Rôle de la protéine associée au nucléoïde Fis dans le contrôle de la ...
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N° d’ordre : 2007-ISAL-0116 Année 2007<br />
Thèse<br />
<strong>Rô<strong>le</strong></strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> <strong>associée</strong> <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong> <strong>Fis</strong><br />
<strong>dans</strong> <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce<br />
chez <strong>la</strong> bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi.<br />
présentée <strong>de</strong>vant<br />
L’Institut National <strong>de</strong>s Sciences Appliquées <strong>de</strong> Lyon<br />
pour obtenir<br />
<strong>le</strong> gra<strong>de</strong> <strong>de</strong> Docteur<br />
Eco<strong>le</strong> doctora<strong>le</strong> : Evolution, Ecosystème, Microbiologie, Modélisation<br />
Spécialité : Microbiologie<br />
par<br />
Thomas LAUTIER<br />
Soutenue publiquement <strong>le</strong> jeudi 20 décembre 2007 <strong>de</strong>vant <strong>la</strong> Commission d’examen<br />
JURY<br />
Mr Carlos BLANCO, Professeur à l’Université <strong>de</strong> Rennes I,<br />
Rapporteur<br />
Mr C<strong>la</strong>u<strong>de</strong> GUTIERREZ, Professeur à l’Université Toulouse III,<br />
Rapporteur<br />
Mr Hafid ABAIBOU, Responsab<strong>le</strong> Senior R&D, Biomérieux,<br />
Examinateur<br />
Mr Philippe LEJEUNE, Professeur à l’INSA <strong>de</strong> Lyon,<br />
Examinateur<br />
Mme Marie-Andrée MANDRAND-BERTHELOT, Directeur <strong>de</strong> Recherche CNRS, Examinateur<br />
Mr William NASSER, Directeur <strong>de</strong> Recherche CNRS,<br />
Directeur <strong>de</strong> thèse<br />
1
INSA Direction <strong>de</strong> <strong>la</strong> Recherche - Eco<strong>le</strong>s Doctora<strong>le</strong>s 2007<br />
SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE<br />
CHIMIE<br />
E.E.A.<br />
E2M2<br />
EDIIS<br />
EDISS<br />
Math IF<br />
MEGA<br />
SSED<br />
CHIMIE DE LYON<br />
http://sakura.cpe.fr/ED206<br />
M. Jean Marc LANCELIN<br />
Insa : R. GOURDON<br />
ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE,<br />
AUTOMATIQUE<br />
http://www.insa-lyon.fr/eea<br />
M. A<strong>la</strong>in NICOLAS<br />
Insa : D. BARBIER<br />
e<strong>de</strong>2a@insa-lyon.fr<br />
Secrétariat : M. LABOUNE<br />
AM. 64.43 – Fax : 64.54<br />
EVOLUTION, ECOSYSTEME,<br />
MICROBIOLOGIE, MODELISATION<br />
http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2<br />
M. Jean-Pierre FLANDROIS<br />
INSA : H. CHARLES<br />
INFORMATIQUE ET INFORMATION<br />
POUR LA SOCIETE<br />
http://ediis.univ-lyon1.fr<br />
M. A<strong>la</strong>in MILLE<br />
Secrétariat : I. BUISSON<br />
INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTE<br />
M. Didier REVEL<br />
Insa : M. LAGARDE<br />
MATERIAUX DE LYON<br />
M. Jean Marc PELLETIER<br />
Secrétariat : C. BERNAVON<br />
83.85<br />
MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE<br />
FONDAMENTALE<br />
M. Pascal KOIRAN<br />
Insa : G. BAYADA<br />
MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE<br />
CIVIL, ACOUSTIQUE<br />
M. Jean Louis GUYADER<br />
Secrétariat : M. LABOUNE<br />
PM : 71.70 –Fax : 87.12<br />
SCIENCES DES SOCIETES, DE<br />
L’ENVIRONNEMENT ET DU DROIT<br />
Mme C<strong>la</strong>u<strong>de</strong>-Isabel<strong>le</strong> BRELOT<br />
Insa : J.Y. TOUSSAINT<br />
M. Jean Marc LANCELIN<br />
Université C<strong>la</strong>u<strong>de</strong> Bernard Lyon 1<br />
Bât CPE<br />
43 bd du 11 novembre 1918<br />
69622 VILLEURBANNE Ce<strong>de</strong>x<br />
Tél : 04.72.43 13 95 Fax :<br />
<strong>la</strong>ncelin@hikari.cpe.fr<br />
M. A<strong>la</strong>in NICOLAS<br />
Eco<strong>le</strong> Centra<strong>le</strong> <strong>de</strong> Lyon<br />
Bâtiment H9<br />
36 avenue Guy <strong>de</strong> Collongue<br />
69134 ECULLY<br />
Tél : 04.72.18 60 97 Fax : 04 78 43 37 17<br />
eea@ec-lyon.fr<br />
Secrétariat : M.C. HAVGOUDOUKIAN<br />
M. Jean-Pierre FLANDROIS<br />
CNRS UMR 5558<br />
Université C<strong>la</strong>u<strong>de</strong> Bernard Lyon 1<br />
Bât G. Men<strong>de</strong>l<br />
43 bd du 11 novembre 1918<br />
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Tél : 04.26 23 59 50 Fax 04 26 23 59 49<br />
06 07 53 89 13<br />
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M. A<strong>la</strong>in MILLE<br />
Université C<strong>la</strong>u<strong>de</strong> Bernard Lyon 1<br />
LIRIS - EDIIS<br />
Bâtiment N<strong>au</strong>tibus<br />
43 bd du 11 novembre 1918<br />
69622 VILLEURBANNE Ce<strong>de</strong>x<br />
Tél : 04.72. 44 82 94 Fax 04 72 44 80 53<br />
ediis@liris.cnrs.fr - a<strong>la</strong>in.mil<strong>le</strong>@liris.cnrs.fr<br />
M. Didier REVEL<br />
Hôpital Cardiologique <strong>de</strong> Lyon<br />
Bâtiment Central<br />
28 Avenue Doyen Lépine<br />
69500 BRON<br />
Tél : 04.72.35 72 32 Fax :<br />
Didier.revel@creatis.uni-lyon1.fr<br />
M. Jean Marc PELLETIER<br />
INSA <strong>de</strong> Lyon<br />
MATEIS<br />
Bâtiment B<strong>la</strong>ise Pascal<br />
7 avenue Jean Capel<strong>le</strong><br />
69621 VILLEURBANNE Cé<strong>de</strong>x<br />
Tél : 04.72.43 83 18 Fax 04 72 43 85 28<br />
Jean-marc.Pel<strong>le</strong>tier@insa-lyon.fr<br />
M.Pascal KOIRAN<br />
Eco<strong>le</strong> Norma<strong>le</strong> Supérieure <strong>de</strong> Lyon<br />
46 allée d’Italie<br />
69364 LYON Cé<strong>de</strong>x 07<br />
Tél : 04.72.72 84 81 Fax : 04 72 72 89 69<br />
Pascal.koiran@ens-lyon.fr<br />
Secrétariat : Fatine Latif - <strong>la</strong>tif@math.univ-lyon1.fr<br />
M. Jean Louis GUYADER<br />
INSA <strong>de</strong> Lyon<br />
