Laboratoire de recherche en virologie médicale - Institut Louis ...

le développement et la validation de différentes méthodes de détection des toxines
ciguatériques (CTXs), pour une meilleure gestion du risque ciguatérique in situ.
1- Etude du dinoflagellé Gambierdiscus
Elle a pour but de mettre au point des sondes moléculaires permettant la détection des
différentes espèces de Gambierdiscus, et plus particulièrement des lignées dangereuses
(toxiques) de cette micro-algue dans le milieu naturel. La caractérisation de sondes nucléiques
et le recours à des anticorps ou des marqueurs fluorescents sont quelques-unes des voies qui ont
été explorées.
Détection des différentes espèces de Gambierdiscus
• par sondes nucléiques : cette méthode consiste à élaborer des amorces ciblant l'opéron
ribosomal de Gambierdiscus - plus particulièrement les domaines hypervariables D1-D3
et D8-D10 de la sous-unité 24S rDNA -, et utilisables en PCR classique ou en temps réel.
Trois couples d'amorces, spécifiques des espèces G. polynesiensis, G. toxicus et
G. yasumotoi, sont d'ores et déjà disponibles, en revanche, la spécificité des amorces
ciblant les espèces G. pacificus et G. australes nécessite encore d'être améliorée.
En 2007, notre priorité sera de mettre au point et d'optimiser la technique de PCR
quantitative en temps réel sur ces sondes, afin de l'appliquer à la quantification des
différentes lignées de Gambierdiscus directement au sein des efflorescences naturelles
de cette micro-algue.
• criblage par des FITC-lectines : les lectines sont des molécules capables de se lier aux
glycoprotéines et glycolipides de surface de bon nombre de cellules. Couplées à la
fluorescéine isothiocyanate (FITC), elles constituent d'excellents marqueurs cellulaires.
L'affinité de 11 FITC-lectines commerciales pour 12 souches de Gambierdiscus,
appartenant aux espèces G. toxicus, G. polynesiensis, G. pacificus et G. australes, a été
comparée par microscopie en fluorescence. Les lectines FITC-HPA (issu de Helix
pomatia); FITC-WGA (Triticum vulgaris); FITC-PEA (Pisum sativum); et FITC-UEA (Ulex
europaeus) ont montré une excellente affinité pour les souches de G. australes et G.
polynesiensis. Un marquage ultérieur avec FITC-LcH (Lens culinaris) ou FITC-BS1
(Bandeiraea simplicifolia) permet ensuite de différencier ces 2 espèces entre elles. A
l'inverse, les espèces G. pacificus et G. toxicus n'ont montré que peu ou pas d'affinité
pour les lectines testées, à l'exception de FITC-DBA (Dolichus biflorus) et FITC-ConA
(Canavalia ensiformis). Toutefois, ces 2 lectines n'ont pas permis de différencier ces 2
espèces entre elles qui apparaissent très proches génétiquement, comme le confirment
nos données de séquences. Leur criblage au moyen de nouvelles lectines sera donc
poursuivi en 2007. De par sa mise en œuvre plus aisée que la PCR, cette méthode de
détection nous paraît la mieux adaptée à une utilisation en routine dans les îles
éloignées de Polynésie désireuses de surveiller le risque ciguatérique dans leur lagon.
Détection des lignées cellulaires toxiques de Gambierdiscus
• par sondes nucléiques : cette méthode consiste à élaborer des amorces ciblant les
gènes codant pour le complexe enzymatique Polykétide Synthase (PKS) impliqué dans la
voie de biosynthèse des CTXs. Déjà bien décrit chez les bactéries Actinomycètes et les
champignons, ce complexe reste toutefois mal connu chez les dinoflagellés. Une
consultation préalable des banques de données relatives aux gènes PKS déjà séquencés
sera initiée en 2007, afin de nous éclairer sur le degré de conservation de ces séquences
d'une espèce à l'autre. Des amorces "dégénérées" adaptées aux dinoflagellés seront
ensuite élaborées, en vue d'un criblage par PCR des lignées cellulaires toxiques et
atoxiques disponibles dans la souchothèque de l'ILM.
• au moyen d'anticorps anti-CTXs : cette méthode consiste à cribler les homogénats
cellulaires de Gambierdiscus (lysats totaux ou fractions subcellulaires) au moyen
d'anticorps anti-CTXs. Ce volet fait partie intégrante d'un contrat de recherche signé le
1 er mars 2006 entre l'ILM et l'Institut Pasteur de Nouvelle-Calédonie (IPNC) (cf
1 er Rapport d'étape portant sur la "Recherche et mise au point de tests de détection
Institut Louis Malardé – Rapport annuel 2006 41