Verticillium - Toubkal

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3. Analyse de l’activité pectine méthyle estérase
3.1. Production de l’enzyme
Le champignon est mis en culture dans des fioles de 250ml contenant 100ml de
milieu Czapeck liquide modifié : le saccharose est remplacé par de la pectine
comme seule source de carbone et le milieu est enrichi en vitamine B1 à raison de
375µg par litre. Le traitement par le sel consiste en l’addition au milieu de culture
de 4 ;8;12 et 16g/l de NaCl. Le pH final est ajusté à 5.9 par addition de NaOH.
Après autoclavage, chaque fiole est ensemencée par 5.10 4 spores de Verticillium
prélevée d’une suspension de spores fraîchement préparée. Après deux semaines
d’incubation à 24°C, les cultures sont filtrées selon le protocole décrit
précédemment. Les filtrats de culture servent immédiatement au dosage de
l’activité enzymatique.
3.2. Révélation
La révélation de l’enzyme est faite dans des boites de Pétri contenant 30ml du
milieu suivant :
- Pectine (pectin apple) 0.5 %
- Agar noble 2 %
- Tampon citrate phosphate 0.05 M, pH 6.5
L’enzyme est dosée selon la technique des cup-late ( Mann, 1962). On dépose 50µl
de chaque filtrat de culture dans des puits creusés à l’emporte pièce dans des
boites de Pétri contenant le milieu gélosé de révélation de l’enzyme à raison de 3
puits par boite.
Après 16 heures d’incubation à 30°C les boites sont submergées d’acide malique
0.1 M et mises en agitation pendant une heure à la température ambiante. Les
boites sont ensuite rincées et inondées avec une solution aqueuse de rouge de
ruthénium à 0.02 %. Après une nuit, un halo clair apparaît autour des puits et
indique la présence de la pectine méthyle estérase.