Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

vortexé avant d'être coulé. Après polymérisation, on prépare un gel de concentration en
mélangeant dans un tube 2,5ml d'urée, 0,9ml d’eau, 0,83ml d'un mélange d'acrylamide à 30%,
0,63ml de Tris 1M pH6,8, 0,05ml de SDS 10%, 0,05ml d'ammonium persulfate 10% et
0,005ml de TEMED. Le gel de concentration est coulé au-dessus du gel de séparation. Après
polymérisation, les gels sont placés dans la cuve de migration du système. Les échantillons
préparés comme décrit précédemment sont déposés. La migration électrophorétique s’effectue
à 120V, à voltage constant. La migration peut être suivie grâce au dépôt de marqueurs
moléculaires précolorés dans un puits de référence. Les masses moléculaires des protéines
étudiées sont déterminées en référence à ces marqueurs moléculaires. L’électrotransfert sur
membrane Immobilon Millipore est ensuite réalisé dans un appareil de transfert semi-sec
Semi-Phor (Hoeffer Scientific Instruments). Le transfert se fait dans un système de «
sandwich » imbibé de tampon de transfert (25mM de TrisHCl, pH=8,3, 0,19 M de glycine,
20% de méthanol) par un courant électrique de 40 mA pendant 1h30. Le transfert effectué, les
marqueurs de masse moléculaire sont également transférés et peuvent servir de contrôle. La
membrane est rincée par un tampon salin TBS-T puis saturée avec du lait écrémé à 10%
pendant 2 heures à température ambiante. La membrane est ensuite rincée trois fois par du
TBS-T durant 10 min, puis incubée à 4°C pendant toute la nuit avec l'anticorps primaire anti-
PLD1 ou anti-PLD2 (dilution 1/2000). L’anticorps anti-PLD1 est dirigé contre les résidus 1-
16, 144-162, 967-981, et 1027-1040 de la protéine tandis que l’anticorps anti-PLD2 est dirigé
contre une séquence d’acides aminés située en N-terminal (résidus 13-33). La membrane est
rincée 7 fois par du TBS-T puis incubée avec un anticorps secondaire anti-IgG de lapin,
couplé à la peroxydase (dilution 1/5000). La membrane est soumise à une dernière série de
lavages avant révélation spécifique des protéines par chimiluminescence (kit ECL
Amersham). Pour la normalisation, les membranes ont été strippées (décapées de leurs
anticorps) et ré-incubées avec l’anticorps monoclonal anti-tubiline-α dilué au 1/2000 dans du
TBS-T ; BSA 0,01% puis avec l’anticorps secondaire anti-IgG de souris dilué au 1/10000.
III-2-10 Transcription inverse et Réaction en chaîne de la polymérase
III-2-10-1 Préparation des ARN
Les ARN totaux des thymocytes sont extraits à l'aide du kit d'extraction Tri Reagent
(SIGMA). Les thymocytes (40.10 6 cellules) sont culottés à 500g à 4°C. Le culot est repris
dans 1ml de réactif Tri Reagent et les cellules sont homogénéisées par passage dans une
seringue. Les homogénats obtenus sont laissés 5 min à température ambiante pour assurer une
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