analyse de 19 pesticides dans le vin par sbse - Oiv2010.ge

ANALYSE DE 19 PESTICIDES DANS LE VIN PAR SBSE (STIR BAR
SORPTIVE EXTRACTION)
Grinbaum Magali (1) , Philippe Thierry (2) , Champeau Nelly (2) , Puech Carole (2) , Frégière
Aline (2) , Bach Benoît (2) and Barnavon Laurent (2)
RÉSUMÉ
(1)
Institut Français de la Vigne et du Vin à la station Inter Rhône
2260, route du Grès, 84100 Orange, France
magali.grinbaum@vignevin.com / mgrinbaum@inter-rhone.com
(2) Inter Rhône, Service technique
2260, route du Grès, 84100 Orange, France
lbarnavon@inter-rhone.com
La SBSE suivie d'une chromatographie gazeuse couplée à un détecteur de spectrométrie de
masse (MS) a été optimisée (température, ajout de NaCl et temps) pour l'analyse de 19
pesticides les plus représentés dans les vins. Les conditions analytiques suivantes ont été
retenues : 12,5 mL de vin sont agités à 400 tr/min pendant 45 minutes à température
ambiante. L’addition de 2,5 g de NaCl, a considérablement augmenté le rapport signal/bruit
probablement en améliorant l'affinité des pesticides pour le PDMS (polydimethysiloxane). La
quantification est réalisée par ajout de trois différents standards internes variant par l’intensité
du signal de détection. La validation de la méthode a été réalisée selon les recommandations
fixées par la Guide de validation OIV (oeno 10/05) et le document SANCO/2007/3131. La
méthode a été appliquée avec succès à une étude interlaboratoire, ainsi qu’à l'analyse de 30
vins. En conclusion, cette méthode sans solvants, est rapide et fiable et peut être utilisée par
une vaste gamme de laboratoires œnologiques équipés de SBSE-CPG-SM.
Stir bar sorptive extraction (SBSE) followed by a thermal desorption-gas chromatography
coupled to a mass spectrometry (MS) detector was evaluated for analyzing 19 of the most
important pesticides in wines. After optimization of the SBSE method (temperature, NaCl
addition and time), the optimal analytical conditions were: 12,5 mL of wine sample was
stirred at 400 rpm for 45 min at room temperature. The addition of 2,5 g of NaCl significantly
increased the ratio signal/noise probably by improving the affinity of pesticides for
polydimethysiloxane (PDMS) sorbent. Experiments were carried out using samples spiked
with three different internal standards varying by the detection signal in the MS detector. The
method was validated according to the OIV validation Guide (oeno 10/05) and the document
SANCO/2007/3131. The method has been successfully applied to an inter collaborative trial,
and to the analysis of 30 wine samples. Eventually, this method is solvent free, fast and
reliable and can be used by a large range of enological laboratories possessing SBSE-GC-MS.
INTRODUCTION
Depuis de nombreuses années, la qualité des produits alimentaires consommés par l’homme
est devenue un sujet important tant pour les consommateurs que pour les filières les
produisant. L’essor de l’agriculture biologique, le souci des consommateurs pour des produits
sains ainsi que les enjeux commerciaux et réglementaires autour de ce sujet en sont autant de
témoins.

Le vin n’échappe pas à cette tendance. En effet, depuis une quarantaine d’années, la
consommation de vin en France a subi de profondes modifications. Désormais, les Français
achètent moins mais mieux, la dépense moyenne par bouteille ne cessant d’augmenter. Ce
mouvement n’est pas un phénomène isolé puisqu’il touche aussi d’autres pays de traditions
viticoles comme l’Italie et l’Espagne.
La détection de molécules indésirables dans les vins est donc devenue un enjeu majeur pour
les laboratoires de la filière. Parmi elles figurent les pesticides qu’il est devenu primordial de
doser afin de rassurer consommateurs et professionnels sur la qualité des vins.
Dans cet objectif, INTER RHONE, interprofession des vins AOC Côtes du Rhône et Vallée
du Rhône, cherche à développer une méthode de dosage multi-résidus des traces de pesticides
dans les vins. Jusqu’à présent, les pesticides étaient dosés par des techniques mono-résidus.
