maenas (intertidal zone) and Segonzacia mesatlantica - Station ...

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106 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS (a) (b) (c) FIG. 3.2 – Différentes modalités hypothétiques de fixation du L-lactate à l’Hc. Représentation schématique d’un dodécamère d’Hc de Crustacé formé de sous-unités différentes (bleu clair, moyen, foncé) et fixant le L-lactate (rouge). (a) Fixation aspécifique du L-lactate sur chaque type de sousunité, (b) Fixation spéficique du L-lactate sur un type de sous-unité seulement, (c) Fixation spécifique du L-lactate dans un site formé par la structure quaternaire de l’Hc. manière coopérative à l’hémocyanine, ce qui suggère que les changements conformationnels induits par la fixation d’une molécule de lactate sur un site n’influencent pas l’autre site (Nies et al., 1992). Une autre étude chez Homarus americanus par SAXS (diffusion des rayons X aux petits angles) ainsi que par microscopie électronique suggère que l’addition de 10 mM de L-lactate provoque le rapprochement des 2 hexamères constituant le dodécamère d’environ 1,1 nm (Hartmann et al., 2001). Cela suggère que des changements locaux au niveau de sites de fixation peuvent entraîner une modification de la structure quaternaire globale de la protéine. Une étude récente réalisée chez Carcinus <strong>maenas</strong> a mesuré la liaison de 0,35 ion lactate par unité fonctionnelle, soit 4 sites par dodécamère (analyse de courbes de dissociation de l’oxygène) (Weber et al., 2008). Ces données diffèrent de celles obtenues pour Homarus vulgaris et Panulirus interruptus mais concordent avec celles du crabe brachyoure Callinectes sapidus. Ces études fournissent des informations sur la stoechiométrie et la spécificité de la liaison du L- lactate à l’hémocyanine. Le site de liaison ainsi que les acides aminés impliqués dans cette liaison restent à mettre en évidence. 3.1.2 Rôle structural et effet des cations divalents Le rôle des cations divalents et du pH dans le maintien de la structure des complexes d’Hc a été mis en évidence par de nombreuses études (Herskovits, 1988). En particulier, le rôle du pH dans la
3.1. PROBLÉMATIQUE ET OBJECTIFS DE L’ÉTUDE 107 stabilité des hémocyanines était connu dès 1936 avec les études d’Eriksson et Svedberg en centrifugation analytique (Eriksson-Quensel et Svedberg, 1936). A pH alcalin et en présence d’EDTA, les complexes d’hémocyanine se dissocient en sous-unités et ne peuvent plus lier l’oxygène (Molon et al., 2000, Olianas et al., 2006). Cette dissociation est réversible dans certaines limites en présence d’ions Ca 2+ et à pH physiologique. Les cations divalents et le pH ont également un effet sur les propriétés fonctionnelles de l’hémocyanine (voir partie 1.4.2). Les travaux étudiant la stoechiométrie de la fixation des cations divalents ainsi que les constantes d’association impliquées montrent l’existence de deux types de sites de fixation : quelques sites à haute affinité pour les cations divalents (de 1 à 3 par hexamère) et de nombreux sites avec une affinité de 10 à 100 fois moins forte (jusqu’à 42 sites par hexamère). Une étude sur l’hémocyanine de Panulirus interruptus a mesuré une affinité similaire des sites de liaison pour les ions Ca 2+ et Mg 2+ (Andersson et al., 1982). En conditions physiologiques, les sites à haute affinité sont saturés en permanence et ont probablement un rôle structural alors que ceux à faible affinité ont une saturation dépendant de la concentration de Ca 2+ dans des gammes physiologiques et ont probablement un rôle dans la modulation de l’affinité du pigment par les cations divalents. 3.1.3 Problématique et approche expérimentale L’objectif initial de l’étude de l’hémocyanine de Carcinus <strong>maenas</strong> par ESI-MS supramoléculaire est la caractérisation de l’interaction du L-lactate avec les sous-unités et le complexe d’hémocyanine (figure 3.2). Le L-lactate interagit-il avec un type particulier de sous-unité ? La structure quaternaire est-elle effectivement nécessaire pour avoir une interaction comme le suggèrent les études précédentes ? Dans ce cadre, la démarche expérimentale suivie consiste à tester l’interaction du lactate avec des sous-unités séparées tout en restant dans des conditions d’analyse ESI-MS permettant de conserver les interactions non-covalentes. Le principe est de dissocier les complexes en tampon aqueux à pH alcalin, puis d’ajouter du lactate tout en revenant à un pH physiologique afin de tester s’il est possible de détecter au cours des analyses en ESI-MS supramoléculaire des sous-unités isolées dont la masse augmente de la masse du lactate (90,4 g.mol −1 ). D’autre part, si la réassociation des sous-unités peut effectivement être suivie par ESI-MS il est intéressant de tester l’effet de la chélation des cations divalents sur la réassociation des complexes ainsi que de comparer les mécanismes de réassociation entre hexamères et dodécamères purifiés. La démarche expérimentale suit donc le plan suivant : – réaliser une dissociation à pH alcalin des complexes en sous-unités – comparer la réassociation par acidification en présence et en absence de L-lactate
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THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE
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