Laboratoire <strong>de</strong> Vibrations et Acoustique<br />
Bâtiment Antoine <strong>de</strong> Saint Exupéry<br />
25 bis avenue Jean Capel<strong>le</strong><br />
69621 VILLEURBANNE Ce<strong>de</strong>x<br />
Tél :04.72.18.71.70 Fax : 04 72 18 87 12<br />
mega@lva.insa-lyon.fr<br />
Mme C<strong>la</strong>u<strong>de</strong>-Isabel<strong>le</strong> BRELOT<br />
Université Lyon 2<br />
86 rue Pasteur<br />
69365 LYON Ce<strong>de</strong>x 07<br />
Tél : 04.78.69.72.76 Fax : 04.37.28.04.48<br />
C<strong>la</strong>u<strong>de</strong>-isabel<strong>le</strong>.brelot@univ-lyon2.fr<br />
3
SOMMAIRE<br />
Remerciements _____________________________________________________________ 6<br />
Liste <strong>de</strong>s figures et tab<strong>le</strong><strong>au</strong>x___________________________________________________ 8<br />
Abréviations ______________________________________________________________ 11<br />
Résumé __________________________________________________________________ 14<br />
Summary_________________________________________________________________ 15<br />
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE ______________________________________ 16<br />
I Les interactions hôte-pathogène ___________________________________________ 16<br />
IA Définir un pathogène ____________________________________________________________ 16<br />
IB Les facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce : acteurs molécu<strong>la</strong>ires <strong>de</strong> <strong>la</strong> pathogénie__________________________ 19<br />
I.B.1 Les facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce précoces _____________________________________________ 21<br />
I.B.1.1 La mobilité __________________________________________________________ 21<br />
I.B.1.2 L’adhérence _________________________________________________________ 24<br />
I.B.1.2.a Les adhésines ______________________________________________________ 24<br />
I.B.1.2.b Les lipopolysacchari<strong>de</strong>s ______________________________________________ 25<br />
I.B.1.2.c Les exopolysacchari<strong>de</strong>s_______________________________________________ 27<br />
I.B.1.2.d Les f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s _______________________________________________________ 27<br />
I.B.1.3 Les harpines _________________________________________________________ 27<br />
I.B.2 Les facteurs <strong>de</strong> propagation __________________________________________________ 28<br />
I.B.2.1 Les enzymes dégradatives <strong>de</strong>s bactéries pathogènes <strong>de</strong>s anim<strong>au</strong>x ________________ 28<br />
I.B.2.2 Les enzymes dégradatives <strong>de</strong>s bactéries phytopathogènes ______________________ 29<br />
I.B.2.3 Les toxines __________________________________________________________ 30<br />
I.B.2.3.a Exotoxines_________________________________________________________ 30<br />
I.B.2.3.b Endotoxines _______________________________________________________ 31<br />
IC Résistance <strong>au</strong>x systèmes <strong>de</strong> défenses <strong>de</strong> l’hôte ________________________________________ 32<br />
I.C.1 Défenses <strong>de</strong>s anim<strong>au</strong>x ______________________________________________________ 32<br />
I.C.2 Réactions <strong>de</strong> défenses <strong>de</strong>s p<strong>la</strong>ntes _____________________________________________ 32<br />
I.C.2.1 La réaction hypersensib<strong>le</strong>, induite par <strong>le</strong> stress oxydant________________________ 32<br />
I.C.2.2 Les systèmes <strong>de</strong> défenses contre <strong>le</strong> stress oxydant ____________________________ 35<br />
ID Conclusion sur <strong>le</strong>s intéractions hôte-pathogène ________________________________________ 37<br />
II Régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’expression génique chez <strong>le</strong>s procaryotes _______________________ 37<br />
IIA Au nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription ________________________________________ 37<br />
II.A.1 L’ARN polymérase est l’élément central <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription _________________________ 37<br />
II.A.1.1 L’enzyme core, <strong>la</strong> partie catalytique <strong>de</strong> l’ARN polymerase _____________________ 38<br />
II.A.1.2 La région promotrice : à <strong>la</strong> fois structurée et modu<strong>la</strong>ire ________________________ 39<br />
II.A.1.3 Les étapes <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription _________________________________ 41<br />
II.A.2 La régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription ___________________________________ 44<br />
II.A.2.1 Les acteurs __________________________________________________________ 44<br />
II.A.2.1.a Les facteurs sigma : acteurs <strong>de</strong> <strong>la</strong> reconnaissance <strong>de</strong>s promoteurs _____________ 44<br />
II.A.2.1.a.i La sous-unité sigma (σ) __________________________________________ 44<br />
II.A.2.1.a.ii Les facteurs σ impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> transcription <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce ______ 45<br />
II.A.2.1.a.iii Régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’activité <strong>de</strong>s facteurs sigma __________________________ 47<br />
II.A.2.1.b Les petits ligands___________________________________________________ 47<br />
II.A.2.1.c Les facteurs <strong>de</strong> transcription __________________________________________ 48<br />
II.A.2.1.c.i Les activateurs _________________________________________________ 49<br />