Les avantages d’une méthode multi-résidus résident dans une diminution des délais, des coûts
et par la capacité à balayer une large gamme de pesticides en une seule analyse. La SBSE-
GC/MS semble tout à fait appropriée à cet effet. Cette méthode analytique est simple à mettre
en œuvre, rapide et plus sensible que des techniques classiques comme la GC-ECD, GC-FID
et HPLC-DAD. L’utilisation de la SBSE pour extraire les contaminants permet, en outre, de
s’affranchir complètement de l’utilisation de solvants. Cette méthode représente une
alternative « sans solvant » à l’analyse de nombreux composés présents dans les vins. Les
réductions de coût se font à double niveau : diminution des achats de solvant et diminution
des coûts de retraitement des solvants assuré par des entreprises spécialisées. Ce dernier point
est d’autant plus important pour les analyses faisant intervenir des solvants chlorés, dont le
retraitement est encore plus onéreux. De plus, cette technique permet de prélever un faible
volume d’échantillon et de diminuer les coûts de main d’œuvre.
L’objectif de ce travail consistait à mettre au point une méthode de dosage multi-résidus de
pesticides dans les vins par SBSE-GC/MS et à valider cette méthode selon les spécifications
émises par l’Organisation Internationale de la Vigne et du Vin (OIV).
MATERIELS ET METHODES
Les pesticides utilisés pour les analyses ont une pureté comprise entre 96 et 99,5%. Les
analyses ont été effectuées sur un chromatographe gaz Agilent 7890A équipé d’un passeur
d’échantillons Gerstel MPS 2 et d’une colonne HP-5MS (J&W Scientific) présentant les
caractéristiques suivantes : longueur = 30m ; diamètre intérieur = 0.25 mm ; épaisseur du film
de phase stationnaire = 0.25 µm ; phase stationnaire : 95% polydiméthylsiloxane greffée 5%
diphényl.
Identification des molécules
L’identification des molécules (liste et caractéristiques Tab. 1) dans le vin a été réalisée
selon les critères suivants :
- temps de rétention identique à celui de la molécule injectée seule dans le vin,
- reconnaissance des ions fragments caractéristiques de la molécule.

Tableau 1 : Temps de rétention (Tr), ions quantificateurs et qualificateurs (Q1, Q2,
Q3), coefficients correcteurs en fonction de l’étalon interne choisi et rappel des
principaux paramètres de validation.
Abréviation
Tr
(min)
ion quantificateur
Ions Coefficients correcteurs Limites (µg/L) Fidélité méthode
Q1 Q2 Q3
Hepta- Triphéchlor
E. nyl
p-ter
d14
LD LQ r (µg/L) R (µg/L)
Benalaxyl BA 19,49 148 91 206 204 0,10 1,09 2,98 1,7 5 0,52 7,81
Chlorpyriphos CP 14,7 314 197 97 0,33 3,61 9,90 1,7 5 0,32 4,07
Cyproconazole CZ 17,93 139 222 125 3,20 35,84 97,28 1,7 5 0,5 10,11
Cyprodinil CD 15,32 224 225 210 226 0,33 3,66 10,04 1,7 5 0,33 3,43
Fenbuconazole FB 27,5 129 198 125 1,34 15,29 39,66 1,7 5 0,45 18,15
Fenexhamid FH 19,87 301 177 97 9,22 106,01 271,91 1,7 5 0,46 12,55
Fenitrothion FE 14,23 277 260 125 0,34 3,93 10,22 3,4 10 0,6 13,95
Fludioxonil FD 17,08 248 182 154 0,43 4,76 13,04 1,7 5 0,5 6,27
Flusilazole FL 17,45 233 315 206 0,13 1,47 4,02 1,7 5 0,59 7,74
Iprodione IP 18,47 187 244 189 246 2,11 24,05 62,33 3,4 10 1,19 6,61
Iprovalicarb
IC1 ;
IC2
17,17 ;
17,45
134 116 58 0,69 7,91 20,82 3,4 10 0,98 9,26
Mepanipyrim MP 16,46 222 223 0,09 1,03 2,71 3,4 10 0,89 7,06
Penconazole PE 15,56 159 248 161 0,23 2,52 6,91 1,7 5 0,5 4,63
Procymidone PR 15,99 283 285 96 0,24 2,62 7,19 1,7 5 0,45 6,2
Pyrimethanil PL 12,48 198 199 0,68 7,48 20,49 3,4 10 0,68 2,61
Quinoxifen QN 19,59 237 272 307 0,10 1,08 2,97 1,7 5 0,38 5,62
Tebuconazole TE 20,3 250 125 0,48 5,43 14,40 3,4 10 0,88 11,08
Tebufenpyrad TB 276 276 171 318 1,36 15,56 40,26 1,7 5 0,27 4,88
Vinchlozoline VI 13,57 285 212 198 0,42 4,61 12,65 1,7 5 0,23 2,43
Quantification des molécules
Les pesticides ont été quantifiés selon la méthode de l’étalonnage interne.
