Rôle de la protéine associée au nucléoïde Fis dans le contrôle de la ...

N° d’ordre : 2007-ISAL-0116 Année 2007 

Thèse 

Rôle de la protéine associée au nucléoïde Fis 

dans le contrôle de la virulence 

chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi. 

présentée devant 

L’Institut National des Sciences Appliquées de Lyon 

pour obtenir 

le grade de Docteur 

Ecole doctorale : Evolution, Ecosystème, Microbiologie, Modélisation 

Spécialité : Microbiologie 

par 

Thomas LAUTIER 

Soutenue publiquement le jeudi 20 décembre 2007 devant la Commission d’examen 

JURY 

Mr Carlos BLANCO, Professeur à l’Université de Rennes I, 

Rapporteur 

Mr Claude GUTIERREZ, Professeur à l’Université Toulouse III, 

Rapporteur 

Mr Hafid ABAIBOU, Responsable Senior R&D, Biomérieux, 

Examinateur 

Mr Philippe LEJEUNE, Professeur à l’INSA de Lyon, 

Examinateur 

Mme Marie-Andrée MANDRAND-BERTHELOT, Directeur de Recherche CNRS, Examinateur 

Mr William NASSER, Directeur de Recherche CNRS, 

Directeur de thèse 

1

INSA Direction de la Recherche - Ecoles Doctorales 2007 

SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE 

CHIMIE 

E.E.A. 

E2M2 

EDIIS 

EDISS 

Math IF 

MEGA 

SSED 

CHIMIE DE LYON 

http://sakura.cpe.fr/ED206 

M. Jean Marc LANCELIN 

Insa : R. GOURDON 

ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, 

AUTOMATIQUE 

http://www.insa-lyon.fr/eea 

M. Alain NICOLAS 

Insa : D. BARBIER 

ede2a@insa-lyon.fr 

Secrétariat : M. LABOUNE 

AM. 64.43 – Fax : 64.54 

EVOLUTION, ECOSYSTEME, 

MICROBIOLOGIE, MODELISATION 

http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2 

M. Jean-Pierre FLANDROIS 

INSA : H. CHARLES 

INFORMATIQUE ET INFORMATION 

POUR LA SOCIETE 

http://ediis.univ-lyon1.fr 

M. Alain MILLE 

Secrétariat : I. BUISSON 

INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTE 

M. Didier REVEL 

Insa : M. LAGARDE 

MATERIAUX DE LYON 

M. Jean Marc PELLETIER 

Secrétariat : C. BERNAVON 

83.85 

MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE 

FONDAMENTALE 

M. Pascal KOIRAN 

Insa : G. BAYADA 

MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE 

CIVIL, ACOUSTIQUE 

M. Jean Louis GUYADER 

Secrétariat : M. LABOUNE 

PM : 71.70 –Fax : 87.12 

SCIENCES DES SOCIETES, DE 

L’ENVIRONNEMENT ET DU DROIT 

Mme Claude-Isabelle BRELOT 

Insa : J.Y. TOUSSAINT 

M. Jean Marc LANCELIN 

Université Claude Bernard Lyon 1 

Bât CPE 

43 bd du 11 novembre 1918 

69622 VILLEURBANNE Cedex 

Tél : 04.72.43 13 95 Fax : 

lancelin@hikari.cpe.fr 

M. Alain NICOLAS 

Ecole Centrale de Lyon 

Bâtiment H9 

36 avenue Guy de Collongue 

69134 ECULLY 

Tél : 04.72.18 60 97 Fax : 04 78 43 37 17 

eea@ec-lyon.fr 

Secrétariat : M.C. HAVGOUDOUKIAN 

M. Jean-Pierre FLANDROIS 

CNRS UMR 5558 


Bât G. Mendel 


69622 VILLEURBANNE Cédex 

Tél : 04.26 23 59 50 Fax 04 26 23 59 49 

06 07 53 89 13 

e2m2@biomserv.univ-lyon1.fr 

M. Alain MILLE 


LIRIS - EDIIS 

Bâtiment Nautibus 



Tél : 04.72. 44 82 94 Fax 04 72 44 80 53 

ediis@liris.cnrs.fr - alain.mille@liris.cnrs.fr 

M. Didier REVEL 

Hôpital Cardiologique de Lyon 

Bâtiment Central 

28 Avenue Doyen Lépine 

69500 BRON 

Tél : 04.72.35 72 32 Fax : 

Didier.revel@creatis.uni-lyon1.fr 

M. Jean Marc PELLETIER 

INSA de Lyon 

MATEIS 

Bâtiment Blaise Pascal 

7 avenue Jean Capelle 

69621 VILLEURBANNE Cédex 

Tél : 04.72.43 83 18 Fax 04 72 43 85 28 

Jean-marc.Pelletier@insa-lyon.fr 

M.Pascal KOIRAN 

Ecole Normale Supérieure de Lyon 

46 allée d’Italie 

69364 LYON Cédex 07 

Tél : 04.72.72 84 81 Fax : 04 72 72 89 69 

Pascal.koiran@ens-lyon.fr 

Secrétariat : Fatine Latif - latif@math.univ-lyon1.fr 

M. Jean Louis GUYADER 

INSA de Lyon 

Laboratoire de Vibrations et Acoustique 

Bâtiment Antoine de Saint Exupéry 

25 bis avenue Jean Capelle 


Tél :04.72.18.71.70 Fax : 04 72 18 87 12 

mega@lva.insa-lyon.fr 

Mme Claude-Isabelle BRELOT 

Université Lyon 2 

86 rue Pasteur 

69365 LYON Cedex 07 

Tél : 04.78.69.72.76 Fax : 04.37.28.04.48 

Claude-isabelle.brelot@univ-lyon2.fr 

3

SOMMAIRE 

Remerciements _____________________________________________________________ 6 

Liste des figures et tableaux___________________________________________________ 8 

Abréviations ______________________________________________________________ 11 

Résumé __________________________________________________________________ 14 

Summary_________________________________________________________________ 15 

INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE ______________________________________ 16 

I Les interactions hôte-pathogène ___________________________________________ 16 

IA Définir un pathogène ____________________________________________________________ 16 

IB Les facteurs de virulence : acteurs moléculaires de la pathogénie__________________________ 19 

I.B.1 Les facteurs de virulence précoces _____________________________________________ 21 

I.B.1.1 La mobilité __________________________________________________________ 21 

I.B.1.2 L’adhérence _________________________________________________________ 24 

I.B.1.2.a Les adhésines ______________________________________________________ 24 

I.B.1.2.b Les lipopolysaccharides ______________________________________________ 25 

I.B.1.2.c Les exopolysaccharides_______________________________________________ 27 

I.B.1.2.d Les flagelles _______________________________________________________ 27 

I.B.1.3 Les harpines _________________________________________________________ 27 

I.B.2 Les facteurs de propagation __________________________________________________ 28 

I.B.2.1 Les enzymes dégradatives des bactéries pathogènes des animaux ________________ 28 

I.B.2.2 Les enzymes dégradatives des bactéries phytopathogènes ______________________ 29 

I.B.2.3 Les toxines __________________________________________________________ 30 

I.B.2.3.a Exotoxines_________________________________________________________ 30 

I.B.2.3.b Endotoxines _______________________________________________________ 31 

IC Résistance aux systèmes de défenses de l’hôte ________________________________________ 32 

I.C.1 Défenses des animaux ______________________________________________________ 32 

I.C.2 Réactions de défenses des plantes _____________________________________________ 32 

I.C.2.1 La réaction hypersensible, induite par le stress oxydant________________________ 32 

I.C.2.2 Les systèmes de défenses contre le stress oxydant ____________________________ 35 

ID Conclusion sur les intéractions hôte-pathogène ________________________________________ 37 

II Régulation de l’expression génique chez les procaryotes _______________________ 37 

IIA Au niveau de l’initiation de la transcription ________________________________________ 37 

II.A.1 L’ARN polymérase est l’élément central de la transcription _________________________ 37 

II.A.1.1 L’enzyme core, la partie catalytique de l’ARN polymerase _____________________ 38 

II.A.1.2 La région promotrice : à la fois structurée et modulaire ________________________ 39 

II.A.1.3 Les étapes de l’initiation de la transcription _________________________________ 41 

II.A.2 La régulation de l’initiation de la transcription ___________________________________ 44 

II.A.2.1 Les acteurs __________________________________________________________ 44 

II.A.2.1.a Les facteurs sigma : acteurs de la reconnaissance des promoteurs _____________ 44 

II.A.2.1.a.i La sous-unité sigma (σ) __________________________________________ 44 

II.A.2.1.a.ii Les facteurs σ impliqués dans la transcription des gènes de virulence ______ 45 

II.A.2.1.a.iii Régulation de l’activité des facteurs sigma __________________________ 47 

II.A.2.1.b Les petits ligands___________________________________________________ 47 

II.A.2.1.c Les facteurs de transcription __________________________________________ 48 

II.A.2.1.c.i Les activateurs _________________________________________________ 49 

II.A.2.1.c.ii Les répresseurs ________________________________________________ 51 

II.A.3 La chromatine bactérienne a une organisation dynamique___________________________ 53 

II.A.3.1 Les « Nucleoid Associated Proteins » (NAP) ________________________________ 56 

II.A.3.1.a Les principales NAP impliquées dans la régulation de la virulence ____________ 59 

II.A.3.1.a.i H-NS_________________________________________________________ 59 

II.A.3.1.a.ii Fis __________________________________________________________ 61 

II.A.3.1.a.iii IHF _________________________________________________________ 62 

II.A.3.1.a.iv HU _________________________________________________________ 62 

4

II.A.4 Dynamique de régulation ____________________________________________________ 63 

II.A.4.1 Un régulateur spécifique couplé à un régulateur général _______________________ 63 

II.A.4.2 Connexion entre régulateurs : réseau de régulation génétique ___________________ 67 

II.A.4.3 La régulation de la synthèse des facteurs de virulence est un processus complexe. ___ 68 

IIB Autres mécanismes de la régulation de la synthèse protéique chez les procaryotes __________ 68 

III Erwinia chrysanthemi, une bactérie phytopathogène _________________________ 71 

IIIA Taxonomie des Erwiniae_______________________________________________________ 71 

IIIB Distribution géographique______________________________________________________ 72 

IIIC Le pouvoir pathogène d’E. chrysanthemi __________________________________________ 74 

III.C.1 Un pouvoir pathogène multifactoriel_________________________________________ 75 

III.C.1.1 La paroi végétale et la pectine____________________________________________ 77 

III.C.1.2 Les pectinases, facteurs de virulence majeurs chez E. chrysanthemi ______________ 78 

III.C.1.2.a Les pectine estérases________________________________________________ 80 

III.C.1.2.b Les dépolymérases _________________________________________________ 81 

III.C.1.2.c Les endo-pectate lyases : déterminantes dans le pouvoir pathogène ___________ 82 

III.C.1.2.d Organisation génétique des pectinases __________________________________ 84 

IIID Régulation de la dégradation de la pectine chez Erwinia chrysanthemi ___________________ 85 

III.D.1 Inductions par les composés végétaux________________________________________ 85 

III.D.1.1 Le répresseur KdgR ___________________________________________________ 85 

III.D.1.2 Le régulateur Pir ______________________________________________________ 87 

III.D.2 La répression catabolique _________________________________________________ 87 

III.D.3 Régulation par diverses conditions physico-chimiques ___________________________ 88 

III.D.3.1 Osmolarité___________________________________________________________ 88 

III.D.3.2 Température _________________________________________________________ 89 

III.D.3.3 pH _________________________________________________________________ 89 

III.D.3.4 Carence en fer ________________________________________________________ 89 

III.D.3.5 Carence en oxygène et en azote __________________________________________ 90 

III.D.4 Les régulateurs répondant à des signaux encore inconnus_________________________ 90 

III.D.4.1 PecS _______________________________________________________________ 91 

III.D.4.2 PecT _______________________________________________________________ 91 

III.D.4.3 H-NS_______________________________________________________________ 92 

III.D.5 Régulation en fonction de la phase de croissance _______________________________ 92 

III.D.5.1 Sigma S_____________________________________________________________ 92 

III.D.5.2 Régulation par la densité cellulaire : le quorum sensing________________________ 93 

III.D.6 Modulation de l’expression des gènes de régulateurs : réseau______________________ 94 

Objectifs de l’étude _________________________________________________________ 97 

RESULTATS _____________________________________________________________ 98 

er 

I 1 ARTICLE: La protéine associée au nucléoïde Fis coordonne l’expression des 

principaux gènes de virulence de la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi. _____ 98 

eme 

II 2 ARTICLE : Intégration de deux signaux essentiels modulant la virulence au 

niveau des promoteurs des gènes pel d’Erwinia chrysanthemi : un rôle pour Fis dans la 

régulation par le phase de croissance. ____________________________________________ 132 

III 

Résultats non publiés : intégration de Fis dans le réseau de régulation des gènes pel. _ 

_____________________________________________________________________ 166 

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ________________________________________ 174 

Références bibliographiques ________________________________________________ 181 

5

Remerciements 

Je remercie Monsieur Carlos Blanco et Monsieur Claude Gutierrez qui ont accepté 

avec cordialité d’être les rapporteurs de ce travail. J’exprime également tous mes 

remerciements à Madame Marie-Andrée Mandrand-Berthelot, Monsieur Hafid Abaibou et 

Monsieur Philippe Lejeune pour avoir accepté d’examiner ce travail. 

Je tiens à exprimer ma sincère reconnaissance à William Nasser pour son encadrement 

exemplaire durant cette thèse. Tu m’as donné une formation aussi bien scientifique 

qu’humaine d’une qualité remarquable. Je n’espérais pas acquérir un tel bagage pour la suite 

de la route. Bien sur je n’ai pas tout retenu mais peut être j’aurais appris, entre autre, à devenir 

un peu plus patient… 

Je tiens à remercier Nicole Hugouvieux-Cotte-Pattat pour m’avoir accueilli dans le 

laboratoire de Microbiologie, Adaptation et Pathogénie et pour avoir su être disponible pour 

toutes les questions liées à la vie dans le laboratoire. 

Mes remerciements vont également à Sylvie Reverchon, notamment pour répondre à 

certaines questions propres à la thématique « Régulation génique » de l’équipe « Erwinia ». Je 

remercie chaleureusement Vladimir Shevchik pour sa sympathie et pour nous avoir permis 

d’utiliser le mutant fliC d’Erwinia chrysanthemi avant publication. La saveur de ces quatre 

années aurait été bien différente sans la bonne humeur de Guy Condemine. Merci pour les 

multiples relectures des différents textes et articles, et pour avoir répondu à toutes les 

questions, aussi bien scientifiques que saugrenues. Je tiens également à remercier Agnès 

Rodrigue ainsi que Françoise Meier et Corinne Dorel pour les discussions au fil des repas. 

A mi-parcours de la thèse a eu lieu le comité de pilotage. J’en remercie les membres, 

Hans Geiselmann, Florence Wisniewski-Dyé, Marie-Andrée Mandrand-Berthelot et William 

Nasser, qui ont eu un effet significatif sur le bon déroulement de la fin de thèse. En 

particulier, je tiens à exprimer ma gratitude à Marie-Andrée Mandrand-Berthelot qui a suivi 

avec gentillesse ce travail. 

Mes remerciements amicaux vont à Georgi Muskhelishvili, Claudia Burau, Marcel 

Geertz, Michael Berger, Ramesh Mavathur et Sebastian Maurer de la Jacobs University of 

Bremen, Allemagne. Outre le matériel biologique fourni tel que la protéine Fis d’Escherichia 

coli, les discussions scientifiques et les compétences techniques acquises au cours de ce 

séjour, l’ambiance chaleureuse de l’équipe a fortement contribué au bon déroulement de cette 

expérience nordique. Ce séjour a été possible grâce aux participations financières de l’IFR41 

"Ecologie Génétique Évolution" ainsi que de la Région Rhône-Alpes dans le cadre d’un projet 

Eurodoc. 

Je remercie les étudiants du laboratoire, qui, reprenant des phrases incontournables 

(«c’est possible ça?»), ont été de bons collègues: Greg, Albert, Nasrin, Fred, Thierry 

(comment trouver un bon resto à Naples ?), Yann, Safia, Aleksandra, Claire, Nan, Zhengwei, 

Mathilde, Camille, Sophie et Camille qui a participé à ce travail. A mon tour de remercier 

Sandra Castang, l’amie du sud-ouest, pour nos pauses philosophiques. Je remercie également 

les étudiants du laboratoire d’écologie microbienne : Mickaël, Aymeric, Denis, Joël, Arnault, 

Hervé, Marina, Sandrine,… 

6

Je remercie l’ensemble du personnel technique pour le support précieux fourni mais 

également pour leur bonne humeur et leurs conversations : Yvette Alfaro, Véronique 

Utzinger, Jean-Michel Prost, Sonia Diasparra, Christine Berger, Sandra Mebarki, Zagik 

Mouton-Kosem, Julie Frontier, Camille Villard et Julien Wawrzyniak. Je remercie avec toute 

ma sympathie Géraldine Effantin qui m’a fait sourire plus d’une fois. 

Je remercie amicalement Mickaël Boyer entre autre pour nous avoir facilité la 

normalisation des expériences de RT-PCR quantitative. De même, Francesca Damiola et 

Laurette Morlé m’ont aidé à débuter dans cette technique. 

Je suis redevable de Messieurs Falkow et Dorman pour m’avoir fait parvenir 

rapidement certains articles scientifiques utiles pour la rédaction de ce manuscrit. Ce travail a 

été facilité par la qualité des services administratifs de l’INSA, évitant ainsi une perte de 

temps dans le travail de recherche. Je tiens également à souligner le travail précieux effectué 

par l’Association Bernard Grégory, notamment à travers la formation « Nouveau Chapitre de 

la Thèse », qui prépare à l’après-thèse. 

Je remercie également Pauline Lautier pour m’avoir permis de rédiger ce manuscrit 

dans de bonnes conditions informatiques. 

Je tiens également à exprimer toute ma reconnaissance au professeur Paul Ritzenthaler 

de l’université de Toulouse, ainsi que son équipe, en particulier Pascal Lebourgeois, pour 

m’avoir guidé avec gentillesse et clairvoyance dans ce choix lyonnais. 

Je remercie l’ensemble de ma famille et belle famille, ainsi que Matthieu et Guillaume 

pour m’avoir soutenu dans tous les moments et pour me montrer qu’Erwinia n’est pas le seul 

être vivant. Enfin, Déborah, je t’exprime mon entière reconnaissance, tu es une des personnes 

ayant le plus contribué à la réussite de ce travail. Merci d’avoir accepté de quitter ton sudouest 

natal pour participer à mes côtés à cette expérience lyonnaise. 

7

Liste des figures et tableaux 

Figures et tableaux de la partie bibliographique : 

Figure 1 : L’interaction entre un micro-organisme et un hôte conduit à différentes issues........ 16 

Figure 2 : Classification des gènes impliqués dans la virulence................................................. 20 

Figure 3 : Etapes du processus infectieux en fonction de la phase de croissance....................... 21 

Figure 4 : Structure du flagelle bactérien.................................................................................... 22 

Figure 5 : La mobilité par l'actine utilisée par Shigella flexneri à l'intérieur des cellules 

épithéliales, nommée "rocket motility"........................................................................................ 23 

Figure 6 : La structure du LPS. ................................................................................................... 26 

Figure 7 : Réponse hypersensible élicitée par E. chrysanthemi sur feuille de tabac. ................. 33 

Figure 8 : Production de composés oxygénés activés lors d’une interaction plante-pathogène 

compatible ou incompatible. ........................................................................................................ 34 

Figure 9 : Structure de l’ARN polymérase et son interaction avec un promoteur...................... 39 

Figure 10 : Eléments principaux du gène procaryote.................................................................. 39 

Figure 11 : Les étapes de l’initiation de la transcription bactérienne. ........................................ 43 

Figure 12 : Les différents types d’activateurs transcriptionnels. ................................................ 50 

Figure 13 : Les différents types de répresseurs transcriptionnels. .............................................. 52 

Figure 14 : Schéma illustrant l’effet de l’organisation spatiale du chromosome sur 

l’expression génique..................................................................................................................... 54 

Figure 15 : Effet du niveau du surenroulement de l’ADN sur l’expression des gènes. .............. 55 

Figure 16 : Concentrations cellulaires des protéines H-NS, Fis, HU et IHF au cours des 

différentes phases de la croissance bactérienne. .......................................................................... 59 

Figure 17 : Mode d’action du répresseur H-NS et de l’activateur Fis en fonction de la 

température sur l’expression du gène virF chez les souches d’Escherichia coli 

entéroinvasives............................................................................................................................. 60 

Figure 18 : Les mécanismes de régualtions mettant en jeu plusieurs facteurs de transcriptions.66 

Figure 19 : Réseau de régulations entre les régulateurs globaux. ............................................... 67 

Figure 20 : Régulation du niveau cellulaire de σ S en fonction des stimuli extérieurs chez la 

bactérie Escherichia coli. ............................................................................................................. 70 

Figure 21 : Distribution géographique d’Erwinia chrysanthemi. ............................................... 73 

Figure 22 : Symptômes causés par E. chrysanthemi................................................................... 74 

Figure 23 : La paroi végétale et la structure biochimique de la pectine...................................... 77 

Figure 24 : La voie de dégradation et d’assimilation de la pectine............................................. 79 

Figure 25 : Production de deux pectine méthyl-estérases et de deux pectine acétyl-estérases 

ches Erwinia chrysanthemi 3937. ............................................................................................... 80 

Figure 26 : Production de dépolymérases chez Erwinia chrysanthemi 3937. ........................... 81 

Figure 27 : Rôle des différentes pectinases dans le pouvoir pathogène d’Erwinia sur 

Saintpaulia. .................................................................................................................................. 83 

Figure 28 : Organisation génétique des pectinases. .................................................................... 84 

Figure 29 : Réseau de régulation contrôlant l’expression des gènes pel chez Erwinia 

chrysanthemi. ............................................................................................................................... 95 

Tableau 1 : Fréquence d’apparition des nucléotides dans les éléments -35 et -10 du promoteur 

bactérien. ...................................................................................................................................... 41 

Tableau 2 : facteurs sigma alternatifs impliqués dans la virulence............................................. 46 

Tableau 3 : Les principales protéines associées au nucléoïde (NAP)......................................... 57 

8

Figures et tableaux de la partie résultats : 

1 er article : 

Fig. 1. Behaviour of the E. chrysanthemi fis mutant.................................................................... 122 

Fig. 2. The induction of pectate lyase activity is delayed in the supernatant of the fis mutant 

growth medium. ........................................................................................................................... 123 

Fig. 3. Expression of the fliC, hrpN, prtC, sapA and cel5 genes in the parental strain and its fis 

derivative...................................................................................................................................... 124 

Fig. 4. Band-shift assay for Fis binding on hrpN, fliC, cel5, sapA, prtC promoter regions. ....... 125 

Fig. 5. Fis interacts with the cel5 downstream promoter regions and inhibits transcript 

elongation..................................................................................................................................... 126 

Fig. 6. Comparison of virulence between E. chrysanthemi 3937 and its various derivatives on 

chicory leaves and potato tubers. ................................................................................................. 127 

Fig. S1.The E. chrysanthemi fis operon. .................................................................................... 128 

Fig. S2. Fis specifically interacts with its own regulatory regions and represses transcription 

initiation by σ 70 RNAP. ............................................................................................................... 129 

Fig. S3. The fis operon and promoter region. .............................................................................. 130 

Fig. S4. Growth phase-dependent induction of pectate lyase activity in the culture supernatants of 

Erwinia chrysanthemi strains A350 (ps) and A4374 (fis). .......................................................... 131 

Table 1. Bacterial strains, plasmids, phages and oligonucleotides used in this work. ................ 117-118 

2 ème article : 

Fig. 1. Time course induction of pectate lyase activity in the culture supernatants of Erwinia 

chrysanthemi strains A350 (ps) and A4374 (fis).......................................................................... 152 

Fig. 2. Bacterial-number-dependent expression of pelA::uidA, pelB::uidA, pelD::uidA and 

pelE::uidA in Erwinia chrysanthemi strains A350 (ps) and A4374 (fis). ................................... 153 

Fig. 3. Quantification of the increase in pelD and pelE gene transcript accumulation in the fis 

background using real-time PCR analysis. .................................................................................. 154 

Fig. 4. Band-shift assay for Fis-DNA binding. ........................................................................... 155 

Fig. 5. DNase I footprinting of Fis, CRP, KdgR and RNAP binding at the pelB (A), pelD (B) 

and pelE (C) promoters. ............................................................................................................... 156-158 

Fig. 6. Sequence of the pelB, pelD and pelE promoters. ............................................................ 159 

Fig. 7. Fis and KdgR prevent transcription initiation at the pelD (A) and pelE (B) promoters. . 160 

Fig. 8. Bacterial-number-dependent expression of pelB::uidA, pelD::uidA and pelE::uidA in 

Erwinia chrysanthemi parental strain and its fis, kdgR and kdgR-fis derivatives. ....................... 161 

Fig. 9. Bacterial-number-dependent expression of the Pel SA present both in the supernatants 

and in the cell pellets in Erwinia chrysanthemi parental strain A350 and its fis derivative 

A4374. .......................................................................................................................................... 162 

Fig. S1. Time course expression of pelA::uidA, pelB::uidA, pelD::uidA and pelE::uidA in 

Erwinia chrysanthemi strains A350 (ps) and A4374 (fis). .......................................................... 163 

Fig. S2. Time course expression of pelB::uidA, pelD::uidA and pelE::uidA in Erwinia 

chrysanthemi parental strain and its fis, kdgR and kdgR-fis derivatives. ..................................... 164 

Fig. S3. Time course expression of the Pel SA present both in the supernatants and in the cell 

pellets in Erwinia chrysanthemi parental strain A350 and its fis derivative A4374. .................. 165 

Table 1. Bacterial strains, plasmids, phages and oligonucleotides used in this work. ................ 148-149 

9

Résultats non publiés : 

Figure R1 : Comparaison par RT-PCR quantitative de l’expression des gènes crp, hns, kdgR, 

pir, pecT et pecS dans le mutant fis par rapport à la souche parentale à différents stades de la 

croissance et dans différents milieux de culture (LB ou LB+PGA). ........................................... 167 

Figure R2 : Expression des fusions transcriptionnelles kdgR::uidA, crp::uidA et pecT::uidA 

en fonction de la densité cellulaire dans la souche parentale et dans le mutant fis...................... 168 

Figure R3 : Intégration de Fis dans le réseau de régulation des gènes pel. ................................ 169 

Figure R4 : Expression de la fusion transcriptionnelle impliquant la région régulatrice du 

gène fis d’E chrysanthemi.. .......................................................................................................... 171 

Figure R5 : Absence de fixation de Fis et de CRP sur la région promotrice du gène crp d’E. 

chrysanthemi. ............................................................................................................................... 172 

Tableau R1 : Souches bactériennes, plasmides et oligonucléotides utilisés dans ce travail....... 173 

Figure de la partie discussion perspectives : 

Figure D1 : Modèle du mécanisme d’action de Fis dans le contrôle de la production de 

différents types de facteurs de virulence au cours de la croissance bactérienne.......................... 176 

Figure D2 : Extraits de surnageants de cultures de la souche parentale et du mutant fis d’E. 

chrysanthemi analysés sur gel de polyacrylamide. ..................................................................... 177 

10

Abréviations 

A : 

acide adénylique 

ABC : 

ATP binding cassette 

Acyl-HSL : N-acylhomoserine lactone 

ADN : 

acide désoxyribonucléique 

AMPc : 

adénosine monophosphate cyclique 

Ap : 

ampicilline 

Ap R : 

ampicillin resistance 

ARN : 

acide ribonucléique 

ARNm : 

ARN messager 

ATP : 

adénosine triphosphate 

bp : 

paire de bases 

BrET: 

ethidium bromide 

C : 

acide cytidylique 

C : 

Fis-DNA complexe 

CFU : 

colony forming units 

Ci : 

curie 

Cm: 

chloramphenicol 

Cm R : 

chloramphenicol resistance 

CNRS : 

centre national de la recherche scientifique 

CP : 

cell pellet 

CRP : 

cyclic AMP receptor protein 

CTD : 

domaine carboxyterminal 

Da : 

dalton 

dATP : 

désoxy adénine tri-phosphate 

dCTP : 

désoxy cytosine tri-phosphate 

°C : degré Celsius 

dI-dC : 

désoxyinosine-désoxycytosine 

DKI : 

5-céto-4-désoxyuronate 

DKII : 

2,5-dicéto-3-désoxugluconate 

DL50 : dose létale 50 

DMI : 

dose minimale infectante 

DMM : 

dose minimale mortelle 

DNA : 

acide désoxyribonucléique 

DO x : 

densité optique à x nm 

DTT : 

dithiothréitol 

EDTA : 

éthylene diamine tétra acetate 

EHEC : 

Escherichia coli entérohémorragique 

EIEC : 

Escherichia coli entéroinvasive 

EPS : 

exopolysaccharide de surface 

F : 

free DNA 

Fis : 

factor for inversion stimulation 

G : 

acide guanylique 

g : 

gramme 

GA : 

galacturonate 

GA 2 : 

digalacturonate 

11

GA n : 

oligogalacturonides saturés 

H-NS : 

histone-like nucleoid structuring protein 

HR : 

réponse hypersensible 

HSL : 

homosérine lactone 

HU : 

heat-unstable nucleoid protein 

IHF : 

integration host factor 

INSA : 

institut national des sciences appliquées 

IPA : 

invasion plasmid antigens 

IPTG : 

isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside 

kDa : 

kilodalton 

KDG : 

2-céto-3-désoxygluconate 

Km : 

kanamycine 

LB : 

Luria Bertani 

LEE : 

locus of enterocyte effacement 

LPS : 

lipopolysaccharide 

M : 

molaire 

MALDI-TOFF : matrix assisted laser desorption ionization - time of flight 

mg : 

milligramme 

µg : microgramme 

MIC : 

minimal inhibitory concentration 

ml : 

millilitre 

µl : microlitre 

min : 

minute 

mM : 

millimolaire 

NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit 

NAP : 

protéines associées au nucléoïde 

ng : 

nanogramme 

nm : 

nanomolaire 

NTD : 

domaine aminoterminal 

OD : 

optical density 

OEPP : 

organisation européenne et méditerranéenne pour la protection des 

plantes 

ONP : 

orthonitrophénol 

3-oxo-C 6 -HSL : N-(3-oxohexanoyl)-homosérine lactone 

PAGE : 

électrophorèse en gel de polyacrylamide 

PCR : 

réaction de polymérisation en chaîne 

Pel : 

pectate lyase 

PGA : 

polygalacturonate 

pH : 

potentiel hydrogène 

pI : 

point isoélectrique 

Pir : 

plant-inducible regulator 

PNP : 

paranitropnénol 

ppGpp : 

guanosine 3′,5′ bisphosphate 

ps : 

parental strain 

PSB : 

poids sec bactérien 

pv. : 

pathovar 

QS : 

quorum sensing 

RNA : 

acide ribonucléique 

RNAP : 

RNA polymerase 

rpm : 

rotations par minute 

12

RT-PCR : reverse transcriptase – polymerase chain reaction 

s : 

seconde 

SA : 

specific activity 

SDS : 

sodium dodécyl sulfate 

Sm : 

streptomycine 

SN : 

supernatant 

ssp. : 

sous-espèce 

STEC : 

Escherichia coli producteurs de Shiga-toxines 

T : 

acide thymidylique 

TBS : 

Tris Buffered Saline 

Tris : 

Tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane 

U : 

units 

UCBL : université Claude Bernard Lyon 1 

uGA 2 : 

digalacturonate insaturé 

uGA n : 

oligogalacturonides insaturés 

UMR : 

unité mixte de recherche 

UP : 

upstream element 

v/v : 

volume to volume 

w/v : 

weight to volume 

13

Résumé 

Rôle de la protéine associée au nucléoïde Fis dans le contrôle de la virulence chez la 

bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi. 