II.A.2.1.c.ii Les répresseurs ________________________________________________ 51<br />
II.A.3 La chromatine bactérienne a une organisation dynamique___________________________ 53<br />
II.A.3.1 Les « Nuc<strong>le</strong>oid Associated Proteins » (NAP) ________________________________ 56<br />
II.A.3.1.a Les principa<strong>le</strong>s NAP impliquées <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce ____________ 59<br />
II.A.3.1.a.i H-NS_________________________________________________________ 59<br />
II.A.3.1.a.ii <strong>Fis</strong> __________________________________________________________ 61<br />
II.A.3.1.a.iii IHF _________________________________________________________ 62<br />
II.A.3.1.a.iv HU _________________________________________________________ 62<br />
4
II.A.4 Dynamique <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion ____________________________________________________ 63<br />
II.A.4.1 Un régu<strong>la</strong>teur spécifique couplé à un régu<strong>la</strong>teur général _______________________ 63<br />
II.A.4.2 Connexion entre régu<strong>la</strong>teurs : rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion génétique ___________________ 67<br />
II.A.4.3 La régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce est un processus comp<strong>le</strong>xe. ___ 68<br />
IIB Autres mécanismes <strong>de</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse protéique chez <strong>le</strong>s procaryotes __________ 68<br />
III Erwinia chrysanthemi, une bactérie phytopathogène _________________________ 71<br />
IIIA Taxonomie <strong>de</strong>s Erwiniae_______________________________________________________ 71<br />
IIIB Distribution géographique______________________________________________________ 72<br />
IIIC Le pouvoir pathogène d’E. chrysanthemi __________________________________________ 74<br />
III.C.1 Un pouvoir pathogène multifactoriel_________________________________________ 75<br />
III.C.1.1 La paroi végéta<strong>le</strong> et <strong>la</strong> pectine____________________________________________ 77<br />
III.C.1.2 Les pectinases, facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce majeurs chez E. chrysanthemi ______________ 78<br />
III.C.1.2.a Les pectine estérases________________________________________________ 80<br />
III.C.1.2.b Les dépolymérases _________________________________________________ 81<br />
III.C.1.2.c Les endo-pectate lyases : déterminantes <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir pathogène ___________ 82<br />
III.C.1.2.d Organisation génétique <strong>de</strong>s pectinases __________________________________ 84<br />
IIID Régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> dégradation <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine chez Erwinia chrysanthemi ___________________ 85<br />
III.D.1 Inductions par <strong>le</strong>s composés végét<strong>au</strong>x________________________________________ 85<br />
III.D.1.1 Le répresseur KdgR ___________________________________________________ 85<br />
III.D.1.2 Le régu<strong>la</strong>teur Pir ______________________________________________________ 87<br />
III.D.2 La répression catabolique _________________________________________________ 87<br />
III.D.3 Régu<strong>la</strong>tion par diverses conditions physico-chimiques ___________________________ 88<br />
III.D.3.1 Osmo<strong>la</strong>rité___________________________________________________________ 88<br />
III.D.3.2 Température _________________________________________________________ 89<br />
III.D.3.3 pH _________________________________________________________________ 89<br />
III.D.3.4 Carence en fer ________________________________________________________ 89<br />
III.D.3.5 Carence en oxygène et en azote __________________________________________ 90<br />
III.D.4 Les régu<strong>la</strong>teurs répondant à <strong>de</strong>s sign<strong>au</strong>x encore inconnus_________________________ 90<br />
III.D.4.1 PecS _______________________________________________________________ 91<br />
III.D.4.2 PecT _______________________________________________________________ 91<br />
III.D.4.3 H-NS_______________________________________________________________ 92<br />
III.D.5 Régu<strong>la</strong>tion en fonction <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance _______________________________ 92<br />
III.D.5.1 Sigma S_____________________________________________________________ 92<br />
III.D.5.2 Régu<strong>la</strong>tion par <strong>la</strong> <strong>de</strong>nsité cellu<strong>la</strong>ire : <strong>le</strong> quorum sensing________________________ 93<br />
III.D.6 Modu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>teurs : rése<strong>au</strong>______________________ 94<br />
Objectifs <strong>de</strong> l’étu<strong>de</strong> _________________________________________________________ 97<br />
RESULTATS _____________________________________________________________ 98<br />
er<br />
I 1 ARTICLE: La <strong>protéine</strong> <strong>associée</strong> <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong> <strong>Fis</strong> coordonne l’expression <strong>de</strong>s<br />
princip<strong>au</strong>x gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi. _____ 98<br />
eme<br />
II 2 ARTICLE : Intégration <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux sign<strong>au</strong>x essentiels modu<strong>la</strong>nt <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce <strong>au</strong><br />
nive<strong>au</strong> <strong>de</strong>s promoteurs <strong>de</strong>s gènes pel d’Erwinia chrysanthemi : un rô<strong>le</strong> pour <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