La relation utilisée pour calculer la concentration en analyte dans l’échantillon (C analyte ) est
la suivante :
Avec :
Aire analyte : Aire du pic chromatographique de l’analyte
Aire étalon : Aire du pic chromatographique de l’étalon interne
C étalon : Concentration de l’étalon interne dans l’échantillon.
Le coefficient correcteur rend compte du coefficient de réponse relatif du composé à doser
vis-à-vis de l’étalon interne ainsi que de l’affinité de chaque composé pour le PDMS. Celui-ci
est caractéristique de chaque couple molécule / étalon interne utilisé pour quantifier la
molécule d’intérêt.
Il sera déterminé, pour chaque couple molécule / étalon interne, par injection d’une gamme
permettant de tracer la droite de régression :

Choix des étalons internes
Les trois étalons internes suivants ont été choisis :
- l’heptachlor epoxyde
- le triphénylphosphate
- le p-terphényl d14
La concentration finale des étalons internes dans l’échantillon est 5 µg/L à l’exception de
l’heptachlor epoxyde (0,5 µg/L).
Mode opératoire
- Prélever 10 ml du vin à analyser à l’aide d’une pipette jaugée et les introduire dans un
pilulier de 12.5 ml.
- Ajouter les étalons internes.
- Ajouter le twister (longueur = 10 mm, épaisseur du film de PDMS = 1 mm).
- Recouvrir le pilulier d’une feuille d’aluminium pour éviter toute contamination au contact
de la cape puis refermer le pilulier avec la cape.
- Placer sur une table d’agitation pendant 45 mn à 400 tr/min.
- Récupérer le twister en vidant le pilulier au dessus d’une passoire métallique, le rincer à
l’eau distillée pour éliminer d’éventuelles impuretés et l’essuyer sur du papier non pelucheux.
- Introduire le twister à l’aide d’une pince métallique dans un tube TDU.
- Lancer l’analyse.
RESULTATS ET DISCUSSION
Optimisation des conditions opératoires
La méthode a été préalablement optimisée afin d’obtenir les temps de rétention et les ions
quantificateurs de chaque pesticide et des étalons internes (Tab. 1). D’autre part, des vins
exempts de pesticides ont été choisis pour l’étude. Une méthode élaborée par le laboratoire
SARCO a été testée pour la quantification des 19 molécules.
Cependant, les molécules suivantes : cyproconazole (CZ), fenbuconazole (FB), fenexhamid
(FH), iprodione (IP), iprovalicarb (IC), metalaxyl-M (MF), tebuconazole (TE) sont difficiles à
détecter à une concentration de 20 µg/L. Or, l’objectif était de disposer d’une méthode dont
les limites de quantification pour chaque molécule est de l’ordre de 5 à 10 µg/L. Il est donc
décidé de développer une méthode spécifique à ces sept pesticides ou une méthode globale
permettant l’analyse simultanée des 19 pesticides. Ainsi, deux paramètres seront étudiés : les
conditions chromatographiques et les conditions de la phase d’extraction des pesticides par
SBSE.