Erwinia chrysanthemi est une entérobactérie phytopathogène responsable de la 

pourriture molle et qui engendre des pertes économiques importantes sur différentes plantes. 

Une colonisation efficace de l’hôte requiert l’action séquentielle de plusieurs facteurs de 

virulence. Certains de ces facteurs sont essentiellement requis dans les étapes précoces du 

processus infectieux tels que la harpine HrpN, le système de détoxification Sap ou les 

flagelles assurant la mobilité bactérienne. D’autres agissent par contre dans les étapes tardives 

du processus tels que les enzymes dégradatives. Parmi ces enzymes, les pectate lyases (Pels) 

jouent un rôle déterminant dans le pouvoir pathogène, en raison de leur capacité à reproduire 

le symptôme de pourriture molle. La synthèse des facteurs de virulence est finement régulée 

pour conduire une infection efficace. 

L’essentiel des travaux de cette thèse a consisté à caractériser le rôle de la protéine 

associée au nucléoïde Fis dans le contrôle de la virulence chez E. chrysanthemi. 

Un mutant fis présente une synthèse diminuée des facteurs de virulence impliqués dans les 

étapes précoces de l’infection (flagelles, harpine et système de détoxification). De plus, 

l’induction de l’activité pectate lyase est retardée et augmente durant la phase stationnaire de 

croissance dans le mutant fis. Le contrôle exercé par Fis sur l’expression des gènes codant ces 

facteurs se fait par un mécanisme direct. In planta, le mutant fis présente une virulence 

atténuée qui serait le résultat de la modification du profil de synthèse des facteurs de 

virulence. 

Le mécanisme moléculaire de la régulation exercée par Fis a été étudié plus en détail 

sur les gènes pel dont l’expression est modulée par un grand nombre de régulateurs (8 sont 

déjà caractérisés). Une étude intégrative réalisée en adoptant une double approche in vivo et in 

vitro a montré que Fis réprime directement l’expression des gènes pel au niveau de l’initiation 

de la transcription. Dans certaines conditions, Fis agit de concert avec KdgR, un autre 

répresseur essentiel, pour verrouiller l’expression des gènes pel. 

L’ensemble de ces données met en évidence un rôle pivot de Fis dans la coordination 

de l’expression des principaux gènes de virulence d’E. chrysanthemi au cours du processus 

infectieux. 

MOTS-CLES : Bactérie phytopathogène / Fis / gènes de virulence / régulation de la 

transcription / Erwinia chrysanthemi. 

14

Summary 

Role of the nucleoid associated protein Fis in the control of the virulence of the 

phytopathogenic bacteria Erwinia chrysanthemi. 

Erwinia chrysanthemi is a soft-rotting Gram-negative bacterium that attacks a wide 

range of plant species, including many crops of economical importance. Efficient host 

colonisation requires a sequential action of various virulence factors. Some of these factors 

are needed in the early steps of the infectious process: the harpin HrpN, the detoxification 

system Sap or the flagellum, responsible for bacterial motility. Others factors, such as 

degradative enzymes, act in advanced steps of the infection. Among these enzymes, the 

pectate lyases (Pels) play a key role in the pathogenicity since, purified, they can reproduce 

the soft-rot symptoms. Production of these virulence factors is tightly regulated to allow the 

correct development of the infectious process. 

The main aim of the investigations of this thesis was to evaluate the role of the 

nucleoid associated protein Fis in the control of the virulence in the phytopathogenic bacteria 

Erwinia chrysanthemi. 

A fis mutant shows a reduced synthesis of the virulence factors involved in the early 

steps of infection (flagellum, harpin and detoxification system). Moreover, induction of Pel 

activity is delayed and increased during the stationary growth phase in the fis mutant. Fis 

regulates the expression of the genes encoding these various factors by a direct mechanism. In 

planta, the fis mutant has a decreased virulence, which probably results from the modification 

of appropriate virulence factors synthesis. 

The molecular mechanism of the Fis action has been studied in more detail on the pel 

genes, which are regulated by at least eight other regulators. By using in vivo and in vitro 

integrative studies it appeared that Fis directly represses the pel gene expression at the 

transcription initiation step. In addition, Fis acts in concert with KdgR, the main repressor 

responding to the presence of pectin compounds, to shut down the pel gene transcription. 

Together, these data indicate that Fis plays a pivotal role in the coordination of the 

expression of the main virulence genes of E. chrysanthemi during pathogenesis. 

KEY WORDS : phytopathogenic bacteria / Fis / virulence genes / transcription regulation / 

Erwinia chrysanthemi 

15

Introduction bibliographique 

INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE 

I 

IA 

Les interactions hôte-pathogène 

Définir un pathogène 

L’interaction entre un micro-organisme et un hôte conduit à différentes issues : neutre 

(micro-organisme saprophyte), bénéfique pour les deux acteurs (symbiose) ou délétère pour 

l’un des deux (élimination du micro-organisme ou de l’hôte). (Figure 1). 

Figure 1 : L’interaction entre un micro-organisme et un hôte conduit à différentes 

issues (d’après Casadevall et Pirofski, 2000). 

Historiquement, la définition d’un micro-organisme pathogène, du grec παθογένεια 

«naissance de la douleur», est basée sur sa capacité à entraîner une maladie chez l’hôte. En 

1870, Louis Pasteur identifie le premier microbe responsable d'une maladie infectieuse, la 

16


maladie des vers à soie et met fin à la théorie de la génération spontanée en publiant " La 

théorie des germes " en 1878. 

En 1882, le médecin allemand Robert Koch, pionnier avec Louis Pasteur de la 

bactériologie, isole le bacille Mycobacterium tuberculosis, responsable de la tuberculose. 

Combinée avec les travaux de Pasteur, cette découverte pose les principes de l'asepsie pour 

éviter la transmission des microbes d'un opéré à l'autre, et prône l'hygiène hospitalière pour 

éviter les transmissions d'infections entre malades contagieux. En 1883, au cours d'une 

expédition en Égypte, Koch isole la bactérie Vibrio cholerae, agent responsbale du choléra, 

avec l'aide de Gaffky et de Bernhard Fischer. Il prouve, peu après, le rôle de l'eau dans la 

transmission de la maladie. 

A la suite de ces travaux, Robert Koch établit en 1890 un postulat définissant les 

caractéristiques d’une bactérie pathogène : 

1- Le micro-organisme doit être présent dans chaque cas de la maladie étudiée. 

2- Il ne doit pas apparaître dans d’autres maladies ou dans des organismes sains. 

3- Après avoir été isolé de l’hôte et cultivé en milieu pur, le micro-organisme doit induire à 

nouveau la maladie. 

Toutefois, ce postulat fait apparaître certaines limites. En effet, l’agent pathogène doit 

pouvoir être cultivé en milieu synthétique, ce qui en exclue les bactéries non cultivables ou les 

virus. Il ne prend pas en compte le portail d’entrée dans l’hôte, la niche écologique du microorganisme 

ou la notion de dose infectieuse (Isenberg, 1988). 

Sur ce dernier point, de nombreuses études ultérieures quantifient le pouvoir 

pathogène suivant trois données : la Dose Minimale Mortelle (DMM), la Dose Létale 50 

(DL50) et la Dose Minimale Infectante (DMI). 

- La DMM est la dose la plus faible qui tue dans un délai déterminé par un groupe 

expérimental. 

- La DL50 est la dose où le nombre d'agents pathogènes est capable de tuer 50% des hôtes 

d'un groupe expérimental en un temps donné. 

- La DMI est la dose minimale d'agents pathogènes donnée permettant la contamination et le 

développement de la maladie. 

Des progrès spectaculaires ont été réalisés dans les domaines de la microbiologie, de 

l'immunologie, de la biologie moléculaire, dans l'amélioration des techniques de diagnostic, 

en épidémiologie. Ces nouvelles avancées ont permis d’affiner le postulat de Koch et mettent 

17


en évidence que la définition d’un pathogène est en perpétuel changement et s’adapte aux 

résultats apportés par les nouveaux outils de la biologie. 

En 1988, en accord avec ces nouvelles données, Stanley Falkow définit une version 

moléculaire des trois postulats de Koch : 

1- Le phénotype ou la propriété étudiée doit être associé à des membres pathogènes d’un 

genre ou des souches pathogènes d’une espèce. 

2- Isolé par des méthodes moléculaires, l’inactivation spécifique du ou des gènes associés 

avec le trait de virulence étudié doit conduire à une perte de fonction dans le pathogène qui 

peut se traduire par une baisse significative du pouvoir pathogène. 

3- Le remplacement allélique du gène muté par le gène sauvage doit conduire à la restauration 

du pouvoir pathogène. 

Cette nouvelle définition permet d’affiner la compréhension des mécanismes mis en 

jeu par le pathogène, notamment en recherchant les gènes impliqués dans le pouvoir 

pathogène. Toutefois, cette définition reste centrée sur le micro-organisme et ne prend en 

compte que les micro-organismes provoquant une infection sévère. Ainsi en sont exclus les 

agents possédant un pouvoir pathogène relativement limité comme les pathogènes 

opportunistes. Casadevall et Pirofski propose en 1999 de définir un pathogène par les dégâts 

générés chez l’hôte par le pathogène mais aussi par les réactions de défenses de l’hôte. Dans 

la plupart des interactions entre un pathogène et son hôte, il y a un continuum entre les 

dommages causés par le pathogène et ceux causés par l’hôte. Ceci conduit à la maladie 

seulement quand la nature des dommages modifie les fonctions normales de l’hôte. De ce fait, 

la maladie est une issue complexe qui survient à cause des dommages provoqués par le 

pathogène (par exemple les pathogènes induisant la nécrose des cellules) et/ou à cause des 

dommages induits par l’hôte (par exemple une réponse immunitaire aberrante). Ainsi, 

Streptococcus pneumoniae s’établit dans les tissus pulmonaires sans induire une nécrose des 

cellules de l’hôte, mais cela peut conduire à une intense réaction inflammatoire. De même, 

Staphylococcus aureus induit une nécrose des tissus et stimule la réponse inflammatoire de 

l’hôte. Au contraire, Mycobacterium tuberculosis provoque une forte réponse immunitaire de 

l’hôte qui entraîne une sévère inflammation aboutissant à des dommages dans les tissus de 

l’hôte. Définir un micro-organisme pathogène en terme de dommages induits chez l’hôte 

permet d’inclure de nombreux paramètres qui affectent la relation hôte-pathogène. De ce 

point de vue, la pathogénie est la cause du pathogène mais est modulée par la résistance de 

l’hôte (Casadevall et Pirofski, 2000). 

18


L’ensemble de ces données met en évidence la difficulté de trouver une définition 

interdisciplinaire d’un pathogène. Dans ce travail, un pathogène est considéré comme un 

micro-organisme dont la survie dépend de sa capacité à se multiplier et à persister sur ou dans 

d’autres espèces en franchissant ou en détruisant la barrière cellulaire de l’hôte qui empêche 

normalement le passage d’autres micro-organismes. 

IB 

Les facteurs de virulence : acteurs moléculaires de la 

pathogénie 

La mise en place d’un processus infectieux, régie par différentes étapes clefs, permet 

parfois au micro-organisme de réussir à infecter son hôte. Il doit pouvoir survivre dans l’hôte, 

s’y multiplier et y causer des dommages. Pour ce faire, il doit être compétitif vis à vis des 

bactéries commensales, neutraliser les mécanismes de défense de l’hôte et y assurer sa 

propagation. Une partie de ces propriétés est conférée par les facteurs de virulence. Définir les 

gènes codant ces facteurs reste un problème délicat (Figure 2) (Wassenaar et Gaastra, 2001). 

Dans ce travail, le terme de gène de virulence sera utilisé pour les gènes codant des facteurs 

indispensables à la colonisation de l’hôte par le pathogène. 

19


Gènes de 

virulence 

vrais 

Gènes associés 

à la virulence 

Gènes de survie au 

cours de l’infection 

Gènes restants 

Les gènes de virulence vrais 

codent des facteurs ou des 

enzymes produisant des facteurs 

qui sont: 

-impliqués dans les interactions 

avec l’hôte 

-directement responsables des 

dommages au cours de l’infection 

-absent dans les souches 

avirulentes 

Les gènes associés à la virulence 

codent des facteurs ou des 

enzymes synthétisant des produits 

qui: 

-régulent l’expression des gènes 

de virulence 

-ou activent les facteurs de 

virulence par modification 

conformationnelle ou sécrétion 

-ou sont requis pour l’activité des 

facteurs de virulence vrais 

Les gènes de survie au cours de 

l’infection codent des facteurs ou 

des enzymes produisant des 

facteurs qui: 

-permettent la colonisation de 

l’hôte 

-ou permettent d’échapper au 

système immunitaire de l’hôte 

-ou permettent la survie 

intracellulaire 

-ou utilisent des facteurs de l’hôte 

pour survivre 

Figure 2: Classification des gènes impliqués dans la virulence (Lautier et Nasser, 2005 

adapté de Wassenaar et Gaastra, 2001). 

Le nombre de gènes de virulence et de gènes associés à la virulence est représenté par des 

cercles concentriques. La limite entre les cercles n’est pas toujours bien établie. 

L’infection peut être considérée comme un processus où le passage à l’étape suivante 

est globalement régi par la phase de croissance (Figure 3). La première étape du processus 

infectieux consiste généralement à l’adhésion du pathogène à l’hôte et débute durant la phase 

de latence, qui est un temps d’adaptation à ce nouvel environnement. En conditions 

favorables, la croissance bactérienne devient exponentielle, conduisant au deuxième niveau de 

20


l’infection appelé phase de multiplication. Lorsqu’elles sont en quantité suffisamment 

importante pour arriver à conduire une attaque brusque et forte des cellules de l’hôte, les 

bactéries synthétisent massivement leurs facteurs de propagation permettant une invasion de 

l’hôte. Cette étape a lieu généralement lorsque le pathogène est en phase exponentielle 

avancée ou en phase stationnaire de croissance, durant laquelle la bactérie est plus résistante à 

un environnement défavorable. 

Processus infectieux 

adhésion 

multiplication 

invasion 

Facteurs de virulence 

précoces 

tardifs 

Densité cellulaire 

Phase d e 

latence 

Phase 

exponentielle 

Phase stationnaire 

Croissance 

Figure 3: Etapes du processus infectieux en fonction de la phase de croissance 

(Lautier et Nasser, 2005). 

I.B.1 

Les facteurs de virulence précoces 

Ils interviennent au début du processus infectieux et permettent aux micro-organismes 

de rejoindre la zone cible de l’hôte, de s’y établir pour s’y multiplier. 

I.B.1.1 

La mobilité 

La mobilité est supposée être une très ancienne caractéristique des bactéries. Elle est 

intimement liée au chimiotactisme, la capacité de s’orienter dans certains gradients chimiques. 

La combinaison de la mobilité et du chimiotactisme permet aux bactéries de détecter et 

rejoindre leurs niches écologiques préférées. 

21


Le mode de locomotion le plus connu met en jeu un organe rotatif spécialisé, le 

flagelle (Figure 4). Il est constitué de trois parties (Aizawa et al., 2000 ; Macnab, 1999): 

- Le filament flagellaire : c'est la plus longue et la plus évidente, elle s'étend depuis la 

surface cellulaire : c'est cette partie qui est mise en évidence lors de colorations et observation 

en microscopie optique. C'est un cylindre creux et rigide constitué de nombreux monomères 

d'une seule protéine : la flagelline. Il existe cependant des flagelles complexes, composés de 

plusieurs protéines distinctes. Ces monomères semblent dans tous les cas emprunter le canal 

central pour être finalement assemblés à l'extrémité distale. 

- Le crochet : d'un diamètre supérieur au filament, il est situé au niveau de la surface 

cellulaire. Il fait la liaison entre le corps basal et le filament flagellaire. Son rôle est de 

transmettre le mouvement du corps basal au filament. 

- Le corps basal : il est enfoui dans la cellule et sa structure diffère des bactéries Gram 

négatives et Gram positives. On peut le définir comme une tige centrale insérée dans un 

système d'anneaux, l’ensemble étant inséré dans la membrane plasmique et la paroi. Cette 

partie du flagelle est reliée à une cascade de transduction du signal répondant au 

chimiotactisme. 

Figure 4 : Structure du flagelle bactérien. 

Dans le cas des bactéries pathogènes, la nécessité d’organes de mobilité varie selon le 

mode de colonisation du micro-organisme : 

- comme précédemment indiqué, la mobilité est nécessaire dans les phases précoces de 

l’infection : elle permet à la bactérie de rejoindre sa niche écologique pour y adhérer. Ainsi, 

22


les Escherichia coli pathogènes STEC doivent être mobiles pour rejoindre les cellules 

épithéliales de la muqueuse intestinale de l’homme. Une fois leur cible atteinte, elles perdent 

leur mobilité en créant des attachements intimes avec les cellules intestinales. 

- la mobilité est nécessaire pour établir et maintenir l’infection. C’est le cas de 

Legionella pneumophila qui colonise les macrophages humains (Dietrich et al., 2001). Une 

fois dans le macrophage, la bactérie perd sa mobilité jusqu’à ce que la cellule hôte lyse. A ce 

stade, la synthèse des flagelles est de nouveau activée pour permettre d’infecter une autre 

cellule. 

Un exemple original est la mobilité par l'actine utilisée par Shigella flexneri à 

l'intérieur des cellules épithéliales, nommée "rocket motility" (Figure 5). Après la pénétration 

dans l’hôte, la bactérie se libère de la vacuole phagocytaire et induit ensuite la formation de 

filaments d'actine qui la propulseront vers une cellule adjacente. La formation de filaments 

d'actine requiert la participation de protéines bactériennes comme IcsA et le recrutement de la 

vinculine et de l'actine (éléments du cytosquelette de la cellule eucaryote); la vinculine se lie à 

IcsA et initie la polymérisation de l'actine. 

Figure 5 : La mobilité par l'actine utilisée par Shigella flexneri à l'intérieur des cellules 

épithéliales, nommée "rocket motility". A. Représentation de l’invasion des cellules 

épithéliales par la bactérie. B. Schématisation de la polymérisation de l’actine au niveau de la 

bactérie. 

Chez les bactéries phytopathogènes, l’implication de la mobilité dans le pouvoir 

pathogène a été relativement bien étudiée chez Agrobacterium tumefaciens. Cette bactérie 

produit des flagelles disposés de façon circulaire à une extrémité de la cellule en forme de 

bacille. Trois gènes, flaA, flaB et flaC sont impliqués dans la synthèse des flagelles 

(Chesnokova et al., 1997), déterminants dans le pouvoir pathogène de cette bactérie. Dans le 

23


cas de la bactérie phytopathogène Erwinia carotovora, des mutants non mobiles présentent 

une virulence atténuée (Mulholand et al., 1993 ; Pirhonen et al., 1991). Ces souches sont 

mutées au niveau des gènes mop codant des protéines homologues aux protéines 

d’assemblage et de sécrétion des flagelles chez Salmonella, Bacillus, Shigella, Yersinia et 

Pseudomonas. L’apport en trans de ces gènes sauvages restaure à la fois la mobilité 

bactérienne et la virulence. L’existence de flagelles permettrait à la bactérie de se déplacer 

dans le sol à la recherche d’une plante hôte et d’y pénétrer par des ouvertures naturelles ou 

des blessures. Ainsi, les flagelles auraient un rôle non négligeable dans le pouvoir pathogène 

des Erwinia. 

I.B.1.2 

L’adhérence 

Adhérer à l’hôte est indispensable pour le micro-organisme afin de s’y implanter 

(Finlay et Falkow, 1997). La charge électrostatique négative présente à la surface du microorganisme 

et des cellules de l’hôte provoque une répulsion électrostatique, qui empêche la 

formation de liaisons faibles ou aspécifiques. De ce fait, l’adhésion bactérienne requiert des 

interactions fortes et hautement spécifiques entre un ligand moléculaire situé sur la surface du 

pathogène et le récepteur correspondant présent sur la surface de la cellule hôte. La nature de 

ces facteurs conditionnent la spécificité (espèces cibles plus ou moins nombreuses) et le 

tropisme (tissus cibles plus ou moins nombreux). 

I.B.1.2.a 

Les adhésines 

Les adhésines bactériennes sont les structures principales d’adhésion du pathogène à 

d'autres cellules. Le terme adhésine définit un ligand produit par le micro-organisme qui se lie 

spécifiquement à un récepteur de la cellule hôte (Nougayrède et al., 2003). Pour être qualifié 

d’adhésine, le produit microbien doit remplir certains critères. La molécule purifiée doit se 

lier de façon stable et saturable à la cellule hôte (ou aux produits extracellulaires). La 

spécificité est déterminée en montrant qu’un excès de ligand non marqué inhibe la fixation de 

ligands marqués. Le caractère saturant de la fixation montre qu’il existe un nombre fini de 

récepteurs qui lient le ligand. La constance de liaison pour cette interaction doit se situer dans 

une gamme biologique plausible. Les bactéries utilisent comme adhésine une grande variété 

de structures de surface. La plupart des pili des bactéries gram négatif fonctionne comme des 

24


adhésines, mais dans beaucoup de cas, c'est une sous unité protéique mineure à l’extrémité 

des fimbriae qui est l'adhésine réelle. Chez les bactéries gram positives, une protéine ou un 

polysaccharide de surface sert d'adhésine spécifique. 

Les Escherichia coli entéropathogéniques ou entérohémoragiques sont des pathogènes 

humains responsables d’un taux de morbidité et de mortalité élevé chez les enfants des pays 

en voie de développement. Ces pathogènes extracellulaires adhèrent aux cellules de 

l’épithélium intestinal de l’hôte, induisant la formation d’un piédestal riche en actine (Kenny 

et al., 2002). La formation de ce piédestal requiert l’intimine, une adhésine dont le gène est 

porté sur le chromosome bactérien (Jerse et al., 1990 ; Donnenberg et al., 1993). Dans ce 

couple adhésine-récepteur, le récepteur, nommé Tir, a la particularité d’être une molécule 

bactérienne. Tir est une protéine effectrice du système de sécrétion de type III, qui une fois 

transloquée dans le cytosol, s’insère dans la membrane de la cellule eucaryote pour remplir 

son rôle de récepteur (Kenny et al., 1997). Cet exemple met en évidence le caractère 

déterminant de la spécificité adhésine-récepteur. 

Pour les bactéries phytopathogènes, les mécanismes impliquant des adhésines sont 

moins bien connus. Toutefois, dans le cas de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, 

l’adhésion aux tissus végétaux nécessite principalement une adhésine calcium dépendante 

(Smit et al., 1992) ainsi qu’un ensemble de protéines codées par les gènes du locus att 

(attachement) (Matthysse et al., 1996, 1998, 2000). Un autre exemple concerne la bactérie 

Erwinia chrysanthemi EC16, qui provoque une nécrose chez différentes plantes hôtes. Elle 

possède un gène hecA codant une adhésine de 3850 acides aminés appartenant à la famille des 

hémagglutinine filamenteuse de Bordetella pertussis (Rojas et al., 2002). Les auteurs ont 

montré qu’une souche mutée dans le gène hecA présente une virulence atténuée sur des 

plantules de Nicotiana clevelandii, infectées sans blessures. De plus, les Erwinae produisent 

des pili qui leur permettraient d’adhérer à la surface des cellules végétales. En effet, l’addition 

d’anticorps anti-piline inhibe la fixation des bactéries sur les racines des plantes (Haahtela et 

al., 1985). 

I.B.1.2.b 

Les lipopolysaccharides 

Les lipopolysaccharides (LPS) sont des complexes macromoléculaires présents de 

manière constitutive dans la membrane externe de toutes les bactéries à Gram négatif. Sur le 

25


plan structural, les LPS sont constitués d'un lipide A et d'une partie polysaccharidique 

débordant de la membrane externe (Figure 6). 

Figure 6 : La structure du LPS. 

Le lipide A est doué de propriétés toxiques et il correspond à l'endotoxine des 

bactéries à Gram négatif. La fraction polysaccharidique constitue l'antigène O et est 

responsable de la spécificité antigénique O permettant de décrire des sérovars au sein d'une 

même espèce bactérienne. Les lipopolysaccharides (LPS) jouent également un rôle dans 

l’adhérence, notamment chez Agrobacterium tumefaciens (Reuhs et al., 1997). D’autres 

études mettent en évidence le rôle du LPS dans l’adhérence de Vibrio cholerae. En effet, un 

mutant dans le gène rfp, essentiel pour la synthèse des LPS, présente une colonisation de 

l’hôte mille fois plus faible par rapport à la souche parentale (Merrell et al., 2002). Chez 

Erwinia carotovora subsp. atroseptica, un mutant altéré dans la synthèse de LPS présente une 

virulence diminuée (Toth et al., 1999). Il est proposé que ces composés de la surface 

membranaire pourraient être impliqués dans les phénomènes de reconnaissance entre la plante 

et la bactérie. 

26


I.B.1.2.c 

Les exopolysaccharides 

Les exopolysaccharides (EPS) forment une capsule mucoïde protectrice autour de la 

cellule bactérienne. La production de ces EPS est souvent liée à la virulence de différents 

pathogènes (Agrobacterium, Erwinia, Pseudomonas,…). Au cours de l’infection, ces EPS, 

grâce à leurs propriétés anioniques et hydrophiles, fournissent un avantage sélectif à la 

bactérie qui les produit (Sutherland, 1988). En effet, ils permettent de maintenir une forte 

hydratation de la zone colonisée et/ou de séquestrer les molécules toxiques en général 

chargées positivement. Chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, ils 

interviennent dans la pathogénèse, en obstruant probablement les vaisseaux du xylème. 

L’étude de l’infection de plants de Saintpaulia par des mutants d’E. chrysanthemi ne 

synthétisant pas d’EPS a montré que le développement des symptômes était retardé et que le 

stade de macération systémique n’était jamais atteint (Condemine et al., 1999). 

I.B.1.2.d 

Les flagelles 

Outre leurs rôles dans la mobilité, les flagelles peuvent également servir d’appendices 

adhésifs au début de la phase de colonisation de l’hôte. Dans ce cas, ils perdent leur fonction 

de mobilité puisqu’ils deviennent attachés (Josenhans et Suerbaum, 2002). La structure 

classique du filament flagellaire est composé de deux protéines : FliC, constituant majoritaire, 

et FliD, constituant la coiffe du flagelle dans la partie distale. Ainsi, il a été mis en évidence le 

rôle de FliD dans l’adhésion de Pseudomonas aeruginosa lors de trachéites (Arora et al., 

1998). Les flagelles apparaissent donc comme une structure assurant la mobilité de la bactérie 

mais également comme acteurs des premières étapes de l’adhésion. 

I.B.1.3 

Les harpines 

Les harpines sont des protéines thermostables sécrétées dans le milieu extérieur par les 

bactéries phytopathogènes. Le mode d’action des harpines reste à clarifier, toutefois, il a été 

montré que la présence de harpine perturbe les échanges ioniques des cellules végétales avec 

le milieu extérieur (El-Maarouf et al., 2001 ; Popham et al., 1995) et provoque l’inhibition 

rapide de la synthèse d’ATP (Xie et Chen, 2000). Celà conduit à une alcalinisation du milieu 

intercellulaire initialement acide, modification bénéfique à la bactérie pathogène (Hoyos et 

27


al., 1996 ; Popham et al., 1995). Il a également été observé une inhibition des pompes à 

protons ATP dépendantes, entraînant une dépolarisation de la membrane (Pike et al., 1998). 

Les mécanismes conduisant ensuite à la mort de la cellule eucaryote reste inconnus. 

Cependant, la harpine HrpZ de Pseudomonas syringae ssp phaseolicola forme in vitro un 

pore dans une bicouche lipidique, permettant le passage sélectif de cations (Lee et al., 2001). 

Ce pore pourrait favoriser l’invasion du pathogène en provoquant une sortie de nutriments 

dans le milieu intercellulaire et en facilitant l’entrée de facteurs de virulence à l’intérieur de la 

cellule végétale. 

I.B.2 

Les facteurs de propagation 

Pour réussir à infecter son hôte, le pathogène doit passer la barrière extérieure de la 

cellule eucaryote (Herron et al., 2000). Dans le cas des cellules végétales, cette barrière est 

essentiellement composée de polysaccharides alors que pour les cellules animales, elle est 

constituée de lipides. 

Une fois que le micro-organisme pathogène a rejoint la partie de l’hôte propice à une 

infection, et lorsque les conditions environnementales sont favorables, il va produire les 

facteurs de propagation. Ces derniers permettent la multiplication et la colonisation de l’hôte. 

Il existe un grand de nombre facteurs de virulence, impliqués dans la colonisation de l'hôte. 

I.B.2.1 

Les enzymes dégradatives des bactéries pathogènes des animaux 

Les bactéries pathogènes sont capables de produire un certain nombre d'enzymes 

extracellulaires permettant d’envahir les tissus de l’hôte : 

- les hyaluronidases sont des enzymes qui favorisent la dissémination des bactéries dans les 

tissus en dégradant l'acide hyaluronique du tissu conjonctif; 

- les fibrinolysines dissolvent les caillots de fibrine que l'hôte constitue souvent pour contenir 

localement les micro-organismes invasifs et empêcher leur dissémination; 

- les protéases, les nucléases et les lipases sont toutes des enzymes qui augmentent l'invasivité 

bactérienne en dégradant des protéines, des acides nucléiques ou des lipides; 

- les hémolysines sont des protéines toxiques extracellulaires capables d'attaquer les 

membranes de différentes cellules, dont celles des globules rouges, et de provoquer par là leur 

lyse; 

28


- les leucocidines sont capables de lyser les polynucléaires, ce qui entraîne l'affaiblissement de 

la résistance de l'hôte. 

