Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

dissociation complète des complexes nucléoprotéiques. Ensuite, on ajoute 0,2ml de
chloroforme et on agite vigoureusement pendant 15 sec. Les échantillons sont laissés 15 min à
température ambiante puis centrifugés à 12000g pendant 15 min à 4°C. Le mélange se sépare
alors en une phase organique rouge contenant les protéines, une interphase contenant l’ADN
et une phase aqueuse incolore contenant l'ARN. La phase aqueuse est transférée dans un autre
tube auquel on ajoute 0,5ml d'isopropanol. Le mélange est incubé 10 min à température
ambiante, centrifugé ensuite à 12000g pendant 10 min à 4°C. L'ARN précipité forme un culot
au fond du tube. Le surnageant est éliminé et le culot est lavé par 1ml d'éthanol 75%.
L'échantillon est de nouveau centrifugé à 7500g ; le surnageant est éliminé et le culot est
séché à l'air, avant d'être repris dans un volume minimum d'eau stérile. La quantification des
ARN est réalisée par lecture spectrophotométrique à la longueur d'onde de 260nm. Les ARN
sont ensuite conservés à -80°C.
III-2-10-2 Transcription inverse (RT)
A partir des ARN préparés comme décrit ci-dessus, l'ADN complémentaire est transcrit à
l'aide de la transcriptase inverse M-MLV (PROMEGA). La réaction se déroule en deux
étapes. La première est la dénaturation des ARN en présence des amorces oligo (dT). Dans un
volume final de 16,5µl, 5µg d'ARN totaux sont incubés en présence de 500µM de dNTP,
3,5µM d’oligo (dT), pendant 10 min à 70°C. Les tubes sont ensuite placés dans la glace avant
la deuxième étape de transcription. Dans le milieu de réaction sont alors ajoutés le tampon
concentré 10X (concentration finale: Tris-HCl 50mM, pH 8,3, 40mM KCl, 8mM, MgCl 2 ,
1mM DTT), l'inhibiteur d'ARNase (1U/µl) ainsi que la transcriptase inverse (1U/µl). Le tout
est incubé 15 min à 25°C, puis 50 min à 42°C pour permettre la synthèse d’ADNc et enfin 15
min à 70°C pour dénaturer les complexes ARN/ADNc.
III-2-10-3 Réaction en chaîne de la polymérase (PCR)
L'ADNc ainsi synthétisé sert de matrice à l'amplification des transcrits de PLD1, PLD2 et β-
actine par «Polymerase Chain Reaction» (PCR). Les amorces spécifiques pour l’amplification
des transcrits de PLD1a et 1b, PLD2 et de la β-actine, sens et antisens, sont présentés dans le
Tableau XIII.
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