régu<strong>la</strong>tion par <strong>le</strong> phase <strong>de</strong> croissance. ____________________________________________ 132<br />
III<br />
Résultats non publiés : intégration <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s gènes pel. _<br />
_____________________________________________________________________ 166<br />
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ________________________________________ 174<br />
Références bibliographiques ________________________________________________ 181<br />
5
Remerciements<br />
Je remercie Monsieur Carlos B<strong>la</strong>nco et Monsieur C<strong>la</strong>u<strong>de</strong> Gutierrez qui ont accepté<br />
avec cordialité d’être <strong>le</strong>s rapporteurs <strong>de</strong> ce travail. J’exprime éga<strong>le</strong>ment tous mes<br />
remerciements à Madame Marie-Andrée Mandrand-Berthelot, Monsieur Hafid Abaibou et<br />
Monsieur Philippe Lejeune pour avoir accepté d’examiner ce travail.<br />
Je tiens à exprimer ma sincère reconnaissance à William Nasser pour son encadrement<br />
exemp<strong>la</strong>ire durant cette thèse. Tu m’as donné une formation <strong>au</strong>ssi bien scientifique<br />
qu’humaine d’une qualité remarquab<strong>le</strong>. Je n’espérais pas acquérir un tel bagage pour <strong>la</strong> suite<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> route. Bien sur je n’ai pas tout retenu mais peut être j’<strong>au</strong>rais appris, entre <strong>au</strong>tre, à <strong>de</strong>venir<br />
un peu plus patient…<br />
Je tiens à remercier Nico<strong>le</strong> Hugouvieux-Cotte-Pattat pour m’avoir accueilli <strong>dans</strong> <strong>le</strong><br />
<strong>la</strong>boratoire <strong>de</strong> Microbiologie, Adaptation et Pathogénie et pour avoir su être disponib<strong>le</strong> pour<br />
toutes <strong>le</strong>s questions liées à <strong>la</strong> vie <strong>dans</strong> <strong>le</strong> <strong>la</strong>boratoire.<br />
Mes remerciements vont éga<strong>le</strong>ment à Sylvie Reverchon, notamment pour répondre à<br />
certaines questions propres à <strong>la</strong> thématique « Régu<strong>la</strong>tion génique » <strong>de</strong> l’équipe « Erwinia ». Je<br />
remercie cha<strong>le</strong>ureusement V<strong>la</strong>dimir Shevchik pour sa sympathie et pour nous avoir permis<br />
d’utiliser <strong>le</strong> mutant fliC d’Erwinia chrysanthemi avant publication. La saveur <strong>de</strong> ces quatre<br />
années <strong>au</strong>rait été bien différente sans <strong>la</strong> bonne humeur <strong>de</strong> Guy Con<strong>de</strong>mine. Merci pour <strong>le</strong>s<br />
multip<strong>le</strong>s re<strong>le</strong>ctures <strong>de</strong>s différents textes et artic<strong>le</strong>s, et pour avoir répondu à toutes <strong>le</strong>s<br />
questions, <strong>au</strong>ssi bien scientifiques que s<strong>au</strong>grenues. Je tiens éga<strong>le</strong>ment à remercier Agnès<br />
Rodrigue ainsi que Françoise Meier et Corinne Dorel pour <strong>le</strong>s discussions <strong>au</strong> fil <strong>de</strong>s repas.<br />
A mi-parcours <strong>de</strong> <strong>la</strong> thèse a eu lieu <strong>le</strong> comité <strong>de</strong> pilotage. J’en remercie <strong>le</strong>s membres,<br />
Hans Geiselmann, Florence Wisniewski-Dyé, Marie-Andrée Mandrand-Berthelot et William<br />
Nasser, qui ont eu un effet significatif sur <strong>le</strong> bon dérou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> <strong>la</strong> fin <strong>de</strong> thèse. En<br />
particulier, je tiens à exprimer ma gratitu<strong>de</strong> à Marie-Andrée Mandrand-Berthelot qui a suivi<br />
avec gentil<strong>le</strong>sse ce travail.<br />
Mes remerciements amic<strong>au</strong>x vont à Georgi Muskhelishvili, C<strong>la</strong>udia Bur<strong>au</strong>, Marcel<br />
Geertz, Michael Berger, Ramesh Mavathur et Sebastian M<strong>au</strong>rer <strong>de</strong> <strong>la</strong> Jacobs University of<br />
Bremen, Al<strong>le</strong>magne. Outre <strong>le</strong> matériel biologique fourni tel que <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> <strong>Fis</strong> d’Escherichia<br />
coli, <strong>le</strong>s discussions scientifiques et <strong>le</strong>s compétences techniques acquises <strong>au</strong> cours <strong>de</strong> ce<br />
séjour, l’ambiance cha<strong>le</strong>ureuse <strong>de</strong> l’équipe a fortement contribué <strong>au</strong> bon dérou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> cette<br />
expérience nordique. Ce séjour a été possib<strong>le</strong> grâce <strong>au</strong>x participations financières <strong>de</strong> l’IFR41<br />
"Ecologie Génétique Évolution" ainsi que <strong>de</strong> <strong>la</strong> Région Rhône-Alpes <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cadre d’un projet<br />
Eurodoc.<br />
Je remercie <strong>le</strong>s étudiants du <strong>la</strong>boratoire, qui, reprenant <strong>de</strong>s phrases incontournab<strong>le</strong>s<br />
(«c’est possib<strong>le</strong> ça?»), ont été <strong>de</strong> bons collègues: Greg, Albert, Nasrin, Fred, Thierry<br />
(comment trouver un bon resto à Nap<strong>le</strong>s ?), Yann, Safia, A<strong>le</strong>ksandra, C<strong>la</strong>ire, Nan, Zhengwei,<br />
Mathil<strong>de</strong>, Camil<strong>le</strong>, Sophie et Camil<strong>le</strong> qui a participé à ce travail. A mon tour <strong>de</strong> remercier<br />
Sandra Castang, l’amie du sud-ouest, pour nos p<strong>au</strong>ses philosophiques. Je remercie éga<strong>le</strong>ment<br />
