maenas (intertidal zone) and Segonzacia mesatlantica - Station ...
maenas (intertidal zone) and Segonzacia mesatlantica - Station ... maenas (intertidal zone) and Segonzacia mesatlantica - Station ...
62 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES une molécule peut être ionisée et non pas uniquement de son abondance. Une approche quantitative en spectrométrie de masse doit être menée avec précaution et en contrôlant la méthode pour chaque molécule. Cependant, entre échantillons contenant des protéines similaires, une comparaison relative d’échantillon à échantillon pour chaque protéine est possible. L’ESI-MS en conditions dénaturantes Selon le type d’analyse désiré, on peut préparer les échantillons et régler les paramètres de la source de manière à séparer les constituants des complexes non-covalents et à dénaturer les molécules pour mesurer les masses des chaînes polypeptidiques, ou au contraire conserver les interactions noncovalentes et mesurer les masses des complexes associés à leur substrat. Pour réaliser une analyse en conditions dénaturantes, l’échantillon est dilué dans un mélange eau/solvant organique tel que l’acétonitrile ou le méthanol avec une faible proportion d’acide organique. Un mélange typique est par exemple eau/acétonitrile/acide formique dans les proportions volumiques 50 :50 :1. Le pH final de la préparation est acide ( pH 3) et les interactions non-covalentes sont détruites. Les molécules sont protonées et multi-chargées. Dans ce cas, on peut mesurer la masse des sous-unités constituant un complexe, et celle de groupements prosthétiques éventuellement présents. Dans le cas des hémoglobines géantes d’Annélides, on peut mesurer la masse des chaînes de globines et des chaînes de structure (linkers). Un pic à 616 Da correspond à l’hème dissocié des chaînes de globines. En réalisant des modifications chimiques sur l’échantillon avant analyse (e.g. réduction des ponts disulfures, coupure des liaisons glycosidiques, carbamidométhylation), on peut obtenir d’autres informations structurales comme le nombre de cystéines libres et impliquées dans les ponts disulfures ou la présence de chaînes glycosylées. De plus, en réalisant des analyses sur des échantillons du même type mais provenant d’individus différents par exemple, une comparaison relative entre échantillons pour les mêmes ions peut être réalisée. L’ESI-MS supramoléculaire Comparée au MALDI, l’ESI-MS est une source douce réalisant une ionisation à pression atmosphérique et sans impact sur l’échantillon, permettant de conserver les interactions non-covalentes entre les molécules si le solvant de départ est adapté et si les paramètres de la source sont correctement ajustés (pression du gaz de nébulisation à 1 bar, augmentation du potentiel de sortie de capillaire à 400 V par exemple). L’ESI a ainsi ouvert la voie à l’analyse de complexes non-covalents par MS (Fenn et al., 1989). Le tampon utilisé peut être de l’eau ou plus généralement un tampon aqueux et volatile à pH compris entre 6 et 8. Ces conditions sont plus proches des conditions physiologiques et permettent a priori de se rapprocher de la conformation native des molécules. Le tampon doit contenir
