Verticillium - Toubkal

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218 B. Préparation des gels 1. Gel de séparation à 10% d’acrylamide Mélanger dans une fiole à vide de 500ml : Protogel 16.7ml Tris-Cl 1.5M 12.5ml SDS 0.5ml H2O 19.5ml Ajouter goutte à goutte Persulfate d’ammonium 500µl TEMMED 20µl Dégazer sous vide jusqu’à disparition complète des bulles. Couler immédiatement le gel avec une pipette de 5ml. Mettre un mince filet d’eau à la surface du gel pour éviter toute évaporation 2. Gel de concentration (Staking) à 5% Mélanger dans une fiole à vide de 250ml Protogel 1.7ml Tris-HCl 1M 1.25ml SDS 0.1ml H2O 6.8ml Mélanger et dégazer sous vide comme précédemment. Pendant ce temps, éliminer l’eau à la surface du gel de séparation. Rincer trois fois avec le tampon Tris-HCl 1M dilué au ¼. Eliminer le maximum de tampon avec du papier Joseph. Après dégazage, ajouter Persulfate d’ammonium 100µl TEMED 10µl Couler sur le gel précédent avec une pipette de 1ml. S’assurer de la polymérisation du gel dans le liquide qui reste dans la fiole. Placer le peigne entre les deux plaques de verre pour former les puits. Après polymération du gel, le peigne est enlevé et les puits sont rincés. C. Préparation des extraits avant dépôt 1. Solution de traitement des échantillons *Tampon TrisHCl 0.5M 1.25ml
219 *SDS à 10% 2ml *Glycérol 1ml *mercaptoéthanol 0.5ml *Bleu de bromophénol à 1% 0.20ml 2. traitement des échantillons Mélanger l’échantillon à analyser volume à volume (ex 50µl + 50) dans la solution de traitement. Chauffer 5 minutes à 100°C en faisant un trou dans l’eppendorf. Les échantillons peuvent être conservés à –20°C et réchauffés avant utilisation. D. Courbe étalon des protéines standards Log PM 2,4 2,3 2,2 2,1 2 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 0,02 0,14 0,28 0,35 0,79 mobilité relative Les zymogrammes sont établis après chaque révélation. Le rapport frontal est calculé par la suite comme suit : RF= distance parcourue par la bande Distance parcourue par le front de migration Les PM des différentes bandes sont déterminés par extrapolation de la courbe étalon des protéines standards.
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Page 229: 217 ANNEXE 2 : Electrophorèse SDS-
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