<strong>le</strong>s étudiants du <strong>la</strong>boratoire d’écologie microbienne : Mickaël, Aymeric, Denis, Joël, Arn<strong>au</strong>lt,<br />
Hervé, Marina, Sandrine,…<br />
6
Je remercie l’ensemb<strong>le</strong> du personnel technique pour <strong>le</strong> support précieux fourni mais<br />
éga<strong>le</strong>ment pour <strong>le</strong>ur bonne humeur et <strong>le</strong>urs conversations : Yvette Alfaro, Véronique<br />
Utzinger, Jean-Michel Prost, Sonia Diasparra, Christine Berger, Sandra Mebarki, Zagik<br />
Mouton-Kosem, Julie Frontier, Camil<strong>le</strong> Vil<strong>la</strong>rd et Julien Wawrzyniak. Je remercie avec toute<br />
ma sympathie Géraldine Effantin qui m’a fait sourire plus d’une fois.<br />
Je remercie amica<strong>le</strong>ment Mickaël Boyer entre <strong>au</strong>tre pour nous avoir facilité <strong>la</strong><br />
normalisation <strong>de</strong>s expériences <strong>de</strong> RT-PCR quantitative. De même, Francesca Damio<strong>la</strong> et<br />
L<strong>au</strong>rette Morlé m’ont aidé à débuter <strong>dans</strong> cette technique.<br />
Je suis re<strong>de</strong>vab<strong>le</strong> <strong>de</strong> Messieurs Falkow et Dorman pour m’avoir fait parvenir<br />
rapi<strong>de</strong>ment certains artic<strong>le</strong>s scientifiques uti<strong>le</strong>s pour <strong>la</strong> rédaction <strong>de</strong> ce manuscrit. Ce travail a<br />
été facilité par <strong>la</strong> qualité <strong>de</strong>s services administratifs <strong>de</strong> l’INSA, évitant ainsi une perte <strong>de</strong><br />
temps <strong>dans</strong> <strong>le</strong> travail <strong>de</strong> recherche. Je tiens éga<strong>le</strong>ment à souligner <strong>le</strong> travail précieux effectué<br />
par l’Association Bernard Grégory, notamment à travers <strong>la</strong> formation « Nouve<strong>au</strong> Chapitre <strong>de</strong><br />
<strong>la</strong> Thèse », qui prépare à l’après-thèse.<br />
Je remercie éga<strong>le</strong>ment P<strong>au</strong>line L<strong>au</strong>tier pour m’avoir permis <strong>de</strong> rédiger ce manuscrit<br />
<strong>dans</strong> <strong>de</strong> bonnes conditions informatiques.<br />
Je tiens éga<strong>le</strong>ment à exprimer toute ma reconnaissance <strong>au</strong> professeur P<strong>au</strong>l Ritzentha<strong>le</strong>r<br />
<strong>de</strong> l’université <strong>de</strong> Toulouse, ainsi que son équipe, en particulier Pascal Lebourgeois, pour<br />
m’avoir guidé avec gentil<strong>le</strong>sse et c<strong>la</strong>irvoyance <strong>dans</strong> ce choix lyonnais.<br />
Je remercie l’ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong> ma famil<strong>le</strong> et bel<strong>le</strong> famil<strong>le</strong>, ainsi que Matthieu et Guil<strong>la</strong>ume<br />
pour m’avoir soutenu <strong>dans</strong> tous <strong>le</strong>s moments et pour me montrer qu’Erwinia n’est pas <strong>le</strong> seul<br />
être vivant. Enfin, Déborah, je t’exprime mon entière reconnaissance, tu es une <strong>de</strong>s personnes<br />
ayant <strong>le</strong> plus contribué à <strong>la</strong> réussite <strong>de</strong> ce travail. Merci d’avoir accepté <strong>de</strong> quitter ton sudouest<br />
natal pour participer à mes côtés à cette expérience lyonnaise.<br />
7
Liste <strong>de</strong>s figures et tab<strong>le</strong><strong>au</strong>x<br />
Figures et tab<strong>le</strong><strong>au</strong>x <strong>de</strong> <strong>la</strong> partie bibliographique :<br />
Figure 1 : L’interaction entre un micro-organisme et un hôte conduit à différentes issues........ 16<br />
Figure 2 : C<strong>la</strong>ssification <strong>de</strong>s gènes impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce................................................. 20<br />
Figure 3 : Etapes du processus infectieux en fonction <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance....................... 21<br />
Figure 4 : Structure du f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong> bactérien.................................................................................... 22<br />
Figure 5 : La mobilité par l'actine utilisée par Shigel<strong>la</strong> f<strong>le</strong>xneri à l'intérieur <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s<br />
épithélia<strong>le</strong>s, nommée "rocket motility"........................................................................................ 23<br />
Figure 6 : La structure du LPS. ................................................................................................... 26<br />
Figure 7 : Réponse hypersensib<strong>le</strong> élicitée par E. chrysanthemi sur feuil<strong>le</strong> <strong>de</strong> tabac. ................. 33<br />
Figure 8 : Production <strong>de</strong> composés oxygénés activés lors d’une interaction p<strong>la</strong>nte-pathogène<br />
compatib<strong>le</strong> ou incompatib<strong>le</strong>. ........................................................................................................ 34<br />
Figure 9 : Structure <strong>de</strong> l’ARN polymérase et son interaction avec un promoteur...................... 39<br />
Figure 10 : Eléments princip<strong>au</strong>x du gène procaryote.................................................................. 39<br />
Figure 11 : Les étapes <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription bactérienne. ........................................ 43<br />
Figure 12 : Les différents types d’activateurs transcriptionnels. ................................................ 50<br />
