<br />
terpéniques, ginsénosides, réb<strong>au</strong>dioside, CoenzQ10, stérols,<br />
phytostérols, CLA, pro<strong>du</strong>its de la réaction de maillard, marqueurs<br />
d’oxydation (IP, IA, MDA, groupements carbonyls, Vitamines A, B,<br />
C, D, E …)
POLES DE SPECIALITES<br />
Nutraceutiques, compléments alimentaires et<br />
extraits végét<strong>au</strong>x<br />
- Vitamines A, B, C, D, E,<br />
- caroténoïdes et dérivés (lycopène, lutéine, zéaxanthine,<br />
βcarotène),<br />
- polyphénols et antioxydants spécifiques (asthaxanthine,<br />
phytohème-phytofluène, caféine, proanthocyanidines de<br />
canneberge, catéchines et dérives, curcumines et dérivés,<br />
acides chlorogéniques, acides ginkoliques, anthocyanes, …)<br />
- <strong>test</strong>s de caractérisation physique (dissolution, désagrégation,<br />
pH, uniformités de masse, …)
POLES DE SPECIALITES<br />
Tests de Biologie Cellulaire et Fonctionnelle<br />
- étude de digestibilité in vitro (protéiques méthode de R.<br />
Glahn, index glycémique selon méthode Englyst),<br />
évaluation de perméabilité in<strong>test</strong>inale avec le modèle<br />
d’épithélium in<strong>test</strong>inal reconstitué Caco2, <strong>au</strong>tres activités<br />
enzymatiques et inhibiteurs ( -amylase, activités<br />
enzymatiques rési<strong>du</strong>elles (lipasiques, protéasiques),<br />
inhibiteur trypsique, inhibiteur glucosidase,<br />
- d’<strong>au</strong>tres modèles cellulaires ont déjà été utilisés : cellules<br />
de pe<strong>au</strong>, adipocytes, cellules endothéliales<br />
- activités antioxydantes in vitro et ex vivo (SOD, <strong>ORAC</strong>,<br />
TEAC/ABTS, protection des lipides cellulaires<br />
membranaires, de l’ADN cellulaire)
AUTRES SERVICES<br />
- Développement et mise en place-validation de<br />
méthodes selon les demandes clients<br />
- Etudes de stabilité selon les conditions ICH<br />
- Assurance qualité - Service technique – Service<br />
commercial
COLLABORATIONS ET PARTENARIATS<br />
‣ AGROBIO est avant tout un <strong>laboratoire</strong> prestataire<br />
analytique qui utilise <strong>du</strong> matériel spécifique des<br />
plateformes techniques ou établi des collaboration avec<br />
divers équipementier pour répondre <strong>au</strong> mieux à ses<br />
demandes clients.<br />
‣ C’est un partenaire potentiel des plateformes pour ses<br />
compétences analytiques complémentaires.<br />
‣ Les échanges, les partenariats ou des collaborations<br />
extérieures nous permettent de faire évoluer et<br />
diversifier notre activité. Nous y sommes donc ouverts.
EXEMPLES DE COLLABORATIONS<br />
Dans ce cadre, nous faisons parfois appel à des collaborateurs extérieurs<br />
ou à des plateformes notamment pour<br />
- la Microscopie électronique à balayage couplé à l’analyse chimique<br />
(Centre de Microscopie Electronique à Balayage et Analyse de<br />
l’université de Rennes 1),<br />
- le séquençage peptidique par spectrométrie de masse (Plateforme<br />
Innova Protéomic),<br />
- la microscopie optique par contraste de phase pour diverses<br />
observations nécessitant des prises de photo<br />
- la microscopie confocale ou de fluorescence pour observer des<br />
marquages cellulaires (plateforme MRIC – <strong>Biogenouest</strong>)<br />
- Collaboration avec la faculté de pharmacie de Rennes pour des <strong>test</strong>s<br />
sur l’immuno-mo<strong>du</strong>lation<br />
- Collaboration avec INRA STLO (Agrocampus Rennes)
MESURE DE LA CAPACITE ANTIOXYDANTE IN VITRO<br />
PAR LA METHODE <strong>ORAC</strong><br />
<strong>ORAC</strong> : Oxygen Radical Absorbance Capacity<br />
Mesure <strong>du</strong> la capacité anti-radicalaire très répan<strong>du</strong>e, adaptable à<br />
be<strong>au</strong>coup de matrices plutôt hydrosolubles (matières premières<br />
seules ou en mélange, pro<strong>du</strong>its finis ou semi finis, extraits<br />
végét<strong>au</strong>x, …)<br />
La méthode <strong>ORAC</strong> joue sur le transfert d’un atome d’hydrogène.<br />
Elle est basée sur la décroissance de la fluorescence de la<br />
fluorescéine en présence d'un oxydant chimique
MESURE DE LA CAPACITE ANTIOXYDANTE IN VITRO<br />
PAR LA METHODE <strong>ORAC</strong><br />
Principe de la méthode<br />
‣ Extraction des principes actifs dans un mélange d’e<strong>au</strong> et de solvant organique<br />
(acétone, éthanol, …) ou de solvant pur selon l’hydrophobie des composés<br />
‣ Utilisation de la fluorescéine comme marqueur de la réaction<br />
‣ Mesure de la protection exercée par le<br />
pro<strong>du</strong>it à <strong>test</strong>er contre l’oxydation de la<br />
fluorescéine par l’AAPH (méthode par<br />
cinétique fluorimétrique).<br />
‣ Les résultats sont exprimés par<br />
rapport à la protection exercée par un<br />
antioxydant de référence, le Trolox<br />
(équivalent hydrosoluble de la vitamine E).<br />
Une gamme de Trolox intro<strong>du</strong>ite dans<br />
l’expérimentation permet d’exprimer les<br />
résultats en µmol d’équivalent Trolox.
