Verticillium - Toubkal

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L’influence du sel semble s’exercer sur la production de métabolites toxiques et
d’enzymes ayant une activité cellulolytique comme la carboxyméthylcellulase.
La salinité serait donc à l’origine de remaniements biochimiques qui touchent le
métabolisme des protéines chez cet agent pathogène. Pour contribuer à apporter
plus d’arguments aux modifications biochimiques des composantes de la
pathogénèse de Verticillium induites par la salinité, nous proposons de faire une
estimation des taux de protéines extracellulaires produites par l’agent pathogène
au cours de son incubation sur milieu salé et d’analyser leurs profils
électrophorétiques en fonction de la richesse du milieu en NaCl.
A. Matériel et méthodes
1. Concentration des protéines
Les filtrats de culture du champignon développé sur milieu Czapeck additionné de
o ; 2 ; 4 ; 6 et 8g/l de NaCl subissent une précipitation à l’éthanol. Cette opération
consiste à traiter un volume du filtrat avec deux volumes d’éthanol absolu. La
précipitation dure deux heures et le précipité est récupéré après centrifugation à
10000 rpm pendant 15 minutes. Le culot obtenu est rincé avec du tampon Tris-
EDTA, pH 7.4 (Tris 10mM, EDTA 1mM). Il va servir au dosage des protéines et à la
séparation par électrophorèse.
2. Dosage des protéines
Les protéines sont dosées par la technique de Bradford (1976). Cette méthode
permet de doser de faibles quantités de protéines. Une gamme étalon (20 ; 40 ;
60 ; 80 ; 100 et 120µg) est préparée à partir d’une solution d’albumine sérique
bovine (BSA, 0.1mg/ml). Chaque dilution est préparée en duplicata.
Dans un tube à essai contenant 200µl de protéine standard (BSA) ou
d’échantillon , 1.8ml du réactif de Bradford au bleu de Coomassie sont ajoutés et
l’ensemble est bien mélangé au vortex. La coloration apparaît en quelques
secondes et reste stable pendant une heure. L’absorbance est lue à 595 nm après
cinq minutes. La quantité de protéines présente dans l’échantillon est déterminée
par extrapolation dans la courbe étalon et est exprimée en µg/ml.