Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

éalisée dans les mêmes conditions.
III-2-8-4 Dosage des phospholipides
Les phospholipides de chaque fraction sont dosés d’après la méthode Stewart (1980). Cette
méthode utilise une détection colorimétrique des phospholipides complexés avec le
ferrothiocyanate d’ammonium. Les phospholipides totaux présents dans un aliquot de chaque
fraction sont extraits selon Bligh et Dyer (1959). Les phases organiques sont récupérées et
évaporées sous jet d’azote. Chaque résidu sec est repris dans 2ml de chloroforme et 2ml de
ferrothiocyanate puis vortexé vigoureusement. La densité optique des phases chloroformiques
est lue à 488 nm dans un spectrophotomètre Uvikon 932. La quantification se fait par rapport
à une gamme étalon de phosphatidylcholine traitée dans les mêmes conditions.
III-2-8-5 Dosage des protéines
III-2-8-5-1 Dosage des protéines par la méthode de Bradford (1976)
Ce dosage est basé sur le changement de coloration du bleu de Commassie en présence de
concentrations variables de protéines. Une fraction de la solution à doser est prélevée et
complétée à 50µl avec de l’eau ou le tampon constituant la solution à doser. On ajoute 200µl
de la solution (BioRad protein assay) diluée 5 fois dans l’eau. Après agitation, la densité
optique est lue à 595 nm dans un lecteur spectrophotométrique de plaques multipuits (Power
Wave X, BIOTECK INSTRUMENTS). La concentration est déterminée par comparaison à
une gamme étalon d’albumine sérique bovine (1-20µg de protéines) réalisée dans les mêmes
conditions.
III-2-8-5-2 Dosage des protéines par la méthode Schaffner–Weissmann (1973)
Ce dosage est utilisé lorsque la solution protéique à doser contient des éléments (sels,
détergents…) pouvant interférer avec le dosage par la méthode de Bradford. Cette technique
consiste à précipiter les protéines des échantillons par l’acide trichloroacétique (TCA) 60% en
présence de 0,1 % de SDS. Les échantillons sont ensuite filtrés sur une membrane millipore
préalablement imprégnée d’une solution de TCA 6%. Les dépôts sont séchés par aspiration
sous vide (Büchner), puis les membranes sont colorées dans une solution d’Amido-Shwarz
0,01% dans un mélange méthanol/ eau/ acide acétique (90/ 8/ 2 ; v/ v/v) pendant 15 min.
Après séchage des membranes, les zones des dépôts sont découpées et placées dans des tubes
contenant 500µl d’une solution éluante (NaOH 25mM, EDTA 50mM, éthanol 50%) pendant
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