le chitosane A. Renou(1) - Oiv2010.ge

Prévention du risque Brettanomyces par l’utilisation d’un biopolymère d’origine
fongique : le chitosane
A. Renou (1) , A. Bornet (2) , L. Pic-Blateyron (1) , D.Granès (1) , P.L. Teissedre (3)
(1) Institut Coopératif du Vin
La jasse de Maurin 34970 Lattes France
(2) KitoZyme sa,
Parc Industriel des Hauts-Sarts, Zone 2, Rue Haute Claire, 4, 4040 Herstal, Belgique
aurelie.bornet@kitozyme.com
(3) Université Victor Ségalen Bordeaux 2 ; Faculté d’Œnologie-UMR 1219
210, chemin de Leysotte CS 50008 33882 Villenave d'Ornon Cedex, France
RESUME
En 2009, KitoZyme a initié en collaboration avec l’ICV (Institut Coopératif du Vin), un projet
de recherche & développement dans le but d’étudier l’action du chitosane, un nouvel
auxiliaire technologique naturel de type polysaccharide, sur l’élimination des Brettanomyces
afin de répondre aux attentes des professionnels de la filière pour la prévention du risque
Brettanomyces.
Les résultats de ce projet ont montré que :
- le chitosane est efficace en 5 à 10 jours et son action n’est pas spécifique à une
souche de Brettanomyces bruxellensis.
- Le chitosane n’a pas d’impact sur les populations de Saccharomyces cerevisiae ni
sur le déroulement de la fermentation alcoolique.
- Le chitosane n’a pas d’impact sur le déroulement de la fermentation malolactique
(soit en mode spontanée, soit en inoculation). Toutefois, il est recommandé
d'attendre 8 jours après la fin du traitement avant de réaliser une inoculation en
bactéries lactiques.
SUMMARY
Kitozyme has initiated, in collaboration with ICV (Cooperative Wine Institute) ,an R&D
project with the aim at studying the effect of chitosan, a new natural oenological to prevent
the growth of Brettanomyces during winemaking processes.
The results of this project are as follows:
- The antimicrobial activity of chitosan is effective from 5 to 10 days on different strains
of Brettanomyces bruxellensis
- Saccharomyces cerevisiae and alcohol fermentation were not affected by the use of
chitosan
- Malolactic fermentation (either spontaneous or inoculated) is note affected by
treatement with chitosan. It’s recommended to except 8 days post- treatment to
realized inoculation with lactic bacteria.
INTRODUCTION
La découverte des levures du genre Brettanomyces remonte à 1904, lorsque Clausen les isole
dans un moût de brasserie. Depuis, les Brettanomyces sont décrits comme un agent de
contamination de nombreux produits de fermentation incluant le vin, le cidre, la bière, le