L’arsenal enzymatique bactérien serait donc déterminant dans l’adaptation du 

pathogène à l’hôte au cours du processus infectieux. Ainsi, Pseudomonas aeruginosa produit 

une batterie d’enzyme dégradative comme les élastases LasA et LasB qui dégradent l'élastine, 

un composant de tissu pulmonaire. Ces deux enzymes inactivent aussi de nombreuses 

protéines telles que les immunoglobulines (IgA et IgG) (Heck et al., 1990). 

I.B.2.2 

Les enzymes dégradatives des bactéries phytopathogènes 

L’obstacle essentiel pour les bactéries phytopathogènes est la paroi des cellules 

végétales, dite paroi pectocellulosique. Elle est constituée de deux matrices de 

polysaccharides : le réseau de pectine et le réseau de cellulose-hémicellulose : 

La cellulose est constituée de monomères de glucose liés entre eux par des 

liaisons β 1-4, conduisant à des polymères linéaires. Ces polymères s'associent entre eux par 

des liaisons intermoléculaires de type liaisons hydrogène, conférant ainsi une structure 

fibrillaire à la cellulose. 

L'hémicellulose est faite de monomères glucidiques. Par rapport à la cellulose, 

l'hémicellulose ne contient pas que des glucoses anhydres. Par exemple, en plus du glucose, 

les monomères de l'hémicellulose peuvent être du xylose, du mannose, du galactose, du 

rhamnose, ou de l'arabinose. 

La pectine est un polymère de polysaccharides acides. La chaîne principale est 

composée d'acide galacturonique lié en α1-4. Régulièrement entre ces monomères 

s'intercalent des molécules de rhamnoses par des liaisons 1-2 et 1-4. Ce type de liaison entre 

les molécules d'acide uronique et de rhamnose forme des coudes. La macromolécule de 

pectine ressemble à un zigzag. Cet agencement donne des propriétés particulières aux 

pectines. Pour compléter la composition chimique des pectines il faut préciser qu'il existe des 

ramifications au niveau des acides uroniques comme au niveau du rhamnose par des 

molécules (ex galactane, arabinane etc…). Cette grande hétérogénéité fait que l'on doit plutôt 

parler des pectines que de la pectine. 

29


Cette prévalence de polysaccharides conduit la plupart des phytopathogènes à produire 

un arsenal de saccharidases comme principal système d’attaque. 

Ainsi les Erwiniae pectinolytiques synthétisent des enzymes qui dégradent les 

polymères des parois végétales (Barras et al., 1994 ; Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996). 

Les plus importantes sont les pectinases, qui permettent la dégradation et l'assimilation de la 

pectine. De nombreuses pectinases ont été caractérisées chez E. chrysanthemi 3937 et seront 

détaillées par la suite. E. chrysanthemi 3937 synthétise également deux cellulases, la cellulase 

périplasmique CelY (EGY) et la cellulase extracellulaire Cel5 (EGZ), qui ont une action 

synergique sur la cellulose (Boyer et al., 1987; Zhou et Ingram, 2000). La faible incidence des 

mutations cel sur la virulence malgré l’importance quantitative de la cellulose dans la paroi 

primaire végétale suggère un rôle mineur des cellulases dans la pathogénicité (Boccara et al., 

1988). D'autres enzymes dégradatives sécrétées par E. chrysanthemi ont été caractérisées dans 

différentes souches, dont une endoxylanases chez E. chrysanthemi D1 (Keen et al., 1996; 

Hurlbert et Preston, 2001) et plusieurs protéases (Wandersman et al., 1990 ; résultats non 

publiés). 

I.B.2.3 

Les toxines 

A côté des facteurs extracellulaires qui favorisent l'invasivité, les bactéries peuvent 

produire des toxines qui sont responsables de symptômes ou même de certains syndromes 

associés à l'infection: les exotoxines et les endotoxines. Ces facteurs n’ayant été pour 

l’essentiel été étudiés que chez les pathogènes d’animaux, nous n’en ferons qu’une 

présentation succincte. 

I.B.2.3.a 

Exotoxines 

Les exotoxines bactériennes présentent en général une structure comportant un 

domaine A (activité) et un domaine B ("binding", liaison au récepteur). Le domaine B est 

responsable de l'introduction du domaine A dans le cytoplasme de la cellule eucaryotique à 

travers sa membrane. 

Le cas décrit porte sur Vibrio cholerae (Spangler, 1992). La toxine produite a pour 

cible les entérocytes, c’est-à-dire les cellules de l'épithélium intestinal dont la principale 

fonction est l'absorption des produits de la digestion. Les vibrions cholériques ne pénètrent 

30


pas dans les tissus : ils restent à la surface des entérocytes auxquels ils adhèrent et sur lesquels 

ils se multiplient. La toxine diffuse localement et dérègle les fonctions cellulaires en stimulant 

l'activité de l'adénylate cyclase. Située principalement dans la membrane cytoplasmique, 

l'adénylate cyclase joue un rôle prépondérant dans le contrôle des échanges cellulaires assurés 

par les entérocytes. Ces échanges sont gravement perturbés par l'adénylate cyclase que 

contient la toxine bactérienne. Quand cette adénylate cyclase bactérienne pénètre dans les 

entérocytes, elle se substitue à l'adénylate cyclase cellulaire. Sous son action, les mécanismes 

de régulation cellulaire sont détruits. Non seulement les liquides et les éléments nutritifs ne 

peuvent plus traverser les entérocytes pour gagner le système circulatoire mais les cellules 

laissent fuir l'eau et les électrolytes corporels vers l'intestin. Cette fuite liquidienne grave, 

irrépressible tant que la toxine n'a pas été neutralisée, entraîne l'acidose et la déshydratation. A 

son tour la déshydratation mène à la diminution du volume sanguin (hypovolémie), à la 

réduction du débit cardiaque et au ralentissement des fonctions rénales. Un malade souffrant 

du choléra peut perdre 15 à 20 litres de liquide par jour. 

I.B.2.3.b 

Endotoxines 

L'endotoxine des bactéries à gram négatif fait partie de leur paroi et est constituée par 

les lipopolysaccharides de la membrane externe. Elle est relâchée en grande quantité lors de la 

lyse cellulaire. Sa toxicité est variable et dépend en particulier de sa composition chimique 

qui est fonction de l'espèce bactérienne. 

Le lipide A, constituant du LPS, est généralement composé d'une ossature de 

glucosamine portant des chaînes aliphatiques: il est responsable de la toxicité de la molécule. 

Du point de vue fonctionnel, une partie saccharidique, même très limitée, est indispensable 

car elle assure la solubilité du lipide A. 

Au cours des septicémies, la lyse bactérienne peut être à l'origine d'un choc 

endotoxinique via une libération massive de lipopolysaccharides. Le LPS se fixe à une 

protéine sérique, la LBP (LPS binding protein). Le complexe LBP+LPS est reconnu à la 

surface des macrophages par le CD14 et le TLR-4. Ceci va activer un facteur transcriptionnel 

cellulaire NF-kB, qui induit la production massive de très nombreux gènes impliqués dans 

l’inflammation. 

31


IC 

Résistance aux systèmes de défenses de l’hôte 

En permanence, les organismes vivants sont susceptibles d’être en contact avec des 

micro-organismes pathogènes. Ils ont développé des mécanismes de défense pour lutter contre 

ces agents infectieux. Ces mécanismes de défense sont tout d'abord physiques comme par 

exemple les épithélia ou la cuticule chez les insectes, la paroi pectocellulosique des plantes. 

I.C.1 

Défenses des animaux 

Chez les animaux, il existe surtout une réponse immunitaire qui repose sur des cellules 

de la lignée sanguine qui vont par exemple sécréter des molécules inflammatoires ou 

cytokines, des molécules toxiques et phagocyter les pathogènes. Chez les vertébrés, on 

distingue classiquement deux types de réponse, une réponse immédiate dite innée et une 

réponse dite adaptative ou spécifique. La réponse immunitaire innée est un système de 

défense ancien présent dans la majorité des métazoaires comme chez les insectes dont la 

drosophile et chez l’homme. C’est une réponse efficace aux infections qui repose notamment 

sur la reconnaissance de motifs microbiens, sur la sécrétion d'agents microbicides à spectre 

d'activité plus ou moins large ainsi que sur la phagocytose des pathogènes. De plus, chez les 

vertébrés, la réponse immunitaire innée est nécessaire à l'activation de la réponse immunitaire 

adaptative. L'immunité adaptative dépend de l'activation des lymphocytes et de la synthèse 

par les lymphocytes B d'immunoglobulines ou anticorps capables de reconnaître des antigènes 

précis et qui sont nécessaires à l'élimination du pathogène. 

I.C.2 

Réactions de défenses des plantes 

I.C.2.1 

La réaction hypersensible, induite par le stress oxydant 

Dans les cas des bactéries phytopathogènes, l’apparition de la maladie résulte de 

l’infection par le pathogène d’une plante dite hôte au cours d’une réaction dite compatible. 

Par contre, si une bactérie pathogène attaque une plante non hôte au cours d’une réaction 

incompatible, celle-ci met en place un système de résistance très efficace appelé réaction 

hypersensible. Cette réaction aboutit au confinement du pathogène au site de l’attaque et en sa 

32


neutralisation. La mise en place de la réaction incompatible est déterminée au niveau 

génétique par une réaction dite « gène pour gène », avec les gènes d’avirulence avr chez la 

bactérie et les gènes R de résistance chez la plante. La présence d’un gène avr chez le 

pathogène induit une réponse hypersensible si la plante infectée porte le gène R correspondant 

(Staskawicz et al., 1995). Dans le cas d’E. chrysanthemi qui possède un arsenal d’enzymes 

dégradatives, l’infection est si brutale que la plante n’a pas le temps de mettre en place une 

réponse hypersensible. Cependant, si la souche utilisée est mutée pour les principales pectate 

lyases (PelABCE), participant à la dégradation de la paroi végétale, alors la plante met en 

place une réponse hypersensible qui conduit à une nécrose localisée au site d’infection 

(Figure 7). Cette réaction hypersensible de la plante serait liée à la production de la harpine 

HrpN. En effet, une souche ne produisant ni les cinq Pels majeures, ni HrpN, perd sa capacité 

d’induire la réaction hypersensible. Ainsi, dans la souche parentale l’effet de la harpine HrpN 

serait masqué par l’action des cinq Pels majeures. 

Figure 7 : Réponse hypersensible élicitée par E. chrysanthemi sur feuille de tabac (Bauer 

et al., 1995). 

La feuille de tabac a été photographiée 24h après l’infection. Les souches d’E. 

chrysanthemi qui ont été utilisées dérivent de la souche parentale EC16 : 1, ∆pelABCE ; 2, 

5, ∆pelABCE hrpN - ; 3, 6, ∆pelABCE hrpN - complémentée en trans par hrpN. 4: témoin 

négatif, inoculation avec du tampon ne contenant pas de bactéries. 

33


Parmi les mécanismes impliqués dans une interaction compatible ou non entre la 

plante et le pathogène, la cinétique de la genèse d’un stress oxydant est primordiale (Mehdy, 

1994). Un parallèle peut être fait avec le stress oxydant observé lors de la phagocytose de 

pathogènes par les macrophages chez les mammifères (Babior, 1992). Dès la première heure 

suivant l’infection, les cellules végétales émettent transitoirement une première vague de 

radicaux oxygénés activés tels que les peroxydes (H 2 O 2 ), des radicaux hydroxyles (OH·) ou 

des ions superoxydes O - 2 : c’est la réponse primaire aspécifique. 

Dans le cas d’une interaction incompatible, cette réponse aspécifique est suivie au 

bout de 3 à 6 heures d’une réponse secondaire spécifique consistant en une deuxième vague 

oxydative plus importante et plus soutenue (Figure 8). 

Radicaux oxygénés activés 

I 

II 

Incompatible 

Compatible 

0 2 4 6 

Temps après l’infection (heures) 

Figure 8 : Production de composés oxygénés activés lors d’une interaction plantepathogène 

compatible ou incompatible. 

La production biphasique de composés oxygénés activés est caractéristique d’une 

réaction incompatible. Dans le cas d’une réaction compatible, seule la première phase 

oxydative a lieu. 

Ces radicaux oxygénés proviennent du détournement du flux électronique de la 

respiration vers une oxydase de la membrane cellulaire végétale (Mehdy, 1994). Ce stress 

oxydant provoque la mort des cellules végétales proches du site infectieux mais permet aussi 

34


d’activer la synthèse de lignine ainsi que de catalyser le pontage intermoléculaire des 

protéines riches en proline ou en hydroxyproline de la paroi végétale (Bradley et al., 1992). 

Cette condensation de la paroi la rend plus résistante à l’action des enzymes lytiques du 

pathogène et gène sa progression dans les tissus végétaux (Brisson et al., 1994). La lyse des 

cellules végétales par le stress oxydant ou par l’action des enzymes lytiques du pathogène 

aboutit à la libération de fragments de paroi végétale. Ces fragments oligosaccharidiques 

contribuent à l’activation des réactions de défense de la plante en stimulant notamment la 

synthèse de peroxydes (Hahn et al., 1993). Enfin, ces radicaux oxygénés participent à la 

peroxydation des lipides membranaires des cellules végétales lysées, qui génère des composés 

à activité biostatique ou antibiotique (Keppler et Baker, 1989 ; Peng et Kuc, 1992). Parmi ces 

composés, le jasmonate, produit de la peroxydation du linoléate, serait impliqué dans la 

protection des cellules végétales saines, proches du site d’infection, des composés oxygénés 

toxiques. Ceci permettrait de confiner la réaction hypersensible au site d’infection. Enfin, la 

réponse hypersensible aboutit à la production par les cellules végétales d’un pic d’acide 

salicylique, responsable de l’induction de l’expression de gènes codant des protéines liées à la 

pathogenèse (Delaney et al., 1994). Parmi ces protéines, on trouve des enzymes pouvant 

dégrader la paroi du pathogène (chitinases, glucanases). Par ailleurs, l’acide salicylique s’est 

révélé être un bon inhibiteur des pectate lyases produites par E. chrysanthemi (Tardy et al. 

1997). 

I.C.2.2 

Les systèmes de défenses contre le stress oxydant 

Les ions superoxydes ainsi que tout radical oxygéné activé sont des métabolites très 

toxiques attaquant l’ADN ainsi que toutes les enzymes du métabolisme cellulaire impliquées 

dans des fonctions d’oxydoréduction (Farr et al., 1986). En initiant la peroxydation des 

lipides, ils peuvent également entraîner de graves lésions au niveau des membranes et mettre 

ainsi en danger l’intégrité cellulaire (Storz et Imlay, 1999). Les bactéries ont donc développé 

des systèmes leur permettant de se protéger de l’action des agents oxydants. Plusieurs de ces 

systèmes sont bien caractérisés chez E. coli et également chez E. chrysanthemi. 

Le cas du régulateur OxyR a été bien décrit. OxyR est un facteur de transcription 

répondant spécifiquement à la présence de peroxyde d’hydrogène (H 2 O 2 ). En présence de 

peroxyde d’hydrogène, cette protéine tétramérique subit une oxydation conduisant à la 

formation de ponts disulfures intramoléculaires. Sous forme oxydée, OxyR active 

l’expression des gènes du régulon oxyR, dont la plupart sont clairement impliqués dans les 

réactions de défense contre le stress oxydant (Toledano et al., 1994 ; Pomposiello et Demple, 

35


2001)). Ainsi, l’expression du gène katG est induite en présence d’OxyR sous forme oxydée. 

katG code la catalase hydroperoxydase I, qui constitue le système majeur de détoxification du 

peroxyde d’hydrogène (Gonzalez-Flecha et Demple, 1997). Les cellules phagocytaires 

animales (neutrophiles, monocytes, macrophages,…) sont capables de générer des ions 

superoxydes grâce à un transfert d’électrons du NADPH vers le dioxygène (Segal, 1989). 

Pour contrer ces défenses, le rôle des catalases bactériennes est déterminant. En effet, chez les 

bactéries Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes et Mycobacterium tuberculosis, il a 

été observé qu’une forte concentration intracellulaire de catalase est corrélée avec une 

résistance à ces défenses produites par les cellules phagocytaires (Mandell, 1975 ; Welch et 

al., 1979 ; Kusunose et al., 1976). 

De même, le gène oxyR d’E. chrysanthemi code une protéine présentant 88% de 

similarité avec celle d’E. coli (Miguel et al., 2000). Le mutant oxyR d’E. chrysanthemi 

possède une sensibilité accrue au peroxyde d’hydrogène, cependant il ne présente pas une 

virulence significativement réduite sur tubercules de pomme de terre ou sur plants de tabac 

(Miguel et al., 2000). Une hypothèse est qu’E. chrysanthemi possède plusieurs systèmes 

redondants de détoxification du peroxyde d’hydrogène. 

E. chrysanthemi possède également une superoxyde dismutase cytoplasmique, SodA, 

impliquée dans la détoxification des ions superoxydes. Dans ce cas également, la protéine 

d’E. chrysanthemi possède une forte homologie (85% de similarité) avec celle d’E. coli 

(Santos et al., 2001). Le mutant sodA d’E. chrysanthemi est plus sensible que la souche 

parentale à la présence de paraquat, capable de générer l’ion O - 2 (Santos et al., 2001). Sur 

tubercules de pomme de terre, ce mutant possède une capacité de macération identique à celle 

de la souche parentale. En revanche, sa virulence est fortement diminuée sur plants de 

Saintpaulia ionantha. Il existe également, chez cette bactérie, d’autres systèmes de résistance 

au stress oxydant, tels que la peptide méthionine sulfoxyde réductase MsrA, la 

flavohémoglobine HmpX ou la protéine SufC (El Hassouni et al., 1999 ; Favey et al., 1995 ; 

Nachin et al., 2001). 

L’ensemble de ces systèmes met en évidence le rôle déterminant d’une bonne 

résistance au stress oxydant pour une bactérie pathogène. 

36


ID 

Conclusion sur les intéractions hôte-pathogène 

A la vue de ces différents exemples, il ressort que les interactions entre les bactéries 

pathogènes et leurs hôtes animaux ou végétaux mettent en jeu des systèmes et des 

mécanismes similaires ; les spécificités des facteurs de virulence de ces deux types de 

pathogène étant en liaison étroite avec les caractéristiques du règne animal et végétal. 

II Régulation de l’expression génique chez les procaryotes 

Il est indispensable pour les bactéries de répondre et de s’adapter aux changements des 

conditions environnementales. Une des manières essentielles par lesquelles ces mécanismes 

adaptatifs sont réalisés consiste en une régulation de l’expression des gènes requis dans des 

conditions données. Ainsi la plupart des réponses adaptatives bactériennes est régie par 

l’ARN polymérase et des facteurs de transcription qui, en réponse à des signaux, déclenchent 

les réponses transcriptionnelles requises. Chaque étape du passage entre le gène et son produit 

est exploitée pour exercer ce contrôle, mais par souci d’une économie d’énergie, l’étape clef 

se situe au niveau de l’initiation de la transcription. 

IIA 

Au niveau de l’initiation de la transcription 

Cette étape cruciale de l’expression génique requiert l’interaction de l’ARN 

polymérase avec les promoteurs de l’ADN et l’ouverture de l’ADN double brin au niveau du 

point d’initiation de la transcription. L’étude de ce phénomène chez la bactérie modèle E. coli, 

a permis de comprendre le contrôle de la transcription dans tous les règnes vivants. 

II.A.1 

L’ARN polymérase est l’élément central de la transcription 

La composante centrale de la régulation de l’initiation de la transcription chez les 

bactéries est l’ARN polymérase, qui est responsable de la transcription à proprement parler 

(Ebright, 2000). L’ARN polymérase est constitué de deux parties : l’enzyme core et le facteur 

sigma. Réunis, ils forment l’holoenzyme. Le rôle du facteur sigma est détaillé plus bas. 

37


II.A.1.1 L’enzyme core, la partie catalytique de l’ARN polymerase 

L’enzyme core est responsable de la transcription mais non de la reconnaissance du 

promoteur. Elle est constituée de cinq sous unités : β, β′, deux sous unités α identiques et une 

petite sous unité ω (Figure 9). Les études structurales ont montré que l’enzyme core adopte 

une structure en pince de crabes, qui est similaire à la structure de l’ARN polymérase II des 

levures (Zhang et al., 1999 ; Fu et al., 1999). Le site actif de l’ARN polymérase est formé des 

sous unités β et β’ (1342 et 1407 acides aminés respectivement chez E. coli (Korzheva et al., 

2000), un ion Mg 2+ est indispensable au bon fonctionnement du site actif. Chacune des sous 

unité α (329 acides aminés) est formée par deux domaines repliés indépendamment et reliés 

par une région charnière, partie flexible d’une vingtaine d’acides aminés (Blatter et al., 1994). 

La partie amino-terminale est la plus grande (résidus 1 à 235). Sa dimérisation permet 

d’assembler les deux sous unités β et β′. La petite partie carboxy-terminale des sous unités α 

(résidus 250 à 329) est un domaine de fixation à l’ADN, qui joue un rôle dans l’interaction 

avec certains promoteurs (Gourse et al., 2000). La petite sous-unité ω n’a pas de rôle direct 

dans la transcription, mais semble fonctionner comme une chaperonne pour le repliement de 

la sous unité β′. 

38


Figure 9 : Structure de l’ARN polymérase et son interaction avec un promoteur (d’après 

Browning et Busby, 2004). 

II.A.1.2 

La région promotrice : à la fois structurée et modulaire 

Figure 10 : Eléments principaux du gène procaryote. 

39


L’étape clef de l’initiation de la transcription est la reconnaissance du promoteur par 

l’ARN polymérase. Les différents éléments de la séquence d’ADN constituants un promoteur 

ont été étudiés intensivement (Busby et Ebright, 1994) (Figure 10). Quatre éléments 

différents ont été identifiés. Les deux principaux sont l’hexamère -10 (Pribnow, 1975) et 

l’hexamère -35 qui sont centrés à 10 et 35 paires de bases en amont du point d’initiation de la 

transcription et distant entre eux généralement de 17 bases. 

L’hexamère -10 est reconnu par le domaine 2 de la sous unité σ de l’ARN polymérase 

alors que l’hexamère -35 est reconnu par le domaine 4 du facteur σ. Des séquences consensus 

pour les éléments -10 et -35 ont été établies : la séquence consensus TATAAT forme 

l’hexamère -10 et la séquence TTGACA constitue le consensus de l’élément -35. Des études 

cristallographiques ont permis l’élaboration de modèles qui expliquent les mécanismes de la 

reconnaissance de ces séquences par l’ARN polymérase (Campbell et al., 2002, Murakami et 

al., 2002). Les deux autres éléments importants de la structure d’un promoteur sont les 

éléments -10 étendus et les éléments UP. Le -10 étendu est un motif de 3 à 4 paires de bases 

situées immédiatement en amont de l’hexamère -10. Il est reconnu par le domaine 3 du 

facteur σ (Murakami et al., 2002 ; Sanderson et al., 2003). L’élément UP est composé d’une 

vingtaine de paires de bases située en amont de l’hexamère -35. Il est reconnu par les 

domaines carboxyterminaux des sous unités α de l’ARN polymérase (Ross et al., 2001). 

Ainsi, les éléments -10, -35, -10 étendus et UP assurent une fixation spécifique de l’ARN 

polymérase au niveau du promoteur (Figure 10), mais la contribution relative de chaque 

élément diffère d’un promoteur à un autre. 

Le rôle de ces éléments est donc de permettre la fixation initiale de l’ARN polymérase 

qui conduit à la formation du complexe ouvert puis aux étapes suivantes de la transcription. 

Dans la cellule bactérienne, l’ARN polymérase est face à un ensemble de presque 2000 

séquences promotrices (Salgado et al., 2001). Les différences entre ces séquences participent 

fortement à la distribution inégale de l’ARN polymérase entre les différentes unités de 

transcription. Plus un promoteur à une séquence proche du consensus, plus il est efficace. Le 

fait que la quasi-totalité des promoteurs possèdent une séquence qui diffère du consensus met 

en évidence que l’activité de chaque promoteur est en balance avec celle des autres 

promoteurs (Tableau 1). Même si les différences de séquences permettent une régulation de 

l’activité des promoteurs, cette régulation est statique et ne peut pas être modulée en fonction 

des conditions environnementales perçues par la cellule. La plupart des régulations 

adaptatives sont médiées par des facteurs de transcription, comme décrit plus bas. 

40


-35 -10 

T T G A C A T A T A A T 

A 10 6 9 56 21 54 5 76 15 61 56 6 

C 10 7 12 17 54 13 10 6 11 13 20 7 

G 10 8 61 11 9 16 8 6 14 14 8 5 

T 69 79 18 16 16 17 77 12 60 12 15 82 

Tableau 1 : Fréquence d’apparition des nucléotides dans les éléments -35 et -10 du promoteur 

bactérien. Les fréquences sont indiquées en pourcentage, celles concernant les bases des 

consensus apparaissent en gras (Lisser et Margalit, 1993). 

II.A.1.3 Les étapes de l’initiation de la transcription 

Le processus de la transcription se divise en trois principales étapes : l’initiation, 

l’élongation et la terminaison. L’initiation de la transcription requiert l’interaction de l’ARN 

polymérase avec la région d’ADN correspondant à un promoteur (Figure 11). Cette fixation 

de l’ARN polymérase se fait via les domaines 2 et 4 du facteur σ qui vont interagir avec les 

hexamères -10 et -35, respectivement (De Haseth et al., 1998). 

Après la fixation initiale de l’ARN polymérase, les brins d’ADN compris entre les 

positions -10 et +2 par rapport au point d’initiation de la transcription s’ouvrent pour former 

une « bulle » appelée le complexe ouvert (Tsujikawa et al., 2002 ; Tomsic et al., 2001). La 

formation du complexe ouvert est due à une isomérisation. Cette isomérisation est encore mal 

comprise, mais il en résulte un mouvement de l’ADN simple brin de la « bulle » vers le site 

actif de l’ARN polymérase, étape qui se poursuit par la formation de la première liaison 

phosphodiester entre les deux premiers nucléosides triphosphates. Après que 9 à 12 

nucléosides d’ARN aient été synthétisés, le complexe d’initiation entre dans le stade 

d’élongation. Cette transition est marquée par un changement conformationnel significatif qui 

conduit notamment au relargage du facteur σ (Ishihama, 2000). 

Ainsi, la synthèse d’ARN implique plusieurs étapes, qui peuvent toutes être sujet à 

régulation. Par soucis d’économie, la plupart de ces régulations ont lieu aux étapes initiales de 

la transcription. Le facteur limitant à cette étape est généralement la disponibilité de l’ARN 

polymérase. En effet, le nombre total de molécules d’enzyme core dans des cellules en 

croissance d’E. coli est d’environ 2000, ce qui est moins que le nombre de gènes d’E. coli 

(environ 5000) (Ishihama, 1981 ; Ishihama, 1997 ; Blattner et al., 1997). Dans ces conditions, 

la majorité de l’holoenzyme active est engagée dans la transcription des gènes codant les 

ARNs stables (ARN ribosomaux et de transferts), nécessaire à la traduction. Donc la quantité 

41


d’ARN polymérase disponible pour transcrire les quatre à cinq mille gènes de la cellule est 

limitée (Ishihama, 2000). Il y a donc une compétition intense entre les différents promoteurs 

pour la fixation de l’holoenzyme (Ishihama, 2000 ; Maeda et al., 2000). Ceci explique en 

partie comment les cellules peuvent synthétiser une grande quantité d’un ARN messager 

donné mais peu ou pas d’un autre. Ce constat a conduit à l’hypothèse selon laquelle la 

fixation de l’ARN polymérase sur les promoteurs et la formation du complexe ouvert 

constituent les étapes clefs de la régulation transcriptionnelle. Cinq éléments essentiels 

semblent diriger la répartition de l’ARN polymérase sur les différents promoteurs. Il s’agit, 

comme précédemment indiqué, de la séquence en ADN des régions promotrices, la proportion 

relative des différents facteurs σ, mais aussi de la présence des petits ligands, des facteurs de 

transcription et de l’organisation structurale du chromosome bactérien. 

42


Figure 11 : Les étapes de l’initiation de la transcription bactérienne (d’après Browning et 

Busby, 2004). 

43


II.A.2 

La régulation de l’initiation de la transcription 

II.A.2.1 

Les acteurs 

II.A.2.1.a Les facteurs sigma : acteurs de la reconnaissance des promoteurs 

II.A.2.1.a.i 

La sous-unité sigma (σ) 

Comme précédemment indiqué, la transcription commence par une interaction de 

l’enzyme core de l’ARN polymérase avec les régions promotrices de l’ADN. Cette interaction 

se fait par le biais de la sous-unité σ. Le premier facteur σ bactérien a été découvert en 1969 

comme la sous unité de l’ARN polymérase d’E. coli essentielle pour la sélection du 

promoteur (Burgess et al., 1969). 

La sous unité σ, ou facteur σ, a trois fonctions principales : assurer la reconnaissance 

des séquences spécifiques d’un promoteur, positionner l’holoenzyme au niveau du promoteur 

cible et faciliter l’ouverture de la double hélice d’ADN au niveau du site d’initiation de la 

transcription (Wösten, 1998). La plupart des bactéries possède plusieurs facteurs σ qui 

permettent de reconnaître différents ensembles de promoteurs. A l’exception de la famille σ 54 , 

tous les facteurs σ partagent les mêmes caractéristiques (Merrick, 1993 ; Campbell et al., 

2002). Ils possèdent généralement quatre domaines reliés par des régions charnières. Les 

domaines 2, 3 et 4 sont connus pour être impliqués dans la reconnaissance du promoteur 

(Murakami et al., 2002; Vassylyev et al., 2002). Le rôle du domaine 1 reste mal compris. 

E. coli possède un facteur σ 70 , dit facteur végétatif, qui permet la reconnaissance par 

l’holoenzyme de la plupart des promoteurs. Cependant le génome d’E. coli contient six autres 

facteurs σ qui s’accumulent en réponse à différents stress plus ou moins spécifiques 

(Ishihama, 2000). En raison de leur caractère inductible, ces facteurs σ alternatifs peuvent 

entrer en compétition avec le facteur σ 70 pour la fixation à l’enzyme core. Ils se lient à une 

certaine quantité d’enzyme core et permettent d’initier la transcription au niveau de 

promoteurs portant des éléments de séquences particuliers (Maeda et al., 2000). 

Le nombre de facteur σ varie d’un pour Mycoplasma genitalium à 63 pour 

Streptomyces coelicolor (Gruber et Gross, 2003). Il apparaît une étroite corrélation entre le 

nombre de facteur σ et la diversité d’environnements dans lesquels le micro-organisme peut 

survivre. 