Figure 13 : Les différents types <strong>de</strong> répresseurs transcriptionnels. .............................................. 52<br />
Figure 14 : Schéma illustrant l’effet <strong>de</strong> l’organisation spatia<strong>le</strong> du chromosome sur<br />
l’expression génique..................................................................................................................... 54<br />
Figure 15 : Effet du nive<strong>au</strong> du surenrou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> l’ADN sur l’expression <strong>de</strong>s gènes. .............. 55<br />
Figure 16 : Concentrations cellu<strong>la</strong>ires <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s H-NS, <strong>Fis</strong>, HU et IHF <strong>au</strong> cours <strong>de</strong>s<br />
différentes phases <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance bactérienne. .......................................................................... 59<br />
Figure 17 : Mo<strong>de</strong> d’action du répresseur H-NS et <strong>de</strong> l’activateur <strong>Fis</strong> en fonction <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
température sur l’expression du gène virF chez <strong>le</strong>s souches d’Escherichia coli<br />
entéroinvasives............................................................................................................................. 60<br />
Figure 18 : Les mécanismes <strong>de</strong> régualtions mettant en jeu plusieurs facteurs <strong>de</strong> transcriptions.66<br />
Figure 19 : Rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tions entre <strong>le</strong>s régu<strong>la</strong>teurs glob<strong>au</strong>x. ............................................... 67<br />
Figure 20 : Régu<strong>la</strong>tion du nive<strong>au</strong> cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> σ S en fonction <strong>de</strong>s stimuli extérieurs chez <strong>la</strong><br />
bactérie Escherichia coli. ............................................................................................................. 70<br />
Figure 21 : Distribution géographique d’Erwinia chrysanthemi. ............................................... 73<br />
Figure 22 : Symptômes c<strong>au</strong>sés par E. chrysanthemi................................................................... 74<br />
Figure 23 : La paroi végéta<strong>le</strong> et <strong>la</strong> structure biochimique <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine...................................... 77<br />
Figure 24 : La voie <strong>de</strong> dégradation et d’assimi<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine............................................. 79<br />
Figure 25 : Production <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux pectine méthyl-estérases et <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux pectine acétyl-estérases<br />
ches Erwinia chrysanthemi 3937. ............................................................................................... 80<br />
Figure 26 : Production <strong>de</strong> dépolymérases chez Erwinia chrysanthemi 3937. ........................... 81<br />
Figure 27 : <strong>Rô<strong>le</strong></strong> <strong>de</strong>s différentes pectinases <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir pathogène d’Erwinia sur<br />
Saintp<strong>au</strong>lia. .................................................................................................................................. 83<br />
Figure 28 : Organisation génétique <strong>de</strong>s pectinases. .................................................................... 84<br />
Figure 29 : Rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion contrô<strong>la</strong>nt l’expression <strong>de</strong>s gènes pel chez Erwinia<br />
chrysanthemi. ............................................................................................................................... 95<br />
Tab<strong>le</strong><strong>au</strong> 1 : Fréquence d’apparition <strong>de</strong>s nucléoti<strong>de</strong>s <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s éléments -35 et -10 du promoteur<br />
bactérien. ...................................................................................................................................... 41<br />
Tab<strong>le</strong><strong>au</strong> 2 : facteurs sigma alternatifs impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce............................................. 46<br />
Tab<strong>le</strong><strong>au</strong> 3 : Les principa<strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s <strong>associée</strong>s <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong> (NAP)......................................... 57<br />
8
Figures et tab<strong>le</strong><strong>au</strong>x <strong>de</strong> <strong>la</strong> partie résultats :<br />
1 er artic<strong>le</strong> :<br />
Fig. 1. Behaviour of the E. chrysanthemi fis mutant.................................................................... 122<br />
Fig. 2. The induction of pectate lyase activity is <strong>de</strong><strong>la</strong>yed in the supernatant of the fis mutant<br />
growth medium. ........................................................................................................................... 123<br />
Fig. 3. Expression of the fliC, hrpN, prtC, sapA and cel5 genes in the parental strain and its fis<br />
<strong>de</strong>rivative...................................................................................................................................... 124<br />
