maenas (intertidal zone) and Segonzacia mesatlantica - Station ...

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68 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES (a) 0.8 0.7 réel gaussien reconstitué 1e+007 Abs. 280nm (UA) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 1e+006 Masse molaire (g/mol) 0.1 0 9 10 11 12 13 14 15 16 100000 volume (ml) (b) FIG. 2.8 – Profil SEC-MALLS typique de l’hémolymphe de Carcinus <strong>maenas</strong>. (a) Profil FPLC (SEC). Le dodécamère est majoritaire devant l’hexamère (en général l’hexamère représente de 5 à 20 % de l’hémocyanine totale). Une faible fraction de 18-mère est présente. L’hémocyanine représente la quasi-totalité des protéines présentes dans l’hémolymphe après centrifugation et culottage des protéines coagulantes. (b) Profil SEC-MALLS des complexes. Les masses estimées correspondent au 18-mère, au dodécamère et à l’hexamère (1 314 kDa, 923 kDa, 486 kDa). 3 pics gaussiens sont suffisants pour reconstituer le profil.
2.2. LE MALLS ET LES PIGMENTS RESPIRATOIRES 69 d’une estimation de masse par MALLS est faible et est en général inférieure à 1 %. Par contre, l’erreur réelle possible est de l’ordre de 10 % en raison de l’incertitude introduite lors de la détermination des lignes de base et du coefficient dn/dc qui varie suivant la glycosylation des protéines. Pour les acquisitions MALLS sur des échantillons d’Hc de Crustacés, les expériences ont eu lieu avec un débit de 0,25 ou 0,5 ml/min. Le coefficient dn/dc utilisé est 0,190 g/ml, typique des protéines non-glycosylées. Une normalisation des détecteurs a été réalisée en utilisant de la BSA (Sigma). La méthode de Zimm a été utilisée pour calculer les masses à partir des intensités diffusées avec le logiciel Astra 4.90.08 (Wyatt Technology Corp., Santa Barbara). 2.2.3 Autres possibilités du MALLS Les méthodes présentées précédemment mesurent la diffusion statique de la lumière, c’est à dire la diffusion due à des particules dont les mouvements browniens sont moyennés sur le temps d’acquisition des détecteurs. Ce type de mesure donne accès à la masse et au rayon de gyration des molécules. Il existe une méthode d’acquisition utilisant des compteurs de photons rapides qui permettent de mesurer les fluctuations de l’intensité diffusée au cours du temps ; il s’agit alors de diffusion de lumière dynamique ou QELS pour Quasi-Elastic Light Scattering (diffusion de lumière quasi-élastique). Ces fluctuations sont dues aux mouvements aléatoires des particules diffusant la lumière, qui provoquent des interférences alternativement constructives et destructives des ondes émises par chacune d’entre elles. La corrélation entre les intensités diffusées sur un petit intervalle de temps dépend de la constante de diffusion des particules dans le solvant. Il est donc possible de déduire la constante de diffusion à partir d’une mesure en QELS, puis de calculer le rayon hydrodynamique R h des particules. Le rapport R g /R h donne une indication sur la forme de la particule. Le MALLS permet également de mesurer le second coefficient de viriel A 2 , qui estime l’interaction entre les molécules analysées et le solvant. 2.2.4 Application du MALLS à l’étude des pigments respiratoires Le MALLS est une méthode permettant de déterminer la masse des pigments respiratoires de haute masse moléculaire en solution de manière relativement précise et rapide (typiquement 1 à 2 h pour une acquisition en SEC-MALLS). Cette technique permet de tester l’effet de différents tampons, physiologiques ou non, sur la structure des complexes et ainsi de suivre des processus de dissociation ou de réassociation (Rousselot et al., 2006). Elle a été utilisée notamment pour déterminer la masse des hémoglobines géantes d’Annélides (non encore accessible en ESI-MS) et celle de l’Hc de certains Crustacés Décapodes. Les données de masses natives acquises en MALLS peuvent être utilisées avec
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THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE
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Dénaturant Natif
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