maenas (intertidal zone) and Segonzacia mesatlantica - Station ...

3.1. PROBLÉMATIQUE ET OBJECTIFS DE L’ÉTUDE 107
stabilité des hémocyanines était connu dès 1936 avec les études d’Eriksson et Svedberg en centrifugation
analytique (Eriksson-Quensel et Svedberg, 1936). A pH alcalin et en présence d’EDTA, les
complexes d’hémocyanine se dissocient en sous-unités et ne peuvent plus lier l’oxygène (Molon et al.,
2000, Olianas et al., 2006). Cette dissociation est réversible dans certaines limites en présence d’ions
Ca 2+ et à pH physiologique. Les cations divalents et le pH ont également un effet sur les propriétés
fonctionnelles de l’hémocyanine (voir partie 1.4.2).
Les travaux étudiant la stoechiométrie de la fixation des cations divalents ainsi que les constantes
d’association impliquées montrent l’existence de deux types de sites de fixation : quelques sites à
haute affinité pour les cations divalents (de 1 à 3 par hexamère) et de nombreux sites avec une affinité
de 10 à 100 fois moins forte (jusqu’à 42 sites par hexamère). Une étude sur l’hémocyanine
de Panulirus interruptus a mesuré une affinité similaire des sites de liaison pour les ions Ca 2+ et
Mg 2+ (Andersson et al., 1982). En conditions physiologiques, les sites à haute affinité sont saturés en
permanence et ont probablement un rôle structural alors que ceux à faible affinité ont une saturation
dépendant de la concentration de Ca 2+ dans des gammes physiologiques et ont probablement un rôle
dans la modulation de l’affinité du pigment par les cations divalents.
3.1.3 Problématique et approche expérimentale
L’objectif initial de l’étude de l’hémocyanine de Carcinus maenas par ESI-MS supramoléculaire
est la caractérisation de l’interaction du L-lactate avec les sous-unités et le complexe d’hémocyanine
(figure 3.2). Le L-lactate interagit-il avec un type particulier de sous-unité ? La structure quaternaire
est-elle effectivement nécessaire pour avoir une interaction comme le suggèrent les études précédentes
?
Dans ce cadre, la démarche expérimentale suivie consiste à tester l’interaction du lactate avec des
sous-unités séparées tout en restant dans des conditions d’analyse ESI-MS permettant de conserver
les interactions non-covalentes. Le principe est de dissocier les complexes en tampon aqueux à pH
alcalin, puis d’ajouter du lactate tout en revenant à un pH physiologique afin de tester s’il est possible
de détecter au cours des analyses en ESI-MS supramoléculaire des sous-unités isolées dont la masse
augmente de la masse du lactate (90,4 g.mol −1 ). D’autre part, si la réassociation des sous-unités peut
effectivement être suivie par ESI-MS il est intéressant de tester l’effet de la chélation des cations
divalents sur la réassociation des complexes ainsi que de comparer les mécanismes de réassociation
entre hexamères et dodécamères purifiés.
La démarche expérimentale suit donc le plan suivant :
– réaliser une dissociation à pH alcalin des complexes en sous-unités
– comparer la réassociation par acidification en présence et en absence de L-lactate