44


II.A.2.1.a.ii Les facteurs σ impliqués dans la transcription des gènes de virulence 

Chez les bactéries pathogènes, les facteurs σ alternatifs sont souvent impliqués dans la 

régulation de la virulence (Tableau 2). Ces effets se manifestent par une action directe sur la 

régulation des gènes de virulence ou par un effet indirect, en régulant les gènes qui 

augmentent le fitness de la bactérie durant l’infection. Ainsi, le facteur σ B de Listeria 

monocytogenes active directement la transcription du gène inlA, qui code l’internaline A, 

protéine participant à l’invasion des cellules phagocytaire non professionnelles (Lingnau et 

al., 1995 ; Sue et al., 2004). Chez les souches pathogènes entérohémorrhagiques (EHEC) d’E. 

coli, le mécanisme d’adhésion aux cellules de l’épithélium intestinal nécessite un système de 

sécrétion de type III, codé par les gènes du locus LEE dont l’expression est activée par le 

facteur de transcription σ S (Beltrametti et al., 1999). L’implication de ce facteur σ dans le 

contrôle de la virulence est encore plus marquée chez des bactéries comme Salmonella 

thyphimurium. En effet, des mutants rpoS, codant σ S , de cette bactérie sont totalement 

avirulents sur des modèles murins (Hengge-Aronis, 2000a). Ce phénotype résulterait de 

l’absence de la mise en place de la réponse générale au stress ainsi que d’une régulation 

inappropriée des gènes de virulence. 

σ S 

est également impliqué dans la régulation de la virulence chez des bactéries 

phytopathogènes comme Erwinia carotovora. Chez cette bactérie, σ S contrôle négativement la 

synthèse d’enzymes extracellulaires, responsables de la dégradation de la paroi des cellules 

végétales et considérées comme un facteur de virulence essentiel (Andersson et al., 1999). Un 

mutant rpoS d’E. carotovora a une capacité macératrice augmentée in planta par rapport à 

celle de la souche parentale mais est incapable de croître à de fortes densités et d’entrer en 

compétition avec la souche parentale aussi bien in vitro qu’in planta. Ce défaut de croissance 

in vivo du mutant rpoS serait lié à une plus grande sensibilité aux stress oxydant et osmotique. 

Ces deux exemples suggèrent qu’un gène rpoS fonctionnel est requis pour la survie des 

bactéries S. typhimurium et E. carotovora dans un environnement compétitif et dans des 

conditions stressantes. Ceci met en évidence l’importance du couplage du contrôle de la 

réponse au stress et de l’expression des gènes de virulence. 

45


Famille, classe et facteur sigma 

Espèces bactériennes 

Famille σ 70 : 

réponse au stress 

σ B B. anthracis, L. monocytogenes, M. 

tuberculosis, S. aureus, S. epidermidis 

σ S 

E. coli, P. aeruginosa, S. enterica serovar 

Typhimurium, Erwinia carotovora 

σ F 

M. tuberculosis 

ECF 

RpoE 

H. influenzae, S. enterica serovar 

Typhimurium, V. cholerae 

AlgU 

P. aeruginosa 

PvdS, Fpvl 

P. aeruginosa 

σ C 


σ D 


σ E 


σ H 


HrpL 

Erwinia spp., P. syringae 

σ 28 FliA 

C. jejuni, H. pylori, S. enterica serovar 

Typhimurium, V. cholerae, Y. enterocolitica 

Famille σ 54 

σ N C. jejuni, H. pylori, L. monocytogenes, P. 

aeruginosa, P. syringae, V. cholerae, V. 

parahaemolyticus 

Tableau 2 : facteurs sigma alternatifs impliqués dans la virulence (d’après Kazmierczak et 

al., 2005). Les facteurs sigma sont regroupés par classe. Les classes réponse au stress, ECF et 

σ 28 font toutes partie de la famille σ 70 des facteurs sigma. 

46


II.A.2.1.a.iii Régulation de l’activité des facteurs sigma 

Etant donné que différents facteurs σ régulent les réponses cellulaires à des stress 

variés, leur activité est étroitement contrôlée. Cette régulation peut s’effectuer en contrôlant la 

synthèse du facteur σ, mais dans la plupart des cas, la régulation est exercée par des facteurs 

anti-σ qui modulent l’activité d’un facteur σ indépendamment de sa transcription et de sa 

traduction (Hughes et Mathee, 1998). Beaucoup de facteurs anti-σ séquestrent le facteurs σ 

dont ils modulent l’activité de façon à ce qu’ils ne puissent plus se lier à l’enzyme core. Le 

cas du facteur σ S sera traité en détail dans le paragraphe IIB « Autres mécanismes de la 

régulation de la synthèse protéique chez les procaryotes ». 

II.A.2.1.b Les petits ligands 

Les petits ligands permettent un mécanisme alternatif par lequel l’ARN polymérase 

peut répondre rapidement et efficacement aux variations de l’environnement. Un bon exemple 

est la guanosine 3′,5′ bisphosphate (ppGpp), qui est produite lors d’une carence en acides 

aminés (Chatterji et Ojha, 2001). Le ppGpp déstabilise les complexes ouverts des promoteurs 

qui contrôlent les gènes codant la machinerie de traduction (Barker et al., 2001). Les 

promoteurs sensibles au ppGpp ont une courte séquence riche en GC près du point d’initiation 

de la transcription. L’activité de ces promoteurs requiert également une forte concentration du 

nucléotide initiant la traduction, généralement l’ATP (Gaal et al., 1997). Il a été proposé que 

le ppGpp contrôle l’expression de la machinerie de traduction en réponse à une carence en 

nutriments alors que la disponibilité en ATP permet une régulation en fonction du taux de 

croissance (Schneider et al., 2003). 

La plupart de ces promoteurs recrutent l’ARN polymérase avec une grande efficacité 

et peuvent initier la transcription à un taux élevé. Cependant pour atteindre ces rendements, le 

complexe ouvert doit être stabilisé ce qui demande une forte concentration en ATP et un 

faible taux de ppGpp. Cet exemple met en évidence une régulation de l’initiation de la 

transcription par l’action directe de petits ligands. 

47


II.A.2.1.c Les facteurs de transcription 

Un facteur de transcription est une protéine nécessaire à l’activation ou la répression 

de l’expression d’un gène. Ils régulent spécifiquement la transcription de gènes en se fixant 

sur des séquences régulatrices situées au niveau des promoteurs de ces gènes. Les facteurs de 

transcription peuvent être classés en différentes familles sur la base de similarités entre leurs 

séquences. Une douzaine de familles ont été identifiées, dont les mieux caractérisées sont les 

familles LacI, AraC, LysR, CRP et OmpR. Lorsqu’un facteur de transcription se lie 

spécifiquement à un promoteur, il peut soit activer soit réprimer l’initiation de la transcription 

(Gralla, 1996 ; Barnard et al., 2004). Un facteur de transcription peut être activateur, 

répresseur ou peut remplir les deux rôles en fonction du promoteur cible. On estime que le 

génome d’E. coli K12 contient 314 facteurs de transcription dont 35% sont activateurs, 43% 

répresseurs et 22% peuvent exercés les deux fonctions (Perez-Rueda et Collado-Vides, 2000). 

Quelque uns de ces facteurs contrôlent une grande quantité de gènes, alors que 

d’autres régulent seulement un ou deux gènes. Il a été estimé que 7 facteurs de transcription 

contrôlent 50% des gènes régulés, alors qu’environ 60 facteurs régulent chacun un promoteur 

(Martinez-Antonio et Collado-Vides, 2003). Ces 7 facteurs de transcriptions, dits globaux, 

sont CRP, FNR, IHF, Fis, ArcA, NarL et Lrp. Les facteurs de transcriptions globaux : 

- contrôlent un grand nombre de gènes qui appartiennent à des classes de fonctions 

différentes, 

- contrôlent une cascade de régulations complexe par des mécanismes directs (fixation 

du régulateur sur le promoteur cible) et indirects (régulations de régulateurs du 

promoteur cible), 

- agissent sur des promoteurs qui interagissent avec différents facteurs σ. 

Les facteurs de transcription couplent l’expression des gènes avec les signaux 

environnementaux. Leur propre activité est donc être finement contrôlée par différents 

mécanismes. En premier lieu, l’affinité du facteur de transcription pour sa séquence d’ADN 

cible peut être modifiée par des ligands, dont les concentrations fluctuent en fonction des 

conditions nutritives ou de certains stress. Un exemple est la forte augmentation de la 

spécificité de liaison à l’ADN de l’activateur CRP par l’AMPc. Un second mécanisme 

implique des modifications covalentes des facteurs de transcription. Ainsi, NarL se lie à sa 

cible ADN uniquement lorsqu’il a été phosphorilé par les kinases NarX ou NarQ, qui 

répondent à la présence d’ions nitrite ou nitrate (Darwin et al., 1996). Troisièmement, la 

48


concentration intracellulaire de certains facteurs de transcription contrôle leur activité. 

L’expression mais aussi la protéolyse sont donc déterminantes dans l’activité de ces facteurs. 

Ainsi, une des réponses cellulaires à un stress oxydant est dépendante de la concentration de 

SoxS, un facteur de transcription régulant un ensemble de gènes impliqués dans la résistance 

au stress oxydant. La transcription de soxS est activée par SoxR sous forme oxydée. Ainsi, en 

présence de composé oxydant, comme des ions superoxydes, SoxR passe sous forme oxydée 

et induit la transcription de soxS (Demple, 1996). Enfin, un mécanisme moins commun pour 

réguler la concentration d’un facteur de transcription est la séquestration par une protéine 

membranaire. Ainsi, PtsG, sous sa forme déphosphorilée, fixe au niveau de la membrane le 

répresseur Mlc, impliqué dans la régulation de l’expression de plusieurs gènes du 

métabolisme du glucose (Plumbridge, 2002). 

II.A.2.1.c.i 

Les activateurs 

Un activateur améliore l’activité d’un promoteur en augmentant son affinité pour 

l’ARN polymérase. Dans la plupart des cas, l’activateur fonctionne en se liant d’abord au 

promoteur cible avant d’interagir avec l’ARN polymérase. Cependant, un mécanisme 

alternatif a été mis en évidence pour les régulateurs MarA et SoxS, qui interagissent avec 

l’ARN polymérase libre avant de se lier au promoteur (Griffith et Wolf, 2002 ; Martin et al., 

2002). Pour la plupart des promoteurs, l’activation de la transcription est simple et implique 

un seul facteur de transcription activateur. Trois mécanismes généraux sont utilisés (Figure 

12). 

L’activateur de Classe I se lie à sa séquence ADN cible, localisée en amont de 

l’élément -35 du promoteur, puis recrute l’ARN polymérase par une interaction directe avec 

la partie carboxyterminale des sous-unités α. La région charnière reliant les domaines carboxy 

et amino terminaux des sous unités α est flexible, ce qui permet aux activateurs de classe I de 

se lier à différentes zones en amont du promoteur, tout en permettant un contact avec les sous 

unités α. Le meilleur exemple d’activateur de classe I est la protéine réceptrice de l’AMP 

cyclique (CRP) et le promoteur lac (Ebright, 1993). 

L’activateur de classe II se lie à une séquence proche de l’élément -35 du promoteur, 

ce qui lui permet d’interagir avec le domaine 4 de la sous unité σ (Dove et al., 2003). Ce 

contact permet de recruter l’ARN polymérase au niveau du promoteur cible mais peut aussi 

affecter d’autres étapes de l’initiation de la transcription. Du fait de la faible flexibilité de la 

liaison entre le domaine 4 du facteur σ et l’élément -35 du promoteur, les positions de fixation 

49


des activateurs de classe II varient peu par rapport au point d’initiation de la transcription. Un 

exemple d’activateur de classe II est la protéine CI du bactériophage λ pour l’activation du 

promoteur prm (Nickels et al., 2002). Certains activateurs de classe II reconnaissent d’autres 

parties de l’ARN polymérase comme la partie amino terminale des sous unités α, mais ils 

conservent la liaison avec l’ADN au niveau de l’élément -35 (Busby et Ebright, 1997). 

Dans le troisième mécanisme d’activation, l’activateur altère la conformation du 

promoteur cible pour favoriser les interactions entre l’ARN polymérase et les éléments -10 ou 

-35 du promoteur. Ceci requiert, en général, que l’activateur se lie très près des éléments du 

promoteur. Ainsi, pour les promoteurs activés par les facteurs de transcription de la famille 

MerR, l’espacement entre les éléments -10 et -35 n’est pas optimal pour la fixation de l’ARN 

polymérase. Les activateurs de type MerR se lie entre ces deux éléments et vrille l’ADN de 

façon à les réorienter pour permettre la fixation de la sous unité σ de l’holoenzyme (Brown et 

al. 2003 ; Heldwein et Brennan, 2001). 

Figure 12 : Les différents types d’activateurs transcriptionnels (d’après Browning et Busby, 

2004). 

50


II.A.2.1.c.ii Les répresseurs 

Dans la plupart des cas, la répression de l’expression d’un promoteur implique un seul 

facteur de transcription. Trois mécanismes sont utilisés (Figure 13). 

L’encombrement stérique gênant la liaison promoteur-ARN polymérase est le 

mécanisme de répression le plus simple. Dans ce cas, le site de fixation du promoteur est 

localisé dans ou à proximité des éléments clefs du promoteur, comme par exemple le site de 

fixation du répresseur du promoteur lac (Müller et al., 1996). Cependant, dans certains cas, le 

répresseur peut agir à une étape ultérieure à la fixation de l’ARN polymérase, en empêchant 

l’ARN polymérase d’initier la transcription, en se liant à l’ARN messager ou en empêchant le 

ribosome d’effectuer la traduction. 

Pour d’autres promoteurs, comme par exemple le promoteur gal qui est réprimé par 

GalR (Choy et Adhya, 1996 ), plusieurs molécules de répresseur se lient à des sites distaux du 

promoteur. La répression est causée par la formation d’une boucle d’ADN qui piège l’ARN 

polymérase au début de la transcription. 

Des cas plus complexes existent où le répresseur agit comme un anti-activateur. Ainsi, 

les promoteurs, qui sont réprimés par CytR, sont dépendants d’une activation par CRP. La 

répression exercée par CytR est une interaction directe entre CytR et CRP, empêchant 

l’activation par CRP (Shin et al., 2001). Dans la plupart de ces promoteurs CytR ne reconnaît 

pas son promoteur cible mais le complexe promoteur cible-CRP (Valentin-Hansen et al., 

1996). 

51


Figure 13 : Les différents types de répresseurs transcriptionnels (d’après Browning et Busby, 

2004). 

52


II.A.3 

La chromatine bactérienne a une organisation dynamique 

L’implication de l’organisation structurale du génome dans la régulation de 

l’expression génique a été mise en évidence dans les années 1990 (Higgins et al., 1988 ; 

Dorman et al., 1990). En effet, Higgins et collaborateurs avaient proposé, à cette époque, que 

la variation de l’état d’enroulement de l’ADN intervenait dans l’osmoadaptation d’E. coli. 

Une extension du rôle régulateur de l’état d’enroulement de l’ADN à d’autres conditions 

physiologiques dont l’anaérobiose a par la suite incité ces auteurs à proposer ce contrôle 

comme étant un mécanisme global de l’adaptation bactérienne aux changements des 

conditions environnementales (Dorman et al., 1988 et 1990). Ce concept, initialement 

controversé, est devenu une évidence depuis l’avènement des méthodes d’analyses globales 

de l’expression génique (Travers et Muskhelishvili, 2005b ; Dorman, 2006). L’utilisation de 

ces approches a non seulement conforté le rôle régulateur de l’état d’enroulement de l’ADN 

mais surtout fait ressortir l’importance cruciale de ce paramètre dans les mécanismes globaux 

du contrôle de l’expression génique (Dorman, 2006). En effet, il s’est avéré que le 

surenroulement négatif agit sur l’expression du génome entier. Chez E. coli, une relaxation 

rapide de l’ADN entraîne une diminution de l’expression de 30% des gènes alors que celle 

des gènes restant augmente (Travers et Muskhelishvili, 2005b et 2006). 

Le nucléoïde bactérien (chromosome et protéines associées) aurait donc une structure 

dynamique dont l’organisation varie en fonction des changements des conditions 

environnementales (Travers et Muskhelishvili, 2005a). L’exigence de compaction et la 

nécessité d’une adaptation de l’expression génique en fonction des changements de 

l’environnement nécessitent un haut degré d’organisation spatiale pour la bactérie. Par 

exemple, le chromosome d’une bactérie comme E. coli contient environ 4,7 millions de bases 

et mesure près de 1,5 mm de long. Compacter cette molécule dans une cellule mesurant 1 

micron de large sur 2 microns de long rend compte de la complexité de la situation. L’ADN 

forme une double hélice où des nucléotides complémentaires s’enroulent autour d’un axe 

unique. La double hélice peut s’enrouler à son tour dans l’espace pour former une nouvelle 

hélice d’ordre supérieur : on dit alors que l’ADN est surenroulé. L'ADN circulaire isolé à 

partir des cellules procaryotes ou eucaryotes adopte une forme surenroulée négativement. Les 

domaines sont surenroulés négativement car l’hélice ADN qui les compose possède un déficit 

de tours sur elle-même. 

53


Le chromosome est organisé en domaines de surenroulement indépendants. Leur 

nombre a été difficile à déterminer et les estimations récentes indiquent la présence d’environ 

400 domaines surenroulés par chromosome (Stein et al., 2005 ; Deng et al., 2005 ; Postow et 

al., 2004). Ainsi, la taille de certains domaines est réduite et pourrait contenir un seul opéron. 

La nature des frontières entre domaines reste à clarifier. Aucun facteur constituant 

définitivement un élément des frontières a été identifié, de même qu’aucune séquence du 

chromosome agissant en cis, ou une molécule d’ARN agissant en trans. Cependant, il y a de 

nombreux candidats tels que les protéines associées au nucléoïde, détaillées plus bas, ou les 

séquences d’ADN répétées formant des motifs agissant en cis (Trun et Marko, 1998 ; Stein et 

al., 2005 ; Deng et al., 2005 ; Postow et al., 2004). Une des caractéristiques des frontières de 

domaines est qu’elles sont éphémères. Elles sont abondantes dans le chromosome d’une 

bactérie en phase exponentielle de croissance mais deviennent rares quand la bactérie entre en 

phase stationnaire de croissance. Le nucléoïde a donc une structure dynamique qui influence 

l’expression génique (Figure 14). 

Figure 14 : Schéma illustrant l’effet de l’organisation spatiale du chromosome sur 

l’expression génique. 

La structuration du chromosome dépend de plusieurs facteurs mais les deux plus 

importants sont les ADN topoisomérases et les protéines associées au nucléoïde abondantes 

(NAP). Les ADN topoisomérases sont des enzymes qui modulent le degré de surenroulement 

de l’ADN. Chez E. coli, cette fonction est assurée par les activités opposées des 

topoisomérases, enzymes favorisant la relaxation de l’ADN, et de la gyrase, qui en présence 

d’ATP introduit du surenroulement négatif dans l’ADN relâché. 

54


Le surenroulement de l’ADN peut influencer la transcription à différents niveaux 

(Travers et Muskhelishvili, 2005b). Ainsi une étape sensible au surenroulement est 

l’isomérisation au cours du passage du complexe fermé vers le complexe ouvert. Les 

supertours négatifs facilitent l’ouverture de la double hélice d’ADN. La cassure des liaisons 

hydrogène reliant les deux brins d’ADN demande de l’énergie qui peut être fournie par le 

déroulement de l’ADN. Cependant, avant d’atteindre l’étape du complexe ouvert, l’ARN 

polymérase doit être recrutée au niveau du promoteur et le surenroulement peut influencer 

cette étape de différentes façons. Une d’entre elles concerne les promoteurs dont les éléments 

-10 et -35 sont espacés par une distance empêchant une fixation efficace du facteur σ. Ainsi, 

ajouter ou enlever des bases altère la disposition des deux hexamères sur la surface de la 

double hélice d’ADN. Cette distorsion rotationnelle peut être corrigée en modifiant le taux 

d’enroulement de la double hélice (Figure 15). 

Figure 15 : Effet du niveau du surenroulement de l’ADN sur l’expression des gènes. 

Le recrutement de l’ARN polymérase à un promoteur peut aussi dépendre de la 

présence d’un facteur de transcription et la fixation de ce facteur peut modifier localement la 

55


topologie de l’ADN. Inversement, le surenroulement de l’ADN peut participer à l’interaction 

du facteur de transcription avec l’ARN polymérase. Par exemple, les promoteurs répondant au 

contrôle stringent, médié par le ppGpp, possèdent une région riche en bases G et C 

immédiatement en aval de l’hexamère -10 (Travers et Muskhelishvili, 2005b). Ces 

promoteurs contrôlent l’expression de gènes impliqués dans la synthèse de la machinerie de 

traduction. Cette synthèse doit être réprimée quand la bactérie manque de nutriments, et la 

réponse stringente permet de remplir cette fonction. La région riche en GC est difficile à 

dénaturer car elle contient plus de liaisons hydrogènes qu’une région riche en AT, trouvée 

classiquement dans la plupart des promoteurs. L’énergie supplémentaire nécessaire pour 

dénaturer la région riche en GC peut être fournie par une modification de l’état de 

surenroulement de l’ADN. Cette modification est médiée par la gyrase dont l’activité est 

fonction de la concentration en ATP. Un fort taux en ATP, favorable à l’activité de la gyrase 

est disponible en présence de nutriments (Dorman, 2002). 

II.A.3.1 Les « Nucleoid Associated Proteins » (NAP) 

En plus du surenroulement, la condensation du chromosome implique l’interaction 

entre l’ADN et plusieurs protéines. La composition en protéines du nucléoïde est 

majoritairement constituée par les « Nucleoid Associated Proteins » (NAP), un groupe de 

petites et abondantes protéines se liant à l’ADN (Azam et Ishihama, 1999 ; Drlica et al., 

1999 ; McLeod et Johnson, 2001). Les NAPs structurent le chromosome et exerce un contrôle 

sur la transcription, la recombinaison et la réplication de l’ADN. Les NAPs modifient la 

géométrie de l’ADN en créant ou en accentuant les courbures de la molécule et en modifiant 

le niveau de surenroulement local de l’ADN. Chez E. coli, les principales NAPs sont HU 

(heat-unstable nucleoid protein), IHF (integration host factor), H-NS (histone-like nucleoid 

structuring protein) et Fis (factor for inversion stimulation). Ils agissent directement ou 

indirectement, souvent en réseau, sur le contrôle d’une large variété de gènes. Ces gènes sont 

impliqués dans la viabilité de la cellule, comme ceux intervenant dans la synthèse des 

protéines ou dans le métabolisme du carbonne. Les NAPs régulent souvent les gènes dont 

l’expression varie en fonction de stimuli extérieurs, comme la température et l’osmolarité 

(Drlica et al., 1999 ; McLeod et Johnson, 2001). 

Les séquences en acides aminés des protéines HU et IHF sont voisines alors que Fis et 

H-NS sont structuralement distincts. IHF se lie avec une forte affinité à l’ADN (Ali et al., 

56


2001) et possède une grande spécificité de liaison à l’ADN. La séquence consensus reconnue 

par IHF est bien définie (Tableau 3) (Ussery et al., 2001). La situation avec Fis et H-NS est 

moins claire mais une séquence consensus dégénérée a été identifiée pour ces deux protéines 

(Pan et al., 1996 ; Lang et al., 2007). Dans le cas de HU, il n’a pas été mis en évidence une 

séquence consensus, la fixation semble être aspécifique (Grove et Saavedra, 2002 ; Schröder 

et Wagner, 2002). H-NS se lie préférentiellement à l’ADN contenant une forte proportion en 

bases A et T, susceptibles d’adopter une structure courbe (Dame et al., 2001). 

NAP Propriétés et abondance Structure Gènes Fonctions principales 

H-NS 

- non-basique 

- 20000-40000 

dimères/cellules 

- oligomérisation sur 

l’ADN 

-Séquence consensus de 

fixation : tCGATAAATT 

Homodimère 

2 x 15.4 kDa 

hns 

- reconnaît l’ADN courbé 

- modifie la topologie de l’ADN 

- induit des courbures de l’ADN 

- impliqué dans la recombinaison 

Fis 

- basique 

- abondant en phase 

exponentielle (20000- 

40000 dimères/cellules) 


fixation : 

GNYAWWWTRNC 

Homodimère 

2 x 11.2 kDa 

fis 

- induit une forte courbure de 

l’ADN (jusqu’à 90°) 

- modifie la topologie de l’ADN 

- participe dans la 

recombinaison, la transposition 

et la réplication de l’ADN 

IHF 

- basique 


stationnaire (25000-30000 

dimères/cellules) 


fixation : 

WATCAANNNNTTR 

Hétérodimère ; 

IHFα : 11.2 kDa 

IHFβ : 10.7 kDa 

himA et 

himB 

- induit une forte courbure de 

l’ADN (jusqu’à 140°) 

- participe dans la 

recombinaison, la transposition 

et la réplication de l’ADN 

HU 

- basique 


exponentielle (15000- 

30000 dimères/cellules) 

Hétérodimère ; 

HUα : 9.2 kDa 

HUβ : 9.2 kDa 

hupA et 

hupB 

- compacte l’ADN 

- induit des courbures de l’ADN 

- impliqué dans le réplication et 

la recombinaison de l’ADN 

Tableau 3 : Les principales protéines associées au nucléoïde (NAP) (d’après Prosseda et al., 

2002). Les codes des séquences consensus sont les suivants : N= A,G,C ou T ; R=A ou G ; 

W=T ou A ; Y=C ou T. 

57


Un aspect important conditionnant le rôle des NAPs est la variation de leurs 

concentrations cellulaires. En effet, elles sont produites à différents niveaux de la croissance 

bactérienne. Ainsi, Fis est synthétisée à un niveau très élevé en début de phase exponentielle 

de croissance (Figure 16), puis sa concentration diminue rapidement (Ali-Azam et al., 1999). 

Au contraire, IHF est à forte concentration dans les cellules entrant en phase stationnaire de 

croissance alors que la concentration d’H-NS est à peu près constante au cours de la 

croissance (Free et Dorman, 1995). La situation avec HU est plus complexe dans la mesure où 

la composition de ses deux sous unités varie avec la croissance. In fine, le taux de HU 

diminue en phase stationnaire (Balandina et al., 2001). Ces variations de concentrations 

introduisent une dynamique dans la composition en NAP du nucléoïde, permettant une 

régulation de l’expression des gènes. 

Ainsi le chromosome bactérien qui a un degré d’enroulement relativement important 

durant la phase exponentielle de croissance, adopte une structure plus relâchée à l’entrée de la 

phase stationnaire. Parallèlement, le facteur σ 70 qui transcrit de manière efficace de l’ADN 

surenroulé, est remplacé par le facteur σ S , qui a une préférence pour l’ADN relâché de 

manière à adapter l’expression génique. 

L’organisation topologique des différents promoteurs d’un génome dépend 

effectivement de l’état d’enroulement local qui est fixé à la fois par les activités des 

topoisomérases et de la gyrase mais aussi de la dynamique de fixation des protéines associées 

au nucléoïde. Le rôle de ces protéines dans l’expression des différents promoteurs reste 

toutefois assez peu étudié. H-NS est la protéine dont le mécanisme d’action a été le plus 

intensivement étudié. Cette protéine est capable de réduire fortement l’expression génique en 

formant des structures nucléo-protéiques étendues comme observé au niveau du promoteur 

virF (Falconi et al., 1998). 

58


Concentration 

cellulaire en 

protéines 

« NAP » 

Densité 

cellulaire 

HU 

HN-S 


IHF 

Phase de latence 

Phase 

exponentielle 

Phase stationnaire 

Croissance 

Figure 16 : Concentrations cellulaires des protéines H-NS, Fis, HU et IHF au cours 

des différentes phases de la croissance bactérienne. 

L’une des caractéristiques des NAPs dans la régulation de l’expression génique est 

leur implication dans les mécanismes adaptatifs dont la pathogénie. 

II.A.3.1.a Les principales NAP impliquées dans la régulation de la virulence 

II.A.3.1.a.i 

H-NS 

Le rôle de H-NS a été abondamment décrit chez E. coli et les bactéries voisines 

comme Shigella flexneri ou Salmonella typhimurium. L’analyse du transcriptome, en utilisant 

des puces à ADN, a montré que H-NS est impliqué dans l’expression de plus de 5% des gènes 

chez E. coli, cultivée en milieu complexe LB. H-NS est donc un régulateur global qui contrôle 

entre autres la régulation de l'expression de gènes de virulence (Hommais et al., 2001). H-NS 

agit essentiellement comme répresseur et son mécanisme d'action a été récemment caractérisé 

(Dame et al., 2002). H-NS se fixe à l'ADN via une séquence consensus dégénérée localisée 

dans des régions d'ADN présentant une structure courbe en amont des promoteurs à réprimer. 

La liaison de plusieurs protéines H-NS conduit à la formation d’une boucle dans laquelle est 

piégée l’ARN polymérase. 

En général, H-NS régule indirectement l’expression des gènes de virulence. Par 

exemple chez les souches EIEC d'E. coli, l’expression des gènes permettant l’adhésion, la 

59


pénétration et la dissémination intra et inter cellulaire est activée par deux régulateurs 

transcriptionnels : VirF et VirB (Adler et al., 1989). En réponse à différents stimuli 

(température, pression osmotique, pH) il y a une augmentation de la synthèse de VirF qui va 

activer l'expression de VirB, régulateur spécifique des gènes codant les protéines IPA 

nécessaires à l'invasion de la barrière intestinale (Sasakawa et al., 1993). A température 

inférieure à 32°C, H-NS réprime l'expression de virF en se liant spécifiquement à une région 

présentant une structure courbée et localisée dans la région promotrice de ce gène (Figure 17) 

(Falconi et al., 1998). A des températures voisines de celle de l'hôte (37°C), une modification 

topologique de cette région s'oppose à la fixation de H-NS, permettant une dérépression de 

l'expression de virF qui va conduire à une forte production des protéines IPA et de l'appareil 

de sécrétion. La courbure de l’ADN, permettant la fixation de H-NS, pourrait agir comme un 

senseur de la température et disparaîtrait à plus de 32°C. Cet exemple met en évidence la 

connexion entre la levée de la répression exercée par H-NS et les conditions 

environnementales. Un mécanisme similaire serait mis en œuvre en réponse à un stress 

osmotique ou thermique. En effet , ces différents stress modifient la topologie de l’ADN 

(Dorman et Deighan, 2003). 

Température 

20°C 

32°C 

37°C 

H-NS 

virF 


ARN 

polymérase 

ARNm virF 

VirF 

VirB Protéines 

IPA 

Figure 17 : Mode d’action du répresseur H-NS et de l’activateur Fis en fonction 

de la température sur l’expression du gène virF chez les souches d’Escherichia 

coli entéroinvasives. 

