Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

Pour la mise en évidence du ganglioside GM1 : les membranes saturées sont incubées
pendant 1h30 à température ambiante dans une solution de toxine cholérique (sous unité B)
liée à la peroxydase de raifort dans un tampon TBS-T (Tris-HCl 20mM, NaCl 137mM,
pH=7.6, Tween 20 à 0.1%) contenant 1% de BSA. Elles sont ensuite rincées sept fois pendant
10 min dans un tampon TBS-T puis révélées par chimiluminescence (kit ECL, Amersham).
Pour la mise en évidence du PIP2 : les membranes saturées sont incubées avec l’anticorps
anti-PIP2 (Assay Designs, Euromedex) dilué au 1/500 ème dans le TBS-T toute la nuit à 4°C,
puis lavées sept fois dans du TBS-T. Elles sont ensuite incubées avec l’anticorps secondaire
anti-souris conjugué à la peroxydase (dilué au 1/10000 ème dans le TBS-T contenant 1% de
BSA) durant 1h30. Les membranes sont lavées sept fois 10 min avec du TBS-T puis révélées
par chimiluminescence (kit ECL, Amersham).
Les luminogrammes sont analysés par un système de caméra CCD (Image MasterVDS-CL,
Amersham Biotech) et quantifiés par le logiciel Image Quant (Amersham biosciences).
III-2-8-3 Dosage du cholestérol
Le dosage du cholestérol est réalisé à l’aide du kit de dosage enzymatique Sigma Diagnostics,
dont le protocole a été adapté pour permettre la réalisation du dosage en microplaques 96
puits. Les réactions enzymatiques impliquées dans cette réaction sont les suivantes :
Cholestérol oxydase
Cholestérol + O 2 Cholestérol 4-en-3-one + H 2 O 2 .
2 H 2 O 2 + Amino-4-antipyrine +p-hydroxybenzènesulfonate
Peroxydase
Quinonéimine colorée + 4H 2 O.
50µl de chaque fraction du gradient sont ajoutés à 200µl du mélange enzymatique commercial
et sont incubés 30 min à 37°C sous agitation, dans une microplaque 96 puits. La densité
optique est lue à 500 nm dans un lecteur de plaque Power-Wave X (Bio-Tek Instruments). La
quantification du cholestérol est réalisée par rapport à une gamme étalon de cholestérol
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