Laboratoire de recherche en virologie médicale - Institut Louis ...

c. Couple DN-F / DN-R: la limite de détection obtenue sur une gamme de
dilutions réalisée à partir d’un pool d’ARN extraits de sérums DEN1 (04.12.06)
(++++) est de 10 -4 (>10 2 eq DICT 50 ), soit en dessous de la sensibilité du 1 er tour
de la RT-PCR nichée.
d. Couple d1/TS1 et d1/D1-R: les meilleurs résultats, en terme de sensibilité,
ont été obtenus avec ces couples d’amorces. Néanmoins, lors de la même
expérience et sur les mêmes échantillons, les courbes de fusion étaient de
plus grande amplitude avec le couple d1/TS1. La limite de détection obtenue
avec d1/TS1, sur une gamme de dilutions réalisée à partir du pool d’ARN
utilisé pour les amorces précédentes, est de 5.10 -5 (>5.10 1 eq DICT 50 ), soit une
sensibilité qui pourrait s’approcher de celle du 1 er tour de la RT-PCR nichée.
2. Elaboration d’un protocole de RT-PCR universelles « Flavivirus, Alphavirus,
Phlébovirus » et de TR-PCR spécifiques
En raison du risque potentiel non négligeable de l’introduction du virus
Chikungunya (CHIKV) en Polynésie française via La Réunion, il a été choisi de
mettre au point la détection de ce virus par RT-PCR RT prioritairement à la mise
au point des RT-PCR universelles.
Le protocole de détection du CHIKV (RT-PCR Taqman sur 3400 DNA synthesizer
d’Applied Biosystems) mis au point et transmis par l’IMTSSA, a servi de base pour
la mise au point des RT-PCR TR (Sybrgreen et Taqman) à l’ILM sur l’iCycler iQ
(Biorad). En l’absence de sérums positifs, un plasmide contenant la région du
CHIKV à amplifier nous a été fourni par l’IMTSSA. Nous avons procédé suivant
différentes étapes :
a- Vérification de la présence dans le plasmide de la séquence à amplifier
b- Transcription de la PCR M13-rM13 en ARN
Utilisation du kit Riboprobe-Combination System-T3/T7 (Promega)
c- RT-PCR CHIK SybrGreen.
• Conclusions et perspectives
Les premiers essais de RT-PCR TR DENV dans le sérum de patients ont permis l’obtention
d’une sensibilité équivalente à celle du 1 er tour de RT-PCR nichée (amorces d1/TS1).
Afin d’augmenter la sensibilité de la technique (suffisamment pour envisager son
utilisation pour le diagnostic), d’autres couples d’amorces vont être testés (Johnson et
al., 2005) en Sybrgreen et Taqman. Les essais de détection du DENV sur lots de
moustiques débuteront une fois que le protocole aura été défini sur sérum.
Les premiers essais de PCR TR Chikungunya, SybrGreen et Taqman, montrent une bonne
qualité du plasmide et un bon fonctionnement des amorces et de la sonde. La RT-PCR
SybrGreen donne une sensibilité limite comprise entre une dilution 10 -7 et 10 -8 de l’ARN
transcrit. Cet ARN pur est en quantité insuffisante pour pouvoir être titré en
spectrophotométrie UV et nous ne connaissons donc pas la sensibilité effective de la
technique. La courbe standard montre un coefficient de corrélation excellent (R 2 >
0.985) mais une efficacité de réaction trop faible (devrait être de 100% + 15%).
Nous devons poursuivre la mise au point de cette technique en :
1. titrant l’ARN transcrit par une technique fluorescente (Quant-iT RiboGreen RNA
Assay)
2. améliorant l’efficacité de la RT-PCR SybrGreen par le test de températures
d’hybridation inférieures à 60°C
3. en testant la RT-PCR Taqman.
Institut Louis Malardé – Rapport annuel 2006 37