Évolution du test ORAC au sein du laboratoire ... - Biogenouest

Témoignage d’une collaboration entre une entreprise
prestataire analytique (AGROBIO), différentes plateformes
et un équipementier (TECAN)

I. Présentation d’AGROBIO-Rennes
II. Le test ORAC et collaboration avec
TECAN
III.TECAN : Robotique et lecteur de
microplaques
Bénédicte LEBAS
Frédérique GAUTIER-GALETTO
ZAC des trois marches
3, Impasse de La Jonchée
F - 35132 VEZIN LE COQUET
Tel : +33 (0)2 99 14 70 50
Fax +33 (0)2 99 14 70 51
Sites : http//www.agrobio-rennes.com

- Prestations et expertises analytiques,
- Conseils analytiques
- Développements-optimisations et validation de
méthodes à façon
- Compléments alimentaire, aliments fonctionnels,
aliments santé
- Parapharmacie, cosmétiques, agroalimentaire
- Nutrition humaine ou animale
ZAC des trois marches
3, Impasse de La Jonchée
F - 35132 VEZIN LE COQUET
Tel : +33 (0)2 99 14 70 50 / Fax +33 (0)2 99 14 70 51
Sites : http//www. labo-nutrinov.com
http//www.laboratoiresagrobio.fr

POLES DE SPECIALITES
Chimie alimentaire traditionnelle (protéines, lipides, glucides
(valeurs et déclaration nutritionnelle) et spécialisée
- cartographie des sucres plus ou moins complexes, fibres (FOS,
inuline, βglycans, lactulose, polydextrose), condroïtine-glucosamine
sulfate
- spécialité pour protéines laitières, répartition des poids
moléculaires, acides aminés libres, totaux, soufrés
- conservateurs, minéraux, contaminants et pesticides, lactones
terpéniques, ginsénosides, rébaudioside, CoenzQ10, stérols,
phytostérols, CLA, produits de la réaction de maillard, marqueurs
d’oxydation (IP, IA, MDA, groupements carbonyls, Vitamines A, B,
C, D, E …)

POLES DE SPECIALITES
Nutraceutiques, compléments alimentaires et
extraits végétaux
- Vitamines A, B, C, D, E,
- caroténoïdes et dérivés (lycopène, lutéine, zéaxanthine,
βcarotène),
- polyphénols et antioxydants spécifiques (asthaxanthine,
phytohème-phytofluène, caféine, proanthocyanidines de
canneberge, catéchines et dérives, curcumines et dérivés,
acides chlorogéniques, acides ginkoliques, anthocyanes, …)
- tests de caractérisation physique (dissolution, désagrégation,
pH, uniformités de masse, …)

POLES DE SPECIALITES
Tests de Biologie Cellulaire et Fonctionnelle
- étude de digestibilité in vitro (protéiques méthode de R.
Glahn, index glycémique selon méthode Englyst),
évaluation de perméabilité intestinale avec le modèle
d’épithélium intestinal reconstitué Caco2, autres activités
enzymatiques et inhibiteurs ( -amylase, activités
enzymatiques résiduelles (lipasiques, protéasiques),
inhibiteur trypsique, inhibiteur glucosidase,
- d’autres modèles cellulaires ont déjà été utilisés : cellules
de peau, adipocytes, cellules endothéliales
- activités antioxydantes in vitro et ex vivo (SOD, ORAC,
TEAC/ABTS, protection des lipides cellulaires
membranaires, de l’ADN cellulaire)

AUTRES SERVICES
- Développement et mise en place-validation de
méthodes selon les demandes clients
- Etudes de stabilité selon les conditions ICH
- Assurance qualité - Service technique – Service
commercial

COLLABORATIONS ET PARTENARIATS
‣ AGROBIO est avant tout un laboratoire prestataire
analytique qui utilise du matériel spécifique des
plateformes techniques ou établi des collaboration avec
divers équipementier pour répondre au mieux à ses
demandes clients.
‣ C’est un partenaire potentiel des plateformes pour ses
compétences analytiques complémentaires.
‣ Les échanges, les partenariats ou des collaborations
extérieures nous permettent de faire évoluer et
diversifier notre activité. Nous y sommes donc ouverts.

