Verticillium - Toubkal
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3. Analyse de l’activité pectine méthyle estérase<br />
3.1. Production de l’enzyme<br />
Le champignon est mis en culture dans des fioles de 250ml contenant 100ml de<br />
milieu Czapeck liquide modifié : le saccharose est remplacé par de la pectine<br />
comme seule source de carbone et le milieu est enrichi en vitamine B1 à raison de<br />
375µg par litre. Le traitement par le sel consiste en l’addition au milieu de culture<br />
de 4 ;8;12 et 16g/l de NaCl. Le pH final est ajusté à 5.9 par addition de NaOH.<br />
Après autoclavage, chaque fiole est ensemencée par 5.10 4 spores de <strong>Verticillium</strong><br />
prélevée d’une suspension de spores fraîchement préparée. Après deux semaines<br />
d’incubation à 24°C, les cultures sont filtrées selon le protocole décrit<br />
précédemment. Les filtrats de culture servent immédiatement au dosage de<br />
l’activité enzymatique.<br />
3.2. Révélation<br />
La révélation de l’enzyme est faite dans des boites de Pétri contenant 30ml du<br />
milieu suivant :<br />
- Pectine (pectin apple) 0.5 %<br />
- Agar noble 2 %<br />
- Tampon citrate phosphate 0.05 M, pH 6.5<br />
L’enzyme est dosée selon la technique des cup-late ( Mann, 1962). On dépose 50µl<br />
de chaque filtrat de culture dans des puits creusés à l’emporte pièce dans des<br />
boites de Pétri contenant le milieu gélosé de révélation de l’enzyme à raison de 3<br />
puits par boite.<br />
Après 16 heures d’incubation à 30°C les boites sont submergées d’acide malique<br />
0.1 M et mises en agitation pendant une heure à la température ambiante. Les<br />
boites sont ensuite rincées et inondées avec une solution aqueuse de rouge de<br />
ruthénium à 0.02 %. Après une nuit, un halo clair apparaît autour des puits et<br />
indique la présence de la pectine méthyle estérase.