Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

III-2-5 Dosage de l’activité PLD des cellules intactes
III-2-5-1 Marquage des cellules avec de l’acide arachidonique tritié
La suspension cellulaire est incubée avec une dose traceuse d’acide arachidonique tritié
(1.25µCi/ml) pendant 1h à 37°C, sous agitation. A la fin de la période d’incubation, les
cellules sont lavées deux fois dans du RPMI afin d’éliminer la radioactivité non incorporée.
Le rendement moyen d’incorporation est de 60%. Les cellules marquées sont suspendues à la
concentration de 40.10 6 cellules /ml dans du RPMI.
Dans l’étude concernant l’effet des acides gras sur l’activité PLD in vitro, les cellules
marquées sont suspendues à la concentration de 40.10 6 cellules /ml dans du RPMI contenant
les différents complexes acide gras /albumine aux concentrations de 5µM et 15µM pendant 2h
à 37°C. Les cellules témoins sont incubées pendant le même temps en présence de HSA 5µM
seule. A la fin de l’enrichissement, une fraction aliquote de chaque essai est conservée pour
l’analyse de la composition en acides gras des phospholipides des thymocytes par
chromatographie en phase gazeuse (CPG).
III-2-5-2 Activation mitogénique des thymocytes
Les cellules sont incubées pendant 20 min. à 37°C en présence ou en absence de butanol-1
(1%) et pendant 5 min. en présence ou en absence de ConA (1µg/10 6 cellules). L’arrêt de la
réaction se fait par refroidissement et addition de 3ml d’éthanol.
III-2-5-3 Extraction lipidique
Les lipides sont extraits selon la technique de Boukchache et Lagarde (1982) à l’aide d’un
mélange éthanol/chloroforme (3/6, v/v) contenant du BHT à la concentration finale de 5.10 5
M, en milieu acide (pH=3). De l’acide phosphatidique (PA) marqué au [ 14 C], utilisé comme
standard interne de rendement, et du phosphatidylbutanol (Pbut) non marqué, utilisé comme
entraîneur, sont ajoutés dans chaque tube. Le mélange est mis à décanter pendant une nuit à
4°C. Les phases organiques sont évaporées et les résidus secs sont congelés pendant une nuit
à -20°C.
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