kombucha, le kefyr, la téquila, etc [Greenwalt C.J. et al., 2000 ; Martens H. et al 1997 ;
Morrissey W.F. et al. 2004 ; Silva P. et al. 2004 ; Teoh A.L. et al. 2004 ; Wyder M.T. et al.
1997].
Dans le milieu viticole, la détection de ces levures de contamination au vignoble est rendue
délicate par le fait qu’elles sont, à ce stade, minoritaires. Toutefois la fermentation (processus
de transformation des sucres en alcool) va entraîner une véritable « sélection » de ces
microorganismes. En effet, les Brettanomyces sont particulièrement résistantes à l’éthanol et
au SO 2 et sont capables de subsister dans le milieu malgré son appauvrissement en sucres. De
plus, certaines techniques ou certains protocoles de vinification peuvent favoriser le
développement des Brettanomyces dans le vin, comme l’élevage sur lies. Pour que les
Brettanomyces puissent se développer, moins de 500 mg/l de sucre suffisent.
L’impact des levures de contamination Brettanomyces a été prouvé par de nombreux auteurs
sur des vins dans différents pays [Di Stefano R. 1985 ; Ciolfi G. 1991 ; Tucknott J. 1977 ;
Heresztyn T. 1986 ; Henschke P. 1996 ; Fridriere I. et al. 1988], des vins mousseux allemands
[Barret et al. 1955] des vins jaunes d’Arbois [Galzy P. et al. 1955] ou des vins du midi de la
France. En 1965, Domercq a rapporté l’isolement des Brettanomyces dans des moûts des
appellations Saint Emilion et Premières Côtes de Bordeaux et dans des vins rouges ou blancs
en cours de conservation des appellations Médoc, Graves et Saint-Emilion.
Quant aux cépages, le pinot semble être le plus touché. En Bourgogne, par exemple, pour le
millésime 2000, 50% des vins en fermentation issus de ce cépage et 25% après embouteillage
avaient été affectés [Gerbaux V. et al. 2000].
En définitive, la maîtrise de cette altération reste difficile, même avec des pratiques
œnologiques réfléchies. Les moyens de lutte sont essentiellement curatifs, ils permettent
d’agir sur les populations de Brettanomyces (flash pasteurisation, filtration). Toutefois ces
traitements modifient les qualités organoleptiques des vins et ne préservent pas les vins traités
des contaminations ultérieures [Ruiz-Hernandez M . 2003 ; Calderon F. et al. 2004 ; Delfini
C. et al. 2002 ; Puig M. et al. 2003 ; Comitini F. et al. 2004 ; Blateyron L. et al. 2008].
Les propriétés antibactériennes et antifongiques du chitosane ont été largement étudiées et
documentées et sont aujourd’hui bien reconnues. Récemment KitoZyme a initié en
collaboration avec l’ICV (Institut Coopératif du Vin), un projet de recherche &
développement dans le but de proposer un auxiliaire technologique naturel de type
polysaccharide, le chitosane, qui puisse répondre aux attentes des professionnels de la filière
pour la prévention du risque Brettanomyces.
MATERIEL & METHODE
1- Le produit de traitement : le chitosane (Cs)
Le chitosane est un polysaccharide linéaire composé de la distribution le long de la chaîne
polymère des unités de répétition D-glucosamine (unité désacétylée) et N-acétyl-Dglucosamine
(unité acétylée). Le chitosane est obtenu par désacétylation (hydrolyse des
groupement N-acétyl) de la chitine. Il est produit à partir d’une source fongique, non-OGM, le
mycélium d’Aspergillus niger, un champignon microscopique utilisé pour la production
d’acide citrique à destination des industries alimentaires et pharmaceutiques.
Le chitosane se présente sous forme d’une poudre fine insoluble dans le vin, de couleur
blanche à légèrement brune, inodore et sans saveur. La structure chimique du chitosane est
illustrée sur la Figure 1.

Figure 1- Structure chimique du chitosane
2- Les souches de levure
Les souches de Brettanomyces bruxellensis utilisées pour l’inoculation artificielle du vin sont
des souches identifiées comme majoritaires sur le vignoble méditerranéen (Blateyron et al.
2008) et ont des génotypes 100% A et 100% B. Elles proviennent de la collection des souches
ICV-ADN id. Elles sont conservées à 4°C sur milieu gélosé incliné (milieu YAC).
3- Le milieu et les conditions de culture du levain
Le levain est un milieu d’acclimatation dans lequel les levures peuvent croître et atteindre une
population de l’ordre de 10 7 UFC/ml, tout en s’adaptant à un environnement peu favorable
(pH acide, taux en éthanol élevé)
La composition du levain utilisé pour les expérimentations est décrite dans le Tab. 1 suivant :
Tableau 1- Composition du milieu levain pour Brettanomyces bruxellensis
Composés
Concentrations/conditions
Yeast Nitrogen Base
6,7g/l
Glucose
20g/l
Ethanol
10% (v/v)
Eau déminéralisée
Compléter au volume souhaité
pH
Ajuster à 3,5 avec des cristaux d’acide tartrique
Stérilisation 20 min à 121°C
4- Techniques analytiques de dénombrement
Pour le suivi microbiologique, des échantillons de vins ont été prélevés à T0, T3 (T0+3 jours),
T7 (T0+7 jours), T10 (T0+10 jours), T25 (T0+25 jours). Le dénombrement des
Brettanomyces viables s’est fait par mise en culture sur milieu gélosé spécifique YAC (YEPD
+ Actidione + Chloramphénicol) selon le protocole suivant : les échantillons de vins sont
prélevés et dilués en cascade sous environnement stérile, dans des tubes contenant 9ml ou
9,9ml d’eau physiologique stérile. 100µl sont mis en culture par étalement sur milieu gélosé
YAC, à partir de la dilution appropriée pour avoir entre 30 et 300 colonies sur la gélose. Les
boîtes sont incubées à 28°C pendant 10 jours. Les mises en culture sont doublées.
RESULTATS & DISCUSSION
1- Effet du chitosane sur la croissance des Brettanomyces de profils génétiques
différents
Le vin choisi pour cette étude est un vin rouge du Languedoc Roussillon, millésime 2008 dont
les paramètres sont décrits dans le Tab. 2. Ce vin a été artificiellement contaminé par des
Brettanomyces de souche A ou de souche B. Le vin a ensuite subi un traitement suivant les
modalités 1, 2, et 3 décrites dans la Figure 2.

