Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

III-2-2 Préparation des échantillons biologiques
III-2-2-1 Le plasma
Les animaux sont sacrifiés par décapitation à la fin de la période de régime. Le sang est
immédiatement collecté dans des tubes plastiques en présence d’héparine (50 U/ ml) ; les
tubes sont agités doucement puis centrifugés 15 min à 200g. Le plasma obtenu est additionné
de butylhydroxytoluène (BHT) 5.10 -5 M avant d’être congelé à -80°C pour analyses
ultérieures.
III-2-2-2 Préparation des thymocytes
Les thymus sont prélevés sous atmosphère stérile puis sont lavés dans une solution de NaCl
0.15M. Ils sont ensuite débarrassés du tissu conjonctif adhérent et homogénéisés dans 20
volumes de NaCl 0.15M à l’aide d’un potter verre-verre (3 allers- retours). Le reste du tissu
conjonctif est éliminé par filtration de la suspension à travers une gaze de nylon.
La séparation des thymocytes se fait par centrifugation sur gradient de densité (Ficoll
Histopaque) pendant 15 min à 600g. L’anneau de cellules collecté à l’interface est lavé une
fois dans du NaCl 0.15M et une fois dans du RPMI 1640 par centrifugation à faible vitesse
(400g pendant 10 min). Les cellules sont comptées sur lame de Thoma. Le test d’exclusion au
bleu trypan montre une viabilité des cellules >95%. Les cellules sont ensuite suspendues à une
concentration de 40.10 6 cellules/ml.
III-2-3 Préparation des complexes acide gras albumine
Pour enrichir in vitro des cellules en culture, les acides gras ne peuvent pas être apportés sous
forme libre au milieu de culture à cause de leur pouvoir détergent vis-à-vis des membranes.
Les acides gras doivent tout d'abord être complexés à une protéine porteuse (l’albumine)
avant d'être mis en contact avec les cellules. Lors de l'incubation avec la protéine chargée, un
échange d’acide gras se fait entre la membrane des cellules et la protéine. Les acides gras
ainsi apportés se trouvent incorporés dans les phospholipides membranaires.
Pour cela, des solutions éthanoliques contenant des quantités variables de l’acide gras à
étudier sont évaporées à sec sous azote. Pour l’étude des effets des acides gras sur la
prolifération des thymocytes, du sérum de veau fœtal est ajouté aux résidus secs pour donner
des rapports acide gras / albumine de 0,5, 1, 1,5, 2 et 3. Les mélanges sont incubés toute la
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