Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

croissantes (0.2M à 0.9M), puis l’homogénat est déposé au fond du tube (tubes SW41,
Beckman) (Figure 26). L’ultracentrifugation est réalisée à 200000g pendant 16h à 4°C dans
un rotor à godets oscillants (type SW41, Kontron). A la fin de l’ultracentrifugation, des
fractions de 1ml sont collectées du fond au sommet du tube (fraction 1 à 11) et sont stockées à
-20°C pour des analyses ultérieures. La mesure du pourcentage de saccharose dans chaque
fraction est réalisée sur un aliquote de 10µl à l’aide d’un réfractomètre portable (Brix),
immédiatement après collecte des fractions.
Fraction
11
10
9
8
7
6
5
4
Molarité
0.2 M
0.3 M
0.4 M
0.5 M
0.6 M
0.7 M
0.8 M
0.9 M
3
2
1
1.33 M
Figure 26 : Gradient de saccharose
III-2-8-2 Dosage du ganglioside GM1 et du PIP2 dans les fractions des gradients
La quantification du GM1 et du PIP2 se fait par dot blotting. 20µl de chaque fraction sont
déposés sur une membrane immobilon (Millipore) par aspiration sous vide à l’aide d’un
appareil hybri-dot relié à une trompe à eau. Les membranes sont ensuite rincées par de l’eau
déminéralisée pendant 1 min afin d’éliminer l’excès de saccharose, puis saturées dans une
solution d’albumine sérique bovine (BSA) 5% dans un tapon TBS-T (Tris-HCl 20mM, NaCl
137mM, pH 7.6, Tween 20 à 0.1%) pendant 2h à température ambiante. Elles sont ensuite
rincées trois fois dans du tampon TBS-T.
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