Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...
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III-2-10-4 Electrophorèse sur gel d'agarose des ADN Les fragments d'ADN amplifiés par PCR sont ensuite analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%. Le gel est préparé extemporanément en diluant 1g d'agarose dans 50ml de tampon TBE (Tris-Borate 90mM, pH8, EDTA 1mM). La solution est portée à ébullition, puis refroidie avant ajout de 5µl d'une solution de bromure d'éthidium (BET) 10 mg/ml. La solution encore tiède est coulée dans la cuve de migration horizontale et après refroidissement, le gel polymérise. Il est ensuite immergé dans le tampon de migration. Les échantillons préparés dans une solution de dépôt (0,05% de bleu de bromophénol, 0,05% de xylène cyanol et 6% de glycérol) sont déposés dans les puits du gel d’agarose. La migration se fait de la cathode vers l’anode sous tension constante d’environ 100 volts, et en présence de marqueurs de taille. Les fragments d’ADN ayant fixé du bromure d’éthidium (BET) sont visualisés sous lumière UV et le gel est photographié à l'aide d'une caméra CCD (ImageMaster VDS-CL, Amersham Biotech). III-2-11 Analyses statistiques des résultats Les résultats sont la moyenne ± SEM de n expériences indépendantes. Ils ont été analysés par ANOVA (Statview II, Macintoch) et comparés par un test de t protégé. Les variations sont considérées comme significatives si la valeur de P est inférieure ou égale à 0,05. Pour les expériences relatives à l’effet des acides gras sur l’activité PLD thymocytaire in vitro et pour les essais visant à déterminer l’influence du sérum sur la réponse proliférative, les résultats sont soumis à une analyse de variance à deux entrées. La valeur de F est donnée dans les légendes de la figure et du tableau correspondants. Une différence est considérée comme significative lorsque P≤0,05. 114
IV- RESULTATS IV-1 Effet des acides gras «in vitro» sur les fonctions immunes De nombreux travaux effectués in vitro ont permis de mettre en évidence un effet immunosuppresseur des acides gras ajoutés au milieu de culture des lymphocytes avant stimulation par un mitogène. Tsang (1977) fut le premier à décrire l’effet immunosuppresseur de l’acide linoléique. Depuis cette date, de nombreux travaux ont montré que les acides gras polyinsaturés inhibaient in vitro les fonctions des lymphocytes murins et humains (Calder et al., 1992 ; Calder et Newsholme, 1992; Verlengia et al., 2003 ; Verlengia et al., 2004). Des résultats contradictoires ont été obtenus concernant l’influence des acides gras sur la réponse proliférative des lymphocytes in vitro. En règle générale, les études décrivant une stimulation de la réponse proliférative ont utilisé de faibles doses (Kelley et Parker, 1979) alors que celles, beaucoup plus nombreuses, qui rapportent un effet inhibiteur ont été réalisées avec des concentrations en acides gras plus élevées (Calder et al., 1991 ; Brouard et Pascaud, 1993). Les acides gras les plus inhibiteurs sont généralement ceux de la famille n-3 alors que les acides gras saturés sont peu ou pas actifs. Dans cette première partie de nos travaux, nous nous sommes intéressés aux effets des acides gras sur la réponse proliférative de thymocytes de rat à une lectine mitogénique, la Concanavaline A. Nous avons comparé les effets des deux acides gras majeurs de l’huile d’argan, l’acide oléique (18:1n-9) et l’acide linoléique (18:2n-6) à ceux des acides gras polyinsaturés n-3 présents dans les huiles de poisson, les acides eicosapentaénoique (20:5n-3) et docosahexaénoique (22:6n-3). Les effets de trois acides gras saturés, les acides myristique (14 :0), palmitique (16:0) et stéarique (18:0), présents dans l’huile de noix de coco, ont également été étudiés à titre de comparaison. IV-1-1 Effet des acides gras « in vitro » sur la réponse proliférative des thymocytes de rat. Nous avons tout d’abord déterminé la concentration optimale de ConA à utiliser pour obtenir une prolifération maximale des thymocytes de rat. Pour cela, des concentrations croissantes de ConA ont été ajoutées dans le milieu de culture et la prolifération a ensuite été évaluée par un test colorimétrique comme décrit dans Matériels et méthodes. Les résultats ont montré que 115