2.1. L’ESI-MS ET LES PIGMENTS RESPIRATOIRES 63 peu de sels afin de limiter le bruit et la formation d’adduits lors de l’analyse. Les tampons les plus souvent utilisés sont l’acétate d’ammonium NH 4 CH 3 CO 2 et le carbonate d’ammonium NH 4 HCO 3 en raison de leur volatilité, dans des concentrations de 1 à 100 mM. Des interactions non-covalentes entre protéines et protéines et entre protéines et cofacteurs, ligands ou groupement prosthétiques ont été observées par cette méthode (Katta et Chait, 1991, van Duijn et al., 2006, Potier et al., 1997, Ganem et al., 1991a,b, Robinson et al., 1998, McCammon et al., 2004, Oldham et al., 2003, Robinson et al., 2007, Benesch et Robinson, 2006). L’utilisation du TOF permet en outre de détecter de hauts rapports m/z sans limite supérieure théorique, ce qui est nécessaire lorsque des complexes de haute masse sont étudiés. La technique du nanospray permet d’introduite de petites quantités d’échantillon (Wilm et Mann, 1994). Des complexes de très haute masse moléculaire ont ainsi pu être analysés : GroEL, la capside du virus MS2, le ribosome (Rostom et Robinson, 1999, Tito et al., 2000, Rostom et al., 2000). En faisant varier les conditions expérimentales, on peut accéder à des constantes d’association protéine-ligand ou à des constantes cinétiques. L’analyse de la structure tertiaire est également possible par cette méthode (Robinson et Radford, 1995, Ashcroft et al., 2002, Konermann et al., 2001, Ganem et al., 1991a). Lorsque des complexes non-covalents sont analysés par ESI-MS supramoléculaire, une question importante est de savoir si les interactions observées en phase gazeuse correspondent effectivement aux interactions existant en solution, c’est à dire si les interactions en solution sont conservées durant l’ionisation et l’analyse en MS. Etant donné que pour une espèce en solution, un changement de pH ou de force ionique peuvent être suffisants pour induire une modification des interactions existantes, il faut examiner avec précaution l’effet d’un changement de phase. Les mécanismes précis ayant lieu lors de l’ESI ne sont pas encore connus exactement (Nguyen et Fenn, 2007) mais il est probable que les différents types d’interactions pouvant exister sont modifiés de manière différente. Les interactions hydrophobes disparaîtraient et les interactions hydrophiles et de Van der Waals seraient renforcées (Robinson et al., 1998). Des études par simulation informatique de l’évaporation du solvant suggèrent que la conformation est influencée par le processus mais que les éléments structuraux principaux (structures secondaires) sont conservés (Patriksson et al., 2007). L’utilisation de composés basiques à la place de l’acétate d’ammonium pour la préparation de l’échantillon pourrait également aider à conserver une conformation plus proche de celle en solution en limitant la charge de la protéine en phase gazeuse (Catalina et al., 2005). La possibilité de collecter des virus viables après un passage en ESI-MS et à travers un quadripôle suggère que la conformation native est retenue durant l’ensemble du processus (Siuzdak et al., 1996). Une limite maximale pour la taille des particules analysables par ESI-MS seraient la taille de la gouttelette dans le spray (C. J. Hogan et al., 2006).
- Page 18 and 19: FIG. 1.5 - Localisation des princip
- Page 20 and 21: (a) FIG. 1.6 - Fonctionnement d’u
- Page 22 and 23: 16 CHAPITRE 1. INTRODUCTION TAB. 1.
- Page 24 and 25: 18 CHAPITRE 1. INTRODUCTION FIG. 1.
- Page 26 and 27: 20 CHAPITRE 1. INTRODUCTION Différ
- Page 28 and 29: 22 CHAPITRE 1. INTRODUCTION FIG. 1.
- Page 30 and 31: 24 CHAPITRE 1. INTRODUCTION le mili
- Page 32 and 33: 26 CHAPITRE 1. INTRODUCTION Capacit
- Page 34 and 35: 28 CHAPITRE 1. INTRODUCTION TAB. 1.
- Page 36 and 37: 30 CHAPITRE 1. INTRODUCTION 700 600
- Page 38 and 39: 32 CHAPITRE 1. INTRODUCTION férent
- Page 40 and 41: 34 CHAPITRE 1. INTRODUCTION (a) (b)
- Page 42 and 43: 36 CHAPITRE 1. INTRODUCTION (a) (b)
- Page 44 and 45: 38 CHAPITRE 1. INTRODUCTION (a) (b)
- Page 46 and 47: 40 CHAPITRE 1. INTRODUCTION 1 P 50
- Page 48 and 49: 42 CHAPITRE 1. INTRODUCTION presque
- Page 50 and 51: 44 CHAPITRE 1. INTRODUCTION affecte
- Page 52 and 53: 46 CHAPITRE 1. INTRODUCTION FIG. 1.
- Page 54 and 55: 48 CHAPITRE 1. INTRODUCTION FIG. 1.
