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56 CHAPITRE 2. ESI-MS ET MALLS APPLIQUÉS AUX PIGMENTS RESPIRATOIRES Les pigments respiratoires présentent une grande diversité de structures quaternaires. En particulier, les pigments respiratoires d’invertébrés marins comme les hémoglobines géantes (HBL-Hbs) d’Annélides ou les hémocyanines (Hcs) de Crustacés Décapodes sont formés par l’association noncovalente d’un grand nombre de sous-unités de différents types. La détermination des structures de ces pigments nécessite des techniques adaptées à de tels édifices. Ce chapitre présente à travers un article de revue réalisé pendant la thèse et intégrant des données personnelles l’utilisation couplée de la spectrométrie de masse et de la diffusion de lumière à l’étude de la structure de ces pigments respiratoires. Les principes des techniques sont brièvement rappelés avant l’article. 2.1 L’ESI-MS et les pigments respiratoires 2.1.1 Principe et historique de la spectrométrie de masse Un spectromètre de masse est un appareil permettant de déterminer très précisément la masse de composés ionisées en les séparant en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). Une analyse en spectrométrie de masse (MS) comporte trois étapes successives : l’ionisation et le passage en phase gazeuse des composés préparés en phase solide ou liquide, la séparation des ions produits selon leur rapport m/z et enfin la détection des ions séparés. Différentes méthodes d’ionisation et de séparation existent et déterminent le type de spectromètre de masse (figure 2.1). Historiquement, la première mesure d’un rapport m/z fut réalisée par J.J. Thomson en 1897 sur l’électron (Griffiths, 1997). J.J. Thomson sépara également un faisceau contenant des cations selon les différentes trajectoires paraboliques caractéristiques des rapports m/z des composés (Vinh, 1999). En 1920, A.J. Dempster crée une source à impact électronique dans laquelle un faisceau d’électrons est produit par le chauffage d’un filament et en 1933 F.W. Aaston mesure les masses atomiques et les distributions isotopiques de presque tous les éléments chimiques (Vinh, 1999). L’application de la spectrométrie de masse à la biologie nécessite une source permettant d’ioniser des molécules de masse moléculaire importante. Dans les années 1970, plusieurs types de sources permettent de mesurer les masses de peptides (PDMS, Plasma Desorption MS, SIMS, Secondary Ion MS, FAB, Fast Atom Bombardment, LISMS, Liquid Secondary Ion MS) mais les plus hautes masses atteintes sont de 25 kDa environ et la sensibilité limitée des appareils exige des dizaines de pmol d’échantillon. De plus, les mélanges protéiques perturbent le signal et les spectres obtenus sont trop
2.1. L’ESI-MS ET LES PIGMENTS RESPIRATOIRES 57 FIG. 2.1 – Principe d’un spectromètre de masse. Les molécules contenues dans l’échantillon sont ionisées par la source et passent en phase gazeuse, puis sont séparées selon leur rapport m/z par l’analyseur et enfin les ions séparés sont comptés par le détecteur. L’ESI et le MALDI sont les sources les plus utilisées en biologie, classiquement associées à des analyseurs quadripôle (Q) ou temps de vol (TOF) ou à une géométrie en tandem (Q-TOF par exemple). sélectifs (Vinh, 1999). En 1988, deux techniques d’ionisation nouvelles sont mises au point : l’ESI (ElectroSpray Ionization) par John Fenn et le MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) par Franz Hillenkamp. Ces deux techniques d’ionisation sont les principales utilisées en biologie aujourd’hui et ont ouvert la voie à de nouvelles performances en terme de masse et de résolution. 2.1.2 L’ESI-MS en biologie La spectrométrie de masse (MS) est une technique à présent couramment employée en biologie. Elle permet de déterminer de manière beaucoup plus précise et exacte la masse moléculaire des composés analysés que d’autres techniques comme l’électrophorèse sur gel ou l’ultracentrifugation analytique. C’est une technique au développement relativement récent qui fut d’abord employée pour déterminer la masse de petits composés (fortuitine de 1,4 kDa, insuline de 5,8 kDa (Vinh, 1999)) puis d’édifices plus importants avec le développement des sources ESI et MALDI (hémocyanine de 2,2 MDa, capside du batériophage MS2 de 2,5 MDa (Sanglier et al., 2003, Tito et al., 2000)). Elle a de nombreuses applications en biologie (séquençages, phénotypage, interactions protéine/protéine ou protéine/substrat, association et dissociation de complexes, cinétiques). Les sources et les analyseurs utilisés en biologie Le MALDI et l’ESI sont les deux principales méthodes d’ionisation actuellement utilisées. Le MALDI consiste à déposer un mélange solide contenant l’échantillon et une matrice de dépôt sur une plaque métallique, la cible, puis à l’exposer à une décharge laser permettant d’ioniser le mélange matrice/échantillon et de produire les ions envoyés dans le détecteur (Karas et Hillenkamp, 1988, Tanaka et al., 1988). L’ESI est une méthode plus douce consistant à produire un spray (nébulisation) à partir de l’échantillon en phase liquide, au niveau d’un cône possédant un fort potentiel électrique
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THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE
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