Fig. 4. Band-shift assay for <strong>Fis</strong> binding on hrpN, fliC, cel5, sapA, prtC promoter regions. ....... 125<br />
Fig. 5. <strong>Fis</strong> interacts with the cel5 downstream promoter regions and inhibits transcript<br />
elongation..................................................................................................................................... 126<br />
Fig. 6. Comparison of viru<strong>le</strong>nce between E. chrysanthemi 3937 and its various <strong>de</strong>rivatives on<br />
chicory <strong>le</strong>aves and potato tubers. ................................................................................................. 127<br />
Fig. S1.The E. chrysanthemi fis operon. .................................................................................... 128<br />
Fig. S2. <strong>Fis</strong> specifically interacts with its own regu<strong>la</strong>tory regions and represses transcription<br />
initiation by σ 70 RNAP. ............................................................................................................... 129<br />
Fig. S3. The fis operon and promoter region. .............................................................................. 130<br />
Fig. S4. Growth phase-<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt induction of pectate lyase activity in the culture supernatants of<br />
Erwinia chrysanthemi strains A350 (ps) and A4374 (fis). .......................................................... 131<br />
Tab<strong>le</strong> 1. Bacterial strains, p<strong>la</strong>smids, phages and oligonuc<strong>le</strong>oti<strong>de</strong>s used in this work. ................ 117-118<br />
2 ème artic<strong>le</strong> :<br />
Fig. 1. Time course induction of pectate lyase activity in the culture supernatants of Erwinia<br />
chrysanthemi strains A350 (ps) and A4374 (fis).......................................................................... 152<br />
Fig. 2. Bacterial-number-<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt expression of pelA::uidA, pelB::uidA, pelD::uidA and<br />
pelE::uidA in Erwinia chrysanthemi strains A350 (ps) and A4374 (fis). ................................... 153<br />
Fig. 3. Quantification of the increase in pelD and pelE gene transcript accumu<strong>la</strong>tion in the fis<br />
background using real-time PCR analysis. .................................................................................. 154<br />
Fig. 4. Band-shift assay for <strong>Fis</strong>-DNA binding. ........................................................................... 155<br />
Fig. 5. DNase I footprinting of <strong>Fis</strong>, CRP, KdgR and RNAP binding at the pelB (A), pelD (B)<br />
and pelE (C) promoters. ............................................................................................................... 156-158<br />
Fig. 6. Sequence of the pelB, pelD and pelE promoters. ............................................................ 159<br />
Fig. 7. <strong>Fis</strong> and KdgR prevent transcription initiation at the pelD (A) and pelE (B) promoters. . 160<br />
Fig. 8. Bacterial-number-<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt expression of pelB::uidA, pelD::uidA and pelE::uidA in<br />
Erwinia chrysanthemi parental strain and its fis, kdgR and kdgR-fis <strong>de</strong>rivatives. ....................... 161<br />
Fig. 9. Bacterial-number-<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt expression of the Pel SA present both in the supernatants<br />
and in the cell pel<strong>le</strong>ts in Erwinia chrysanthemi parental strain A350 and its fis <strong>de</strong>rivative<br />
A4374. .......................................................................................................................................... 162<br />
Fig. S1. Time course expression of pelA::uidA, pelB::uidA, pelD::uidA and pelE::uidA in<br />
Erwinia chrysanthemi strains A350 (ps) and A4374 (fis). .......................................................... 163<br />
Fig. S2. Time course expression of pelB::uidA, pelD::uidA and pelE::uidA in Erwinia<br />
chrysanthemi parental strain and its fis, kdgR and kdgR-fis <strong>de</strong>rivatives. ..................................... 164<br />
Fig. S3. Time course expression of the Pel SA present both in the supernatants and in the cell<br />
pel<strong>le</strong>ts in Erwinia chrysanthemi parental strain A350 and its fis <strong>de</strong>rivative A4374. .................. 165<br />
Tab<strong>le</strong> 1. Bacterial strains, p<strong>la</strong>smids, phages and oligonuc<strong>le</strong>oti<strong>de</strong>s used in this work. ................ 148-149<br />
9
Résultats non publiés :<br />
Figure R1 : Comparaison par RT-PCR quantitative <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes crp, hns, kdgR,<br />
pir, pecT et pecS <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis par rapport à <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> à différents sta<strong>de</strong>s <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
croissance et <strong>dans</strong> différents milieux <strong>de</strong> culture (LB ou LB+PGA). ........................................... 167<br />
Figure R2 : Expression <strong>de</strong>s fusions transcriptionnel<strong>le</strong>s kdgR::uidA, crp::uidA et pecT::uidA<br />
en fonction <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>nsité cellu<strong>la</strong>ire <strong>dans</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> et <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis...................... 168<br />
Figure R3 : Intégration <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s gènes pel. ................................ 169<br />