EXEMPLES DE COLLABORATIONS
Dans ce cadre, nous faisons parfois appel à des collaborateurs extérieurs
ou à des plateformes notamment pour
- la Microscopie électronique à balayage couplé à l’analyse chimique
(Centre de Microscopie Electronique à Balayage et Analyse de
l’université de Rennes 1),
- le séquençage peptidique par spectrométrie de masse (Plateforme
Innova Protéomic),
- la microscopie optique par contraste de phase pour diverses
observations nécessitant des prises de photo
- la microscopie confocale ou de fluorescence pour observer des
marquages cellulaires (plateforme MRIC – Biogenouest)
- Collaboration avec la faculté de pharmacie de Rennes pour des tests
sur l’immuno-modulation
- Collaboration avec INRA STLO (Agrocampus Rennes)

MESURE DE LA CAPACITE ANTIOXYDANTE IN VITRO
PAR LA METHODE ORAC
ORAC : Oxygen Radical Absorbance Capacity
Mesure du la capacité anti-radicalaire très répandue, adaptable à
beaucoup de matrices plutôt hydrosolubles (matières premières
seules ou en mélange, produits finis ou semi finis, extraits
végétaux, …)
La méthode ORAC joue sur le transfert d’un atome d’hydrogène.
Elle est basée sur la décroissance de la fluorescence de la
fluorescéine en présence d'un oxydant chimique

MESURE DE LA CAPACITE ANTIOXYDANTE IN VITRO
PAR LA METHODE ORAC
Principe de la méthode
‣ Extraction des principes actifs dans un mélange d’eau et de solvant organique
(acétone, éthanol, …) ou de solvant pur selon l’hydrophobie des composés
‣ Utilisation de la fluorescéine comme marqueur de la réaction
‣ Mesure de la protection exercée par le
produit à tester contre l’oxydation de la
fluorescéine par l’AAPH (méthode par
cinétique fluorimétrique).
‣ Les résultats sont exprimés par
rapport à la protection exercée par un
antioxydant de référence, le Trolox
(équivalent hydrosoluble de la vitamine E).
Une gamme de Trolox introduite dans
l’expérimentation permet d’exprimer les
résultats en µmol d’équivalent Trolox.

MESURE DE LA CAPACITE ANTIOXYDANTE IN VITRO
PAR LA METHODE ORAC
Evolution du test chez AGROBIO-Rennes et collaboration TECAN
‣ Test réalisé en routine au laboratoire de Vezin le Coquet depuis de nombreuses années
(2003), d’abord en cuve 4 faces en quartz avec un répartiteur 4 places, avec acquisition
informatique des cinétiques
‣ Adaptation en microplaque : le passage en microplaque a permis de gagner du temps au niveau
des manipulations, de gagner en répétabilité, et en fiabilité (augmentation du nombre de point
de gamme d’étalonnage, passage des échantillons en double ou en triple).
‣ Notre lecteur étant tombé en panne, un nouvel appareil TECAN est arrivé. Plus perfectionné
qui permet de visualiser directement les cinétiques et nous permettra d’optimiser le
retraitement des données acquises pour déterminer la valeur ORAC par l’intégration de
calculs automatiques. (en cours, en collaboration avec TECAN)
‣ Un automate TECAN associé nous permettra à terme d’automatiser une partie de
l’expérimentation (dilutions et dépôts en plaques), réduisant ainsi le temps de manipulations.
(pour le moment optimisation pour d’autres analyses avec l’aide de TECAN)

MESURE DE LA CAPACITE ANTIOXYDANTE IN VITRO
PAR LA METHODE ORAC
Utilisable pour
Quelques exemples chiffrés
- Screening d’extraits végétaux
- Potentiel antioxydants du lait
- Potentiel antioxydant des fruits ou légumes frais,
cuits, préparés, (jus de fruits, compotes, purées, …)
- Screening de céréales
- Dans le domaine de l’alimentation animale ou de la
nutrition humaine : protection des aliments, apports
nutritionnels permettant une protection physiologique
(stress oxydant, vieillissement, cancer)
Quelques valeurs ORAC (en µmol
Aliments
(en µmole d'équivalent Trolox/g de poids frai)
Baies de Goji 146
Pruneau 45
Raisin 28
Mûre 24
Fraise 15
Chou frisé 18
Epinard 13
Brocoli 9
Quelques valeurs ORAC
Ingrédients
(en µmol d'équivalent Trolox /g de produit)
café en poudre 600-900
café soluble 2000
café boisson 30-50
poudre de Polyphénols
de vin rouge
poudre de polyphénols
de raisin rouge
poudre d'anthocyanes de
raisin
poudre de polyphénols
de raisin blanc
8000-9000
7000-8000
6000
12000-13000
jus de pruneau 60-80
pâte de pruneau 45
purée de pruneau 20-30
extrait de thé 10000
extrait d'oignon 6000
extrait de cacao 8000
pollens 100 - 300
propolis 480
Analyses réalisées par Agrobio-Rennes

