Verticillium - Toubkal

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3. Analyse des protéines par électrophorèse
La séparation des protéines fongiques est effectuée par électrophorèse sur gel
dénaturant de polyacrylamide, en utilisant le système discontinu en présence du
SDS (sodium dodecyl sulfate). Ce dernier déroule complètement les protéines en
détruisant leurs structures secondaires et tertiaires. Les protéines se comportent
comme des anions. Leur mobilité sous l’action d’un champs électrique est fonction
de leur taille.
3.1. Préparation des gels
Nous avons utilisé un gel de séparation à 10% d’acrylamide et un gel de
concentration à 5%. ( voir annexes).
3.2. Préparation des échantillons
Les échantillons de protéines sont traités avec un tampon de traitement des
échantillons (annexes) puis chauffés à 95°C pendant cinq minutes. Après
refroidissement, 20µl d’échantillons sont déposés dans les puits du gel. Les
échantillons sont conservés en aliquots de 0.5ml et mis au congélateur.
3.3. Migration
Après avoir déposé les échantillons dans les puits, les deux chambres de la cuve à
électrophorèse sont remplies de tampon d’électrophorèse (annexes) et la cuve est
connectée au générateur. La migration est effectuée sous tension de 200V. Le front
de migration est visualisé grâce au bromophénol ajouté à l’extrait.
3.4. Révélation
Après avoir retiré délicatement le gel, la coloration se fait selon les étapes
suivantes :
- Fixation : fixer 30 minutes dans la solution de fixation. Rincer cinq
minutes dans la solution de décoloration (éthanol 250ml- acide acétique 20ml- eau
distillée 730ml). On peut laisser le gel la nuit dans le fixateur et au frigo pour
coloration le lendemain.