Tableau 2- Caractéristique analytique du vin
TAV
Sucres résiduels Acidité totale
SO
pH
2 actif
%
g/l
g/l H 2 SO 4
mg/l
13,78 1,7 3,18 3,45 < 0,02
Vin rouge inoculé en Brettanomyces : souche
A implantée depuis 24 jours
Vin rouge inoculé en Brettanomyces : souche
B implantée depuis 30 jours
(1)
Témoin
(2)
Traitement par le DMDC 20g/hl
(3)
Traitement par le Cs 4g/hl
Figure 2- Plan expérimental pour l’étude de l’effet du chitosane sur la croissance des
Brettanomyces de profils génétiques différents
Nous avons mis en évidence que les effets du DMDC et du chitosane sont similaires quelle
que soit la souche de Brettanomyces. Les résultats (Figures 3 et 4) montrent une réduction
significative des populations en Brettanomyces viables sous le seuil de détection
(

Modalité 1 Modalité 2 Modalité 3
100.000
Population souche B (UFC/mL)
10.000
1.000
100
10
1
0 5 10 15 20 25 30
Jours après traitement
Figure 4- Suivi de la population de Brettanomyces bruxellensis souche B dans le vin après le
traitement
2- Impact du chitosane sur les autres populations microbiologiques du vin
importantes dans le processus de vinification (Saccharomyces cerevisiae, Oenococcus
oeni)
2.1- Impact sur Saccharomyces cerevisiae
Pour cette étude le moût choisi est un jus de raisin blanc de la marque Casino qui a été
supplémenté en sucre pour atteindre la teneur de 200g/l et en azote pour atteindre une teneur
supérieure 200mg/l. Nous avons par la suite inoculé en Saccharomyces cerevisiae ICV D47 ®
à la dose de 30g/hl.
Comme il est décrit dans la Figure 5, l’ajout du chitosane a été réalisé en cours de
fermentation alcoolique à deux moments différents :
- densité de 1035 : 3 jours après le levurage
- densité de 1015 : 6 jours après le levurage
Moût en début de fermentation
(1)
Témoin
(2)
Densité moût 1035
Traitement par le Cs 4g/hl
(3)
Densité moût 1015
Traitement par le Cs 4g/hl
Fin de fermentation alcoolique
Figure 5- Plan expérimental pour l’étude de l’impact du chitosane sur la croissance des
Saccharomyces cerevisiae
La Figure 6 permet de démontrer que le chitosane n’a pas d’impact sur le déroulement de la
fermentation alcoolique. La période de 13 jours de la réalisation de la fermentation alcoolique
est identique quelle que soit la modalité.
La cinétique de croissance de la population de Saccharomyces cerevisiae (Figure 8) atteint sa
valeur maximale de l’ordre de 6.10 7 UFC/ml après 3 jours de fermentation, puis le nombre de