MESURE DE LA CAPACITE ANTIOXYDANTE IN VITRO<br />
PAR LA METHODE <strong>ORAC</strong><br />
Evolution <strong>du</strong> <strong>test</strong> chez AGROBIO-Rennes et collaboration TECAN<br />
‣ Test réalisé en routine <strong>au</strong> <strong>laboratoire</strong> de Vezin le Coquet depuis de nombreuses années<br />
(2003), d’abord en cuve 4 faces en quartz avec un répartiteur 4 places, avec acquisition<br />
informatique des cinétiques<br />
‣ Adaptation en microplaque : le passage en microplaque a permis de gagner <strong>du</strong> temps <strong>au</strong> nive<strong>au</strong><br />
des manipulations, de gagner en répétabilité, et en fiabilité (<strong>au</strong>gmentation <strong>du</strong> nombre de point<br />
de gamme d’étalonnage, passage des échantillons en double ou en triple).<br />
‣ Notre lecteur étant tombé en panne, un nouvel appareil TECAN est arrivé. Plus perfectionné<br />
qui permet de visualiser directement les cinétiques et nous permettra d’optimiser le<br />
retraitement des données acquises pour déterminer la valeur <strong>ORAC</strong> par l’intégration de<br />
calculs <strong>au</strong>tomatiques. (en cours, en collaboration avec TECAN)<br />
‣ Un <strong>au</strong>tomate TECAN associé nous permettra à terme d’<strong>au</strong>tomatiser une partie de<br />
l’expérimentation (dilutions et dépôts en plaques), ré<strong>du</strong>isant ainsi le temps de manipulations.<br />
(pour le moment optimisation pour d’<strong>au</strong>tres analyses avec l’aide de TECAN)
MESURE DE LA CAPACITE ANTIOXYDANTE IN VITRO<br />
PAR LA METHODE <strong>ORAC</strong><br />
Utilisable pour<br />
Quelques exemples chiffrés<br />
- Screening d’extraits végét<strong>au</strong>x<br />
- Potentiel antioxydants <strong>du</strong> lait<br />
- Potentiel antioxydant des fruits ou légumes frais,<br />
cuits, préparés, (jus de fruits, compotes, purées, …)<br />
- Screening de céréales<br />
- Dans le domaine de l’alimentation animale ou de la<br />
nutrition humaine : protection des aliments, apports<br />
nutritionnels permettant une protection physiologique<br />
(stress oxydant, vieillissement, cancer)<br />
Quelques valeurs <strong>ORAC</strong> (en µmol<br />
Aliments<br />
(en µmole d'équivalent Trolox/g de poids frai)<br />
Baies de Goji 146<br />
Prune<strong>au</strong> 45<br />
Raisin 28<br />
Mûre 24<br />
Fraise 15<br />
Chou frisé 18<br />
Epinard 13<br />
Brocoli 9<br />
Quelques valeurs <strong>ORAC</strong><br />
Ingrédients<br />
(en µmol d'équivalent Trolox /g de pro<strong>du</strong>it)<br />
café en poudre 600-900<br />
café soluble 2000<br />
café boisson 30-50<br />
poudre de Polyphénols<br />
de vin rouge<br />
poudre de polyphénols<br />
de raisin rouge<br />
poudre d'anthocyanes de<br />
raisin<br />
poudre de polyphénols<br />
de raisin blanc<br />
8000-9000<br />
7000-8000<br />
6000<br />
12000-13000<br />
jus de prune<strong>au</strong> 60-80<br />
pâte de prune<strong>au</strong> 45<br />
purée de prune<strong>au</strong> 20-30<br />
extrait de thé 10000<br />
extrait d'oignon 6000<br />
extrait de cacao 8000<br />
pollens 100 - 300<br />
propolis 480<br />
Analyses réalisées par Agrobio-Rennes
MESURE DE LA CAPACITE ANTIOXYDANTE IN VITRO<br />
PAR LA METHODE <strong>ORAC</strong><br />
Avantages<br />
- Une fois la mise en place et l’interprétation des<br />
résultats réussies, méthode facile d’utilisation<br />
- Des dérivations de cette méthode permettent de<br />
<strong>test</strong>er des composés lipophiles.<br />
- Le remplacement <strong>du</strong> radical AAPH chimique par<br />
OH.- (radical hydroxyl) permet de se rapprocher<br />
des conditions de stress oxydatif in vivo.<br />
- Dosage possible dans le plasma mais en<br />
complément d’un <strong>au</strong>tre marqueur d’intérêt.<br />
Inconvénients<br />
- Ne reflète pas la capacité<br />
antioxydante totale, seulement<br />
celle mettant en œuvre le transfert<br />
d’un atome d’hydrogène.<br />
- Non applicable directement <strong>au</strong>x<br />
cultures cellulaires. Il f<strong>au</strong>t passer<br />
