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104 CHAPITRE 3. STRUCTURE DE L’HC DE C. MAENAS PAR ESI-MS Chez les Crustacés Décapodes, la régulation de la fonction respiratoire d’un individu fait intervenir une modulation des propriétés de fixation de l’oxygène par l’hémocyanine à l’échelle moléculaire. Afin de comprendre les mécanismes mis en jeu, il est important de connaître les interactions entre le pigment respiratoire et ses modulateurs physiologiques. Ces interactions sont non-covalentes et réversibles et sont donc plus fragiles que des liaisons chimiques covalentes ; elles doivent être étudiées par des techniques permettant de les conserver lors de l’analyse. La spectrométrie de masse supramoléculaire, de développement relativement récent, permet de conserver ce type d’interaction et d’observer la masse de complexes non-covalents ; c’est un outil performant et puissant pour l’étude des interactions entre molécules biologiques de type protéine/protéine et protéine/ligand (Invernizzi et al., 2007). L’objectif du travail exposé dans ce chapitre est de caractériser par cette méthode les interactions entre l’hémocyanine de Carcinus maenas et deux modulateurs importants : le L-lactate et les cations divalents. Le principe de la spectrométrie de masse par nébulisation électrique (ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) est d’abord présenté ; cette méthode est utilisée en particulier dans ce chapitre mais aussi dans les études portant sur la plasticité phénotypique de Carcinus maenas et Segonzacia mesatlantica. Le contexte biologique de l’étude est ensuite présenté, puis les travaux et les résultats obtenus sont détaillés dans le manuscrit d’un article issu de cette étude et reproduit ici (actuellement en cours de soumission). L’ensemble des travaux présentés dans ce chapitre ont été réalisés en collaboration avec Peran Terrier de l’équipe LDSM2 de l’UMR 7177 (CNRS - Université Louis Pasteur) dirigée par Emmanuelle Leize-Wagner. 3.1 Problématique et objectifs de l’étude 3.1.1 Liaison et effet du L-lactate Chez les Crustacés, le L-lactate est un effecteur organique important de l’Hc (voir partie 1.4.2 dans l’introduction, page 51) (figure 3.1) (Truchot, 1980). Comme expliqué précédemment, il est produit par le métabolisme anaérobie de l’animal lors d’une hypoxie environnementale ou métabolique. Le L-lactate augmente en général l’affinité de l’hémocyanine pour l’oxygène (Truchot, 1980, 1992, Bridges, 2001) mais chez certaines espèces le pigment est peu ou pas sensible au L-lactate (par exemple chez des crevettes Thalassinidés vivant dans la vase (Taylor et al., 2000) ou chez Scyllarides
3.1. PROBLÉMATIQUE ET OBJECTIFS DE L’ÉTUDE 105 FIG. 3.1 – Structure du L-lactate. Le L-lactate est asymétrique au niveau du carbone central (*). Sa masse molaire est de 90 g.mol −1 et son pKa à 25°C, 100 kPa est de 3,85. Il est donc présent sous forme d’ion lactate à pH physiologique. latus (Sanna et al., 2004)). Un effet lactate inverse a même été observé chez une espèce terrestre, Gecarcoidea natalis (Adamczewska et Morris, 1998). La diminution de la sensibilité au lactate semble corrélée avec le passage à un mode de vie plus terrestre et à la ventilation aérienne (Morris et Bridges, 1994, Bridges, 2001). Des expériences avec des analogues du L-lactate et l’absence d’effet du D-lactate suggèrent que le L-lactate se lie de manière stéréospécifique à un site de l’hémocyanine (Johnson et al., 1988) et que la liaison se fait par l’intermédiaire des 4 positions autour du carbone chiral (Graham, 1985). Des expériences de calorimétrie (ITC, Isothermal Titration Calorimetry) réalisées sur des hémocyanines sensibles et insensibles au L-lactate ont montré que les hémocyanines insensibles ne liaient pas le L-lactate, contrairement aux hémocyanines sensibles (Taylor et al., 2000). Pour l’hémocyanine du crabe bleu Callinectes sapidus, des titrations du lactate donnent une valeur de constante de dissociation du lactate de 1,8 mM pour l’état oxygéné et 2,2 sites de fixation par hexamère, et des mesures par