Hybridation In Situ
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<strong>Hybridation</strong> in situ :<br />
principes et méthodesm<br />
Hélène<br />
Hardin-Pouzet<br />
Neurobiologie des Signaux <strong>In</strong>tercellulaires,<br />
CNRS UMR 7101, Université Paris 6
Plan de l ’exposé<br />
Définition de l’HISl<br />
Principe de l’HISl<br />
: l’hybridation l<br />
moléculaire<br />
fusion de l ’ADN et notion de Tm<br />
hybridation moléculaire<br />
Les sondes<br />
les différentes sondes<br />
les marquages<br />
les nucléotides<br />
otides-marqueurs<br />
<strong>Hybridation</strong> in situ proprement dite<br />
préparation paration du matériel biologique<br />
hybridation<br />
lavage et repérage rage des hybrides<br />
contrôles de la spécificit<br />
cificité d’hybridation
Définition de<br />
l’hybridation<br />
in situ
«Etude de la distribution histologique et cytologique<br />
d ’un acide nucléique<br />
ique»<br />
développement dans les années 80<br />
acide nucléique marqué : « sonde »<br />
acide nucléique recherché : « séquence-ciblecible »<br />
Séquence-ciblecible<br />
Sonde<br />
2 applications : biologie cellulaire, cytogénétique<br />
tique
Principes de<br />
l ’hybridation<br />
in situ
1. Fusion de l ’ADN, notion de Tm<br />
DO 260 nm<br />
simple brin<br />
double brin<br />
Tm<br />
température
Facteurs influençant la Tm :<br />
composition en bases<br />
mismatches<br />
composition ionique<br />
stringence<br />
formamide<br />
longueur de l ’ADN<br />
Tm = 16,6 log (Na+) + 0,41 %GC - 81,5 – 0.65 % formamide<br />
- 675/(longueur en bases) - % mismatch<br />
Pour oligonucléotides<br />
otides de 14 à 20 pb:<br />
Tm= = 2(G+C) + 4(A+T)
2. <strong>Hybridation</strong> moléculaire<br />
Après s fusion :<br />
abaissement brutal de la température :<br />
dissociation maintenue<br />
abaissement progressif de la température :<br />
réassociation des deux brins : hybridation<br />
Facteurs influençant l ’hybridation :<br />
quantité de cibles en présence<br />
durée e de la réactionr<br />
température<br />
longueur des fragments<br />
nature des acides nucléiques<br />
force ionique
«Etude de la distribution histologique et cytologique<br />
d ’un acide nucléique<br />
ique»<br />
développement dans les années 80<br />
acide nucléique marqué : « sonde »<br />
acide nucléique recherché : « séquence-ciblecible »<br />
Séquence-ciblecible<br />
Sonde<br />
2 applications : biologie cellulaire, cytogénétique<br />
tique
Les sondes
1. Les différentes sondes<br />
Sondes ADNc :<br />
ADN déjàd<br />
cloné dans un plasmide<br />
avantages : très s spécifique<br />
inconvénients nients :<br />
production lourde,<br />
séquence longue (prétraitements,<br />
Tm élevée)<br />
e)<br />
donc bruit de fond
Sondes ARN :<br />
ADN cloné dans un plasmide contenant<br />
deux promoteurs viraux<br />
Promoteur T3<br />
plasmide<br />
ADN<br />
avantages : grande quantité<br />
sondes très s marquées<br />
sens + anti-sens<br />
hybridation très s stable<br />
Promoteur T7<br />
inconvénients nients : hybridation à haute température<br />
sensible aux RNases
Oligonucléotides<br />
otides :<br />
séquence codante connue (banques : EMBL, DDBJ…)<br />
avantages : pas de biologie moléculaire<br />
« lourde »<br />
facilité d’utilisation<br />
peu onéreux<br />
très s spécifique<br />
inconvénients nients : sondes peu marquées<br />
(cocktails pour compenser)
Règles pour choisir un oligo :<br />
choisir dans la séquence s<br />
codante<br />
taille : 30 mers<br />
50 % GC<br />
pas de séquences s<br />
répétées r<br />
ni palindromiques<br />
pas de G aux extrémit<br />
mités<br />
pas de séquences s<br />
poly T
2. Les marquages<br />
dépend de la nature de la sonde :<br />
ADNc : nick-translation<br />
ou random priming<br />
ARN : transcription in vitro<br />
oligonucléotide<br />
otide : 3’ 3 tailing
Nick-translation<br />
(déplacement de coupure)<br />
Dnase 1<br />
ADN pol<br />
ADN pol
Random priming<br />
(Elongation d ’amorce au hasard)<br />
chauffage<br />
+<br />
hexanucléotides<br />
ADN pol
3 ’ Tailing<br />
(marquage à l ’extrémité 3 ’)<br />
Terminal désoxynucléotidylotidyl<br />
transférase<br />
rase
3. Les nucléotides<br />
otides-marqueurs<br />
radioactifs : 32 P, 35 S, 33 P, 3 H<br />
sensibilité<br />
quantification<br />
non radioactifs : dUTP-biotine<br />
ou dUTP-digoxyg<br />
digoxygénine<br />
mode de révélationr<br />
sensibilité faible<br />
quantification difficile
<strong>Hybridation</strong> in situ<br />
proprement dite
1. Préparation du matériel<br />
biologique<br />
fixation :<br />
conservation de la morphologie<br />
efficacité de l ’hybridation<br />
fixateurs précipitants ou fixateurs aldéhydiques<br />
prétraitements :<br />
perméabilisation<br />
des structures<br />
accès s de la sonde<br />
diminution de l ’accrochage non-sp<br />
spécifique<br />
(acétylation,<br />
préhybridation<br />
hybridation)
2. <strong>Hybridation</strong><br />
tampon d ’hybridation<br />
:<br />
pH compris entre 5 et 7<br />
(NaCl)) compris entre 0,3 M et 0,6 M<br />
en pratique :<br />
Tris 10mM - EDTA 1mM pH 7,4 -NaCl<br />
0,6M<br />
Citrate de Na 0,06M - NaCl 0,6M = SSC 4X<br />
température d ’hybridation<br />
: 20 à 25°C C sous la Tm<br />
en pratique :<br />
hybrider entre 37°C C et 42°C C (50% formamide )
limitation du bruit de fond :<br />
DNA salmon sperm soniqué, , dénaturd<br />
naturé<br />
tRNA<br />
polyA<br />
Dehnardt<br />
augmentation de l ’efficacité d ’hybridation<br />
:<br />
sulfate de dextran<br />
dilution de la sonde :<br />
sonde radioactive : 1 nM (Rqe<br />
: DTT)<br />
sonde non radioactive : 10 nM<br />
incubation : la nuit, en chambre humide
3. Lavages et repérage<br />
rage<br />
des hybrides<br />
lavages : élimination de la sonde non hybridée<br />
durée e et stringence à adapter<br />
repérage rage des hybrides :<br />
sondes radioactives : autoradiographie<br />
sondes non radioactives : réaction r<br />
ICC
4. Contrôles de la spécificit<br />
cificité<br />
d’hybridation<br />
contrôle de la qualité de la sonde : tissu + et tissu -<br />
contrôle du matériel<br />
: hybridation avec sonde hétérologueh<br />
contrôle des cibles :<br />
RNAse A ou T1<br />
DNAse 1<br />
hybridation avec sonde anti-sens<br />
déplacement par un excès s de sonde<br />
non marquée
Endocrine neurons<br />
(Trembleau et al., 1993)<br />
Decavel and Calas, unpublished)
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