Dans certains cas, H-NS peut avoir un rôle activateur de la synthèse des facteurs de 

virulence. Par exemple, chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, l’expression 

60


des gènes pel, codant les pectate lyases, facteurs de virulence majeurs, est fortement diminuée 

dans un mutant hns. Ce phénotype d’activateur est le résultat d’un contrôle indirect mettant en 

jeu PecT, un répresseur des gènes pel (Nasser et Reverchon, 2002). Dans le mutant hns, 

l’augmentation de la synthèse de PecT conduit à une répression de l’expression des gènes pel. 

Le signal auquel répond PecT n’est pas encore identifié. 

II.A.3.1.a.ii Fis 

Un des rôles essentiels de Fis est d’activer la transcription de gènes codant les ARN 

stables (ARN de transfert et ribosomaux) en début de phase exponentielle de croissance. Fis 

est également impliqué dans divers processus biologiques tel que l’intégration dans le 

chromosome du phage Mu. Fis se lie à l’ADN sous forme de dimère via un consensus assez 

dégénéré et peut jouer soit un rôle d’activateur soit de répresseur. La répression par Fis 

s’effectue via une compétition avec l’ARN polymérase ou des activateurs pour l’occupation 

d’une même région d’ADN. Dans le cas d’une activation, la fixation de Fis à l’ADN induit 

une modification locale de la topologie de l’ADN, facilitant la fixation de l’ARN polymérase 

sur les promoteurs (Muskhelishvili et Travers, 2003). Ainsi, Fis active le gène virF d’E. coli 

(figure 17) (Falconi et al., 2001). Fis permet donc l’expression des gènes d’adhésion et de 

colonisation de la bactérie. De même, Fis active l’expression des gènes de l’îlot de pathogénie 

SPI-1 chez S. typhimurium. Les produits de ces gènes permettent le franchissement de la 

barrière intestinale de l’hôte (Wilson et al., 2001). Récemment, l’analyse du transcriptome de 

S. typhimurium a montré un rôle central de Fis dans la coordination de l’expression des gènes 

de ménage et des gènes de virulence nécessaires à la survie de la bactérie dans les poumons 

ou au cours d’une infection systémique (Kelly et al., 2004). L’adhésion aux cellules 

épithéliales des souches enteropathogéniques d’E. coli est médiée par les bundle-forming pili 

(BFP). Ce processus est activé par Fis (Goldberg et al., 2001). Dans ces différents cas, Fis 

active la synthèse de facteurs de virulence précoces (adhésion). Il existerait donc une bonne 

adéquation entre la forte concentration cellulaire de Fis en début de phase exponentielle de 

croissance et la fonction des gènes de virulence dont il active l’expression. Fis contrôle par 

ailleurs l’expression de H-NS (Falconi et al., 1996) et du facteur σ S chez S. typhimurium (O 

Croinin et Dorman, 2007). 

61


II.A.3.1.a.iii IHF 

Contrairement à H-NS et Fis, IHF reconnaît un consensus bien défini pour sa fixation 

à l’ADN (Ali et al., 2001). 

Plusieurs études mettent en évidence le rôle de IHF dans la régulation de la virulence 

chez les entérobactéries. L’un des cas les mieux étudiés porte sur les gènes spv de S. 

typhimurirum. Dans ce cas, le facteur σ S et le régulateur SpvR activent conjointement 

l’expression des gènes de virulence spv à l’entrée de la phase stationnaire. L’expression de 

spvR est également activée par IHF à forte densité cellulaire (Marshall et al., 1999). Afin 

d’exprimer les gènes spv au moment opportun, la bactérie exerce un double contrôle sur 

l’expression de ces gènes impliquant σ S et IHF qui sont présents durant la phase stationnaire. 

Un cas atypique a été décrit chez les coli entéropathogènes chez lesquelles IHF active 

l’expression des gènes LEE codant les protéines nécessaires à la formation des lésions 

attachement/effacement sur les cellules épithéliales. IHF stimule la synthèse de la protéine 

Ler, activateur de la plupart des gènes du locus LEE (Bustamante et al., 2001 ; Friedberg et 

al., 1999). 

IHF active par ailleurs l’expression de Fis en début de phase exponentielle de 

croissance (Pratt et al., 1997). 

II.A.3.1.a.iv HU 

Les distorsions de l’ADN provoquées par HU permettent de former des complexes 

nucléoprotéiques spécifiques avec des séquences d’ADN distants. Ainsi HU stimule la 

fixation des protéines régulatrices sur le promoteur cible, notamment dans le cas de l’opéron 

lac. HU peut également induire la formation d’une boucle qui va stabiliser les interactions 

entre protéines régulatrices, comme pour l’opéron gal (Drlica et al., 1999 ; McLeod et 

Johnson, 2001 ; Perez-Martin et de Lorenzo, 1997). 

HU semble peu impliqué dans le contrôle de l’expression des gènes de virulence. 

Ainsi, chez la bactérie pathogène Salmonella typhimurium, HU active l’expression de hilA, 

dont le produit est impliqué dans la régulation de la synthèse du système de sécrétion de type 

III (Schechter et al., 2003). 

62


II.A.4 

Dynamique de régulation 

II.A.4.1 Un régulateur spécifique couplé à un régulateur général 

L’activité de la plupart des promoteurs bactériens est dépendante de multiples 

conditions environnementales plutôt que d’un seul signal. Beaucoup de promoteurs sont 

contrôlés par plusieurs facteurs de transcription, où chaque acteur relais la perception d’un 

signal. Cependant, dans certains cas, une protéine régulatrice peut intégrer plusieurs signaux. 

Ainsi le système NifL-NifA chez Azotobacter vinelandii contrôle l’expression des gènes 

impliqués dans la fixation de l’azote en fonction du taux d’oxygène, de la disponibilité en 

carbone et en azote. Les systèmes de régulation de cette complexité sont assez rares et, dans la 

plupart des cas, pour un promoteur régulé par plusieurs signaux, plusieurs facteurs de 

transcription sont nécessaires. 

En général, lorsque deux facteurs de transcription sont impliqués, un des facteurs 

répond à un signal d’un métabolisme spécifique alors que le deuxième facteur relais un signal 

du métabolisme général. Un bon exemple est le régulon gal chez E. coli qui contient des 

gènes impliqués dans le transport et le métabolisme du galactose. La transcription des gènes 

du régulon gal est réprimée par deux régulateurs isoformes, GalR (Gal repressor) et GalS (Gal 

isorepressor) (Weickert et Adhya, 1993). Ces deux répresseurs reconnaissent le même site de 

fixation à l’ADN (Weickert et Adhya, 1992). Cette fixation est inhibée par la présence de D- 

galactose, métabolite responsable du signal spécifique. La plupart des gènes du régulon gal 

sont par contre activés par le complexe CRP-AMPc, le régulateur général de la répression 

catabolique (Weickert et Adhya, 1993). Cet exemple met en évidence un dialogue cellulaire 

entre métabolisme général et métabolisme spécifique, permettant une adaptation de la bactérie 

aux conditions environnementales. 

Il y a peu d’exemples de régulations intégrées impliquant seulement des répresseurs, 

mais, dans la majorité des cas étudiés, les régulations complexes dépendent de combinaisons 

d’activateurs et de répresseurs. En général, les régulateurs agissent indépendamment sur le 

promoteur, cependant, dans certains cas comme pour les promoteurs qui sont réprimés par 

CytR, le répresseur et l’activateur interagissent entre eux directement (Chahla et al., 2003). 

Pour les promoteurs qui sont régulés par deux ou plusieurs régulateurs, des mécanismes plus 

complexes sont mis en œuvre. Quatre mécanismes généraux ont été trouvés chez E. coli, 

impliquant le repositionnement de l’activateur, les contacts avec l’ARN polymérase 

63


indépendants entre les activateurs, les contacts coopératifs entre activateurs ainsi que les 

interactions conduisant à une anti-répression par un activateur (Figure 18). 

Pour le mécanisme de repositionnement, le promoteur cible peut être activé 

pleinement par un activateur primaire, mais en absence de l’activateur secondaire, l’activateur 

primaire est mal positionné. Le repositionnement peut impliquer le déplacement de 

l’activateur primaire d’un site de fixation à l’ADN à un autre, comme par exemple pour le 

repositionnement de MalT par CRP au niveau du promoteur malK (Richet et al., 1991). 

Par ailleurs, l’activateur secondaire peut altérer la conformation de l’ADN, par exemple en 

créant une courbure, pour permettre l’interaction entre l’activateur primaire et l’ARN 

polymérase qui conduit à l’activation de la transcription. Un mécanisme différent existe pour 

les promoteurs où les deux activateurs se lient de façon indépendante par rapport à l’ARN 

polymérase. Ces promoteurs contrastent avec les promoteurs dépendant des activateurs 

simples de classe I et II, où les interactions avec un seul facteur de transcription sont 

suffisantes pour une transcription optimale (Joung et al., 1994 ; Scott et al., 1995). Dans 

certains cas, des promoteurs complexes sont dépendants d’un activateur de classe I et d’un de 

classe II, comme le promoteur proP P2, où Fis et CRP fonctionnent comme activateurs de 

classe I et II respectivement (McLeod et al., 2002 ; Belyaeva et al., 1998). Une autre 

combinaison est l’action de deux activateurs de classe I, comme pour le promoteur acs P2, qui 

est dépendant de la fixation de deux dimères CRP aux sites d’activation de classe I (Beatty et 

al. 2003 ; Tebbutt et al., 2002). Le mécanisme d’activation sans contact direct permet de 

coupler un promoteur avec deux activateurs. Ce mode d’action semble ubiquitaire, en effet il 

permet de combiner de nombreux régulateurs ensemble puisque aucune interaction entre eux 

est nécessaire, donc le mécanisme présente beaucoup de possibilités d’évolution. La plupart 

des activateurs se fixent à leur promoteur cible de façon indépendante par rapport aux autres 

régulateurs de ce promoteur. Cependant, il y a quelques promoteurs dont les activateurs se 

fixent de façon coopérative, ce mécanisme assure une co-dépendance puisqu’un activateur ne 

peut se fixer de façon efficace sans l’autre. Un bon exemple est le promoteur melAB, pour 

lequel CRP est incapable de se fixer sans la fixation préalable de MelR (Wade et al., 2001). 

Les répresseurs qui empêchent l’activation par l’activateur primaire peuvent aussi créer une 

co-dépendance entre deux activateurs (Wu et al., 1998). La présence de l’activateur 

secondaire est nécessaire pour modifier l’action du répresseur de façon à ce qu’il n’interfère 

plus avec l’action de l’activateur primaire. Ainsi les promoteurs nir et nrf d’E. coli sont 

dépendants de FNR, un régulateur répondant à l’anaérobiose, et de NarL ou NarP, facteurs de 

transcription activés par la présence de nitrite ou de nitrate (Browning et al., 2000 ; Browning 

64


et al., 2002). Les deux promoteurs sont fortement activés par l’activateur primaire FNR, qui 

interagit avec l’ARN polymérase par un mécanisme de classe II. Cependant l’action de FNR 

est abolie par la fixation de IHF et de Fis au niveau de sites adjacents. La fixation de 

l’activateur secondaire NarL ou NarP est requise pour contrecarrer les effets de IHF ou Fis, 

notamment en inhibant la fixation de IHF (Browning et al., 2002). 

65


Figure 18 : Les mécanismes de régulations mettant en jeu plusieurs facteurs de transcriptions 

(d’après Browning et Busby, 2004). 

66


II.A.4.2 Connexion entre régulateurs : réseau de régulation génétique 

En plus des mécanismes de régulation au niveau de gènes impliqués dans une fonction 

particulière, il existe un ensemble de régulation ayant un degré de hiérarchisation plus élevé. 

En effet, les régulateurs globaux sont eux-mêmes régulés. L’existence d’un réseau de 

régulation de ce niveau assure à la bactérie un contrôle plus fin de l’ensemble de son 

métabolisme. 

Ainsi l’expression des gènes codant des régulateurs globaux tels que CRP ou les NAP est 

régie par un système de rétrocontrôle interdépendant (Figure 19). Il a été mis en évidence que 

Fis réprime la transcription de crp (González-Gil et al., 1998), de même que CRP influence 

directement l’expression de fis (Nasser et al., 2001b). Aussi bien Fis que CRP se fixent aux 

promoteurs de hupA et hupB (Claret et Rouvière-Yaniv, 1996). Fis est également impliqué 

dans le contrôle de l’expression de hns (Falconi et al., 1996). La complexité de ces 

interactions reste pour le moment mal comprise, en particulier la nature des changements en 

composition de NAP dans un mutant inactivé au niveau du gène codant l’une des autres NAP. 

Toutefois, les données actuelles indiquent que le réseau d’interactions entre régulateurs est un 

élément essentiel de la modulation de l’expression génique. 

Figure 19 : Réseau de régulations entre les régulateurs globaux. Le schéma est simplifié en 

omettant les autorégulations de certains gènes tels que fis, hns, crp. Les gènes sont indiqués 

en italique, les protéines en type droit. Les effets activateurs sont représentés par une flèche 

bleue, les effets répresseurs par une ligne rouge. L’expression des gènes est signalée par une 

flèche grise (d’après Travers et Muskhelishvili, 2005b). 

67


II.A.4.3 La régulation de la synthèse des facteurs de virulence est un 

processus complexe. 

Au cours de l’infection, la bactérie pathogène doit faire face à un environnement 

complexe et hostile. Elle doit donc être capable de mettre en place des réponses adaptatives 

appropriées, médiées par une modification de l’expression génique (Cotter et Miller, 1998). 

Les facteurs de transcription régulant l’expression des gènes de virulence peuvent sentir les 

signaux rencontrés dans l’hôte, comme des changements de température, l’osmolarité, le pH, 

la concentration en fer, la disponibilité en nutriments, les agents anti-microbiens, le taux 

d’oxygène,… (MacKichan et al., 2004 ; Mandin et al., 2005 ; Lamy et al., 2004 ; Dramsi et 

al., 2004 ; Rickman et al.,2005 ; Deziel et al., 2005 ; Dong et al., 2005). En plus de leur 

action directe sur l’expression des gènes de virulence, les régulateurs de la virulence sont 

généralement organisés en réseaux qui permettent d’imposer une chronologie dans la synthèse 

des différents facteurs de virulence. En effet, comme précédemment indiqué, l’infection de 

l’hôte par le pathogène requiert une production adéquate par ce dernier des facteurs requis aux 

différents stades du processus infectieux. Le cas du réseau de régulation des gènes de 

virulence d’E. chrysanthemi sera traité dans le chapitre suivant. 

IIB 

Autres mécanismes de la régulation de la synthèse protéique 

chez les procaryotes 

Le contrôle de l’expression génique peut également avoir lieu à d’autres niveaux de la 

chaîne de production. Ainsi, il existe des régulations post transcriptionnelles et post 

traductionnelles. Ces deux types de contrôle possèdent deux avantages principaux : le premier 

est de réaliser la synthèse des produits quand les conditions environnementales sont 

favorables et non quand la bactérie est en stress nutritionnel par exemple, condition limitante 

pour l’initiation de la transcription. Le deuxième avantage est de disposer immédiatement du 

produit requis, en s’affranchissant du temps de synthèse et du coût énergétique à cet instant 

précis. La régulation de l’activité du facteur σ S illustre bien ces deux cas. Comme 

précédemment indiqué, la synthèse de σ S est fortement stimulée lors de l’entrée en phase 

stationnaire de croissance et par divers stress environnementaux (Hengge-Aronis, 2000b). 

Cette protéine, codée par le gène rpoS, a un poids moléculaire d’environ 38 kDa. Les facteurs 

68


σ S et σ 70 peuvent reconnaître un même promoteur avec la même efficacité in vitro (Ding et 

al., 1995; Jishage et al., 1996). Pourtant ils contrôlent l’expression de gènes différents 

puisqu’une inactivation de rpoS réduit fortement ou élimine l’expression des gènes cibles de 

σ S . Comment est assurée la spécificité de σ S pour ses séquences promotrices? La structuration 

des régions régulatrices des gènes cibles (présence d’éléments UP proximale ou distale) et 

l’augmentation de la concentration cellulaire de σ S dans les conditions où il est requis pourrait 

favoriser la fixation de ce facteur de transcription sur les promoteurs de ses gènes cibles au 

détriment de σ 70 . Par ailleurs, comme précédemment indiqué, l’ADN génomique est associé 

in vivo à différentes protéines, appartenant à la famille des NAP (« protéines associées au 

nucléoïde »), pour former le nucléoïde ; certaines de ces protéines, notamment H-NS et Fis, 

interviennent également dans la spécificité des facteurs sigma (Arnqvist et al., 1994; Hengge- 

Aronis, 1999). En fait, l’ARN polymérase ne reconnaît pas des séquences sur un ADN 

linéaire mais plutôt une structure nucléoprotéique complexe dans laquelle l’accessibilité à 

l’ADN est modulée par les protéines NAP. La sélection des promoteurs par L’ARN 

polymérase σ 70 ou l’ARN polymérase σ S serait donc liée à la relative disponibilité des deux 

facteurs σ et à l’action de certaines protéines NAP. Cet exemple met encore une fois en 

évidence l’existence d’une connexion entre les protéines NAP et σ S . 

En plus de la phase de croissance, il a été observé que la concentration cellulaire de σ S 

est régulée par différents stimuli tels que : une forte osmolarité, une température faible, un pH 

acide… (Figure 20). La régulation de la synthèse de σ S s’avère donc très complexe. 

69


Diminution de 

la croissance 

Densité 

cellulaire 

Faible 

température 

Forte 

osmolarité 

Absence de 

source de 

carbone 

Température 

haute pH acide 

Transcription 

Traduction 

σS 

Protéolyse 

rpoS 

ARNm 

Enzyme core 

ARN 

polymérase 

Expression des gènes: 

de la réponse 

générale au 

stress 

de virulence 

Figure 20 : Régulation du niveau cellulaire de σ S en fonction des stimuli extérieurs chez 

la bactérie Escherichia coli (Hengge-Aronis, 2000b). 

Stimulus extérieur activateur 

Stimulus extérieur répresseur 

La transcription du gène rpoS se fait via un promoteur majeur de type σ 70 . Durant la 

phase exponentielle de croissance, chez E. coli, le gène rpoS est significativement transcrit et 

le niveau de transcription augmente d’un facteur trois à quatre lors de l’entrée en phase 

stationnaire (Takayanagi et al., 1994). Ce contrôle transcriptionnel implique essentiellement 

des métabolites s’accumulant en phase stationnaire (le guanosine-3’ 5’bispyrophosphate 

(ppGpp), l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et le polyphosphate). Les mécanismes 

d’actions de ces métabolites demeurent non élucidés. Toutefois, la régulation 

transcriptionnelle influe peu sur la concentration cellulaire de σ S chez E. coli ; c’est par contre 

le niveau de régulation principal dans le genre Pseudomonas où la transcription du gène rpoS 

est fortement activée en phase stationnaire de croissance (Fujita et al., 1994). 

Chez E. coli, il y a une quasi absence du facteur σ S durant la phase exponentielle de 

croissance, malgré l’existence d’une transcription effective du gène rpoS, laissant présager 

une régulation post-transcriptionnelle. L’utilisation de différentes approches expérimentales a 

montré que la traduction des transcrits rpoS est activée par les divers stimuli qui modulent la 

concentration cellulaire de σ S (Figure 20) (Lange et Hengge-Aronis, 1994). L’augmentation 

de l’efficacité de la traduction implique une interaction entre les ARNms rpoS et différentes 

protéines régulatrices d’ARNs (Hfq, RprA, DsrA, la protéine NAP HU), rendant leurs 

70


séquences de Shine et Dalgarno plus accessibles aux ARNs ribosomaux. Les régulateurs 

DsrA et RprA seraient impliqués dans l’induction de la traduction de rpoS par le froid et le 

stress osmotique, respectivement (Majdalani et al., 2002; Repoila et Gottesman, 2001). En 

plus de ces systèmes d’activation, deux mécanismes de répression impliquant la protéine NAP 

H-NS et le régulateur OxyS ont également été mis en évidence ; H-NS et OxyS antagonisent 

l’action de HU et Hfq, respectivement (Hengge-Aronis, 2000b). 

Le facteur σ S est soumis à une forte protéolyse lors de la phase exponentielle de 

croissance. Cette dégradation requiert deux partenaires : la protéase ClpXP et le régulateur 

RssB (Muffler et al., 1996; Schweder et al., 1996). Un modèle du fonctionnement de la 

protéolyse a été proposé par Hengge-Aronis (Hengge-Aronis, 2000b): sous sa forme 

phosphorylée, RssB se lie à σ S , le complexe est reconnu par ClpXP et σ S est dégradé. Les 

mécanismes de signalisation contrôlant la phosphorylation de RssB sont inconnus. 

Il apparaît donc que σ S est un facteur de transcription de la réponse générale au stress 

plutôt qu’un régulateur spécifique de la phase stationnaire de croissance. La régulation du 

niveau cellulaire de σ S est donc essentiellement régie par des contrôles post-transcriptionnels 

chez E. coli et transcriptionnels chez les Pseudomonas. Cette différence de contrôle pourrait 

être lié au fait que σ S a un rôle relativement limité dans la réponse générale au stress chez 

Pseudomonas. 

III Erwinia chrysan hemi, t une bactérie phytopathogène 

IIIA Taxonomie des Erwiniae 

Le genre Erwinia, nommé d’après le phytobactériologiste Erwin F. Smith, a été fondé 

en 1920 pour réunir les bactéries phytopathogènes à Gram négatif, en forme de bacille, 

anaérobies facultatives et mobiles (Winslow et al., 1920). Les Erwiniae appartiennent à la 

famille des Enterobacteriaceae, elle-même incluse dans le phylum des protéobactéries. 

Pendant de nombreuses années, une classification proposée par Dye et basée sur des critères 

de virulence a largement été adoptée (Dye, 1968, 1969a, b, c). Elle subdivisait le genre 

Erwinia en 4 groupes : les Erwiniae provoquant une nécrose, les Erwiniae pectinolytiques, les 

Erwiniae à pigment jaune et les Erwiniae atypiques. 

71


La comparaison d’une trentaine de séquences d’ADNr 16S d’espèces différentes du 

genre Erwinia (Hauben et al., 1998; Kwon et al., 1997) et la comparaison de la structure 

secondaire des ARNr correspondants ont conduit Hauben et al. (1998) à répartir les Erwinia 

dans quatre genres différents : 

- Le genre Erwinia regroupe désormais les Erwiniae nécrotiques strictes telles que 

E. amylovora ou E. rhapontici. 

- Le genre Pectobacterium regroupe les espèces pectinolytiques dont E. 

chrysanthemi, E. cypripedii et les cinq sous-espèces d’E. carotovora. Ce genre, 

comprend les espèces possédant une forte activité pectinolytique qui provoquent la 

macération des tissus végétaux. 

- Le genre Brenneria rassemble des espèces responsables des maladies affectant les 

arbres telles que E. alni ou E. nigrifluens. 

- Enfin, le genre Pantoea déjà existant (Gavini et al., 1989) comprend les espèces E. 

herbicola et E. stewartii qui sécrètent un pigment jaune. 

Quelques autres espèces d’Erwinia ont été reclassées dans le genre Enterobacter, comme 

E. dissolvens. 

Certains microbiologistes s'opposent toutefois au classement d'E. chrysanthemi dans le 

genre Pectobacterium, notamment suite à la comparaison de diverses séquences nucléiques 

qui tendraient à rapprocher E. chrysanthemi du genre Yersinia. 

De récentes analyses de ce groupe de bactéries suggèrent qu’E. chrysanthemi devrait 

être renommée Dickeya dadantii (Samson et al., 2005). Cette nouvelle proposition démontre 

que la classification des entérobactéries phytopathogènes reste à clarifier. Ces remises en 

questions perpétuelles et l’usage beaucoup plus courant du terme Erwinia chrysanthemi nous 

conduisent à continuer d’utiliser l’ancienne dénomination. 

IIIB Distribution géographique 

E. chrysanthemi est couramment rencontrée dans les sols (saprophyte) ou à la surface 

des plantes (épiphyte). D’autres Erwiniae pectinolytiques, comme Erwinia carotovora 

atroseptica et Erwinia carotovora carotovora, produisent le même type de symptômes. Les 

pertes économiques associées aux Erwiniae pectinolytiques varient en fonction du climat, 

mais aussi des pratiques culturales et des conditions de conservation post-récolte. Jusqu’à 

présent, ces bactéries étaient retrouvées dans des niches écologiques distinctes : Erwinia 

72


carotovora atroseptica spécifiquement sur pomme de terre en milieu tempéré, E. 

chrysanthemi sur de nombreux hôtes en milieu tropical, et Erwinia carotovora carotovora sur 

une grande diversité d’hôtes et une large répartition géographique (Pérombelon, 2002). 

Depuis quelques années, les producteurs d’endive et de pomme de terre du nord de la France 

font face au développement de bactérioses causées par E. chrysanthemi (Hélias et al., 2006). 

Réchauffement et variations climatiques brusques pourraient en être la cause. L’émergence en 

milieu tempéré de cette bactérie d’origine tropicale est d’autant plus inquiétante qu’aucun 

cultivar résistant n’est connu à ce jour et que les moyens de lutte sont limités. 

Les Erwiniae pectinolytiques sont donc caractérisées par leur répartition géographique 

mondiale. E. chrysanthemi et E. carotovora sont retrouvées aussi bien sous des climats 

tropicaux ou subtropicaux que tempérés. Selon les données de l'O.E.P.P., E. chrysanthemi est 

définitivement présente dans de nombreuses régions du monde (Figure 21). Dans certaines 

d'entre elles, comme l'Australie, l'Afrique du sud, le Brésil ou Cuba, la bactérie est très 

largement répandue. Dans la plupart des pays concernés, E. chrysanthemi est répertoriée dans 

la liste des organismes phytopathogènes de quarantaine. 

Figure 21 : Distribution géographique d’Erwinia chrysanthemi (O.E.P.P, 2006). 

73


IIIC Le pouvoir pathogène d’E. chrysanthemi 

Comme précédemment indiqué, E. chrysanthemi infecte une large gamme d'hôtes 

parmi lesquels des plantes monocotylédones et dicotylédones, ornementales (chrysanthème, 

Saintpaulia ionantha) ou d'intérêt économique (maïs, pomme de terre) (Perombelon et 

Salmond, 1994). Elle s'attaque aussi bien aux feuilles, qu'aux tiges et aux organes de réserve 

de ses hôtes (Figure 22). 

A 

B 

C 

D 

E 

Figure 22 : Symptômes causés par E. chrysanthemi. 

A et B : Pourriture de feuilles de chrysanthème (Institut national de production végétale et de la protection 

des plantes, de Mayence, Allemagne) 

C : Macération d’un tubercule de pomme de terre (Laboratoire Microbiologie Adaptation Pathogénie) 

D : Macération d’un plant d’aloe vera (National Research Centre for Medicinal and Aromatic Plants, India) 

E : Macération d’une feuille d’endive (Laboratoire Microbiologie Adaptation Pathogénie). 

74


Avant d'initier une infection, les Erwiniae se comportent comme des bactéries 

saprophytes dans le sol et l'eau (Toth et al., 2003). Elles peuvent pénétrer dans les plantes par 

l'intermédiaire des ouvertures naturelles (les stomates ou les lenticelles) et artificielles (les 

blessures). Elles peuvent alors rester latentes ou proliférer (Perombelon et Salmond, 1994). La 

mobilité des bactéries leur permet d'atteindre les différents organes de l'hôte. Même après être 

parvenues dans les espaces intercellulaires, les bactéries peuvent résider dans ces zones, 

parfois pendant plusieurs mois, dans un état de quiescence (Perombelon, 2002; Toth et al., 

2003). 

La prolifération dans les tissus vasculaires déclenche une maladie dont les symptômes 

dépendent des conditions environnementales. Généralement, les Erwiniae pectinolytiques 

envahissent le parenchyme et provoquent la macération des tissus. Le symptôme de la 

maladie provoquée par E. chrysanthemi est appelé "pourriture molle", celui dû à E. 

carotovora est appelé "jambe noire" sur plants de pomme de terre. Le processus de 

macération implique la déstructuration des parois intercellulaires végétales. Pour ce faire, les 

bactéries sécrètent un arsenal d’enzymes dégradatives. 

III.C.1 Un pouvoir pathogène multifactoriel 

L’interaction entre E. chrysanthemi et ses hôtes est un processus multifactoriel 

complexe impliquant de nombreux facteurs de virulence. Au cours de l’interaction, les 

Erwiniae pectinolytiques vont progressivement passer d’un état biotrophe à un état 

nécrotrophe ce qui implique une chronologie dans la mise en place des fonctions nécessaires à 

la virulence et à la survie de la bactérie dans la plante. La première phase de l’infection passe 

par une étape d’adhésion de la bactérie à la plante qui implique des structures de surface telles 

que le lipopolysaccharide (LPS), les exopolysaccharides (EPS) et l’adhésine HecA. 

Dans un deuxième temps, E. chrysanthemi doit se multiplier et survivre dans la plante. 

Cette multiplication est liée à une adaptation à des conditions particulières. Ainsi, E. 

chrysanthemi, en réponse à la faible disponibilité en fer libre dans les espaces intercellulaires, 

produit deux sidérophores : la chrysobactine et l’achromobactine qui lui permettent d’entrer 

en compétition avec les cellules végétales vis-à-vis de l’assimilation du fer (Expert, 1999). Le 

fer, toxique à l’état libre et très peu soluble, n’existe pratiquement que sous forme complexée 

dans les plantes et la quantité de fer libre dans les fluides intercellulaires est très faible. E. 

75


chrysanthemi 3937 possède plusieurs voies d’acquisition du fer. Outre les gènes fct et acr qui 

correspondent respectivement aux récepteurs des complexes ferri-chrysobactine et ferriachromobactine, 

elle possède également un gène fepA qui code le récepteur de 

l’entérobactine, un sidérophore produit par d’autres entérobactéries notamment Escherichia 

coli, un gène fhuA qui code le récepteur du ferrichrome, un sidérophore produit par des 

champignons, ainsi que trois autres gènes codant d’autres récepteurs de ferri-sidérophores 

potentiels. E. chrysanthemi peut donc assimiler, en plus de ses propres sidérophores, des 

complexes ferriques produits par d’autres microorganismes (Enard et al., 1988; Enard et 

Expert, 2000; Persmark et al., 1992). La disponibilité du fer coordonne l’expression de gènes 

impliqués dans le transport du fer et de plusieurs pectate lyases (Franza et al., 1999; Franza et 

al., 2002). 