par d’<strong>au</strong>tres <strong>test</strong>s plus spécifique<br />
d’un marqueur d’intérêt.<br />
Evolution d’<strong>au</strong>tres radic<strong>au</strong>x libres<br />
<strong>ORAC</strong>(L) pour composés lipophiles – H<strong>ORAC</strong> – N<strong>ORAC</strong> – S<strong>ORAC</strong>
MATERIEL UTILISE CHEZ AGROBIO<br />
EVO 75<br />
Robot EVO 75<br />
2 aiguilles<br />
Lecteur Microplaque<br />
INFINITE M200<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013
Configuration <strong>du</strong> robot EVO<br />
selon besoins et budget<br />
EVO 150<br />
EVO 200<br />
EVO 100<br />
EVO 75<br />
• Taille 75 à 200 cm + extensions<br />
• Pipetage 1, 2, 4, 8, 96, 384<br />
• Robotique microplaques, tubes<br />
• Logiciel EVOware<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013
Automatisation à façon<br />
Clonage<br />
Culture<br />
Expression<br />
Purification<br />
Analyse<br />
Lecteur Microplaques<br />
Extraction ADN<br />
Repiquage<br />
Chromatographie<br />
Absorbance<br />
Quantification<br />
Bioréacteurs<br />
Tampons<br />
Fluorescence<br />
PCR<br />
Luminescence<br />
Clonage<br />
Microplaques<br />
Pico Dosages<br />
Titration IC50<br />
Génotypage<br />
HP D300<br />
NGS<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013
Bras Pipetages liquide ou air<br />
• 1, 2, 4, 8 aiguilles ou cônes<br />
• Écartement et h<strong>au</strong>teur variables<br />
• Détection liquides (électrique, pression)<br />
• 0,1 à 5000 uL<br />
• 0,5 uL e<strong>au</strong> CV < 6% (seringue 500 uL ou piston 1000 uL)<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013
Bras pipetage 96<br />
• 1 à 96 cônes<br />
• 96 aiguilles<br />
• 1 à 200 uL<br />
• 1 uL e<strong>au</strong> CV < 6%<br />
• Bras robotique manipulateur<br />
• (pour déplacer la plaque)<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013
Extraction d’ADN ARN, Purification PCR<br />
Colonnes<br />
• Sous-vide<br />
• Centrifugation<br />
Billes magnétique<br />
• Aimant<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013
Quantification et normalisation<br />
Infinite F200 ou M200 (Abs, Fluo)<br />
qPCR<br />
Below<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013
LECTEUR DE MICROPLAQUES INFINITE<br />
• DETECTION<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
Fluorescence top / bottom<br />
TR-FRET, FRET, TRF, polarisation, Alpha Screen/Lisa<br />
Luminescence (Flash & Glow)<br />
Dual color luminescence (w. BRET 1&2)<br />
Absorbance<br />
Cuvette port for Absorbance (option)<br />
Excitation-, emission-, absorbance-scan<br />
• 6 to 384 well plates<br />
• INJECTEURS de réactifs<br />
• Plaque Microvolumes (2µl)<br />
• CONTROLE DU GAZ (CO2 et 02)<br />
• (mesure de croissance)<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013
CONCEPT DU DOUBLE MONOCHROMATEUR<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013
ANALYSE MULTI MODES<br />
Absorbance : de 230 à 1000 nm (par pas de 1 nm)<br />
Fluorescence : de 230 à 850 nm (par pas de 1 nm)<br />
Luminescence (comptage de photons)<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013
EXEMPLES D’APPLICATIONS<br />
• GENOMIC<br />
DNA & RNA-quantification UV-Visible<br />
Protein quantification via BCA®, Bradford & Lowry®-assay<br />
Reporter Gene Assays such as alkaline phosphatase, GFP etc.<br />
• CELL BASED ASSAYS<br />
Cell viability, proliferation, migration, adhesion<br />
Apoptosis<br />
Ion channel assays<br />
• MESURE D’INTERACTIONS MOLECULAIRES<br />
Receptor / Ligand interactions (FRET, HTRF TR de CISBIO…)<br />
DNA / DNA binding or protein<br />
Protein/protein binding<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013
EX <strong>ORAC</strong> : ANALYSE DES DONNEES (AUC…)<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013
MERCI DE VOTRE ATTENTION!...<br />
CONTACTS<br />
• AGROBIO Rennes : +33 2 99 14 70 50<br />
lebas.b@<strong>laboratoire</strong>sagrobio.fr<br />
• TECAN France : +33 4 72 76 04 80<br />
david.rodarie@tecan.com (Robot)<br />
frederique.g<strong>au</strong>tier-galetto@tecan.com (lecteur-laveur)<br />
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013