MESURE DE LA CAPACITE ANTIOXYDANTE IN VITRO
PAR LA METHODE ORAC
Avantages
- Une fois la mise en place et l’interprétation des
résultats réussies, méthode facile d’utilisation
- Des dérivations de cette méthode permettent de
tester des composés lipophiles.
- Le remplacement du radical AAPH chimique par
OH.- (radical hydroxyl) permet de se rapprocher
des conditions de stress oxydatif in vivo.
- Dosage possible dans le plasma mais en
complément d’un autre marqueur d’intérêt.
Inconvénients
- Ne reflète pas la capacité
antioxydante totale, seulement
celle mettant en œuvre le transfert
d’un atome d’hydrogène.
- Non applicable directement aux
cultures cellulaires. Il faut passer
par d’autres tests plus spécifique
d’un marqueur d’intérêt.
Evolution d’autres radicaux libres
ORAC(L) pour composés lipophiles – HORAC – NORAC – SORAC

MATERIEL UTILISE CHEZ AGROBIO
EVO 75
Robot EVO 75
2 aiguilles
Lecteur Microplaque
INFINITE M200
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013

Configuration du robot EVO
selon besoins et budget
EVO 150
EVO 200
EVO 100
EVO 75
• Taille 75 à 200 cm + extensions
• Pipetage 1, 2, 4, 8, 96, 384
• Robotique microplaques, tubes
• Logiciel EVOware
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013

Automatisation à façon
Clonage
Culture
Expression
Purification
Analyse
Lecteur Microplaques
Extraction ADN
Repiquage
Chromatographie
Absorbance
Quantification
Bioréacteurs
Tampons
Fluorescence
PCR
Luminescence
Clonage
Microplaques
Pico Dosages
Titration IC50
Génotypage
HP D300
NGS
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013

Bras Pipetages liquide ou air
• 1, 2, 4, 8 aiguilles ou cônes
• Écartement et hauteur variables
• Détection liquides (électrique, pression)
• 0,1 à 5000 uL
• 0,5 uL eau CV < 6% (seringue 500 uL ou piston 1000 uL)
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013

Bras pipetage 96
• 1 à 96 cônes
• 96 aiguilles
• 1 à 200 uL
• 1 uL eau CV < 6%
• Bras robotique manipulateur
• (pour déplacer la plaque)
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013

Extraction d’ADN ARN, Purification PCR
Colonnes
• Sous-vide
• Centrifugation
Billes magnétique
• Aimant
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013

Quantification et normalisation
Infinite F200 ou M200 (Abs, Fluo)
qPCR
Below
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013

LECTEUR DE MICROPLAQUES INFINITE
• DETECTION
Fluorescence top / bottom
TR-FRET, FRET, TRF, polarisation, Alpha Screen/Lisa
Luminescence (Flash & Glow)
Dual color luminescence (w. BRET 1&2)
Absorbance
Cuvette port for Absorbance (option)
Excitation-, emission-, absorbance-scan
• 6 to 384 well plates
• INJECTEURS de réactifs
• Plaque Microvolumes (2µl)
• CONTROLE DU GAZ (CO2 et 02)
• (mesure de croissance)
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013

CONCEPT DU DOUBLE MONOCHROMATEUR
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013

ANALYSE MULTI MODES
Absorbance : de 230 à 1000 nm (par pas de 1 nm)
Fluorescence : de 230 à 850 nm (par pas de 1 nm)
Luminescence (comptage de photons)
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013

EXEMPLES D’APPLICATIONS
• GENOMIC
DNA & RNA-quantification UV-Visible
Protein quantification via BCA®, Bradford & Lowry®-assay
Reporter Gene Assays such as alkaline phosphatase, GFP etc.
• CELL BASED ASSAYS
Cell viability, proliferation, migration, adhesion
Apoptosis
Ion channel assays
• MESURE D’INTERACTIONS MOLECULAIRES
Receptor / Ligand interactions (FRET, HTRF TR de CISBIO…)
DNA / DNA binding or protein
Protein/protein binding
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013

EX ORAC : ANALYSE DES DONNEES (AUC…)
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013

MERCI DE VOTRE ATTENTION!...
CONTACTS
• AGROBIO Rennes : +33 2 99 14 70 50
lebas.b@laboratoiresagrobio.fr
• TECAN France : +33 4 72 76 04 80
david.rodarie@tecan.com (Robot)
frederique.gautier-galetto@tecan.com (lecteur-laveur)
AGROBIO_TECAN GEN2Bio 2013