levures se maintient à 5.10 7 UFC/ml pendant 10 jours pour finalement amorcer sa phase de
décroissance après 13 jours de fermentation.
Cette cinétique est similaire pour toutes les modalités. Par conséquent nous pouvons conclure
que le chitosane n’a pas d’impact négatif sur les levures Saccharomyces cerevisiae.
Ces résultats sont en accord avec les travaux de Gomez-Rivas et al. en 2004 qui ont conclu
que le chitosane avait un effet inhibiteur sur Brettanomyces bruxellensis et un effet neutre
voire positif selon les doses employées sur Saccharomyces cerevisiae.
Modalité 1 Modalité 2 Modalité 3
Population (UFC/ml)
8,00E+07
7,00E+07
6,00E+07
5,00E+07
4,00E+07
3,00E+07
2,00E+07
1,00E+07
1120
1100
1080
1060
1040
1020
1000
980
960
Densité (g/l)
0,00E+00
0 3 6 10 13 17 21 35
jours après le levurage
940
Figure 6- Evolution de la population en Saccharomyces cerevisiae dans le moût avant et
après le traitement par du chitosane et suivi de la densité
2.2- Impact sur Oenococcus oeni
Le vin choisi pour cette étude est un vin rouge du Languedoc Roussillon, millésime 2008 dont
les paramètres sont décrits dans le Tab. 3. Nous avons inoculé ce vin en Oenococcus oeni
Elios 1 ® suivant les modalités décrites dans la Figure 7.
Tableau 3- Caractéristique analytique du vin
TAV
Sucres Acidité totale
Acide malique Acide lactique SO
pH
2 actif
% résiduels g/l g/l H 2 SO 4
g/l
g/l
mg/l
12,95 1,4 3,09 3,58 1,26 0,18 0,03
Vins dont la fermentation malolactique est non réalisée
(1)
Témoin
Pas d’inoculation
Elios 1 ® (2)
Traitement Cs 4g/hl
Pas d’inoculation Elios 1 ® (3)
Traitement Cs 4g/hl
8 jours après traitement
inoculation Elios 1 ®
Figure 9- Plan expérimental pour l’étude de l’impact du chitosane sur la croissance des
Oenococcus oeni
Lors d’un pécédent essai non présenté ici, nous avons démontré grâce au suivi
microbiologique des bactéries lactiques et au suivi de la dégradation de l’acide malique qu’un
traitement au chitosane à la dose de 4g/hl bloque le développement et l’activité des bactéries
lactiques si ces dernières sont inoculées dans les 3 jours suivant le traitement par le chitosane.

Lors de ce second essai, nous avons pu démontrer qu’un traitement au chitosane réalisé 8
jours avant l’inoculation en bactéries lactiques n’a pas d’impact sur la réalisation de la
fermentation malolactique (modalité 3).
Dans le cas d’une fermentation malolactique spontanée (modalité 2), le traitement par le
chitosane a pour effet de rallonger la phase de latence de la fermentation malolactique de 3
jours.
En conclusion, lors d'un traitement au chitosane, il est recommandé d'attendre 8 jours après la
fin du traitement avant de réaliser une inoculation en bactéries lactiques.
Modalité 1 Modalité 2 Modalité 3
3500000
1,4
3000000
1,2
Population (UFC/ml)
2500000
2000000
1500000
1000000
1
0,8
0,6
0,4
Acide malique (g/l)
500000
0,2
0
0 12 16 20 23
Jours après ensemencement
0
Figure 10- Evolution de la population en Oenococcus oeni dans le vin avant et après le
traitement par du chitosane et suivi de la FML
CONCLUSIONS
Ce projet de recherche & développement initié en collaboration avec ICV avait pour but de
proposer un auxiliaire technologique alternatif au DMDC (limité aux vins avec sucres
résiduels, nécessitant un dispositif d’injection spécifique et de ce fait souvent limité à une
application au moment du conditionnement) qui puisse répondre aux besoins des
professionnels de l’œnologie et du conditionnement tout en tenant compte des exigences de
sécurité alimentaire pour le consommateur.
Ce projet a permis de montrer que :
- l’action du chitosane n’est pas spécifique à une souche de Brettanomyces
bruxellensis : les souches A et B testées ont toutes deux été éliminées par le
chitosane en 5 à 10 jours.
- le chitosane n’a pas d’impact sur les populations de Saccharomyces cerevisiae ni
sur le déroulement de la fermentation alcoolique.
- Le chitosane n’a pas d’impact sur le déroulement de la fermentation malolactique
(soit en mode spontanée, soit en inoculation). Toutefois, il est recommandé
d'attendre 8 jours après la fin du traitement avant de réaliser une inoculation en
bactéries lactiques.
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