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58 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES FIG. 2.2 – Principe de l’ESI (pris dans Vinh (1999)). L’échantillon en solution est expulsé par une aiguille portée à un fort potentiel. Les gouttelettes formées sont chargées et le solvant s’évapore lors du passage vers l’entrée de l’échantillonneur grâce au flux de gaz sec (N 2 ), provoquant la concentration des charges surfaciques et l’explosion coulombienne des gouttelettes jusqu’à ce que les molécules soient désolvatées plus ou moins complétement.
2.1. L’ESI-MS ET LES PIGMENTS RESPIRATOIRES 59 permettant de charger la surface des gouttelettes. Le spray traverse ensuite un flux de gaz sec et chaud provoquant l’évaporation du solvant et la concentration des charges ; les gouttelettes explosent en gouttelettes plus petites lorsque la répulsion électrostatique est plus forte que les forces de tension superficielles, jusqu’à concentrer les charges sur les composés contenus dans l’échantillon (figure 2.2) (Fenn et al., 1989). Contrairement au MALDI qui produit généralement des ions monochargés (M+H + ) + , la source ESI produit des ions multichargés (M+nH + ) n+ . Ceci permet de mesurer des rapports m/z pour des macromolécules de haute masse dans la gamme de mesure m/z des analyseurs actuels. L’ESI est également utilisée pour l’analyse de complexes non-covalents (ESI supramoléculaire) car elle permet de conserver intacts ces complexes. Des particules virales de virus de plantes collectées après une ionisation par ESI sont toujours capables d’infecter des hôtes, démontrant ainsi que la conformation native et fonctionnelle des complexes est conservée lors du processus (Siuzdak et al., 1996). La mise au point de sources miniaturisées pour l’ESI (nanospray, picospray) a également permis d’augmenter la sensibilité de l’analyse et de diminuer les quantités d’échantillons requises, certaines expériences permettant de mesurer la masse de composés à partir d’une seule cellule (Vinh, 1999). La deuxième étape de l’analyse MS, après l’ionisation des composés, est la séparation des ions dans l’analyseur et la mesure de leur rapport m/z. Les deux principales méthodes de séparation actuellement utilisées sont le quadripôle (Q) et le temps de vol (time of flight, TOF). Un quadripôle est constitué de quatre électrodes allongées disposées le long de la trajectoire des ions. Les électrodes opposées deux à deux sont portées au même potentiel électrique, les deux couples d’électrodes étant soumis à des potentiels opposés. Le potentiel imposé est la somme d’une composante sinusoïdale et d’une composante continue. Lors de leur passage dans le quadripôle, les ions suivent une trajectoire oscillante sous l’effet de la composante alternative. Les ions ayant un rapport m/z inférieur à une valeur seuil dépendant de l’amplitude et de la fréquence de la composante alternative ont une amplitude d’oscillation trop élevée et sont arrêtés par les barres du quadripôle. De même, les ions dérivent sous l’effet de la composante continue et ceux ayant un rapport m/z supérieur à une valeur seuil dépendant de la valeur de la composante continue ont trop dévié à la sortie du quadripôle et ne sont pas détecté par la cellule du détecteur (figure 2.3). Le quadripôle agit donc comme un filtre passe-b<strong>and</strong>e et permet l’acquisition d’un spectre en balayant la gamme m/z transmise au cours d’une analyse. Le principe du TOF est différent : les ions sont stockés pendant un bref instant en amont du tube de TOF, puis sont soumis à une accélération dans un champ électrique. Leur accélération dépend de leur rapport m/z. Ils passent ensuite dans le tube de vol libre de champ électrique dans lequel ils ne sont plus accélérés et se déplacent à la vitesse acquise pendant l’accélération. La détection se fait au bout du tube selon le temps d’arrivée des ions, les ions les plus accélérés (rapport m/z faible) arrivant
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THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE
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