Au cours de l’interaction avec la plante, E. chrysanthemi produit des signaux éliciteurs 

qui induisent les défenses de l’hôte. Ces signaux sont les oligogalacturonides issus de la 

dégradation de la pectine (Legendre et al., 1993; Norman et al., 1999; Reymond et al., 1995) 

ou des protéines bactériennes comme la flagelline (Zipfel et al., 2004), la harpine HprN 

(Bauer et al., 1995; Yang et al., 2002), la pectate lyase PelI-3 d’E. chrysanthemi (Shevchik et 

al., 1998). La mise en place des réactions de défenses de la plante aboutit à la production de 

peptides antimicrobiens, de composés phénoliques et d’agents oxydants qui ont un fort 

pouvoir bactéricide. Pour survivre, E. chrysanthemi va alors devoir contrer ces réactions de 

défense en induisant la synthèse d’un ensemble de facteurs impliqués d’une part dans la 

détoxification des composés bactéricides et d’autre part dans des mécanismes de réparation 

des composants cellulaires (El Hassouni et al., 1999; Lopez-Solanilla et al., 1998; Miguel et 

al., 2000; Reverchon et al., 2002; Santos et al., 2001). E. chrysanthemi a également la 

capacité de manipuler et de supprimer les réactions de défense de la plante. En effet, cette 

bactérie produit des protéines effectrices DspE qui, grâce à un système de sécrétion de type 

III, sont injectées dans la cellule végétale où elles vont interférer avec des cascades de 

phosphorylation et supprimer l’activation des gènes de défenses (DebRoy et al., 2004; Holeva 

et al., 2004). 

Enfin dans une dernière phase du processus infectieux, la bactérie libère une quantité 

massive des enzymes dégradatives de la paroi végétale provoquant la pourriture molle. Parmi 

ces enzymes, les pectinases ont un rôle prépondérant puisque purifiées ces enzymes sont 

capables à elles seules de reproduire les symptômes de la pourriture molle (Collmer et Keen, 

1986). De concert avec ces pectinases, d’autres enzymes participent à la dégradation des 

parois végétales. Deux cellulases, CelY et Cel5, ont été identifiées dans la souche 3937 et 

76


participent à la dégradation des fibres de cellulose. D’autres enzymes dégradatives sécrétées 

par E. chrysanthemi ont été caractérisées dans différentes souches sauvages, parmi lesquelles 

quatre métalloprotéases PrtA, PrtB, PrtC et PrtG qui sont sécrétées par l’ABC transporteur 

spécifique PrtDEF (Barras et al., 1994; Delepelaire et Wandersman, 1990), une endoxylanase 

chez E. chrysanthemi D1 (Hurlbert et Preston, 2001; Keen et al., 1996) et la phospholipase 

PlcA chez E. chrysanthemi EC16 (Keen et al., 1992). Les gènes correspondant à ces 

différentes protéines caractérisées chez d’autres souches d’E. chrysanthemi sont présents au 

sein du génome de la souche 3937 (Glassner et al., en préparation). 

III.C.1.1 La paroi végétale et la pectine 

Comme décrit brièvement dans la première partie, la paroi végétale est constituée de 

matrices polysaccharidiques complexes comprenant de la pectine, de la cellulose et des 

hémicelluloses (Albersheim et al., 1996). Tous les composants de cette paroi sont 

interconnectés de façon à former un squelette rigide capable de maintenir la cohésion des 

tissus végétaux et de résister à la pression de turgescence des cellules végétales. Les 

polymères de pectine sont les plus complexes des polysaccharides pariétaux. La pectine 

comprend de longues chaînes linéaires d'homogalacturonanes interrompues par des 

rhamnogalacturonanes ramifiés, le RG-I et le RG-II (Schols et Voragen, 1996) (Figure 23). 

Figure 23 : La paroi végétale et la structure biochimique de la pectine 

A : Composition de la paroi végétale. 

77


B : La pectine est un polymère d’acides galacturoniques (GA) liés en α 1-4. Ce squelette 

contient des zones riches en rhamnose (R), liés en β 1-2 avec les galacturonates suivant, qui 

introduisent des courbures dans le squelette de la pectine. D’autre part, dans le RGI ces 

résidus de rhamnose servent d’ancrage aux chaînes d’arabino-galactanes (molécules de 

pectine neutre) riche en arabinose (A) et en galactose (GL). Le RGI et le RGII constituent les 

régions ramifiées de la pectine. Les résidus galacturonates peuvent être méthylés sur le 

carbone 6 ou acétylés sur le carbone 2 et/ou 3. G : D-glucose, X : D-xylose, A : L-arabinose, 

GA : acide D-galacturonique, R : L-rhamnose, GL : D-galactose, HA : acide 3-désoxy-Dlyxo-heptulosarique, 

OA : acide 3-désoxy-D-manno-octulosonique, Ap : D-apiose, F : L- 

fucose, AA : acide L-acérique, GU : acide D-glucuronique. 

L'homogalacturonane est un homopolymère de résidus D-galacturonate liés par des 

liaisons α 1-4 , parfois interrompu par des résidus rhamnose solitaires qui servent d’ancrage à 

des chaînes latérales d’oses neutres (arabinogalactanes) dans le RGI. La présence de 

rhamnose, lié en α 1-2 au galacturonate suivant introduit des courbures dans la molécule de 

pectine. Le RG-I est composé d'un squelette de disaccharides (2-α-L-rhamnose-(1-4)α-Dgalacturonate-1) 

portant des chaînes ramifiées riches en galactose et en arabinose (les 

arabinogalactanes) (Mc Neil, 1980). Le RG-II est composé d'un squelette 

d'oligogalacturonates (7 à 12 résidus liés en α 1-4) portant des chaînes latérales incluant des 

monosaccharides divers, dont certains rares et avec des liaisons inhabituelles (Schols et 

Voragen, 1996; Thomas et Darvill, 1989). 

La pectine est liée à la cellulose grâce aux hémicelluloses (Bauer et al., 1973). 

L’ensemble est maintenu en cohésion grâce aux ions Ca 2+ qui assurent un pontage entre les 

molécules de pectine mais aussi grâce à des liaisons covalentes entre les différents 

constituants pariétaux. La pectine n’est pas un polymère homogène, elle varie par le degré de 

méthylation du C 6 et d’acétylation du C 3 ou C 2 des résidus galacturonates (on parlera de 

pectine lorsque l’homogalacturonane est estérifié et de polygalacturonate (PGA) lorsqu’il ne 

l’est pas), par la longueur de la chaîne principale, par la présence de RGI et la longueur des 

chaînes d’arabinogalactanes et enfin par la présence de RGII. 

III.C.1.2 Les pectinases, facteurs de virulence majeurs chez E. chrysanthemi 

Du fait de la complexité des pectines se trouvant dans les parois végétales, E. 

chrysanthemi produit diverses pectinases. Elles peuvent être séparées en deux groupes 

différents : les pectine estérases et les dépolymérases. Une dégradation efficace de la pectine 

par E. chrysanthemi résulte de l’action concertée de ces deux groupes d’enzymes (Shevchik et 

78


Hugouvieux-Cotte-Pattat, 1997) (Figure 24). Nous ne décrirons que les enzymes les plus 

importantes pour le pouvoir pathogène. 

Figure 24 : La voie de dégradation et d’assimilation de la pectine 

Les pectinases extracellulaires (Pem : pectine méthylestérase, Pae : pectine acétylestérase, Pnl 

: pectine lyase, Pel : pectate lyase, RhiE : rhamnogalacturonate lyase) dégradent les polymères 

pectiques en oligogalacturonides, majoritairement insaturés (uGAn), qui entrent dans la 

cellule. Ils sont alors dégradés par les pectinases périplasmiques (PehV, W et X : 

exopolygalacturonases ainsi que PelX et PaeX) et traversent la membrane interne. Dans le 

cytoplasme, ils sont catabolisés en pyruvate et 3-phosphoglycéraldéhyde qui entrent dans le 

79


métabolisme cellulaire. La pectine peut donc être utilisée comme source de carbone pour la 

croissance d’E. chrysanthemi. La localisation cellulaire de PelN, PehN, PehK, PnlG et PnlH 

n’est pas encore connue. L’activité enzymatique de PelN, PehK, PnlG, PnlH n’a pas encore 

été démontrée. 

III.C.1.2.a Les pectine estérases 

Les pectine estérases hydrolysent les groupements méthyles et acétyles de la pectine. 

Ces enzymes, en diminuant les estérifications présentes dans la pectine, donnent naissance au 

polygalacturonate (PGA) qui est un substrat plus facilement accessible aux principales pectine 

dépolymérases produites par E. chrysanthemi. Les pectine méthyl-estérases (Pem) clivent les 

méthylations de la pectine au niveau des régions d’homogalacturonanes, libérant du méthanol 

et du PGA. Les pectine acétyl-estérases (Pae) hydrolysent les groupes O-acétyle des 

homogalacturonanes et libèrent de l’acide acétique et du PGA. E. chrysanthemi 3937 

synthétise deux pectine méthyl-estérases, PemA sécrétée et PemB qui est ancrée dans la 

membrane externe (Laurent et al., 1993; Shevchik et al., 1996), et deux pectine acétylestérases, 

PaeY sécrétée et PaeX localisée dans le périplasme (Shevchik et Hugouvieux- 

Cotte-Pattat, 1997, 2003) (Figure 25). 

O-CH 3 O-CH 3 

O 

CO 

OH 

O 

O 

CO 

OH 

O 

COOH 

COOH 

O 

O 

COCH 

O OH 

O 3 O 

O 

COOH 

O 

OH 

O 

COOH 

O 

OH 

O 

COOH 

OH 

O 

O 

OH 

OH 

O 

COCH 3 

OH 

OH 

OH 

OH 

pectin 

methylesterase 

pectate lyase 

acetylesterase 

PelE 

PemB 

PelD 

PemA 

PelC 

PelB 

PaeY 

PaeX 

PelA 

Figure 25 : Production de deux pectine méthyl-estérases et de deux pectine acétyl-estérases 

ches Erwinia chrysanthemi 3937. Electrofocalisation d’extraits d’Erwinia suivie de révélation 

80


enzymatique spécifique. L’action des pectate lyases, principales dépolymérases, est également 

représentée et utilisée comme marqueur de pI. 

III.C.1.2.b Les dépolymérases 

En ce qui concerne les dépolymérases, on distingue deux types d’activités selon le 

mode de clivage de la liaison glycosidique. D’une part, les pectate lyases qui clivent les 

liaisons glycosidiques par β-élimination en enlevant un proton et créant une insaturation à 

l’extrémité non réductrice du polymère. D’autre part, les polygalacturonases qui clivent la 

liaison glycosidique par un mécanisme d’hydrolyse en incorporant une molécule d’eau par 

une catalyse acide. Les dépolymérases se distinguent également par leur mode d’attaque du 

substrat (endo : clivage aléatoire à l’intérieur de la chaîne peptidique ou exo : clivage à partir 

d’une extrémité de la chaîne de pectine) et par leur substrat préférentiel (degré de méthylation, 

longueur des polymères…) (Figure 26). 

O-CH 3 

O-CH 3 

COOH 

COOH 

CO 

CO 

COOH 

O 

O 

O 

O 

O 

O 

COCH 3 

O 

OH 

O OH 

O 

OH 

O 

OH 

OH 

OH 

OH 

OH 

OH 

OH 

COCH 3 COCH 3 

souche 

sauvage 

mutant 

∆ pel 

PelE 

PelI 

PelD 

PelC 

PelB 

PelL 

PehX, PehW, PehV 

PelX 

PelW 

PelA 

(cc x 1 x 30) 

Figure 26 : Production de dépolymérases chez Erwinia chrysanthemi 3937. 

Electrofocalisation d’extraits d’Erwinia suivie de révélation enzymatique spécifique. 

Le récent séquençage du génome de la souche 3937 d’E. chrysanthemi (Glasner et al., 

en préparation) a prédit l’existence de deux pectine lyases potentielles (PnlG et PnlH), onze 

pectate lyases (PelA, PelB, PelC, PelD, PelE, PelI, PelL, PelN, PelW, PelX, PelZ), cinq 

81


polygalacturonases (PehK, PehN, PehV, PehW et PehX) ainsi qu’une rhamnogalacturonate 

lyase, RhiE. 

Les pectate lyases jouent un rôle déterminant dans les symptômes de pourriture molle. 

Elles clivent la pectine faiblement méthylée et libèrent des oligogalacturonides insaturés 

(uGA n ). Chez E. chrysanthemi, parmi les dix pectate lyases caractérisées biochimiquement, 

neuf sont des endo-pectate lyases et deux des exo-pectate lyases. Au moins 11 pectinases 

(PemA, PaeY, PelA, PelB, PelC, PelD, PelE, PelI, PelL, PelZ et RhiE) sont sécrétées dans le 

milieu extérieur par le système de sécrétion de type II Out, où elles génèrent des oligomères 

pectiques (Laatu et Condemine, 2003; Roy et al., 1999). Les oligomères extracellulaires 

entrent dans le périplasme dans lequel ils sont désestérifiés et clivés par des enzymes 

périplasmiques (PemB, PaeY, PelX, PehV, PehW, PehX) (Shevchik et al., 1999b). Les petits 

oligomères, des dimères aux tétramères, entrent dans le cytoplasme grâce à deux systèmes de 

transport : TogT et l’ABC transporteur TogMNAB. Dans le cytoplasme, ils sont dégradés en 

monomères, générant essentiellement du 5-céto-4-désoxyuronate (DKI) et de faibles quantités 

de galacturonate (Shevchik et al., 1999a) (Figure 24). 

III.C.1.2.c Les endo-pectate lyases : déterminantes dans le pouvoir pathogène 

Parmi les endo-pectate lyases, cinq isoenzymes à forte activité in vitro, PelA, PelB, 

PelC, PelD et PelE, représentent 95% de l’activité pectate lyase en culture. Elles jouent un 

rôle crucial dans le pouvoir pathogène et elles sont capables hormis PelA de provoquer la 

pourriture molle sur divers organes végétaux dont des tubercules de pommes de terre et des 

feuilles d’endives (Barras et al., 1994; Collmer et Keen, 1986). Les autres endo-pectate 

lyases, PelI, PelL et PelZ (Lojkowska et al., 1995; Pissavin et al., 1998; Shevchik et 

Hugouvieux-Cotte-Pattat, 1997), sont dites secondaires car elles présentent une activité plus 

faible sur le polygalacturonate en dosage in vitro. 

Les endo-pectate lyases ont été arbitrairement séparées en trois groupes en fonction de 

leur point isoélectrique (pI) (Figure 26). La protéine PelA est la seule à posséder un pI acide, 

les protéines PelB, PelC, PelI et PelZ ont un pI légèrement alcalin (de 8 à 9.0), enfin le pI de 

PelD, PelE et PelL est fortement alcalin (>9) (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996; 

Lojkowska et al., 1995; Shevchik et Hugouvieux-Cotte-Pattat, 1997). Par contre toutes ces 

enzymes possèdent un pH optimum d’activité alcalin, variant entre 8.0 et 9.3. Cependant, à 

pH neutre, PelA, PelD et PelE conservent une partie non négligeable de leur activité, (25 à 

82


30%), alors que PelB et PelC sont quasiment inactives (Tardy et al., 1997). Au début de 

l’infection, le milieu intercellulaire végétal colonisé par Erwinia présente un pH légèrement 

acide (entre 5,0 et 6,5 selon le végétal), ce qui suggère que les enzymes PelA, PelD et PelE 

sont probablement les plus actives lors de cette étape. 

L’activité des endo-pectate lyases dépend également de la présence d'un cofacteur 

ionique divalent, le calcium (Lojkowska et al., 1995; Shevchik et Hugouvieux-Cotte-Pattat, 

1997; Tardy et al., 1997). Elles peuvent être séparées en deux groupes : PelA, PelD et PelE 

agissent préférentiellement sur la pectine non méthylée, les autres pectate lyases ont une 

activité optimale sur la pectine partiellement méthylée (Tardy et al., 1997). L’activité in vitro 

des Pels varie selon la longueur de la chaîne du substrat. Ainsi, PelD a une activité optimale 

sur des tétramères, PelB sur des hexamères et PelA, PelI et PelL sont plus actives sur des 

heptamères et octamères (Roy et al., 1999). Cette diversité des pectate lyases permet à 

E. chrysanthemi de dégrader des pectines variées et d’infecter un large spectre d’hôtes. Des 

tests d’infection sur des plants de Saint paulia, hôte naturel d’E. chrysanthemi, ont révélé une 

relative forte implication des pectate lyases E, A et D dans le pouvoir pathogène de cette 

bactérie (Figure 27). 

Figure 27 : Rôle de différentes pectinases dans le pouvoir pathogène d’Erwinia sur 

Saintpaulia. Le pourcentage des plants présentant une infection généralisée, 15 jours après 

inoculation, est indiqué en rouge. Au contraire, le pourcentage de plants pour lesquels une 

absence de symptômes ou une macération localisée a été observée après le même délai est 

indiqué en bleu (d’après Boccara et al., 1988). 

83


III.C.1.2.d Organisation génétique des pectinases 

28). 

Les gènes de pectinases sont dispersés en 14 loci sur le chromosome bactérien (Figure 

pel 

pehV pehW 

pelB pelC 

Ori 

4572 4910/ 

4433 0 

630 

pnl 

pelA pelE 

pae 

peh 

pe 


3937 

3856 

1030 

3573 

1306 

(4922 kb) 

3430 

rhi 

peh 

cel5 pelL 

pnl 

3099 

2879 

2575 

2014 

2225 

pem 

kduI 

ogl 

Organisation transcriptionnelle : 

P P P P 

pelA pelE pelD paeY pemA 

pelN pnlG pehK 

ADN 

} ARNm 

pelX pnlH pehN 

PpelB PpelC PpelZ 

ADN 

} ARNm 

kduI 

kduD 

pelI 

pelW 

rhiE 

pemB 

togM togN togA togB kdgM paeX 

P P 

pehV pehW 

P 

pehX 

ADN 

ARNm 

cel5 

pelL 

Figure 28 : Organisation génétique des pectinases. 

A: Localisation chromosomique des gènes codant les pectinases. La direction des flèches 

indique le sens de transcription sur le chromosome et les chiffres correspondent à la 

position en kb par rapport à l’origine de réplication OriC. 

B : Organisation transcriptionnelle des pectinases. Les différentes pectinases sont indiquées 

par des couleurs : vert, pectate lyases; rose, polygalacturonases ; rouge, pectine 

méthylestérases ; bleu, pectine acétylestérases, bleu ciel, rhamnogalacturonate lyase. 

Certains loci contiennent un gène isolé, c'est le cas pour rhiE, pelI, pelL, pelX, pelN, 

pnlG, pnlH, pehK, pehN et pemB alors que d'autres loci regroupent plusieurs gènes de 

pectinases, notamment dans le locus pelA, pelE, pelD, paeY, pemA, le locus pelB, pelC, pelZ, 

ainsi que le locus pehV, pehW, pehX (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1989; Pissavin et al., 

1996). Lorsque les ARN issus de ces loci sont étudiés, on constate qu'à l'exception du gène 

paeY, chaque gène peut être exprimé comme une unité transcriptionnelle indépendante 

(Figure 28). Il existe un ARN polycistronique couvrant les gènes pelD, paeY et pemA, ainsi 

84


qu'un ARN polycistronique pour les gènes pelC et pelZ (Shevchik et Hugouvieux-Cotte- 

Pattat. 1997 ; Pissavin et al. 1996). Les gènes pelW et paeX sont quant à eux insérés dans un 

locus qui réunit différents gènes impliqués dans la voie catabolique de la pectine, notamment 

kdgM codant une porine de la membrane externe spécifique des oligogalacturonides, les gènes 

togMNAB codant l’ABC transporteur impliqué dans l'entrée des oligogalacturonides dans le 

cytoplasme ainsi que les gènes kduI et kduD permettant l'isomérisation et l'oxydation du 5- 

céto-4-désoxyuronate (DKI), le monomère principal issu du clivage des oligogalacturonides. 

L’existence de promoteurs indépendants pour la plupart des gènes de pectinases suggère que 

chaque gène va pouvoir être exprimé de façon différentielle dans les conditions particulières 

rencontrées dans la plante. 

IIID Régulation de la dégradation de la pectine chez Erwinia 

chrysanthemi 

La synthèse des Pels est soumise à un contrôle très fin qui permet à la bactérie de 

s’adapter rapidement aux conditions rencontrées lors de l’infection. La présence de la pectine 

et la densité cellulaire sont les facteurs agissant le plus fortement sur la synthèse des 

pectinases. D’autres facteurs environnementaux (présence d’extraits de plante, température, 

pH, osmolarité, carence en fer, en azote ou en oxygène, nature du sucre métabolisable) 

contrôlent la synthèse de ces enzymes (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996; Nasser et 

Reverchon, 2002; Reverchon et al., 1998). Pour certains de ces signaux, les régulateurs 

associés ont été caractérisés. 

III.D.1 Inductions par les composés végétaux 

III.D.1.1 Le répresseur KdgR 

KdgR est un régulateur global des gènes impliqués dans le catabolisme de la pectine et 

des fonctions associées dont le système Out nécessaire à la sécrétion des pectinases et de la 

cellulase Cel5 (Condemine et al., 1992; Reverchon et al., 1991). Le gène kdgR code une 

protéine de 30 kDa appartenant à la famille du répresseur transcriptionnel IclR (Reverchon et 

al., 1991; Thomson et al., 1999). L’induction des gènes de la pectinolyse par la pectine est 

85


principalement contrôlée par ce répresseur qui se fixe sous forme de dimère sur les régions 

régulatrices des gènes cibles in vivo (Nasser et al., 1994). KdgR interagit avec une séquence 

d’ADN de 25 pb qui comprend le motif palindromique AAATGAAACANTGTTTCATTT 

(Nasser et al., 1994). En absence de pectine, KdgR réprime l’expression des gènes pel en 

masquant le site de fixation de l’ARN polymérase ou en s’opposant à l’initiation de la 

transcription (Nasser et al., 1994; Robert-Baudouy et al., 2000; Shevchik et al., 1997a). En 

revanche, en présence de pectine, le niveau de base de synthèse des pectinases permet la 

formation de KDG (2-céto-3-désoxygluconate), un produit de dégradation de la pectine 

(Figure 24). Ce dernier, qui est l’inducteur intracellulaire vrai, va se complexer avec le 

répresseur KdgR qui perd alors son affinité pour l’ADN et les gènes pel sont efficacement 

transcrits (Nasser et al., 1994). Les complexes KdgR-ADN peuvent être dissociés par le KDG 

(Nasser et al., 1992). 

Bien que la fixation directe de KdgR sur les régions régulatrices de nombreux gènes 

contrôlés in vivo ait été mise en évidence in vitro (Nasser et al., 1994), d'autres gènes, comme 

pemA, pelZ, kdgA et outC, semblent indirectement régulés par KdgR. Les régions régulatrices 

des gènes pemA, pelZ, outC, kduD et kdgA ne fixent pas KdgR in vitro dans les conditions 

testées. KdgR pourrait réguler l'expression de ces gènes de manière indirecte, soit en 

impliquant le promoteur d’un gène situé en amont via la formation d’un messager 

polycistronique soit via une cascade de réactions impliquant d’autres protéines régulatrices. 

Par exemple, KdgR contrôle directement l'expression du gène outT dont le produit est un 

activateur de la transcription de l'opéron outC-M (Condemine et Robert-Baudouy, 1995). Le 

gène pelZ peut être transcrit comme une unité transcriptionnelle indépendante mais également 

en opéron avec pelC, dont la région régulatrice comporte un site de fixation de KdgR 

(Pissavin et al., 1996). 

Récemment, l’utilisation d’une approche bioinformatique, couplée à une vérification 

expérimentale, a révélé l’existence de nouveaux gènes contrôlés par le régulateur KdgR 

(Rodionov et al., 2004). Dix nouveaux gènes présentent un site de fixation de KdgR et sont 

fortement régulés in vivo par KdgR. La fonction de ces gènes n’est pas encore connue. Les 

gènes pecT et sotA, codant un régulateur et un transporteur de sucres sont également régulés 

par KdgR, mais à un niveau plus faible. De plus, dans le cas de pecT, KdgR agit en tant 

qu’activateur. Cette fonction d’activation par KdgR n’avait jamais été soupçonnée pour cette 

protéine considérée précédemment comme répresseur uniquement (Rodionov et al., 2004). 

Le régulateur KdgR n’est pas la seule protéine responsable de l’induction des gènes 

pel par les composés pectiques. En effet, les gènes pel sont déréprimés dans un mutant kdgR 

86


mais restent inductibles en présence de pectine (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996). De 

plus, l’expression du gène pelL est induite en présence de PGA, mais ce gène n'est pas une 

cible de KdgR (Lojkowska et al., 1995). Ces observations suggèrent l'existence d'autres 

mécanismes de régulation répondant à la présence de pectine. 

III.D.1.2 Le régulateur Pir 

Chez E. chrysanthemi EC16, dans un mutant pir (pour plant-inducible regulator), la 

synthèse des Pels est fortement diminuée et n’est plus inductible par les extraits de plantes. La 

virulence de ce mutant est atténuée (Nomura et al., 1998). Pir agirait donc comme un 

activateur. Pir active également l’expression de son propre gène (Nomura et al., 1999). La 

protéine Pir a une masse moléculaire de 30 kDa et appartient tout comme KdgR à la famille 

des régulateurs transcriptionnels IclR. Elle se fixe à l’ADN sous forme de dimère sur une 

séquence de 35 pb, identifiée à ce jour uniquement sur le promoteur de pelE de la souche 

EC16 (Nomura et al., 1998). Le site de fixation à l’ADN de Pir recouvre celui de KdgR 

suggérant une compétition entre les deux régulateurs pour leur fixation sur la région 

régulatrice de pelE. En présence de PGA, les inducteurs intracellulaires comme le KDG 

empêchent la fixation de KdgR, ce qui permettrait la fixation de Pir et une surinduction en 

présence du signal auquel répond Pir, ce composé n’étant pas encore identifié. Dans la souche 

d’E. chrysanthemi 3937, un mutant pir présente par contre une augmentation de la synthèse 

des pectinases en condition non induite ce qui suggère plutôt un rôle de répresseur pour la 

protéine Pir (Reverchon et al., résultats non publiés). 

III.D.2 La répression catabolique 

La synthèse des Pels est fortement diminuée en présence de glucose (Hugouvieux- 

Cotte-Pattat et al., 1996). Ce phénomène connu sous le terme de répression catabolique 

implique la protéine CRP (cyclic AMP Receptor Protein) et la molécule signal AMP cyclique 

(AMPc). CRP est une protéine de 210 acides aminés qui présente 98% d’identité avec les 

protéines CRP d'E. coli, S. typhimurium ou K. pneumoniae. Le complexe CRP-AMPc 

activerait la transcription des gènes pel par un mécanisme direct en favorisant la fixation de 

l’ARN polymérase (Nasser et al., 1997). En présence de glucose, le taux d’AMPc dans la 

cellule chute, ce qui aboutit à une diminution de la disponibilité du complexe CRP-AMPc et 

87


par voie de conséquence à une diminution de l’expression des gènes pel. Un mutant crp est 

déficient dans la production des pectinases et son pouvoir pathogène est sévèrement affecté. 

D’autre part, un mutant crp se développe sur glucose mais est incapable d'assimiler la plupart 

des autres sources de carbone comme le PGA, le galacturonate, le glycérol et le mannitol 

(Reverchon et al., 1997). CRP active l'expression des gènes pelB, pelC, pelD et pelE mais pas 

de pelA (Reverchon et al., 1997). En l’absence de KdgR, l’expression de pelA semble au 

contraire être réprimée par CRP (Reverchon et al., 1997). L'affinité de CRP pour la région 

régulatrice de ses gènes cibles est bien corrélée au taux de régulation observé in vivo. Cette 

affinité est maximale pour les promoteurs de pelD et pelE, ce qui est parfaitement en accord 

avec le fort niveau d'expression de ces gènes en conditions induites (Nasser et al., 1997). 

III.D.3 Régulation par diverses conditions physico-chimiques 

III.D.3.1 Osmolarité 

La pression osmotique est une variable importante de l’environnement qui peut 

affecter le pouvoir pathogène. Chez E. chrysanthemi, la pression osmotique affecte à la fois la 

croissance de la bactérie et la production des Pels. Une forte osmolarité induit l’expression de 

pelE mais diminue celles de pelD et pelL (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992; Lojkowska et 

al., 1995). L’expression des gènes pelA, pelB, pelC, pelI et pelZ ne semble pas régulée par 

l'osmolarité (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992; Pissavin et al., 1996; Shevchik et al., 

1997b). L'effet inhibiteur d'une forte osmolarité peut être relevé par les osmoprotectants 

(glycine bétaïne, proline, ectoïne, acide pipecolique...) (Gouesbet et al., 1995; Prior et al., 

1994) qui s'accumulent dans les cellules via des systèmes de transport spécifiques comme 

OusA, et OusB (Choquet et al., 2005; Gouesbet et al., 1996). 

Les principaux régulateurs globaux contrôlant le stress osmotique chez E. coli, à 

savoir sigma S, H-NS et Hfq sont présents chez E. chrysanthemi et sont également impliqués 

dans le stress osmotique (Gouesbet et al., 1996). Chez E. chrysanthemi, un mutant hns 

présente une plus grande sensibilité aux fortes osmolarités, suggérant une implication de cette 

protéine dans l’osmoadaptation de cette bactérie (Nasser et al., 2001a). 

88


III.D.3.2 Température 

La production des pectate lyases diminue généralement lorsque la température est 

supérieure à la température optimale de croissance de la bactérie (30°C). Cette 

thermorégulation est plus importante pour les gènes pelA, pelD et pelE que pour les autres 

gènes pel (Hugouvieux-Cotte-Pattat et Robert-Baudouy, 1992; Lojkowska et al., 1995). Chez 

E. chrysanthemi, la modulation de la synthèse des Pels en fonction de la température pourrait 

faire intervenir la protéine H-NS. En effet, l’induction de l’activité Pel à 25°C n’est plus 

observée dans un mutant hns (Nasser et al., 2001a). 

III.D.3.3 pH 

Quand les Erwiniae spp. infectent les plantes, elles colonisent dans un premier temps 

le fluide intercellulaire apoplastique dont le pH varie entre 5 et 6,5 (Nachin et Barras, 2000). 

Dans les étapes plus avancées de la colonisation, les bactéries induisent la lyse des cellules 

végétales et provoquent une alcalinisation du milieu. Les feuilles de chicorée passent ainsi 

d’un pH acide à basique lors de l’infection par E. chrysanthemi. La synthèse des Pels est 

affectée par le pH qui peut donc jouer un rôle important dans leur production lors de 

l’infection (Nachin et Barras, 2000). Les gènes pelA et pelD sont plutôt exprimés en milieu 

acide alors que pelE est transcrit à pH alcalin. Ces résultats suggèrent que PelA et PelD 

seraient importants lors des étapes précoces de l’infection quand le pH environnant est acide 

et inversement, PelE serait nécessaire lors des étapes plus tardives de l’infection lorsque le pH 

devient basique. Ainsi le pH pourrait être responsable d’une production séquentielle des Pels 

au cours de l'infection. Le mécanisme de régulation de l'expression des gènes pel en réponse 

au pH est inconnu. 