Les conditions chromatographiques sont modifiées en fonction des températures d’ébullition
des molécules extrapolées à partir de leurs temps de rétention avec la méthode de départ. De
nombreuses modifications ont été réalisées concernant les gradients de température et les
paramètres de l’unité thermique de désorption, néanmoins, aucun des essais n’apporte de
variation significative de la réponse des molécules par rapport à la méthode de départ.
Une étude (Ochiai et al., 2006) a montré l’influence de l’ajout de chlorure de sodium sur la
modification des conditions d’extraction des pesticides par SBSE. En effet, l’ajout de chlorure
de sodium dans la matrice à analyser permettrait d’augmenter les rendements d’extraction des
composés les plus polaires c’est-à-dire ayant une faible affinité pour le PDMS du twister. Une

des explications serait que le chlorure de sodium permettrait de modifier les coefficients de
partage Ko/w de chaque molécule et donc d’augmenter l’affinité des composés les plus
polaires pour le PDMS. D’autre part, de nombreuses méthodes utilisant la technique
« QuECHER » (Zhang et al., 2009) ont aussi recours à l’ajout de chlorure de sodium pendant
la phase d’extraction. L’influence de l’ajout de deux sels sur la réponse de ces 8 molécules a
été étudiée : le chlorure de sodium et le sulfate de sodium.
L’ajout de sels permet d’augmenter significativement les réponses des pesticides (Figure 1).
En effet, un ajout de NaCl permet d’augmenter les réponses d’un facteur 1.5 (FB) jusqu’à un
facteur 15 (IC).
Figure 1 : réponses des molécules en fonction de la quantité de NaCl.
Pour Na 2 SO4 (résultats non montrés), les facteurs de multiplication varient de 1.5 (FB) à 11
(IC).
Le chlorure de sodium étant un produit facilement disponible, économique, il sera préféré au
sulfate de sodium. Des essais complémentaires ont montré que les réponses des molécules
continuaient à augmenter jusqu’à un maximum de 2.5g de NaCl ajouté (réponses multipliées
par 2 pour FB et jusqu’à 23 pour IC).
L’ajout de NaCl pendant la phase d’extraction permet d’augmenter suffisamment les
réponses des 8 molécules pour qu’elles soient quantifiables à des concentrations de l’ordre de
5 à 10 µg/L. Toutefois, cela nécessite de réaliser deux analyses par échantillon. Cependant,
afin de disposer d’une seule méthode pour l’analyse des 19 pesticides, la méthode a été
transposée avec succès à l’ensemble des pesticides étudiés (Figure 2).

Figure 2 : Chromatogramme en mode SCAN des 19 molécules dans le vin avec la
méthode optimisée.
Linéarité des étalons internes
La linéarité de l’heptachlor epoxyde, du triphénylphosphate et du p-terphényl d14 est
contrôlée. Pour cela, chaque étalon est injecté seul dans le vin selon les gammes suivantes :
- Heptachlor epoxyde : 0.5 ; 1 ; 2.5 ; 5 ; 10 ; 20 µg/L
- Triphénylphosphate : 0.25 ; 0.5 ; 1.25 ; 2.5 ; 5 ; 10 µg/L
- p-terphényl d14: 0.25 ; 0.5 ; 1.25 ; 2.5 ; 5 ; 10 µg/L.
La linéarité est vérifiée pour chaque étalon interne par le tracé du graphique aire étalon = f
(concentration étalon). Les trois molécules présentent une linéarité très satisfaisante avec un
R² > 0.998. Ils seront utilisés comme étalons internes pour la suite de l’étude.
Les concentrations des trois étalons internes dans le vin ont été déterminées en fonction de
leur réponse : faible, intermédiaire, grande, afin de couvrir l’ensemble des gammes de
réponses des pesticides. Ils seront injectés à une concentration de 5 µg/L dans le vin :
- L’heptachlor epoxyde (aire attendue du pic = 5000 ua pour unité d’aire) servira à
quantifier les molécules dont les aires de pics ne dépassent pas les 20 000 ua.
