Laboratoire de recherche en virologie médicale - Institut Louis ...
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c. Couple DN-F / DN-R: la limite <strong>de</strong> détection obt<strong>en</strong>ue sur une gamme <strong>de</strong><br />
dilutions réalisée à partir d’un pool d’ARN extraits <strong>de</strong> sérums DEN1 (04.12.06)<br />
(++++) est <strong>de</strong> 10 -4 (>10 2 eq DICT 50 ), soit <strong>en</strong> <strong>de</strong>ssous <strong>de</strong> la s<strong>en</strong>sibilité du 1 er tour<br />
<strong>de</strong> la RT-PCR nichée.<br />
d. Couple d1/TS1 et d1/D1-R: les meilleurs résultats, <strong>en</strong> terme <strong>de</strong> s<strong>en</strong>sibilité,<br />
ont été obt<strong>en</strong>us avec ces couples d’amorces. Néanmoins, lors <strong>de</strong> la même<br />
expéri<strong>en</strong>ce et sur les mêmes échantillons, les courbes <strong>de</strong> fusion étai<strong>en</strong>t <strong>de</strong><br />
plus gran<strong>de</strong> amplitu<strong>de</strong> avec le couple d1/TS1. La limite <strong>de</strong> détection obt<strong>en</strong>ue<br />
avec d1/TS1, sur une gamme <strong>de</strong> dilutions réalisée à partir du pool d’ARN<br />
utilisé pour les amorces précé<strong>de</strong>ntes, est <strong>de</strong> 5.10 -5 (>5.10 1 eq DICT 50 ), soit une<br />
s<strong>en</strong>sibilité qui pourrait s’approcher <strong>de</strong> celle du 1 er tour <strong>de</strong> la RT-PCR nichée.<br />
2. Elaboration d’un protocole <strong>de</strong> RT-PCR universelles « Flavivirus, Alphavirus,<br />
Phlébovirus » et <strong>de</strong> TR-PCR spécifiques<br />
En raison du risque pot<strong>en</strong>tiel non négligeable <strong>de</strong> l’introduction du virus<br />
Chikungunya (CHIKV) <strong>en</strong> Polynésie française via La Réunion, il a été choisi <strong>de</strong><br />
mettre au point la détection <strong>de</strong> ce virus par RT-PCR RT prioritairem<strong>en</strong>t à la mise<br />
au point <strong>de</strong>s RT-PCR universelles.<br />
Le protocole <strong>de</strong> détection du CHIKV (RT-PCR Taqman sur 3400 DNA synthesizer<br />
d’Applied Biosystems) mis au point et transmis par l’IMTSSA, a servi <strong>de</strong> base pour<br />
la mise au point <strong>de</strong>s RT-PCR TR (Sybrgre<strong>en</strong> et Taqman) à l’ILM sur l’iCycler iQ<br />
(Biorad). En l’abs<strong>en</strong>ce <strong>de</strong> sérums positifs, un plasmi<strong>de</strong> cont<strong>en</strong>ant la région du<br />
CHIKV à amplifier nous a été fourni par l’IMTSSA. Nous avons procédé suivant<br />
différ<strong>en</strong>tes étapes :<br />
a- Vérification <strong>de</strong> la prés<strong>en</strong>ce dans le plasmi<strong>de</strong> <strong>de</strong> la séqu<strong>en</strong>ce à amplifier<br />
b- Transcription <strong>de</strong> la PCR M13-rM13 <strong>en</strong> ARN<br />
Utilisation du kit Riboprobe-Combination System-T3/T7 (Promega)<br />
c- RT-PCR CHIK SybrGre<strong>en</strong>.<br />
• Conclusions et perspectives<br />
Les premiers essais <strong>de</strong> RT-PCR TR DENV dans le sérum <strong>de</strong> pati<strong>en</strong>ts ont permis l’obt<strong>en</strong>tion<br />
d’une s<strong>en</strong>sibilité équival<strong>en</strong>te à celle du 1 er tour <strong>de</strong> RT-PCR nichée (amorces d1/TS1).<br />
Afin d’augm<strong>en</strong>ter la s<strong>en</strong>sibilité <strong>de</strong> la technique (suffisamm<strong>en</strong>t pour <strong>en</strong>visager son<br />
utilisation pour le diagnostic), d’autres couples d’amorces vont être testés (Johnson et<br />
al., 2005) <strong>en</strong> Sybrgre<strong>en</strong> et Taqman. Les essais <strong>de</strong> détection du DENV sur lots <strong>de</strong><br />
moustiques débuteront une fois que le protocole aura été défini sur sérum.<br />
Les premiers essais <strong>de</strong> PCR TR Chikungunya, SybrGre<strong>en</strong> et Taqman, montr<strong>en</strong>t une bonne<br />
qualité du plasmi<strong>de</strong> et un bon fonctionnem<strong>en</strong>t <strong>de</strong>s amorces et <strong>de</strong> la son<strong>de</strong>. La RT-PCR<br />
SybrGre<strong>en</strong> donne une s<strong>en</strong>sibilité limite comprise <strong>en</strong>tre une dilution 10 -7 et 10 -8 <strong>de</strong> l’ARN<br />
transcrit. Cet ARN pur est <strong>en</strong> quantité insuffisante pour pouvoir être titré <strong>en</strong><br />
spectrophotométrie UV et nous ne connaissons donc pas la s<strong>en</strong>sibilité effective <strong>de</strong> la<br />
technique. La courbe standard montre un coeffici<strong>en</strong>t <strong>de</strong> corrélation excell<strong>en</strong>t (R 2 ><br />
0.985) mais une efficacité <strong>de</strong> réaction trop faible (<strong>de</strong>vrait être <strong>de</strong> 100% + 15%).<br />
Nous <strong>de</strong>vons poursuivre la mise au point <strong>de</strong> cette technique <strong>en</strong> :<br />
1. titrant l’ARN transcrit par une technique fluoresc<strong>en</strong>te (Quant-iT RiboGre<strong>en</strong> RNA<br />
Assay)<br />
2. améliorant l’efficacité <strong>de</strong> la RT-PCR SybrGre<strong>en</strong> par le test <strong>de</strong> températures<br />
d’hybridation inférieures à 60°C<br />
3. <strong>en</strong> testant la RT-PCR Taqman.<br />
<strong>Institut</strong> <strong>Louis</strong> Malardé – Rapport annuel 2006 37