Etude biochimique et nutritionnelle de l'effet immunomodulateur des ...

nuit sous agitation à 37°C. Une solution témoin de sérum de veau fœtal est incubée dans les
mêmes conditions sans acide gras. Pour l’étude des effets des acides gras sur l’activité PLD
des thymocytes in vitro, une solution de sérum albumine humaine (HSA) delipidée est
préparée à la concentration de 5µM dans du RPMI 1640 et est ajoutée aux résidus secs pour
donner des concentrations finales en acide gras de 5µM et 15µM, et un rapport acide gras /
albumine égal à 1 et 3 respectivement. Les solutions sont incubées à 37°C pendant 4h sous
agitation. Une solution témoin d’HSA 5µM est incubée dans les mêmes conditions.
III-2-4 Test de prolifération
Les thymocytes sont suspendus à la concentration de 5.10 6 cellules/ml dans un milieu RPMI
contenant 2mM de glutamine (Glu), 0.1 mg/ml de streptomycine / pénicilline (S/P)) et 10% de
sérum de veau fœtal décomplémenté (SVF) (v/v). Pour les manipulations de l’étude in vitro,
le sérum de veau fœtal est préalablement chargé en acide gras, comme décrit précédemment.
Les incubations sont réalisées dans des plaques à 96 puits à fond plat. Chaque puits reçoit
50µl de la suspension cellulaire et 50µl de Concanavaline A (ConA) à une concentration de
2.5µg/ml ou 50µl de RPMI pour les puits témoins. Toutes les étapes se déroulent stérilement
sous la hotte à flux laminaire. Les plaques sont incubées au stéricult à 37°C dans une
atmosphère humide contenant 5% de CO 2 . Après 68h d’incubation, la prolifération cellulaire
est mesurée selon la méthode décrite par Mosmann (1983) par le test colorimétrique au MTT.
Ce test est basé sur la transformation du sel de tétrazolium MTT en cristaux de formazan
violet par les cellules métaboliquement actives (Figure 23). Cette réduction par les enzymes
cellulaires nécessite les cofacteurs NADH et NADPH. Les cristaux de formazan ainsi formés
sont solubilisés et l’absorbance de la solution colorée obtenue est quantifiée par
spectrophotométrie.
Brièvement, 10µl de bromure de 3-(4-,5-diméthylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltétrazolium (MTT,
concentration finale de 0.5 mg/ml) sont ajoutés dans chaque puits. Les cellules sont incubées
pendant 4h à 37°C sous atmosphère humide. 100µl de solution de solubilisation sont ajoutés
dans chaque puits et la microplaque est incubée à 37°C toute la nuit. Les densités optiques
sont lues à 550 et 690 nm à l’aide d’un lecteur spectrophotométrique de plaques multipuits
(Power Wave X). Le nombre de cellules vivantes est proportionnel à la différence des densités
optiques (DO 550 - DO 690 ). Le pourcentage de prolifération est déterminé par comparaison avec
les témoins non activés, traités dans les mêmes conditions.
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