- Le triphénylphosphate (aire attendue du pic = 50 000 ua) permettra la quantification des
molécules dont les aires de pics varient entre 20 000 et 100 000 ua.
- Le p-terphényl d14 (aire attendue du pic = 150 000 ua) permettra la quantification des
molécules dont les aires de pics excédent les 100 000 ua.

Détermination des coefficients correcteurs
Les coefficients correcteurs ont été vérifiés par l’injection d’une gamme à 6 niveaux de
concentration et 4 répliques par niveaux de concentration pour chaque molécule. Les
répliques sont effectuées à des jours différents. Pour chaque couple pesticide / étalon interne,
le coefficient correcteur a été déterminé de la façon suivante :
Les coefficients correcteurs ont été calculés pour chaque pesticide (Tab. 1).
Le biais entre les mesures et les valeurs obtenues par la fonction de calibration n’excède pas
les ± 20% de la courbe de calibration comme précisé dans le document N°SANCO/2007/3131
(2007).
Pour rappel, les conditions opératoires de la phase d’extraction des pesticides par SBSE sont
les suivantes :
- ajout de 2.5 g de NaCl dans les piluliers avant introduction du vin,
- ajout de 30 µL de la solution de travail contenant les trois étalons internes.
La méthode est à présent optimisée. Pour chaque pesticide, le temps de rétention, l’ion
quantificateur spécifique et les coefficients correcteurs ont été déterminés. La validation de la
méthode peut désormais être réalisée selon les spécifications du Guide de validation OIV
(oeno 10/05). Les paramètres de validation retenus sont les suivants : linéarité, vérification
des coefficients correcteurs (à partir d’un vin provenant d’essais interlaboratoires), limites de
détection et de quantification, répétabilité, reproductibilité intralaboratoire et spécificité. Les
principaux résultats sont présentés dans le tableau 1.
CONCLUSION
Une méthode simple, rapide, peu coûteuse (absence de solvants) et permettant de doser 19
pesticides simultanément a été optimisée. L’ensemble des critères de validation ont été
confrontés aux tests statistiques et se sont révélés positifs, permettant de conclure que la
méthode est validée et qu’elle pourra être utilisée en routine pour l’analyse des pesticides dans
les vins.
De plus, deux échantillons d’un même vin (vin rouge issu de l’agriculture biologique)
provenant d’un essai interlaboratoire ont été analysés. L’essai portait sur 28 pesticides répartis
de manière égale entre les deux échantillons (14 pesticides par échantillon).
Les deux échantillons ont été analysés par plusieurs opérateurs, et aucuns résultats fauxpositifs
n’ont été observés. Les écarts les plus importants avec la quantité de pesticide ajoutée
aux échantillons se situent à ±40%, le biais moyen est de 18 % et l’écart médian de 16%. Ces
résultats sont donc très satisfaisants et valident l’utilisation de la méthode en routine.
Remerciements :
Les auteurs souhaitent remercier Marie-Laure Murat et Stéphane La Guerche du laboratoire
SARCO, Gilles de Revel de l’ISVV Bordeaux et Pascal Hoogenbosch de RIC France pour
leur aimable collaboration.

BIBLIOGRAPHIE
Document N°SANCO/2007/3131. 2007. « Method validation and quality control procedures
for pesticides residues analysis in food and feed ».
http://ec.europa.eu/food/plant/protection/resources/qualcontrol_en.pdf
N. Ochiai, K. Sasamoto, H. Kanda, S. Nakamura. 2006. Fast screening of pesticides
multiresidues in aqueous samples by dual Stir Bar Sorptive Extraction (dual SBSE) and
thermal desorption ». Gerstel, application note : Appnote-12.
http://www.gerstel.com/pdf/p-gc-an-2006-12.pdf
K. Zhang, J. Wong, D. Hayward, P. Sheladia, A. Krynitsky. 2009. Multiresidues analysis of
wine by Dispersive Solid-Phase Extraction and Ultra High Performance Liquid
Chromatography # Tandem Mass Spectrometry. Journal. Agric. Food chem., 57 (10),
4019-4029