maenas (intertidal zone) and Segonzacia mesatlantica - Station ...

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138 CHAPITRE 4. PLASTICITÉ PHÉNOTYPIQUE DE L’HC DE C. MAENAS de déterminer si des changements de structure de leur hémocyanine sont induits par les différentes conditions. Les premiers travaux présentés sont des expériences préliminaires réalisées sur des échantillons d’hémolymphe de crabes acclimatés à différentes conditions de salinité, les échantillons ayant subi une congélation à -80°C. La seconde partie consiste en l’acclimatation de crabes à différentes conditions de salinité et d’oxygénation et à l’étude des variations individuelles grâce à des prélévements appariés sur les même crabes avant et après acclimatation. Enfin, la troisième partie présente des analyses réalisées sur des individus prélevés dans un estuaire et exposés naturellement à un habitat hyposalin afin de déterminer si des effets de l’environnement existent dans le milieu naturel. 4.3 Matériels et méthodes communs Les méthodes d’analyse utilisées pour l’ensemble de ce chapitre sont présentées ici. Certaines méthodes sont décrites dans d’autres parties de la thèse ; dans ce cas il est fait référence à la partie en question. Les démarches utilisées pour chaque étude du chapitre sont présentées au début de chaque étude. 4.3.1 Prélévement d’hémolymphe sur les crabes L’hémolymphe est prélevée à l’aide d’une seringue hypodermique au niveau de la membrane articulaire des pattes locomotrices, à leur jonction avec le céphalothorax, sur la face dorsale. Un sinus branchial situé à cet endroit permet de prélever facilement une quantité importante d’hémolymphe. Les échantillons sont conservés sur glace pendant le prélévement puis immédiatement centrifugés pendant 10 min à 10000 trs/min, à 4°C. Le surnageant est ensuite récupéré et conservé à 4°C ou congelé pour utilisation ultérieure. 4.3.2 Dosage de protéine Les protéines totales ont été dosées en utilisant le réactif de Bradford (Biorad) et en réalisant une gamme étalon à partir de BSA (Sigma). 4.3.3 Chromatographie et MALLS La chromatographie liquide d’exclusion de taille (SEC) a été utilisée pour caractériser les composants présents dans l’hémolymphe et pour purifier les différents complexes d’Hc (dodécamère, hexamère). Les protocoles utilisés sont expliqués dans les parties 3.2.2 (page 113) et 5.4.2 (page
4.3. MATÉRIELS ET MÉTHODES COMMUNS 139 186). Briévement, les chromatographies sont réalisées dans un tampon 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgSO4, 20 mM CaCl2, 50 mM Tris, pH 7,8 sur une colonne Superose 6 10/300 (Amersham) à un débit de 0,25 à 0,5 ml/min. 50 µl d’échantillon natif dilué au 1/40 sont injectés pour les analyses et environ 3 à 5 mg de protéine sont injectés pour les purifications. La diffusion de lumière multi-angulaire (Multi-Angular Laser Light Scattering, MALLS) a été utilisée pour déterminer la masse des complexes analysés à l’aide d’un appareil Dawn EOS (Wyatt Technology Corp.,Santa Barbara) et du logiciel Astra 4.90.08. 4.3.4 Electrophorèse sur gel d’acrylamide SDS-PAGE Les électrophorèses en conditions dénaturantes sont réalisées sur gel SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) (système mini-protean, Biorad). Un gel de compression (stacking ou upper) à 4 % d’acrylamide et un gel de séparation (resolving ou lower) à 7 % sont utilisés, contenant 0,1 % de SDS. Les échantillons sont dilués dans un tampon Tris HCl pH 6,8 125 mM, 4 % SDS, 20 % glycerol et 10 % β-mercapto-éthanol puis incubés à 95°C pendant 90 s avant dépôt. La coloration après migration est réalisée au bleu de Coomassie. PAGE natif Les électrophorèses en conditions natives sont réalisées avec un gel de compression à 4 % et un gel de séparation à 7 %. Les échantillons sont dilués (dilution au moins 1/2) dans un tampon de dissociation EDTA 50 mM, Tris HCl pH 9,1 50 mM, 30 % glycerol pendant 10 min avant dépôt. Pour suivre la migration, 10 µl d’une solution de bleu de bromophénol peuvent être ajoutés dans chaque échantillon. La coloration après migration est réalisée au bleu de Coomassie. 4.3.5 Spectrométrie de masse Les analyses en spectrométrie de masse sont réalisées par ESI-MS en conditions dénaturantes et non-covalentes (ESI-MS supramoléculaire). Elles ont été réalisées avec Peran Terrier et Emmanuelle Leize dans l’équipe LDSM2 à Strasbourg (UMR 7177, CNRS-ULP). Le protocole utilisé est détaillé dans les parties 3.2.2 (page 114) et 5.4.2 (page 186). L’utilisation de l’ESI-MS en biologie est présentée dans la partie 2.1 (page 56).
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THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE
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i Résumé / Abstract Réponse adap
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188 CHAPITRE 5. ADAPTATIONS RESPIRA
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