Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

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nuit sous agitation à 37°C. Une solution témoin de sérum de veau fœtal est incubée dans les mêmes conditions sans acide gras. Pour l’étude des effets des acides gras sur l’activité PLD des thymocytes in vitro, une solution de sérum albumine humaine (HSA) delipidée est préparée à la concentration de 5µM dans du RPMI 1640 et est ajoutée aux résidus secs pour donner des concentrations finales en acide gras de 5µM et 15µM, et un rapport acide gras / albumine égal à 1 et 3 respectivement. Les solutions sont incubées à 37°C pendant 4h sous agitation. Une solution témoin d’HSA 5µM est incubée dans les mêmes conditions. III-2-4 Test de prolifération Les thymocytes sont suspendus à la concentration de 5.10 6 cellules/ml dans un milieu RPMI contenant 2mM de glutamine (Glu), 0.1 mg/ml de streptomycine / pénicilline (S/P)) et 10% de sérum de veau fœtal décomplémenté (SVF) (v/v). Pour les manipulations de l’étude in vitro, le sérum de veau fœtal est préalablement chargé en acide gras, comme décrit précédemment. Les incubations sont réalisées dans des plaques à 96 puits à fond plat. Chaque puits reçoit 50µl de la suspension cellulaire et 50µl de Concanavaline A (ConA) à une concentration de 2.5µg/ml ou 50µl de RPMI pour les puits témoins. Toutes les étapes se déroulent stérilement sous la hotte à flux laminaire. Les plaques sont incubées au stéricult à 37°C dans une atmosphère humide contenant 5% de CO 2 . Après 68h d’incubation, la prolifération cellulaire est mesurée selon la méthode décrite par Mosmann (1983) par le test colorimétrique au MTT. Ce test est basé sur la transformation du sel de tétrazolium MTT en cristaux de formazan violet par les cellules métaboliquement actives (Figure 23). Cette réduction par les enzymes cellulaires nécessite les cofacteurs NADH et NADPH. Les cristaux de formazan ainsi formés sont solubilisés et l’absorbance de la solution colorée obtenue est quantifiée par spectrophotométrie. Brièvement, 10µl de bromure de 3-(4-,5-diméthylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltétrazolium (MTT, concentration finale de 0.5 mg/ml) sont ajoutés dans chaque puits. Les cellules sont incubées pendant 4h à 37°C sous atmosphère humide. 100µl de solution de solubilisation sont ajoutés dans chaque puits et la microplaque est incubée à 37°C toute la nuit. Les densités optiques sont lues à 550 et 690 nm à l’aide d’un lecteur spectrophotométrique de plaques multipuits (Power Wave X). Le nombre de cellules vivantes est proportionnel à la différence des densités optiques (DO 550 - DO 690 ). Le pourcentage de prolifération est déterminé par comparaison avec les témoins non activés, traités dans les mêmes conditions. 100
A B Figure 23: A : Métabolisme du MTT en sel de formazan par les cellules viables. B: Comparaison du spectre UV du MTT (ligne pointillée) et du sel de formazan après solubilisation (ligne continue). 101
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N° : 2006-ISAL-0031 ANNEE 2006 THE
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GOUTTE R. (Prof. émérite) CREATIS
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SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDO
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Dédicace Je dédie ce travail A me
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Je remercie également Mme Madelein
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HOREJSI, V. The Roles of Membrane M
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YAQOOB, P. Fatty Acids and the Immu
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RESUME L’huile d’argan est extr
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