Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

III-2-7 Analyse de la composition en acides gras des phospholipides totaux de
thymocytes et des triglycérides et phospholipides plasmatiques par
chromatographie en phase gazeuse (CPG)
120.10 6 thymocytes isolés à partir des rats qui ont suivi les régimes ou enrichis in vitro, ou
1ml de plasma préparé selon le protocole décrit au paragraphe (II-2-2) sont extraits selon la
méthode de Bligh et Dyer (1959) par le mélange chloroforme/méthanol (1/2 ; v/v) en présence
de BHT (5.10 -5 M). Après agitation et 30 min de repos, un mélange de NaCl/chloroforme
(1/1 ; v/v) est ajouté. La phase chloroformique est récupérée et évaporée sous jet d’azote ; une
deuxième extraction est effectuée et les phases organiques obtenues sont réunies puis
évaporées à sec et conservées sous azote a -20°C.
Les extraits secs sont repris dans un faible volume du mélange méthanol/chloroforme (1/2 ;
v/v) et déposés sur plaques de silice G60 préalablement lavées au méthanol et séchées sous la
hotte. La séparation des lipides est effectuée par migration dans le système de solvants :
hexane/ éther/ acide acétique (70/30/1 ; v/v/v). Les phospholipides très polaires restent à
l’origine (Rf=0) alors que les triglycérides migrent plus haut. Après la séparation, les bandes
de silice correspondant aux phospholipides des thymocytes et du plasma et aux triglycérides
du plasma sont grattées et récupérées dans des tubes en verre à vis. Les acides gras sont
transméthylés en présence de 5% d’acide sulfurique dans du méthanol à 100°C dans un bain
de sable pendant 90 min. La réaction est arrêtée en plongeant les tubes dans la glace et en
ajoutant 1.5ml de carbonate de potassium (K 2 CO 3 ) afin de neutraliser le milieu. Les esters
méthyliques d’acides gras ainsi obtenus sont extraits par 2ml d’isooctane. Les phases
organiques sont récupérées puis évaporées à sec sous jet d’azote.
Les extraits sont repris dans un volume d’isooctane puis analysés par chromatographie
gazeuse à l’aide d’une colonne capillaire polaire en silice fondue (Supelco). Les esters
méthyliques d’acides gras injectés dans la colonne sont entraînés par le gaz vecteur (Hélium).
Le programme de température du four dans lequel se trouve la colonne est le suivant : la
température initiale est de 57°C (2 min.) puis augmente à 150°C à raison de 20°C/min (≈5
min.) ; elle augmente ensuite jusqu’à 215°C à raison de 1.50°C/min. (43.4 min.) et enfin
jusqu’à 250°C à raison de 10°C/min. (≈4 min.). Les produits sont volatilisés dans l’injecteur à
230°C et sont détectés en sortie de colonne par un détecteur à ionisation de flamme (DIF)
dont la température est de 250°C.
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