Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

1h jusqu’à élution complète des dépôts colorés. La densité optique est lue au
spectrophotomètre à une longueur d’onde de 630 nm. La quantification est réalisée par
comparaison à une gamme étalon d’albumine sérique bovine traitée dans les mêmes
conditions.
III-2-9 Electrophorèse en SDS-PAGE et "Western-blotting" :
III-2-9-1 Préparation des échantillon :
Les thymocytes sont homogénéisés dans un tampon de lyse (Tris 25mM, NaCl 50mM, EDTA
5mM) contenant un mélange d’inhibiteurs de protéases (Inhibitor coktail) dilué au 1/4. Les
homogénats cellulaires sont ensuite centrifugés (900g pendant 10 min.) et le surnageant post
nucléaire est récupéré. Le dosage de protéines se fait selon la méthode de Bradford (1976)
pour les surnageants post-nucléaires, et selon la méthode de Schaffner Weissman pour les
fractions de gradient
III-2-9-2 Précipitation des protéines par l’acétone à froid :
Dans un bain de glace, on ajoute du CaCl 2 afin de faire chuter la température a -25°C.
Lorsque la température est stabilisée, on place dans un tube 1,5 volume d'acétone sur lequel
on dépose 1 volume de l'homogénat à précipiter. Le tout est immédiatement vortexé
vigoureusement, puis replacé à -25°C dans la glace pendant 30 min. Le mélange est de
nouveau vortexé puis centrifugé à 15000g durant 15 min à 4°C. Le surnageant est éliminé et
le culot est séché à l'air pendant 5 min. Il est repris dans un volume minimum de tampon
Laemmli (Tris 125mM, pH=6,8, Saccharose 10%, SDS 2%, mercaptoethanol 1% et bleu de
bromophénol 0,05%) contenant de l'urée 4M et de l'EDTA 2,5M. Le tout est vortexé
vigoureusement et soniqué dans un bain à ultrasons (maximum de la puissance de l'appareil),
jusqu'à dissolution totale du culot. Les échantillons sont ensuite portés à 100°C pendant 1 min
puis conservés à -20°C avant électrophorèse.
II-2-9-3 Electrophorèse en SDS-PAGE :
L’électrophorèse est réalisée sur un gel à 8% de polyacrylamide en présence de 0,1% de SDS
et d’urée (environ 4M final) grâce à un appareil pour électrophorèse pour minigels Biorad.
Brièvement, pour deux mini gels, on prépare le gel de séparation en mélangeant dans un tube
6.9ml d'urée 8M, 4ml d'un mélange d'acrylamide à 30%, 3,8ml de Tris 1,5M pH8,8, 0,15ml
de SDS 10%, 0,15ml d'ammonium persulfate 10% et 0,009ml de TEMED. Le mélange est
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