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PLD1a PLD1b 750 pb 500 pb PLD2 Thymo Thymo MT Figure 33 : Caractérisation de l’expression des ARNm de PLD dans les thymocytes de rat Les ARNm extraits des thymocytes de rat sont soumis à une transcription inverse. Les ADNc ainsi obtenus ont été amplifiés par PCR avec des couples d’amorces spécifiques de PLD1 et PLD2. Abréviations : Thymo : thymocytes ; MT : marqueurs de taille. Comme le montre la Figure 33, les thymocytes de rat expriment les deux isoformes de PLD : PLD1 et PLD2. Pour PLD1, les deux variants d’épissage PLD1a et PLD1b sont exprimés. En plus, des expériences de western-blotting réalisées sur des homogénats cellulaires des thymocytes de rat montrent clairement la présence des protéines PLD1 et PLD2 dans les cellules (Figure 34). 177 KDa 120 KDa PLD1 177 KDa 120 KDa 80 KDa 80 KDa PLD2 MT Thymo MT Thymo Figure 34 : Expression des protéines PLD1 et PLD2 dans les thymocytes de rat. Le lysat thymocytaire a été déposé et soumis à une électrophorèse en SDS-PAGE (8% d'acrylamide en présence d'urée 4M). Les gels ont été révélés et analysés comme décrit dans la partie Matériels et Méthodes. Abréviations : Thymo : thymocytes ; MT : marqueurs de taille. 122
L’ensemble des résultats concernant la caractérisation de la PLD indique qu’aussi bien PLD1a, PLD1b et PLD2 sont présentes dans les thymocytes de rat. En revanche, ces cellules semblent être dépourvues d’activité PLD oléate sensible. IV-1-2-2 Effet des acides gras «in vitro» sur l’activité PLD Afin de déterminer l’effet des acides gras sur l’activité PLD, les thymocytes sont tout d’abord préincubés pendant 2h avec les différents acides gras complexés à de l’albumine humaine délipidée (rapports acide gras-albumine de 1 et 3 correspondant à des concentrations en acides gras de 5 et 15µM, respectivement). A la fin de l’incubation, une aliquote est prélevée afin de déterminer le degré d’enrichissement en acides gras des phospholipides par chromatographie en phase gazeuse. Les phospholipides représentent la classe lipidique majoritaire dans les membranes cellulaires, c’est pourquoi nous avons étudié les modifications de leur composition en fonction des différents enrichissements réalisés. Une incubation de 2h est suffisante pour modifier de façon significative la composition des phospholipides en acides gras (Tableau XV a, b et c). L’incubation des thymocytes avec un acide gras donné, sauf pour les acides stéarique et oléique, augmente sa proportion dans les phospholipides des cellules. On remarque par ailleurs que le 20:5n-3 est l’acide gras le mieux incorporé comparativement aux autres acides gras, l’incorporation de l’acide oléique et stéarique étant la moins efficace. L’enrichissement se fait d’une manière dose-dépendante. Ainsi, pour le rapport acide gras : albumine=1, la quantité de 18:2n-6 augmente de 1,3 fois par rapport au contrôle; celle du 20:5n-3 augmente de plus de 18 fois. Pour le 22:6n-3, l’augmentation est de 1,5 fois et pour le 14:0 l’augmentation est de 1,7 fois. Au rapport 3, les augmentations sont de 1,4 fois pour le 18:2n-6, plus de 36 fois pour le 20:5n-3, 2,5 fois pour le 22:6n-3 et 4,6 fois pour le 14:0. Concernant les effets des acides gras sur l’activité PLD (Figure 36), les résultats montrent d’une part que le 22:6n-3, le 18:2n-6 et le 14:0 augmentent significativement l’activité PLD basale et stimulée (P=0,0001, 0,0002 et 0,027 respectivement). L’effet activateur du 18:1n-9 n’est pas statiquement significatif probablement en raison de sa faible incorporation dans les phospholipides. Le 18:0 et le 20:5n-3 n’ont pas d’effet sur l’activité PLD. Il est à noter que le 20:5n-3 ne modifie pas l’activité PLD des thymocytes de rat malgré son incorporation efficace dans les phospholipides des thymocytes. 123
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GOUTTE R. (Prof. émérite) CREATIS
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SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDO
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Dédicace Je dédie ce travail A me
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