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64 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES FIG. 2.4 – ESI-MS supramoléculaire et dénaturante appliquées à l’Hc de Crustacé. A partir d’un échantillon natif, les conditions d’analyse peuvent permettre de conserver les interactions noncovalentes et donc d’ioniser des complexes intacts qui sont séparés par l’analyseur (en haut). Dans des conditions dénaturantes, les complexes sont dissociés en sous-unités qui sont ionisées puis séparées (en bas). 2.1.3 Application de l’ESI-MS à l’étude des pigments respiratoires Les capacités de l’ESI-MS en font un outil de choix pour l’étude des pigments respiratoires multimériques de haute masse moléculaire. Son utilisation en conditions dénaturantes permet d’accéder au nombre de sous-unités différentes, à leur taille, au nombre d’hèmes liés dans le cas des hémoglobines, au nombre de cystéines libres et liées et à des informations sur la présence de chaînes glycosylées. L’ESI-MS supramoléculaire permet d’avoir la masse des complexes natifs (hémocyanines de Crustacés) ou des sous-ensembles non-covalents (dodécamères de globines des HBL-Hb d’Annélides) (figure 2.4). La forme native d’une HBL-Hb d’Annélide (3-4 MDa) n’a pas encore été observé en raison d’un manque de sensibilité dans cette gamme de masse et de l’élargissement des pics de cette espèce moléculaire dû à la présence d’adduits. La connaissance des masses natives des complexes (par ESI-MS supramoléculaire ou par diffusion de lumière) et celle des masses des sous-unités (par ESI-MS en conditions dénaturantes) permet de proposer des modèles structuraux pour ces protéines. 2.2 Le MALLS et les pigments respiratoires 2.2.1 Principe de la diffusion de lumière Lorsqu’une molécule polarisable est excitée par une onde électromagnétique (e.g. laser), un dipôle oscillant est induit au sein de la molécule qui réémet à son tour une onde électromagnétique (figure 2.5). La quantité de lumière réémise dépend la polarisabilité des molécules qui peut être estimée par
2.2. LE MALLS ET LES PIGMENTS RESPIRATOIRES 65 leur coefficient dn/dc (variation d’indice de réfraction d’une solution en fonction des variations de concentration des solutés). L’intensité diffusée dépend aussi de la quantité de molécules et double pour une quantité double de molécules. Lorsque deux molécules forment un dimère, leurs mouvements browniens se synchronisent et les ondes diffusées par chacune sont alors en phase. L’intensité diffusée est alors le double de la somme des intensités diffusées individuellement (figure 2.6). En connaissant la concentration des solutés, la masse molaire peut donc être déduite par la mesure des intensités diffusées. La diffusion de lumière par une particule se fait dans toutes les directions de l’espace. La diffusion peut être isotrope (identique dans toutes les directions) : c’est le cas des petites particules globulaires (e.g. BSA). Selon la forme et la taille des particules, elle peut également être anisotrope (l’intensité mesurée dépend de l’angle d’observation). Les premiers appareils construits pour exploiter le principe de la diffusion de lumière ne pouvaient mesurer la lumière diffusée qu’à un seul angle. Pour pouvoir déduire la masse molaire d’un échantillon avec une seule mesure, il faut en principe réaliser la mesure à 0° par rapport au rayon incident : l’intensité dépend alors uniquement de la masse molaire et non de la forme. Dans la pratique, cet angle correspond également à celui du rayon transmis par la cellule et la mesure était réalisée à un petit angle proche de 0° pour ne pas mesurer l’intensité du rayon simplement transmis par l’échantillon. Dans les années 1970, P.J. Wyatt développa un appareil permettant de mesurer l’intensité diffusée à plusieurs angles. Ce type de mesure permet d’extrapoler la valeur de la mesure à 0° et de déduire avec précision la masse du composé analysé, t<strong>and</strong>is que la dépendance angulaire de l’intensité diffusée permet de déduire la taille de la particule (rayon de gyration R g correspondant au rayon moyen de la particule pondéré par la distribution de masse autour de son centre de gravité). Ce type de méthode est appelé MALLS pour Multi-Angle Laser-Light Scattering (diffusion de lumière laser à plusieurs angles). Le MALLS est une méthode d’emploi relativement récent en biologie, permettant une détermination de la masse moléculaire de composés en solution sans établir de calibration a priori comme c’est le cas par exemple lors d’une calibration de système SEC avec des molécules de masses connues. La détermination du rayon de gyration permet également de déduire la forme générale des particules lorsque les populations sont légèrement polydisperses en représentant log(R h ) en fonction de log(MM) : la pente de la courbe indique si les particules ont plutôt une forme de bâtonnet, de sphère ou de pelote statistique.
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THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE
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Dénaturant Natif
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