ultrafiltration donnent une valeur de 3,2 mM pour la constante de dissociation et 2,8 sites par hexamère (Johnson et al., 1984). Pour l’hémocyanine de la langouste Panulirus interruptus, une purification des sous-unités et la formation d’homohexamères sensibles ou insensibles a montré que la sensibilité au lactate dépend des sous-unités présentes (Johnson et al., 1987). L’analyse des courbes de dissociation de l’oxygène montre chez cette espèce la présence d’environ un site de fixation seulement par homohexamère et non six, ce qui suggère que le site n’est pas localisé sur une seule sous-unité mais émergerait de l’association des sous-unité en structure quaternaire (figure 3.2(c)) (Johnson et al., 1987). Pour l’hémocyanine du homard Homarus vulgaris, des expériences d’ultrafiltration et de dialyse à l’équilibre en utilisant des ligands marqués ont montré la présence d’environ 2 sites de fixation du lactate par dodécamère, ce qui est en accord avec les données obtenues pour Panulirus interruptus. L’urate aurait autant de site de fixation mais les sites de fixation du lactate et de l’urate seraient distincts et indépendants (Nies et al., 1992). Le lactate ne se lie pas de
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Chez les Crustacés Décapodes, la régulation de la fonction respiratoire d’un individu fait intervenir<br />
une modulation des propriétés de fixation de l’oxygène par l’hémocyanine à l’échelle moléculaire.<br />
Afin de comprendre les mécanismes mis en jeu, il est important de connaître les interactions entre le<br />
pigment respiratoire et ses modulateurs physiologiques.<br />
Ces interactions sont non-covalentes et réversibles et sont donc plus fragiles que des liaisons<br />
chimiques covalentes ; elles doivent être étudiées par des techniques permettant de les conserver lors<br />
de l’analyse. La spectrométrie de masse supramoléculaire, de développement relativement récent,<br />
permet de conserver ce type d’interaction et d’observer la masse de complexes non-covalents ; c’est<br />
un outil performant et puissant pour l’étude des interactions entre molécules biologiques de type<br />
protéine/protéine et protéine/lig<strong>and</strong> (Invernizzi et al., 2007).<br />
L’objectif du travail exposé dans ce chapitre est de caractériser par cette méthode les interactions<br />
entre l’hémocyanine de Carcinus <strong>maenas</strong> et deux modulateurs importants : le L-lactate et les cations<br />
divalents. Le principe de la spectrométrie de masse par nébulisation électrique (ElectroSpray Ionization<br />
Mass Spectrometry, ESI-MS) est d’abord présenté ; cette méthode est utilisée en particulier dans<br />
ce chapitre mais aussi dans les études portant sur la plasticité phénotypique de Carcinus <strong>maenas</strong> et<br />
<strong>Segonzacia</strong> <strong>mesatlantica</strong>. Le contexte biologique de l’étude est ensuite présenté, puis les travaux et<br />
les résultats obtenus sont détaillés dans le manuscrit d’un article issu de cette étude et reproduit ici<br />
(actuellement en cours de soumission).<br />
L’ensemble des travaux présentés dans ce chapitre ont été réalisés en collaboration avec Peran Terrier<br />
de l’équipe LDSM2 de l’UMR 7177 (CNRS - Université Louis Pasteur) dirigée par Emmanuelle<br />
Leize-Wagner.<br />
3.1 Problématique et objectifs de l’étude<br />
3.1.1 Liaison et effet du L-lactate<br />
Chez les Crustacés, le L-lactate est un effecteur organique important de l’Hc (voir partie 1.4.2<br />
dans l’introduction, page 51) (figure 3.1) (Truchot, 1980). Comme expliqué précédemment, il est<br />
produit par le métabolisme anaérobie de l’animal lors d’une hypoxie environnementale ou métabolique.<br />
Le L-lactate augmente en général l’affinité de l’hémocyanine pour l’oxygène (Truchot, 1980,<br />
1992, Bridges, 2001) mais chez certaines espèces le pigment est peu ou pas sensible au L-lactate (par<br />
exemple chez des crevettes Thalassinidés vivant dans la vase (Taylor et al., 2000) ou chez Scyllarides
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