III.D.3.4 Carence en fer 

En réponse à une carence en fer, E. chrysanthemi synthétise deux sidérophores, la 

chrysobactine et l’achromobactine (Expert et al., 1996). La chrysobactine a beaucoup plus 

d’affinité pour le fer et sa synthèse est nécessaire lorsque la carence en fer est très sévère. La 

disponibilité du fer est très importante dans la régulation de la virulence d’E. chrysanthemi. 

La privation de fer induit la synthèse de pelB, pelC, pelD, pelE et pelL (Masclaux et al., 1996; 

89


Sauvage et Expert, 1994). Le répresseur transcriptionnel Fur (pour ferric uptake regulation) 

qui utilise l’ion fer comme co-facteur, est responsable de cette régulation des pectinases. Dans 

un mutant fur, l’expression des gènes pelD et pelE est déréprimée indépendamment de la 

concentration en fer dans le milieu (Franza et al., 1999). Les sites de fixation de Fur sont 

situés au voisinage des séquences d’ADN reconnues par CRP. Fur inhiberait ainsi la fixation 

de CRP et donc l’activation de la transcription qui en résulte (Franza et al., 2002). Cependant 

le maintien de l'induction de l'expression de pelD et pelE dans un mutant fur en carence en fer 

suggère l'existence d'un autre système de régulation par le fer (Franza et al., 1999). Fur régule 

également directement l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse et le transport de 

la chrysobactine et de l’achromobactine (Franza et al., 1999; Franza et al., 2002; Franza et al., 

2005; Sauvage et al., 1996). 

III.D.3.5 Carence en oxygène et en azote 

La maladie provoquée par les Erwiniae pectinolytiques est plus sévère si la 

concentration en oxygène est faible (Perombelon, 1990). Bien que la synthèse globale des 

pectate lyases augmente en semi-anaérobiose, chaque gène répond différemment à la 

limitation en oxygène. Ainsi l’expression de pelA, pelD, pelE et pelI est stimulée, celle de 

pelB, pelC et pelL n'est pas affectée, et celle de pelZ est réduite (Hugouvieux-Cotte-Pattat et 

al., 1992). 

La carence en azote inhibe l’expression de l’ensemble des gènes codant les endopectate 

lyases (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992; Lojkowska et al., 1995; Pissavin et al., 

1996; Shevchik et al., 1997b). La respiration anaérobie sur le nitrate, qui se trouve en quantité 

suffisante dans les tissus végétaux, faciliterait la prolifération bactérienne (Smid et al., 1993). 

Les fertilisants azotés favoriseraient ainsi la pourriture molle, à l'inverse d'une carence en 

azote (Canaday, 1992; Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992). 

Les régulateurs contrôlant l’expression des gènes pel en réponse au taux d’oxygène et 

d’azote n’ont pas encore été identifiés. 

III.D.4 Les régulateurs répondant à des signaux encore inconnus 

Lors d’expériences de mutagenèses aléatoires, deux régulateurs PecS et PecT ont été 

identifiés comme des répresseurs de l’expression des gènes pel. Le rôle précis de ces deux 

90


régulateurs ainsi que celui de H-NS restent mal définis en raison de l’absence d’informations 

concernant les signaux qui modulent l’activité de ces régulateurs. Cependant, il apparaît 

clairement que ces régulateurs participent à la coordination de l’expression de diverses 

fonctions impliquées dans le pouvoir pathogène, incluant les Pels, ce qui permet à E. 

chrysanthemi d’ajuster de façon coordonnée la production des divers facteurs de virulence. 

III.D.4.1 PecS 

L’inactivation du gène pecS chez E. chrysanthemi aboutit à la dérepression des gènes 

pel, du gène cel5, des gènes prtA, B, C et G codant quatre métalloprotéases extracellulaires, 

des gènes out impliqués dans la machinerie de type II nécessaire à la sécrétion des pectinases 

et des cellulases, et des gènes indA, B et C impliqués dans la production d’un pigment bleu, 

l’indigoïdine (Reverchon et al., 1994). Des mutants déficients dans la production 

d’indigoïdine sont incapables d’envahir la plante hôte et l’indigoïdine confère une résistance 

accrue au stress oxydant, indiquant que ce composé pourrait protéger les bactéries contre les 

radicaux oxygénés générés pendant la réaction de défense de la plante (Reverchon et al., 

2002). D’autre part, PecS réprime également la synthèse de la protéine harpine HrpN (Nasser 

et al., 2005) qui induit les réactions de défense de la plante et en particulier la production de 

radicaux oxygénés suspectés d’inactiver le régulateur PecS (Reverchon et al. 2002). 

La protéine PecS, de 20 kDa, appartient à la famille des régulateurs transcriptionnels 

de type MarR qui sont généralement impliqués dans des processus de détoxification (Sulavik 

et al., 1995). Le signal auquel répond PecS est encore inconnu mais les protéines de la famille 

MarR reconnaissent généralement des composés phénoliques. PecS se fixe sous forme de 

dimère aux promoteurs de ses gènes cibles (Praillet et al., 1996; Reverchon et al., 2002b). 

PecS réprime également l’expression de son propre gène. Le site de fixation de PecS sur 

l’ADN peut recouvrir le promoteur comme dans le cas de pecS et cel5 (Praillet et al., 1996, 

Rouanet et al., 2004), ou se trouve en aval des promoteurs des gènes contrôlés comme dans le 

cas des gènes outC et expI (Praillet et al., 1996 ; Reverchon et al., 1998). 

III.D.4.2 PecT 

Le répresseur PecT contrôle la synthèse de la plupart des Pels mais également celle 

des EPS et de la harpine HrpN (Condemine et al., 1999; Pissavin et al., 1996; Shevchik et al., 

91


1997; Surgey et al., 1996; Nasser et al., 2005). Outre sa capacité à surproduire des pectate 

lyases, un mutant pecT forme des colonies muqueuses sur milieu minimum solide et les 

cellules floculent en milieu minimum liquide. PecT agit donc à plusieurs niveaux dans 

l'expression des facteurs de virulence. 

PecT est un régulateur de type LysR et, comme beaucoup de régulateurs de cette 

famille, il contrôle fortement sa propre synthèse (Castillo et Reverchon, 1997). 

III.D.4.3 H-NS 

La protéine H-NS d’E. chrysanthemi contrôle la synthèse de différents facteurs de 

virulence parmi lesquels les pectate lyases (Nasser et al., 2001a). H-NS exerce un effet global 

d’activateur sur l’expression des gènes pel. Comme précédemment indiqué, cette activation 

résulte principalement d’un contrôle négatif direct de H-NS sur l’expression du gène pecT 

(Nasser et Reverchon, 2002). Ainsi, dans un mutant hns, la surproduction du répresseur PecT 

aboutit à une forte inhibition de la synthèse des pectinases. H-NS contrôle également la 

mobilité et la synthèse des EPS. 

III.D.5 Régulation en fonction de la phase de croissance 

III.D.5.1 Sigma S 

Chez les Erwinia pectinolytiques, l'expression des gènes pel est fortement induite à la 

fin de la phase exponentielle de croissance (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992). Chez E. 

coli, l'expression des gènes induits en phase stationnaire et dans certaines conditions de stress 

requiert le facteur sigma S de l'ARN polymérase. L’analyse d’un mutant rpoS d’E. carotovora 

révèle qu’il présente une plus grande sensibilité au stress oxydant et produit plus de pectinases 

(Andersson et al., 1999; Mukherjee et al., 1998). Ce dernier phénotype serait en fait lié au 

contrôle positif qu'exerce RpoS sur la transcription du gène rsmA qui participe à la régulation 

de la synthèse des Pels via un mécanisme post-transcriptionnel. La construction d’un mutant 

rpoS de la souche d’E. chrysanthemi 3937 a également révélé une légère augmentation de la 

synthèse des pectinases dans ce contexte génétique mais cette synthèse reste dépendante de la 

phase de croissance (Reverchon et al., résultats non publiés). 

92


III.D.5.2 Régulation par la densité cellulaire : le quorum sensing 

Un mécanisme couramment utilisé par les bactéries pour assujettir l’expression des 

gènes de virulence à la densité cellulaire est le « quorum sensing » (QS). Il s’agit d’un 

mécanisme de communication intercellulaire via de petites molécules diffusibles dont la 

concentration est le reflet de la densité cellulaire. Chez les bactéries à Gram négatif, ce 

contrôle se fait principalement par le biais des N-acyl-homosérine lactones (acyl-HSLs) 

(Fuqua et al., 1994). Ce système a été décrit pour la première fois chez la bactérie Vibrio 

fischeri où le QS implique le couple de protéines LuxI/LuxR. LuxI est une synthétase 

catalysant la formation d’acyl-HSLs tandis que LuxR est un régulateur transcriptionnel 

(Fuqua et al., 1994). 

Chez E. chrysanthemi, deux acyl-HSLs différentes ont été caractérisées : la N-(3- 

oxohexanoyl)-homosérine lactone (3-oxo-C 6 -HSL) et la N-hexanoyl-homosérine lactone (C 6 - 

HSL) (Nasser et al., 1998). Un troisième composé capable d’activer des systèmes rapporteurs 

sensibles aux acyl-HSLs a également été détecté dans le surnageant de culture de la souche 

3937 mais la structure de ce composé reste inconnue. De plus, deux gènes convergents, expI 

et expR, codant deux protéines homologues à LuxI et LuxR de V. fischeri ont été caractérisés 

(Nasser et al., 1998). ExpI catalyse la synthèse des composés 3-oxo-C 6 -HSL et C 6 -HSL. En 

revanche, le locus responsable de la production du troisième composé n’est pas connu. Le 

mutant expR ne présente pas de phénotype notable en ce qui concerne la synthèse des Pels. 

Cependant, des expériences d’interaction ADN-protéine réalisées in vitro ont montré que la 

protéine ExpR purifiée se fixe de façon spécifique sur les régions régulatrices des gènes pelA, 

B, C, D et E (Nasser et al., 1998). L’absence de phénotype du mutant expR laisse donc 

présager l’existence chez E. chrysanthemi, d’un ou plusieurs homologues fonctionnels de 

ExpR. Par ailleurs, dans un mutant expI, l’activité Pel totale n’est pas significativement 

affectée et, parmi les gènes codant les Pels majeures, seule l’expression de pelA et pelB est 

diminuée (Nasser et al., 1998). ExpR se fixe sur les régions régulatrices des gènes pel mais 

aussi sur celles du gène expI et de son propre gène (Reverchon et al., 1998). La 3-oxo-C 6 - 

HSL dissocie les complexes ExpR-ADN dans le cas du gène expR et modifie la migration des 

complexes obtenus avec les gènes expI ou pel, ce qui suggère que l’interaction de ExpR avec 

cette acyl-HSL modifie sa fixation à l’ADN (Nasser et al., 1998; Reverchon et al., 1998; 

Castang et al., 2006). Les sites de fixation de ExpR sont situés en amont des régions –10 et – 

35 dans le cas des gènes pel et expI. En revanche, dans le cas de expR, la zone protégée par la 

fixation de ExpR recouvre en grande partie les deux promoteurs de ce gène (Nasser et al., 

93


1998; Reverchon et al., 1998a; Castang et al., 2006). De manière cohérente, des travaux 

récents ont montré que ExpR réprime directement l’expression de son propre gène en agissant 

au niveau de l’initiation de la transcription et que cette action est levée en présence de 3-oxo- 

C 6 -HSL (Castang et al., 2006). 

III.D.6 Modulation de l’expression des gènes de régulateurs : réseau 

Comme nous venons de le voir, la régulation de la synthèse des Pels met en jeu 

plusieurs régulateurs répondant à différents signaux. Une étude intégrative a montré que les 

régulateurs sont interconnectés, laissant présager une organisation en réseau (Reverchon et 

al., 1998 ; Nasser et Reverchon, 2002). Cette hypothèse a été récemment confirmé par 

modélisation mathématique (Sepulchre et al., 2007) (Figure 29). 

94


Figure 29: Réseau de régulation contrôlant l’expression des gènes pel chez Erwinia 

chrysanthemi. Les régulations négatives et positives sont représentées en bleu et en rouge, 

respectivement. L’épaisseur des traits traduit l’importance d’une régulation. Les formes 

inactives des régulateurs apparaissent en jaune. 

95


Le régulateur global H-NS réprime l’expression de expI, expR et pecT (Nasser et 

Reverchon, 2002). CRP active la transcription de expR et réprime celle de expI ce qui pourrait 

expliquer l'effet répresseur de CRP sur l'expression de pelA (Reverchon et al., 1998). En effet, 

dans un mutant crp l’expression de pelA est augmentée alors qu’aucune interaction directe 

entre ce régulateur et la région promotrice de pelA n’a pas été mise en évidence (Nasser et al., 

1997). L’accumulation d’acyl-HSLs chez un mutant crp pourrait être responsable de 

l’induction de pelA (Reverchon et al., 1998). PecS réprime l'expression de expI et ExpR 

active l’expression de pecS (Reverchon et al., 1998). La régulation par la protéine Pir semble 

indépendante de KdgR, PecS et CRP puisque aucun de ces régulateurs ne semble contrôler 

l'expression du gène pir (Nomura et al., 1999). L’effet activateur de KdgR sur la synthèse du 

régulateur PecT est un nouvel exemple de connexion entre deux systèmes de régulation de la 

synthèse des Pels (Rodionov et al., 2004). En résumé, il apparaît que le réseau de régulation 

des gènes pel est hiérarchisé avec un rôle prépondérant pour les régulateurs généraux CRP et 

H-NS ; ces deux régulateurs pourraient constituer des nœuds permettant une mise en œuvre 

séquentielle du réseau (Sepulchre et al., 2007). 

L’existence d’un tel réseau de régulation pourrait permettre à E. chrysanthemi de 

moduler finement la synthèse des Pels en fonction des conditions de l’environnement et de 

son état physiologique. Ainsi la bactérie pourrait induire l’expression des différents gènes pel 

au bon moment et au bon endroit lors du processus infectieux. Par ailleurs, étant donné que la 

plupart des acteurs de ce réseau contrôlent d’autres facteurs de virulence en plus des Pels, 

cette organisation hiérarchisée pourrait permettre une bonne coordination de la production des 

facteurs requis aux différents stades du processus infectieux. 

96

Résultats 

1 er article 

Objectifs de l’étude 

L’agressivité de la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, comme nous 

l’avons vu précédemment, est essentiellement liée à sa capacité à coordonner une production 

massive de différents facteurs de virulence dont les pectate lyases (Pels), enzymes essentiels 

du pouvoir pathogène. La synthèse des Pels est soumise à une régulation complexe et répond 

à divers stimuli, tels que la présence de pectine ou d’extraits de plantes, la phase de 

croissance, la température et la concentration en fer. Les effets de la pectine et de la phase de 

croissance sont prépondérants. En dépit des travaux déjà réalisés, les réponses à certains 

stimuli, notamment la phase de croissance, sur la synthèse des facteurs de virulence n’ont pas 

encore été élucidées. Le génome d’E. chrysanthemi étant séquencé, une approche prometteuse 

pour élucider ce mode de régulation consistait à analyser l’action des homologues des 

régulateurs contrôlant la synthèse de facteurs de virulence en fonction de la phase de 

croissance chez des bactéries taxonomiquement proches. Des résultats publiés au début de 

cette thèse faisaient état d’une implication de la protéine associée au nucléoïde Fis dans la 

régulation phase de croissance-dépendante s'exerçant sur la synthèse de différents facteurs de 

virulence chez des bactéries pathogènes de l’homme dont les souches entéropathogéniques 

d’Escherichia coli et Salmonella typhimurium (Falconi et al., 2001 ; Wilson et al., 2001 ; 

Kelly et al., 2004). Fis apparaissait donc comme un candidat prometteur pour la régulation 

des facteurs de virulence par la phase de croissance chez E. chrysanthemi. 

L’objectif principal de cette thèse était de vérifier cette hypothèse. La première partie 

du travail a consisté à caractériser génétiquement le mutant fis d’E. chrysanthemi, à évaluer 

son pouvoir pathogène et à déterminer l’effet de Fis sur la régulation de la synthèse des 

principaux facteurs de virulence, dont les Pels. La deuxième partie de cette étude a porté sur 

une caractérisation plus fine du mécanisme moléculaire de Fis sur la régulation de la 

production des Pels. Pour ce faire, l’action de Fis a été intégrée au complexe multiprotéique 

agissant au niveau des promoteurs des gènes pel ainsi qu’au réseau de régulation de ces gènes. 

Ces travaux ont été réalisés en collaboration avec le laboratoire du professeur Georgi 

Muskhelishvili (Jacobs University of Bremen, Germany) dont les études portent en partie sur 

la caractérisation fonctionnelle de la protéine Fis chez E. coli. 

97

Résultats 


RESULTATS 

I 

1 er 

ARTICLE: La protéine associée au nucléoïde Fis 

coordonne l’expression des principaux gènes de 

virulence de la bactérie phytopathogène Erwinia 

chrysanthemi. 

Les enzymes pectinolytiques, en particulier, les pectate lyases (Pels), jouent un rôle 

clef dans les symptômes de pourriture molle générée par Erwinia chrysanthemi. Toutefois une 

colonisation efficace des plantes par la bactérie requiert des facteurs de virulence additionnels. 

Ces facteurs incluent la harpine HrpN, la cellulase principale Cel5, des protéases (Prts), les 

protéines flagellaires et le système Sap, impliqué dans la détoxification des peptides 

antibactériens produits par la plante en réponse à l’infection. HrpN et les flagelles sont 

principalement impliqués dans les étapes initiales de l’infection alors que les enzymes 

dégradatives (Pels, Cel5, Prts) sont requis dans les stades avancés de l’infection. La 

production de ces facteurs de virulence est finement régulée par les conditions 

environnementales. 

Ce premier article décrit la caractérisation génétique et biochimique de l’opéron fis 

d’E. chrysanthemi et l’implication de Fis dans le contrôle de la virulence de la bactérie. 

Comme précédemment montré chez Escherichia coli et chez plusieurs entérobactéries 

pathogènes des animaux, Fis constitue un opéron avec le gène orfI. La régulation de cet 

opéron par la phase de croissance et le rétro-contrôle négatif observés chez E. chrysanthemi 

sont également similaires à ceux précédemment décrits. Notons que la synthèse de Fis est 

maximale en tout début de phase exponentielle de croissance et que ce pic de synthèse est 

suivi par une diminution progressive de la concentration cellulaire de la protéine qui devient 

quasiment indétectable durant la phase stationnaire (voir introduction bibliographique, 

chapitre II.A.3.1). 

De plus, le mutant fis d’E. chrysanthemi présente des caractéristiques communes avec 

ceux du pathogène humain Salmonella typhimurium à savoir la perte de mobilité et une 

croissance ralentie en milieu riche LB. En revanche, le mutant fis d’E. chrysanthemi a révélé 

98

Résultats 


une particularité, non décrite chez les autres bactéries, qui est une forte capacité d’agrégation 

en milieu liquide complexe LB. Cette observation laisse présager une implication de Fis dans 

le contrôle de la synthèse d’une structure de surface d’E. chrysanthemi encore inconnue. 

Ces analyses phénotypiques générales ont été complétées par une évaluation de 

l’action de Fis sur la synthèse des protéases et des pectate lyases, enzymes dont l’activité est 

quantifiable sur des milieux synthétiques. Ainsi le mutant fis s’est avéré produire moins de 

protéases que la souche parentale. Concernant l’activité Pel, elle s’est avérée retardée et 

augmentée durant la phase stationnaire de croissance dans un mutant fis. La synthèse des Pels 

étant sous le contrôle d’un réseau de régulation complexe, les mécanismes d’action de Fis sur 

la régulation de la production de ces enzymes sont présentés dans le deuxième article. 

L’effet de Fis sur l’expression de différents gènes de virulence a été par la suite 

analysé au cours des différents stades de la croissance bactérienne. Les choix pour cette étude 

concernent les gènes impliqués dans les étapes initiales (codants le composant du flagelle 

FliC et la harpine HrpN), précoces (Sap, un système de détoxification) et des étapes avancées 

du processus infectieux (Cel5, cellulase majeure et PrtC, une protéase). L’utilisation de la 

technique de fusion de gènes ou de la RT-PCR quantitative a révélé que Fis active 

l’expression de hrpN, fliC, sap et prtC au cours de la croissance avec une action très marquée 

sur l’expression de hrpN, prtC et fliC. Pour cel5, une action de répresseur est observée 

également le long de la croissance mais avec un effet plus prononcé au début de la phase 

exponentielle de croissance. Ainsi, le profil de régulation de ces gènes cibles ne concorde pas 

strictement avec l’accumulation temporelle de Fis dans la cellule. 

La plupart de ces contrôles se fait via un mécanisme d’action direct de Fis puisque la 

protéine purifiée se lie spécifiquement aux régions promotrices de fis, hrpN, sapA, cel5 et 

fliC. De plus, les empreintes à la DNase I et au permanganate de potassium et les expériences 

de transcription in vitro ont révélé que Fis réprime l’expression de cel5 en empêchant 

l’élongation des transcrits. 

Des tests d’infection ont révélé une absence de macération par le mutant fis sur des 

organes végétaux non blessés alors que la souche parentale développe des symptômes de 

macération significatifs. Par contre, sur des organes blessés, le pouvoir pathogène du mutant 

n’est qu’atténué en comparaison de celui de la souche parentale. 

L’absence de macération provoquée par le mutant fis sur les organes végétaux est 

certainement liée à la faible synthèse, dans cette souche, des systèmes requis durant les étapes 

initiales et précoces de l’infection. Nous proposons un modèle intégratif de l’action de Fis sur 

les différents facteurs de virulence au cours du processus infectieux. 

99

Résultats 


The DNA nucleoid-associated protein Fis coordinates the expression of the main 

virulence genes in the phytopathogenic bacterium Erwinia chrysanthemi 

Thomas Lautier and William Nasser * 

Université de Lyon, F-69003, France ; Université Lyon 1, F-69622 ; INSA-Lyon, 

Villeurbanne, F-69621 ; CNRS, UMR 5240, Unité Microbiologie Adaptation et Pathogénie, 

F-69622. 

* For Correspondance: E-mail:William.nasser@insa-lyon.fr; Tel.: (33) 4 72 43 26 95; Fax: 

(33) 4 72 43 15 84; 

Accepted in Molecular Microbiology, the 15 th october 2007 

Key words: phytopathogenic bacteria/ Fis/ virulence genes/ regulation 

Running title: E. chrysanthemi fis and virulence gene regulation 

Summary 

Erwinia chrysanthemi strain 3937 is a necrotrophic bacterial plant pathogen. 

Pectinolytic enzymes and, in particular, pectate lyases (Pels) play a key role in soft rot 

symptoms but the efficient colonization of plants by E. chrysanthemi requires additional 

factors. These factors include the harpin HrpN, the cellulase Cel5, proteases (Prts), 

flagellar proteins and the Sap system, involved in the detoxification of plant 

antimicrobial peptides. HrpN and flagellum are mostly involved in the early steps of 

infection whereas the degradative enzymes (Pels, Cel5, Prts) are mainly required in the 

advanced stages. Production of these virulence factors is tightly regulated by 

environmental conditions. This report shows that the nucleoid-associated protein Fis 

plays a pivotal role in the expression of the main virulence genes. Its production is 

regulated in a growth phase-dependent manner and is under negative autoregulation. 

An E. chrysanthemi fis mutant displays a reduced motility and expression of hrpN, prtC 

and the sap operon. In contrast, the expression of the cel5 gene is increased in this 

mutant. Furthermore, the induction of the Pel activity is delayed and increased during 

the stationary growth phase in the fis mutant. Most of these controls occur through a 

direct effect since purified Fis binds to the promoter regions of fis, hrpN, sapA, cel5 and 

fliC. Moreover, potassium permanganate footprinting and in vitro transcription assays 

have revealed that Fis prevents transcription initiation at the fis promoter and also 

transcript elongation from the cel5 promoter. Finally, the fis mutant has a decreased 

virulence. These results suggest a coordinated regulation by Fis of virulence factors 

involved in certain key steps of infection, early (asymptomatic) and advanced 

(symptomatic) phases. 

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Résultats 


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Résultats 


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Résultats 


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Résultats 

2 ème article 

II 2 eme 

ARTICLE : Intégration de deux signaux essentiels 

modulant la virulence au niveau des promoteurs des 

gènes pel d’Er winia chrysanthemi : un rôle pour Fis 

dans la régulation par le phase de croissance. 

La production des pectate lyases (Pels), facteurs de virulences essentiels d’Erwinia 

chrysanthemi, est contrôlée par un réseau de régulation complexe et réponds à différents 

signaux environnementaux, tels que la présence de pectine ou d’extraits de plante, la phase de 

croissance, la température ou la concentration en fer. La présence de pectine et la phase de 

croissance sont les plus importants signaux identifiés. Huit régulateurs modulant l’expression 

des gènes pel ont été caractérisés. Ces régulateurs sont organisés en réseau permettant leur 

mise en œuvre séquentielle au cours de l’infection. Malgré les nombreuses études 

précédentes, le mécanisme de contrôle de la production de Pels par la phase de croissance n’a 

pas été encore élucidé. 

Dans ce second article, nous montrons qu’un mutant fis d’E. chrysanthemi présente 

une forte augmentation de la transcription des gènes pel durant la phase exponentielle de 

croissance alors que l’induction de l’expression dans la souche parentale n’a lieu qu’à la fin 

de la phase exponentielle de croissance. De plus, le taux d’induction des gènes pel par les 

dérivés pectiques est plus fort dans le mutant fis que dans la souche parentale. Ces données 

suggèrent que KdgR, le répresseur majeur répondant à la présence de composés pectiques, et 

Fis répriment de manière coopérative l’expression des gènes pel. Cette hypothèse a été 

confirmée dans un premier temps par des expériences in vitro qui ont révélé que Fis et KdgR 

réprime chacun l’expression des gènes pel en agissant au niveau de l’initiation de la 

transcription et que la présence simultannée des deux régulateurs se traduit par une 

diminution encore plus forte de l’accumulation des transcrits. Ces expériences in vitro ont été 

complétées par une quantification in vivo de l’expression des gènes pel. Il s’est avéré que le 

niveau d’expression observé dans les deux mutants simples fis et kdgR, notamment au début 

de la phase exponentielle de croissance, sont plus faibles que ceux obtenus dans le double 

mutant kdgR-fis. 

Au vu des résultats décrits ci-dessus, il apparaît que la répression de l’expression des 

gènes pel par Fis est plus marquée au début de la phase exponentielle de croissance. En 

132

Résultats 


revanche, des expériences de quantification réalisées sur des surnageants de culture avaient 

montré que l’induction de l’activité Pel est augmentée durant la phase stationnaire de 

croissance dans le mutant fis. Ce constat suggère une implication de Fis dans la translocation 

des Pels dans le milieu extérieur. Cette hypothèse a été validée par une comparaison de 

l’activité Pel présente à la fois dans les surnageants de culture et dans les cellules. Ces 

expériences ont révélé que l’activité Pel intracellulaire du mutant fis est beaucoup plus forte, 

notamment en début de phase exponentielle, que celle de la souche parentale. 

L’ensemble de ces données suggèrent fortement que Fis contrôle finement la 

disponibilité en Pels durant le processus infectieux en agissant aussi bien sur leur production 

que sur leur translocation dans le milieu extérieur. Nous présentons un modèle intégrant les 

actions de Fis et de KdgR pour contrôler la disponibilité des Pels au cours du processus 

infectieux. 

133

Résultats 


Integration of two essential virulence modulating signals at the Erwinia chrysanthemi pel 

gene promoters: a role for Fis in the growth phase regulation 

Thomas Lautier 1 , Nicolas Blot 2 , Georgi Muskhelishvili 3 and William Nasser 1* 

1 Université de Lyon, F-69003, France ; Université Lyon 1, F-69622 ; INSA-Lyon, 

Villeurbanne, F-69621 ; CNRS, UMR 5240, Unité Microbiologie Adaptation et Pathogénie, 

F-69622. 

2 Present adress: Station Biologique de Roscoff; CNRS, UMR7144 ; Roscoff, F-29680 

3 Jacobs University, Bremen, Campus Ring1, D-28759 Bremen, Germany 

*For Correspondance: E-mail:William.nasser@insa-lyon.fr; Tel.: (33) 4 72 43 26 95; Fax: 

(33) 4 72 43 15 84; 

Accepted in Molecular Microbiology, the 13 th october 2007 

Key words: phytopathogenic bacteria/ Fis/ virulence genes/ growth-phase regulation 

Running title: E. chrysanthemi fis and virulence growth-phase regulation 

Summary 

Production of the essential virulence factors, called pectate lyases (Pels), in the 

phytopathogenic bacterium Erwinia chrysanthemi is controlled by a complex regulation 

system and responds to various stimuli, such as the presence of pectin or plant extracts, 

growth phase, temperature and iron concentration. The presence of pectin and growth 

phase are the most important signals identified. Eight regulators modulating the 

expression of the pel genes (encoding Pels) have been characterized. These regulators 

are organized in a network allowing a sequential functioning of the regulators during 

infection. Although many studies have been carried out, the mechanisms of control of 

Pel production by growth phase have not yet been elucidated. Here we report that a fis 

mutant of E. chrysanthemi showed a strong increase in transcription of the pel genes 

during exponential growth whereas induction of expression in the parental strain 

occurred at the end of exponential growth. This reveals that Fis acts to prevent an 

efficient transcription of pel genes at the beginning of exponential growth and also 

provides evidence of the involvement of Fis in the growth-phase regulation of the pel 

genes. By using in vitro DNA-protein interactions and ranscription experiments, we find 

that Fis directly represses the pel gene expression at the transcription initiation step. In 

addition, we show that Fis acts in concert with KdgR, the main repressor responding to 

the presence of pectin compounds, to shut down the pel gene transcription. Finally, we 

find that active Fis is required for the efficient translocation of the Pels in growth 

medium. Together, these data indicate that Fis tightly controls the availability of Pels 

during pathogenesis by acting both on their production and their translocation in the 

external medium. 

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Résultats 

Résultats non publiés 

III Résultats non publiés : intégration de Fis dans le réseau 

de régulation des gènes pel. 

En présence de dérivés pectiques, une augmentation de l’expression des gènes pel, 

notamment celle de pelD et pelE, est observée le long de la croissance dans le mutant fis, avec 

toutefois un effet plus marqué au début de la phase exponentielle de croissance (2 ème article). 