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IV- RESULTATS<br />
IV-1 Eff<strong>et</strong> <strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s gras «in vitro» sur les fonctions immunes<br />
De nombreux travaux effectués in vitro ont permis <strong>de</strong> m<strong>et</strong>tre en évi<strong>de</strong>nce un eff<strong>et</strong><br />
immunosuppresseur <strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s gras ajoutés au milieu <strong>de</strong> culture <strong>de</strong>s lymphocytes avant<br />
stimulation par un mitogène. Tsang (1977) fut le premier à décrire l’eff<strong>et</strong> immunosuppresseur<br />
<strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> linoléique. Depuis c<strong>et</strong>te date, <strong>de</strong> nombreux travaux ont montré que les aci<strong>de</strong>s gras<br />
polyinsaturés inhibaient in vitro les fonctions <strong>de</strong>s lymphocytes murins <strong>et</strong> humains (Cal<strong>de</strong>r <strong>et</strong><br />
al., 1992 ; Cal<strong>de</strong>r <strong>et</strong> Newsholme, 1992; Verlengia <strong>et</strong> al., 2003 ; Verlengia <strong>et</strong> al., 2004). Des<br />
résultats contradictoires ont été obtenus concernant l’influence <strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s gras sur la réponse<br />
proliférative <strong>de</strong>s lymphocytes in vitro. En règle générale, les étu<strong>de</strong>s décrivant une stimulation<br />
<strong>de</strong> la réponse proliférative ont utilisé <strong>de</strong> faibles doses (Kelley <strong>et</strong> Parker, 1979) alors que<br />
celles, beaucoup plus nombreuses, qui rapportent un eff<strong>et</strong> inhibiteur ont été réalisées avec <strong>de</strong>s<br />
concentrations en aci<strong>de</strong>s gras plus élevées (Cal<strong>de</strong>r <strong>et</strong> al., 1991 ; Brouard <strong>et</strong> Pascaud, 1993).<br />
Les aci<strong>de</strong>s gras les plus inhibiteurs sont généralement ceux <strong>de</strong> la famille n-3 alors que les<br />
aci<strong>de</strong>s gras saturés sont peu ou pas actifs.<br />
Dans c<strong>et</strong>te première partie <strong>de</strong> nos travaux, nous nous sommes intéressés aux eff<strong>et</strong>s <strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s<br />
gras sur la réponse proliférative <strong>de</strong> thymocytes <strong>de</strong> rat à une lectine mitogénique, la<br />
Concanavaline A. Nous avons comparé les eff<strong>et</strong>s <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux aci<strong>de</strong>s gras majeurs <strong>de</strong> l’huile<br />
d’argan, l’aci<strong>de</strong> oléique (18:1n-9) <strong>et</strong> l’aci<strong>de</strong> linoléique (18:2n-6) à ceux <strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s gras<br />
polyinsaturés n-3 présents dans les huiles <strong>de</strong> poisson, les aci<strong>de</strong>s eicosapentaénoique (20:5n-3)<br />
<strong>et</strong> docosahexaénoique (22:6n-3). Les eff<strong>et</strong>s <strong>de</strong> trois aci<strong>de</strong>s gras saturés, les aci<strong>de</strong>s myristique<br />
(14 :0), palmitique (16:0) <strong>et</strong> stéarique (18:0), présents dans l’huile <strong>de</strong> noix <strong>de</strong> coco, ont<br />
également été étudiés à titre <strong>de</strong> comparaison.<br />
IV-1-1 Eff<strong>et</strong> <strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s gras « in vitro » sur la réponse proliférative <strong>de</strong>s<br />
thymocytes <strong>de</strong> rat.<br />
Nous avons tout d’abord déterminé la concentration optimale <strong>de</strong> ConA à utiliser pour obtenir<br />
une prolifération maximale <strong>de</strong>s thymocytes <strong>de</strong> rat. Pour cela, <strong>de</strong>s concentrations croissantes<br />
<strong>de</strong> ConA ont été ajoutées dans le milieu <strong>de</strong> culture <strong>et</strong> la prolifération a ensuite été évaluée par<br />
un test colorimétrique comme décrit dans Matériels <strong>et</strong> métho<strong>de</strong>s. Les résultats ont montré que<br />
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