Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...
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III-2-7 Analyse <strong>de</strong> la composition en aci<strong>de</strong>s gras <strong>de</strong>s phospholipi<strong>de</strong>s totaux <strong>de</strong><br />
thymocytes <strong>et</strong> <strong>de</strong>s triglycéri<strong>de</strong>s <strong>et</strong> phospholipi<strong>de</strong>s plasmatiques par<br />
chromatographie en phase gazeuse (CPG)<br />
120.10 6 thymocytes isolés à partir <strong>de</strong>s rats qui ont suivi les régimes ou enrichis in vitro, ou<br />
1ml <strong>de</strong> plasma préparé selon le protocole décrit au paragraphe (II-2-2) sont extraits selon la<br />
métho<strong>de</strong> <strong>de</strong> Bligh <strong>et</strong> Dyer (1959) par le mélange chloroforme/méthanol (1/2 ; v/v) en présence<br />
<strong>de</strong> BHT (5.10 -5 M). Après agitation <strong>et</strong> 30 min <strong>de</strong> repos, un mélange <strong>de</strong> NaCl/chloroforme<br />
(1/1 ; v/v) est ajouté. La phase chloroformique est récupérée <strong>et</strong> évaporée sous j<strong>et</strong> d’azote ; une<br />
<strong>de</strong>uxième extraction est effectuée <strong>et</strong> les phases organiques obtenues sont réunies puis<br />
évaporées à sec <strong>et</strong> conservées sous azote a -20°C.<br />
Les extraits secs sont repris dans un faible volume du mélange méthanol/chloroforme (1/2 ;<br />
v/v) <strong>et</strong> déposés sur plaques <strong>de</strong> silice G60 préalablement lavées au méthanol <strong>et</strong> séchées sous la<br />
hotte. La séparation <strong>de</strong>s lipi<strong>de</strong>s est effectuée par migration dans le système <strong>de</strong> solvants :<br />
hexane/ éther/ aci<strong>de</strong> acétique (70/30/1 ; v/v/v). Les phospholipi<strong>de</strong>s très polaires restent à<br />
l’origine (Rf=0) alors que les triglycéri<strong>de</strong>s migrent plus haut. Après la séparation, les ban<strong>de</strong>s<br />
<strong>de</strong> silice correspondant aux phospholipi<strong>de</strong>s <strong>de</strong>s thymocytes <strong>et</strong> du plasma <strong>et</strong> aux triglycéri<strong>de</strong>s<br />
du plasma sont grattées <strong>et</strong> récupérées dans <strong>de</strong>s tubes en verre à vis. Les aci<strong>de</strong>s gras sont<br />
transméthylés en présence <strong>de</strong> 5% d’aci<strong>de</strong> sulfurique dans du méthanol à 100°C dans un bain<br />
<strong>de</strong> sable pendant 90 min. La réaction est arrêtée en plongeant les tubes dans la glace <strong>et</strong> en<br />
ajoutant 1.5ml <strong>de</strong> carbonate <strong>de</strong> potassium (K 2 CO 3 ) afin <strong>de</strong> neutraliser le milieu. Les esters<br />
méthyliques d’aci<strong>de</strong>s gras ainsi obtenus sont extraits par 2ml d’isooctane. Les phases<br />
organiques sont récupérées puis évaporées à sec sous j<strong>et</strong> d’azote.<br />
Les extraits sont repris dans un volume d’isooctane puis analysés par chromatographie<br />
gazeuse à l’ai<strong>de</strong> d’une colonne capillaire polaire en silice fondue (Supelco). Les esters<br />
méthyliques d’aci<strong>de</strong>s gras injectés dans la colonne sont entraînés par le gaz vecteur (Hélium).<br />
Le programme <strong>de</strong> température du four dans lequel se trouve la colonne est le suivant : la<br />
température initiale est <strong>de</strong> 57°C (2 min.) puis augmente à 150°C à raison <strong>de</strong> 20°C/min (≈5<br />
min.) ; elle augmente ensuite jusqu’à 215°C à raison <strong>de</strong> 1.50°C/min. (43.4 min.) <strong>et</strong> enfin<br />
jusqu’à 250°C à raison <strong>de</strong> 10°C/min. (≈4 min.). Les produits sont volatilisés dans l’injecteur à<br />
230°C <strong>et</strong> sont détectés en sortie <strong>de</strong> colonne par un détecteur à ionisation <strong>de</strong> flamme (DIF)<br />
dont la température est <strong>de</strong> 250°C.<br />
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