Le profil de régulation des gènes pel ne s’accorde donc pas strictement avec celui de la 

concentration cellulaire en Fis. Pour expliquer cette différence, l’hypothèse émise dans le 2 ème 

article serait que la faible concentration cellulaire de Fis durant la phase stationnaire soit 

suffisante pour exercer une répression de l’expression des gènes pel à ce stade de la 

croissance. Une autre possibilité serait que la régulation par Fis durant la phase stationnaire se 

fasse par un mécanisme indirect impliquant un ou plusieurs autres régulateurs du réseau des 

gènes pel (voir introduction bibliographique, chapitre III.D.6). 

Afin de clarifier ce dernier point, l’étude de l’action de Fis sur l’expression des gènes 

essentiels du réseau de régulation a été initiée. Les investigations ont porté sur les gènes 

codant : 

-CRP, l’activateur principal des gènes pel, 

-Pir, un régulateur répondant à des composés de la plante, 

-PecS et PecT, deux répresseurs dont les signaux n’ont pas été encore caractérisés, 

-H-NS, la protéine associée au nucléoïde qui joue un rôle central dans le réseau, 

-KdgR, le principal répresseur répondant à la présence de composés pectiques. 

La plupart des régulateurs du réseau étant soumis à un rétro contrôle, nous avons dans 

un premier temps retenu la méthode de la RT-PCR quantitative (voir 1 er et 2 ème article) pour 

évaluer l’accumulation des transcrits dans la souche parentale et dans le mutant fis cultivées 

en LB et en LB supplémenté en PGA (Figure R1 ). Les méthodes utilisées pour le calcul des 

niveaux d’expression et pour les normalisations sont celles décrites dans les deux articles 

précédents. 

166

Résultats 


Figure R1 : Comparaison par RT-PCR quantitative de l’expression des gènes crp, hns, kdgR, 

pir, pecT et pecS dans le mutant fis par rapport à la souche parentale à différents stades de la 

croissance et dans différents milieux de culture (LB ou LB+PGA). La normalisation a été 

effectuée en utilisant les transcrits rsmA et pAW 109 comme décrit dans les articles 

précédents. La ligne rouge met en évidence la valeur 1 correspondant à une expression 

équivalente du gène étudié dans le mutant fis et la souche parentale. 

Au vu de ces résultats, il ressort que Fis régule négativement l’expression de : 

- crp, pir et pecS à la fin de la phase exponentielle uniquement en présence de PGA, 

- pecT au début et à la fin de la phase exponentielle de croissance en présence de PGA, 

avec un effet plus marqué en début de croissance. 

Par contre, Fis a un effet activateur sur l’expression du gène hns en début de 

croissance, suivie d’une légère répression à la fin de la phase exponentielle. Aucun effet 

significatif de Fis n’a été observé sur l’expression de kdgR dans les conditions de cultures 

réalisées. 

Les résultats de RT-PCR quantitative ont été complétés par des dosages de fusions 

transcriptionnelles mettant en jeu les régions régulatrices de kdgR, crp et pecT (Figure R2). 

167

Résultats 


Figure R2 : Expression des fusions transcriptionnelles kdgR::uidA, crp::uidA et pecT::uidA 

en fonction de la densité cellulaire dans la souche parentale et dans le mutant fis. Les cultures 

ont été réalisées en LB (A) et en LB supplémenté de PGA (4g L -1 ) (B). L’activité spécifique 

β-glucuronidase est exprimée en nmoles de p-nitrophenol produit par minute par mg de poids 

sec bactérien. 

Les résultats obtenus par ces deux approches sont globalement concordants mis à part 

dans les cas de kdgR et de crp. En effet, en LB supplémenté de PGA, un effet d’activation 

significatif par Fis sur l’expression de la fusion kdgR::uidA a été observé dans les phases 

exponentielles tardives alors qu’aucune action significative n’a été mise en évidence sur 

l’expression de la fusion impliquant la région régulatrice de crp. La raison de ces différences 

n’est pas encore élucidée mais les expériences mettant en jeu les fusions n’ayant été réalisées 

qu’une fois, nous avons surtout considéré les résultats de RT-PCR quantitative. Ces résultats 

168

Résultats 


préliminaires permettent tout de même d’intégrer Fis dans le réseau de régulation des gènes 

pel (Figure R3). 

Figure R3 : Intégration de Fis dans le réseau de régulation des gènes pel. 

Le rôle de Fis dans le réseau de régulation devra être précisé en évaluant l’impact des 

régulations en cascades mises en évidence sur l’expression des gènes pel. Toutefois, quelques 

169

Résultats 


hypothèses peuvent être émises. PecT étant un répresseur dont l’activité est intimement liée à 

sa concentration cellulaire (Castillo et Reverchon, 1997 ; Nasser et Reverchon, 2002), une 

augmentation de la concentration de ce régulateur dans le mutant fis, notamment au début de 

la croissance, pourrait retarder et réduire la dérépression des gènes pel. Par contre, 

l’augmentation de la synthèse de l’activateur CRP dans le mutant fis durant la phase 

stationnaire en présence de composés pectiques pourrait contribuer à la stimulation de 

l’expression des gènes pel ou compenser l’augmentation de l’expression de certains gènes 

répresseurs (pecT, pecS et pir) à ce stade de la croissance. 

Concernant l’action de Fis sur la synthèse des régulateurs généraux CRP et H-NS, un 

parallèle peut être établi avec les résultats obtenus chez l’entérobactérie modèle E. coli. Dans le 

cas de hns, les deux mécanismes de contrôle sont sensiblement identiques compte tenu du fait que 

chez E. coli une activation par Fis a été observée durant la première moitié de la phase 

exponentielle de croissance (Falconi et al., 1996). Par contre, des différences notables existent 

dans le contrôle de l’expression du gène crp par Fis chez ces deux bactéries. Chez E. coli, il a été 

montré que Fis réprime l’expression de crp au cours de la croissance via un mécanisme direct 

(Gonzalez-Gil et al., 1998) alors que seul un contrôle relativement modéré en phase plateau a été 

observé chez E. chrysanthemi. Des travaux préliminaires semblent indiquer que cette différence 

serait due à une organisation différente des régions régulatrices du gène crp chez les deux 

bactéries. En effet, sur le gène crp d’E. coli, deux sites de fixation de CRP et cinq de Fis ont été 

mis en évidence par des expériences d’empreintes à la DNAse I (Gonzalez-Gil et al., 1998) alors 

qu’aucun site évident pour ces deux régulateurs n’a été observé, par des approches identiques, sur 

la région promotrice du gène crp d’E. chrysanthemi (Figure R5). 

Les résultats obtenus in vitro sont en accord avec une régulation relativement limitée de 

l’expression du gène crp par Fis chez E. chrysanthemi. La signification biologique de cette 

différence de régulation du gène crp devra être clarifiée. 

Enfin, une intégration appropriée de Fis dans le réseau de régulation requiert 

également d’étudier l’effet des régulateurs précédemment caractérisés sur l’expression du 

gène fis. Des études préliminaires, réalisées en système hétérologue chez E. coli, à l’aide 

d’une fusion transcriptionnelle plasmidique mettant en jeu les régions régulatrices de fis d’E. 

chrysanthemi, ont montré que l’absence de CRP se traduit par une diminution de l’expression 

de la fusion (Figure R4). Ce résultat montre que CRP est un activateur majeur de l’expression 

du gène fis. Cependant, le profil d’expression reste dépendant de la phase de croissance, 

suggérant que CRP agit sur le niveau d’expression de fis mais non sur le profil de 

170

Résultats 


l’expression. Ces premiers résultats montrant une interconnexion entre les régulateurs globaux 

CRP et Fis devront être confirmés chez E. chrysanthemi. 

Figure R4 : Expression de la fusion transcriptionnelle impliquant la région régulatrice du 

gène fis d’E chrysanthemi portée sur le plasmide pNB4 (Bardonnet et Blanco, 1992). 

L’activité spécifique β-glucuronidase est exprimée en nmoles de p-nitrophenol produit par 

minute par mg de poids sec bactérien. 

171

Résultats 


Figure R5 : Absence de fixation de Fis et de CRP sur la région promotrice du gène crp d’E. 

chrysanthemi. Ces expériences d’empreintes à la DNAse I ont été réalisées comme décrit dans les 

deux articles précédents. La région d’ADN utilisée comprend les bases localisées de –140 à +293 

(position de l’ATG) par rapport au point d’initiation de transcription du gène crp (Reverchon et 

al., 1997). 

172

Résultats 


Tableau R1 : Souches bactériennes, plasmides et oligonucléotides utilisés dans ce travail. 

Souches / Plasmides Génotype / Description (a) Référence ou source 

/ Oligonucléotides 

Escherichia coli 

CHS50 ara ∆(lac pro)thi rpsL Miller, 1972 

CHS50 ∆fis ara ∆(lac pro)thi rpsL ∆fis Koch et al., 1988 

CHS50 ∆crp ara ∆(lac pro)thi rpsL ∆crp Gonzalez-Gil et al., 1998 


A350 lmrT(con) lacZ2 Hugouvieux-Cotte-Pattat 

and Robert-Baudouy, 1985 

A4374 lmrT(con) lacZ2 fis::Cm Ce travail 

A4549 lmrT(con) lacZ2 , crp::uidA -Km Reverchon et al., 1997 

A4550 lmrT(con) lacZ2 fis::Cm, crp::uidA-Km Ce travail 

A4591 lmrT(con) lacZ2 pecT::uidA-Km Surgey et al., 1996 

A4592 lmrT(con) lacZ2 fis::Cm, pecT::uidA-Km Ce travail 

A4606 lmrT(con) lacZ2 kdgR::uidA-Km Ce travail 

A4607 lmrT(con) lacZ2 fis::Cm, kdgR::uidA-Km Ce travail 

Plasmides 

pTL7 pGEM-T avec les 433 pb contenant la région régulatrice de crp 

(de -140 à +293 pb (ATG) par rapport au point +1 de transcription) Ce travail 

pTL8 pBluescript, Ap r (Stratagene) avec la region codante de kdgR 

contenant la cassette uidA-Km insérée dans le site HpaI 

Ce travail 

pNB4 vecteur de clonage, Ap r uidA Bardonnet and Blanco, 

1992 

pNB4fis pNB4 avec les 442 pb contenant la région régulatrice de fis issue 

du pTL1 (Lautier et Nasser, 2007) 

Ce travail 

Oligonucléotides 

AW158 5’-TGACCACCCAGCCATCCTTC-3’ Applied Biosystems 

crp qPCRf 5’-AAACAGACCCGACTCTCGAA-3’ Ce travail 

crp qPCRr 5’-ACTGCGTTCCTGACCATCTT-3’ Ce travail 

DM152 5’-CATGTCAAATTTCACTGCTTCATCC-3’ Applied Biosystems 

hns qPCRf 5’-GCGAAGCACTTAAGATTCTAAACA-3’ Ce travail 

hns qPCRr 5’-CTTTACCGGCAACTTTGCTT-3’ Ce travail 

kdgR qPCRf 5’-TAAACAACCCGATTCCGTGT-3’ Ce travail 

kdgR qPCRr 5’-GCGGATCAGATCAACGTTCT-3’ Ce travail 

pecS qPCRf 5’-GGCACGCTACCTGGAAGTAT-3’ Ce travail 

pecS qPCRr 5’-TGTTGATCATCAGTGCGTTG-3’ Ce travail 

pecT qPCRf 5’-ATACAAGTCGCCCTGTCCTC-3’ Ce travail 

pecT qPCRr 5’-AGGCCTCATCGTTAAACTGC-3’ Ce travail 

pir qPCRf 5’-CATTGATGACGAGGGAAAGG-3’ Ce travail 

pir qPCRr 5’-CCGATAGCGATGAACTTGGT-3’ Ce travail 

RR crp deb 5’-CTGCATAAGTTTGCCCTCAA-3’ Ce travail 

RR crp fin 5’-TTCGAGAGTCGGGTCTGTTT-3’ Ce travail 

rsmA qPCRf 5’-GAGTTGGCGAAACCCTCAT-3’ Ce travail 

rsmA qPCRr 5’-GCTGAGACTTCTCTGCCTGAA-3’ Ce travail 

a Les génotypes sont donnés en utilisant les critères définis par Berlyn (1998). lmrT(con) indique que le système de 

transport du mélibiose, du lactose et du raffinose codé par le gène lmrT, est constitutivement exprimé dans la souche. 

Résistances aux antibiotiques : kanamycine (Km), chloramphenicol (Cm), ampicilline (Ap), streptomycine (Sm). 

173

Conclusion et perspectives 

CONCLUSION ET PERSPECTIVES 

La coordination de la synthèse des facteurs de virulence chez les agents pathogènes est 

un prérequis pour conduire une infection appropriée de l’hôte. La régulation en fonction du 

nombre de cellules est un des mécanismes les plus utilisés par les agents pathogènes pour 

satisfaire cette exigence. La densité cellulaire ou « quorum sensing » est généralement le 

mécanisme de ce type de régulation le plus décrit dans la littérature (Burr et al., 2006 ; Lenz 

and Bassler, 2007 ; Deziel et al., 2005). Contrairement aux observations faites chez des 

bactéries taxonomiquement proches telle qu’Erwinia carotovora (Burr et al., 2006), ce 

mécanisme ne semble pas jouer un rôle prépondérant chez Erwinia chrysanthemi. En effet, 

l’inactivation des gènes d’E. chrysanthemi impliqués dans la synthèse des différents types de 

phéromones (expI et luxS) ne s’accompagne ni d’une perturbation significative de la synthèse 

des facteurs de virulence, ni d’une modification importante de son pouvoir pathogène (Nasser 

et al., 1998 ; Reverchon et al., résultats non publiés). 

Ce constat nous a incité à prendre en considération des mécanismes de régulation liés 

à la phase de croissance, contrôlés d’une manière générale par les protéines associées au 

nucléoïdes (NAPs). Parmi ces NAPs, Fis a particulièrement retenu notre attention en raison de 

la forte variation de sa concentration cellulaire au cours de la croissance. De plus des résultats 

parus au début de ma thèse faisaient état d’une implication de cette NAP dans la régulation 

phase de croissance-dépendante de différents facteurs de virulence, impliqués notamment 

dans les étapes précoces du processus infectieux chez les bactéries pathogènes humaines E. 

coli et S. typhimurium (Falconi et al., 2001 ; Goldberg et al., 2001 ; Kelly et al., 2004). Les 

mécanismes de ces contrôles n’ont généralement pas été clairement élucidés mais plusieurs 

hypothèses allant du contrôle direct (Kelly et al., 2004) à des mécanismes indirects mettant en 

jeu d’autres régulateurs (Kelly et al., 2005, O Croinin et al., 2006 ; Lenz et al., 2007) ou via 

une action sur l’organisation structurale des régions régulatrices des gènes de virulence (O 

Croinin et al., 2006) ont été avancées. 

Nous montrons dans ce travail que, chez E. chrysanthemi, les étapes clés de l’infection 

sont régulées de manière coordonnée par la protéine associée au nucléoïde Fis. En effet, il s’est 

avéré que la présence de Fis est requise pour l’induction de l’expression des gènes codant les 

facteurs impliqués au début du processus infectieux. Le contrôle de la synthèse des facteurs de 

virulence impliqués dans les phases précoces de l’infection par Fis semble donc être une 

caractéristique retrouvée à la fois chez les bactéries pathogènes des animaux et des végétaux. 

174


En revanche, Fis réprime la synthèse des facteurs de propagation essentiels d’E. chrysanthemi. 

L’ensemble des résultats obtenus dans le cadre de ma thèse permet de proposer un modèle de 

l’action de Fis au cours des différentes étapes du processus infectieux (Figure D1). Le pic de 

production du régulateur en début de croissance permet une stimulation de la synthèse des 

systèmes requis dans les étapes précoces de l’infection (flagelles, HrpN et système Sap) ainsi 

que les machineries de translocation des Pels. Parallèlement, Fis réprime la synthèse des 

systèmes de propagation (Pels et Cel5) afin d’éviter d’éveiller les réactions de défense de 

l’hôte. Lorsque la concentration intracellulaire du régulateur diminue dans les stades de 

croissance avancés, la synthèse des Pels et de Cel5 est déréprimée. Par ailleurs, la forte 

accumulation des systèmes de translocation des enzymes à ce stade assure un bon couplage 

entre synthèse et sécrétion des enzymes dégradatives. Il s’en suit une attaque brusque de l’hôte 

qui n’a pas, dans ces conditions, le temps de mettre en place efficacement ses réactions de 

défense. 

175


Figure D1 : Modèle du mécanisme d’action de Fis dans le contrôle de la production de 

différents types de facteurs de virulence au cours de la croissance bactérienne. 

Des points restent toutefois à éclaircir avant de comprendre parfaitement les 

mécanismes de contrôle de la virulence par Fis chez E. chrysanthemi. Par exemple, le mutant 

fis d’E. chrysanthemi s’est révélé être avirulent lorsque les tests d’infection sont réalisés sur 

des organes végétaux non blessés alors que sur des organes blessés, il présente un pouvoir 

pathogène atténué. Ce constat conforte l’implication de Fis dans la régulation de la synthèse 

de facteurs intervenants dans les phases précoces de l’infection dont certains n’ont 

vraisemblablement pas encore été identifiés. En effet, l’un des phénotypes caractéristique du 

mutant fis d’E. chrysanthemi est sa forte capacité d’agrégation dans certains milieux de 

culture liquides. Cette propriété, résultant généralement de la surproduction de structures 

impliquées dans l’adhérence des bactéries, s’est avérée être conservée dans toutes les souches 

176


double-mutantes inactivées à la fois pour le gène fis et pour un des gènes codant les différents 

facteurs de virulence étudiés. Ces éventuels systèmes d’adhésion pourraient être identifiés en 

utilisant une approche protéomique. En effet, la comparaison d’extraits contenant les 

structures de surface de la souche parentale et du mutant fis d’E. chrysanthemi sur gel de 

polyacrylamide a révélé la présence de protéines additionnelles dans les extraits du mutant fis 

(Figure D2). 

Figure D2 : Extraits de surnageants de cultures de la souche parentale et du mutant fis d’E. 

chrysanthemi analysés sur gel de polyacrylamide. Les protéines surproduites dans le mutant 

fis sont indiquées par des flèches. 

Ces protéines seront purifiées et caractérisées par MALDI-TOF, les gènes 

correspondants seront inactivés et leurs effets sur le pouvoir pathogène d’E. chrysanthemi 

évalués. Les structures de surface régulées par Fis pourront également être recherchées en 

caractérisant les gènes codant des structures similaires mise en évidence dans des bactéries 

taxonomiquement proches. Le gène hecA, codant une adhésine chez la souche d’E. 

chrysanthemi EC16 (Rojas et al., 2002) est un candidat de choix. Les premières tentatives en 

vue du clonage du gène de la souche de référence 3937 se sont soldées par des échecs en 

raison de difficultés rencontrées pour l’amplification du gène. 

L’expression des gènes pel est augmentée le long de la croissance dans le mutant fis 

avec toutefois un effet beaucoup plus marqué en début de phase exponentielle. Le mécanisme 

de la régulation de l’expression de ces gènes par Fis en phase plateau n’a pas encore été 

totalement clarifié. Dans le deuxième article, il a été suggéré que ce contrôle pourrait se faire 

via un mécanisme direct par la faible quantité cellulaire de Fis. Cette hypothèse repose sur la 

relative forte affinité de Fis pour les régions promotrices des gènes pel. Cependant, les 

résultats obtenus sur le réseau de régulation suggèrent que le contrôle en phase plateau 

pourrait se faire également via un mécanisme indirect mettant en jeu certains régulateurs du 

177


réseau, notamment le répresseur PecT. Enfin, une troisième hypothèse pouvant expliquer 

l’effet de Fis sur l’expression des gènes pel en phase plateau serait une structuration différente 

des régions régulatrices de ces gènes dans le mutant fis et la souche parentale. Cette hypothèse 

est confortée par des résultats préliminaires non présentés qui ont montré que l’expression des 

gènes pel est modulée par l’état d’enroulement de l’ADN (expression in vitro plus forte sur 

plasmide superenroulé par rapport au même plasmide linéarisé). 

La première hypothèse pourra être vérifiée par des expériences d’immunoprécipitation 

de la chromatine suivie d’une quantification par RT-PCR de la quantité des gènes pel 

complexés à Fis à différents stades de la croissance. La deuxième possibilité de contrôle 

pourra être appréciée en comparant la quantité de transcrits des gènes pel en absence de Fis à 

celle observée dans les mutants doubles impliquant fis et chacun des régulateurs cibles de Fis. 

Par exemple dans le cas de PecT, il s’agira de quantifier les transcrits des gènes pel dans la 

souche parentale, les mutants simples fis et pecT et dans le double mutant fis-pecT. Il serait 

également informatif d’analyser l’effet des régulateurs du réseau précédemment caractérisés 

sur l’expression du gène fis et de poursuivre l’étude des mécanismes de signalisation agissant 

sur l’expression de ce gène en s’intéressant notamment au nucléotide modifié ppGpp, connu 

pour agir chez E. coli sur la concentration intracellulaire de Fis (Ninnemann et al., 1992). Ces 

investigations permettront de situer précisement le niveau d’action de Fis dans le réseau de 

régulation. La troisième hypothèse, l’implication de Fis dans l’organisation structurale des 

promoteurs des gènes pel, pourra être analysée en adoptant une double approche in vivo et in 

vitro. In vivo, il s’agira de comparer, à l’aide de la RT-PCR quantitative, l’expression des 

gènes pel obtenue dans les conditions standard de croissance à celle obtenue dans les 

conditions altérant l’état d’enroulement de l’ADN aussi bien dans la souche parentale que 

dans le mutant fis. Une évolution différente de l’expression génique dans la souche parentale 

et dans le mutant fis après ajout des composés altérant la structuration du chromosome serait 

la preuve de l’implication de Fis dans ce mécanisme. Ces expériences pourront être 

complétées par des travaux similaires réalisés sur la souche parentale et une souche dérivée 

comportant des gènes pel inactivés au niveau de leur(s) site(s) de fixation de Fis. Les 

constructions ont déjà été réalisées pour les gènes pelD et pelE. En plus de l’avantage de 

s’affranchir de l’effet pléiotropique du mutant fis, cette dernière approche permettra de 

vérifier si l’implication éventuelle de Fis dans ce mécanisme de régulation se fait par une 

action directe ou non. In vitro, des expériences de transcription pourront être réalisées avec 

des matrices d’ADN ayant des niveaux d’enroulement différents en présence et en absence de 

Fis. 

178


Pour le cas où ces différents travaux ne permettraient pas de clarifier totalement la 

régulation phase de croissance-dépendante s’exerçant sur les gènes pel, la recherche de 

nouvelles protéines régulatrices impliquées directement dans ce contrôle pourra être 

entreprise en privilégiant une approche biochimique. Elle consistera à identifier dans des 

extraits de cultures d’E. chrysanthemi à différents stades de la croissance, des protéines 

susceptibles d’interagir spécifiquement avec les régions régulatrices des gènes pel. Les 

régulateurs dont l’activité est liée à la phase de croissance seront caractérisés. Une telle 

démarche devrait aboutir à l’identification de nouvelles protéines contrôlant la régulation par 

la phase de croissance s’exerçant sur l’expression des gènes pel. 

Si la caractérisation des régulateurs transcriptionnels s’avère insuffisante pour 

expliquer la régulation phase de croissance-dépendante des gènes pel, les études pourraient 

être étendues au contrôle post transcriptionnel en privilégiant les mécanismes décrits chez des 

bactéries taxonomiquement proches telle qu’E. carotovora. En effet, chez cette dernière, 

RsmA est impliqué dans la régulation phase de croissance-dépendante des enzymes 

extracellulaires en favorisant en début de croissance à la fois la dégradation des ARNs des 

gènes codant les enzymes extracellulaires et le système de signalisation de type « quorumsensing 

» ExpI-ExpR (Liu et al., 1998). 

Enfin, ces études ont révélé une discordance entre le profil d’expression des gènes pel 

dans le mutant fis et celui de l’activité Pel obtenu dans les surnageants de culture de cette 

souche. Cette discordance serait due à un défaut de la translocation des Pels dans le milieu 

extracellulaire dans le mutant fis. Les acteurs responsables de ce défaut de translocation 

pourront être identifiés en analysant l’expression des systèmes impliqués (systèmes Sec et Out 

et les constituants de la membrane externe) dans les expériences de RT-PCR quantitative ou 

de protéomique précédemment indiquées. 

Le contrôle de Fis sur les autres facteurs de virulence laisse également présager la 

mise en œuvre de mécanismes indirects comme précédemment indiqué. A plus long terme, 

ces circuits pourront être clarifiés par une approche globale de transcriptomique en adoptant 

une stratégie similaire à celle mentionnée pour les gènes pel. En effet, la comparaison à 

différents stades de croissance (début de phase exponentielle et phase stationnaire) du profil 

d’expression de la souche parentale et de sa dérivée fis dans des conditions de culture standard 

ou favorisant une altération structurale du génome (par exemple présence de substance 

agissant sur la gyrase ou les topoisomérases) devrait permettre d’identifier les cibles de Fis et 

de distinguer celles dont l’expression dépend fortement de l’organisation structurale de 

l’ADN de celles dont l’expression n’en dépend que modérément. Une attention particulière 

179


sera portée sur les gènes codant des facteurs de virulence avérés ou potentiels. Cette approche 

permettra également d’apprécier l’implication de Fis dans la régulation dépendant de 

l’organisation structurale de l’ADN des gènes d’intérêt. De plus, la caractérisation des 

régulateurs différentiellements exprimés non encore étudiés pourrait permettre l’identification 

de protéines additionnelles servant de relais à Fis pour le contrôle de l’expression de certains 

gènes de virulence. Une approche similaire a été récemment utilisée pour identifier, chez E. 

coli, les gènes régulés par Fis et l’état d’enroulement de l’ADN (Blot et al., 2006). 

Ces différentes investigations devraient permettre de satisfaire totalement l’objectif de 

cette thèse qui était d’élucider les mécanismes de la régulation de la synthèse des facteurs de 

virulence par la phase de croissance. L’intégration de l’action des différents acteurs impliqués 

dans ce contrôle au réseau de régulation précédemment caractérisé devrait permettre de 

comprendre comment la bactérie perçoit les signaux provenant de l’environnement et 

comment, en retour, elle adapte la synthèse de ses facteurs de virulence. De telles 

connaissances pourraient favoriser l’identification de nouveaux agents interférant avec le 

pouvoir pathogène d’E. chrysanthemi. Enfin, comme présenté dans la partie bibliographique et 

conforté par les résultats des travaux de ma thèse, les facteurs de virulence ainsi que les 

mécanismes utilisés pour réguler leur synthèse sont similaires chez les pathogènes des animaux 

et des végétaux. Les résultats obtenus sur E. chrysanthemi pourraient donc être étendus à un 

grand nombre de bactéries pathogènes. 

180

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THESE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON 

NOM : LAUTIER DATE de SOUTENANCE : 

Prénoms : Thomas 20 décembre 2007 

TITRE : Rôle de la protéine associée au nucléoïde Fis dans le contrôle de la virulence chez la 

bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi. 

NATURE : Doctorat 

Numéro d'ordre : 2007-ISAL-0116 

Ecole doctorale : Evolution, Ecosystème, Microbiologie, Modélisation 

Spécialité : Microbiologie 

Cote B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 ---- CLASSE :---- 

RESUME : 

Erwinia chrysanthemi est une entérobactérie phytopathogène responsable de la pourriture molle et 

qui engendre des pertes économiques importantes sur différentes plantes. Une colonisation efficace de 

l’hôte requiert l’action séquentielle de plusieurs facteurs de virulence. Certains de ces facteurs sont 

essentiellement requis dans les étapes précoces du processus infectieux tels que la harpine HrpN, le 

système de détoxification Sap ou les flagelles assurant la mobilité bactérienne. D’autres agissent par 

contre dans les étapes tardives du processus tels que les enzymes dégradatives. Parmi ces enzymes, les 

pectate lyases (Pels) jouent un rôle déterminant dans le pouvoir pathogène, en raison de leur capacité à 

reproduire le symptôme de pourriture molle. La synthèse des facteurs de virulence est finement 

régulée pour conduire une infection efficace. 

L’essentiel des travaux de cette thèse a consisté à caractériser le rôle de la protéine associée au 

nucléoïde Fis dans le contrôle de la virulence chez E. chrysanthemi. 

Un mutant fis présente une synthèse diminuée des facteurs de virulence impliqués dans les étapes 

précoces de l’infection (flagelles, harpine et système de détoxification). De plus, l’induction de 

l’activité pectate lyase est retardée et augmente durant la phase stationnaire de croissance dans le 

mutant fis. Le contrôle exercé par Fis sur l’expression des gènes codant ces facteurs se fait par un 

mécanisme direct. In planta, le mutant fis présente une virulence atténuée qui serait le résultat de la 

modification du profil de synthèse des facteurs de virulence. 

Le mécanisme moléculaire de la régulation exercée par Fis a été étudié plus en détail sur les gènes 

pel dont l’expression est modulée par un grand nombre de régulateurs (8 sont déjà caractérisés). Une 

étude intégrative réalisée en adoptant une double approche in vivo et in vitro a montré que Fis réprime 

directement l’expression des gènes pel au niveau de l’initiation de la transcription. Dans certaines 

conditions, Fis agit de concert avec KdgR, un autre répresseur essentiel, pour verrouiller l’expression 

des gènes pel. 

L’ensemble de ces données met en évidence un rôle pivot de Fis dans la coordination de l’expression 

des principaux gènes de virulence d’E. chrysanthemi au cours du processus infectieux. 

MOTS-CLES : Bactérie phytopathogène / Fis / gènes de virulence / régulation de la transcription / 

Erwinia chrysanthemi. 

Laboratoire de recherche : 

Microbiologie, Adaptation et Pathogénie, UMR 5240 CNRS-UCBL-INSA-BayerCropScience, 

Domaine Scientifique de la Doua, Université Lyon 1, Bat. André Lwoff, 10 rue Raphaël Dubois, 

69622 Villeurbanne Cedex France 

Composition du jury : 

Mr Carlos BLANCO, Professeur à l’Université de Rennes I, Rapporteur 

Mr Claude GUTIERREZ, Professeur à l’Université Toulouse III, Rapporteur 

Mr Hafid ABAIBOU, Responsable Senior R&D, Biomérieux, Examinateur 

Mr Philippe LEJEUNE, Professeur à l’INSA de Lyon, Examinateur 

Mme Marie-Andrée MANDRAND-BERTHELOT, Directeur de Recherche CNRS, Examinateur 

Mr William NASSER, Directeur de Recherche CNRS, Directeur de thèse 

200

Rôle de la protéine associée au nucléoïde Fis dans le contrôle de la ...

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