Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

II-2-3 Mesure de l’activité PLD
Les méthodes de dosage de l’activité PLD peuvent être distinguées en fonction de la
méthodologie utilisée pour isoler et quantifier le produit de catalyse. L’activité PLD peut être
déterminée par la mesure du produit lipidique (PA ou phosphatidylalcool) ou du produit
soluble (choline) formé.
L’activité PLD peut être mesurée par dosage de la choline libérée lors de l’activation de
l’enzyme. Cette méthode consiste à marquer la tête polaire de la PC avec de la choline tritiée.
La PLD libère alors la choline tritiée qui peut être dosée dans le milieu réactionnel.
Cependant, dans les cellules intactes, la choline formée est très rapidement phosphorylée en
phosphocholine qui peut provenir aussi d’une activité PLC (Besterman et al., 1986 ; Purkiss et
al., 1991). Inversement, la phosphocholine générée par la PLC peut aussi être métabolisée en
choline sous l’action d’une phosphatase. Cette méthode de dosage n’est donc utilisable
qu’avec des cellules perméabilisées ou des membranes isolées dans lesquelles la choline
libérée dans le milieu réactionnel n’est pas accessible aux kinases intracellulaires. La phase
aqueuse contenant la choline marquée peut être séparée de la phase lipidique selon la méthode
de Bligh et Dyer (1959). La choline radioactive est alors quantifiée
L’activité PLD peut être déterminée aussi par la mesure du produit lipidique. Pour cela, un
acide gras marqué peut être incorporé dans les phospholipides. Différents acides gras sont
couramment utilisés pour marquer les phospholipides : acides oléique, myristique,
arachidonique ou palmitique (Morris et al., 1997a). L’activité PLD est alors déterminée par la
mesure du PA radioactif formé. Cependant, ce type de mesure ne reflète pas toujours de façon
certaine une activité PLD. Le PA peut aussi être produit par phosphorylation du DAG par une
DAG kinase ou résulter de la voie de la biosynthèse des phospholipides. D’autre part, il est
très rapidement métabolisé dans les cellules (Figure 7). La méthode la plus fiable et la plus
utilisée est celle qui consiste à mesurer le phosphatidylalcool marqué produit lors de la
réaction de transphosphatidylation caractéristique de la PLD, comme décrit dans le
paragraphe II-2-2 (Randall et al., 1990 ; Cook et Wakelam, 1992). Il est extrait dans la phase
organique et séparé des autres phospholipides par chromatographie sur couche mince ou par
HPLC.
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