Verticillium - Toubkal

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1.2. Matériel et méthodes
Plusieurs méthodes ont été décrites pour la détermination de l’activité nitrate
réductase. Nous avons opté pour la méthode « in situ » telle qu’elle a été décrite
par Robin et al., (1983 a). Si on se réfère aux résultats de Robin et al., (1983 b) sur
le maïs, cette méthode permet d’évaluer avec une bonne approximation la
réduction réelle de nitrate en nitrite, contrairement à la méthode in vitro qui
mesure l’activité potentielle de l’enzyme.
Le principe consiste à doser le nitrite formé au moment de la réduction des
nitrates.
Après un mois de culture, les parties aériennes des plantes de tomate soumises au
stress salin et à l’infection par Verticillium sont prélevées après 6 heures du début
de la photopériode. Elles sont ensuite pesées et mises à incuber dans des vénojects
de 140ml en anoxie et à l’obscurité en présence de KNO3 ( 100mM) (Gojon et al.,
1983).
Après un temps d’incubation d’une heure, le nitrite accumulé est extrait par de
l’eau bouillante pour arrêter la réaction puis dosé par colorimétrie après addition
des réactifs de diazotation (N. Naphty Ethylène Diamine Dichlorure NNEDD) ;
0.2g/l) et de sulfanilamide (10g/l d’HCl). On laisse ensuite la coloration violette se
développer pendant au moins 30 minutes puis on mesure la densité optique au
spectrophotomètre à 540 nm. Les résultats , moyennes de six répétitions sont
exprimés en µM de NO2 - /h/ g de matière fraîche en utilisant la formule qui suit :
A N R = DO x V
PF. E 0. t
DO= densité optique lue à 540 nm
V= volume d’extraction en litre
t= temps d’incubation en heure
PF= poids frais en g
E 0= coefficient d’extinction molaire
NNEDD : N.Naphty Ethylène Diamine Dichlorure