- Page 56 and 57: 50 CHAPITRE 1. INTRODUCTION fure co
- Page 58 and 59: 52 CHAPITRE 1. INTRODUCTION amélio
- Page 60 and 61: 54 CHAPITRE 1. INTRODUCTION 1.5 Que
- Page 62 and 63: 56 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPL
- Page 64 and 65: 58 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPL
- Page 66 and 67: 60 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPL
- Page 70 and 71: 64 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPL
- Page 72 and 73: 66 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPL
- Page 74 and 75: 68 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPL
- Page 76 and 77: 70 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPL
- Page 78 and 79: The Structural Analysis of Large No
- Page 80 and 81: The Structural Analysis of Large No
- Page 82 and 83: The Structural Analysis of Large No
- Page 84 and 85: The Structural Analysis of Large No
- Page 86 and 87: The Structural Analysis of Large No
- Page 88 and 89: The Structural Analysis of Large No
- Page 90 and 91: The Structural Analysis of Large No
- Page 92 and 93: The Structural Analysis of Large No
- Page 94 and 95: The Structural Analysis of Large No
- Page 96 and 97: The Structural Analysis of Large No
- Page 98 and 99: The Structural Analysis of Large No
- Page 100 and 101: The Structural Analysis of Large No
- Page 102 and 103: The Structural Analysis of Large No
- Page 104 and 105: The Structural Analysis of Large No
- Page 106 and 107: The Structural Analysis of Large No
- Page 108 and 109: 102 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APP
- Page 110 and 111: 104 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC
- Page 112 and 113: 106 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC
- Page 114 and 115: 108 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC
- Page 116 and 117: 110 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC
62 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES<br />
une molécule peut être ionisée et non pas uniquement de son abondance. Une approche quantitative<br />
en spectrométrie de masse doit être menée avec précaution et en contrôlant la méthode pour chaque<br />
molécule. Cependant, entre échantillons contenant des protéines similaires, une comparaison relative<br />
d’échantillon à échantillon pour chaque protéine est possible.<br />
L’ESI-MS en conditions dénaturantes<br />
Selon le type d’analyse désiré, on peut préparer les échantillons et régler les paramètres de la<br />
source de manière à séparer les constituants des complexes non-covalents et à dénaturer les molécules<br />
pour mesurer les masses des chaînes polypeptidiques, ou au contraire conserver les interactions noncovalentes<br />
et mesurer les masses des complexes associés à leur substrat.<br />
Pour réaliser une analyse en conditions dénaturantes, l’échantillon est dilué dans un mélange<br />
eau/solvant organique tel que l’acétonitrile ou le méthanol avec une faible proportion d’acide organique.<br />
Un mélange typique est par exemple eau/acétonitrile/acide formique dans les proportions volumiques<br />
50 :50 :1. Le pH final de la préparation est acide ( pH 3) et les interactions non-covalentes sont<br />
détruites. Les molécules sont protonées et multi-chargées. Dans ce cas, on peut mesurer la masse des<br />
sous-unités constituant un complexe, et celle de groupements prosthétiques éventuellement présents.<br />
Dans le cas des hémoglobines géantes d’Annélides, on peut mesurer la masse des chaînes de globines<br />
et des chaînes de structure (linkers). Un pic à 616 Da correspond à l’hème dissocié des chaînes de<br />
globines. En réalisant des modifications chimiques sur l’échantillon avant analyse (e.g. réduction des<br />
ponts disulfures, coupure des liaisons glycosidiques, carbamidométhylation), on peut obtenir d’autres<br />
informations structurales comme le nombre de cystéines libres et impliquées dans les ponts disulfures<br />
ou la présence de chaînes glycosylées. De plus, en réalisant des analyses sur des échantillons du même<br />
type mais provenant d’individus différents par exemple, une comparaison relative entre échantillons<br />
pour les mêmes ions peut être réalisée.<br />
L’ESI-MS supramoléculaire<br />
Comparée au MALDI, l’ESI-MS est une source douce réalisant une ionisation à pression atmosphérique<br />
et sans impact sur l’échantillon, permettant de conserver les interactions non-covalentes<br />
entre les molécules si le solvant de départ est adapté et si les paramètres de la source sont correctement<br />
ajustés (pression du gaz de nébulisation à 1 bar, augmentation du potentiel de sortie de capillaire<br />
à 400 V par exemple). L’ESI a ainsi ouvert la voie à l’analyse de complexes non-covalents par MS<br />
(Fenn et al., 1989). Le tampon utilisé peut être de l’eau ou plus généralement un tampon aqueux et<br />
volatile à pH compris entre 6 et 8. Ces conditions sont plus proches des conditions physiologiques et<br />
permettent a priori de se rapprocher de la conformation native des molécules. Le tampon doit contenir
Change language