Figure R4 : Expression <strong>de</strong> <strong>la</strong> fusion transcriptionnel<strong>le</strong> impliquant <strong>la</strong> région régu<strong>la</strong>trice du<br />
gène fis d’E chrysanthemi.. .......................................................................................................... 171<br />
Figure R5 : Absence <strong>de</strong> fixation <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> et <strong>de</strong> CRP sur <strong>la</strong> région promotrice du gène crp d’E.<br />
chrysanthemi. ............................................................................................................................... 172<br />
Tab<strong>le</strong><strong>au</strong> R1 : Souches bactériennes, p<strong>la</strong>smi<strong>de</strong>s et oligonucléoti<strong>de</strong>s utilisés <strong>dans</strong> ce travail....... 173<br />
Figure <strong>de</strong> <strong>la</strong> partie discussion perspectives :<br />
Figure D1 : Modè<strong>le</strong> du mécanisme d’action <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> production <strong>de</strong><br />
différents types <strong>de</strong> facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce <strong>au</strong> cours <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance bactérienne.......................... 176<br />
Figure D2 : Extraits <strong>de</strong> surnageants <strong>de</strong> cultures <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> et du mutant fis d’E.<br />
chrysanthemi analysés sur gel <strong>de</strong> polyacry<strong>la</strong>mi<strong>de</strong>. ..................................................................... 177<br />
10
Abréviations<br />
A :<br />
aci<strong>de</strong> adénylique<br />
ABC :<br />
ATP binding cassette<br />
Acyl-HSL : N-acylhomoserine <strong>la</strong>ctone<br />
ADN :<br />
aci<strong>de</strong> désoxyribonucléique<br />
AMPc :<br />
adénosine monophosphate cyclique<br />
Ap :<br />
ampicilline<br />
Ap R :<br />
ampicillin resistance<br />
ARN :<br />
aci<strong>de</strong> ribonucléique<br />
ARNm :<br />
ARN messager<br />
ATP :<br />
adénosine triphosphate<br />
bp :<br />
paire <strong>de</strong> bases<br />
BrET:<br />
ethidium bromi<strong>de</strong><br />
C :<br />
aci<strong>de</strong> cytidylique<br />
C :<br />
<strong>Fis</strong>-DNA comp<strong>le</strong>xe<br />
CFU :<br />
colony forming units<br />
Ci :<br />
curie<br />
Cm:<br />
chloramphenicol<br />
Cm R :<br />
chloramphenicol resistance<br />
CNRS :<br />
centre national <strong>de</strong> <strong>la</strong> recherche scientifique<br />
CP :<br />
cell pel<strong>le</strong>t<br />
CRP :<br />
cyclic AMP receptor protein<br />
CTD :<br />
domaine carboxyterminal<br />
Da :<br />
dalton<br />
dATP :<br />
désoxy adénine tri-phosphate<br />
dCTP :<br />
désoxy cytosine tri-phosphate<br />
°C : <strong>de</strong>gré Celsius<br />
dI-dC :<br />
désoxyinosine-désoxycytosine<br />
DKI :<br />
5-céto-4-désoxyuronate<br />
DKII :<br />
2,5-dicéto-3-désoxugluconate<br />
DL50 : dose léta<strong>le</strong> 50<br />
DMI :<br />
dose minima<strong>le</strong> infectante<br />
DMM :<br />
dose minima<strong>le</strong> mortel<strong>le</strong><br />
DNA :<br />
aci<strong>de</strong> désoxyribonucléique<br />
DO x :<br />
<strong>de</strong>nsité optique à x nm<br />
DTT :<br />
dithiothréitol<br />
EDTA :<br />
éthy<strong>le</strong>ne diamine tétra acetate<br />
EHEC :<br />
Escherichia coli entérohémorragique<br />
EIEC :<br />
Escherichia coli entéroinvasive<br />
EPS :<br />
exopolysacchari<strong>de</strong> <strong>de</strong> surface<br />
F :<br />
free DNA<br />
<strong>Fis</strong> :<br />
factor for inversion stimu<strong>la</strong>tion<br />
G :<br />
aci<strong>de</strong> guanylique<br />
g :<br />
gramme<br />
GA :<br />
ga<strong>la</strong>cturonate<br />
GA 2 :<br />
diga<strong>la</strong>cturonate<br />
11
GA n :<br />
oligoga<strong>la</strong>cturoni<strong>de</strong>s saturés<br />
H-NS :<br />
histone-like nuc<strong>le</strong>oid structuring protein<br />
HR :<br />
réponse hypersensib<strong>le</strong><br />
HSL :<br />
homosérine <strong>la</strong>ctone<br />
HU :<br />
heat-unstab<strong>le</strong> nuc<strong>le</strong>oid protein<br />
IHF :<br />
integration host factor<br />
INSA :<br />
institut national <strong>de</strong>s sciences appliquées<br />
IPA :<br />
invasion p<strong>la</strong>smid antigens<br />
IPTG :<br />
isopropyl-beta-D-thioga<strong>la</strong>ctopyranosi<strong>de</strong><br />
kDa :<br />
kilodalton<br />
KDG :<br />
2-céto-3-désoxygluconate<br />
Km :<br />
kanamycine<br />
LB :<br />
Luria Bertani<br />
LEE :<br />
locus of enterocyte effacement<br />
LPS :<br />
lipopolysacchari<strong>de</strong><br />
M :<br />
mo<strong>la</strong>ire<br />
MALDI-TOFF : matrix assisted <strong>la</strong>ser <strong>de</strong>sorption ionization - time of flight<br />
mg :<br />
milligramme<br />
µg : microgramme<br />
MIC :<br />
minimal inhibitory concentration<br />
ml :<br />
millilitre<br />
µl : microlitre<br />
min :<br />
minute<br />
mM :<br />
millimo<strong>la</strong>ire<br />
NADPH : nicotinami<strong>de</strong> adénine dinucléoti<strong>de</strong> phosphate réduit<br />
NAP :<br />
<strong>protéine</strong>s <strong>associée</strong>s <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong><br />
ng :<br />
nanogramme<br />
nm :<br />
nanomo<strong>la</strong>ire<br />
NTD :<br />
domaine aminoterminal<br />
OD :<br />
optical <strong>de</strong>nsity<br />
OEPP :<br />
organisation européenne et méditerranéenne pour <strong>la</strong> protection <strong>de</strong>s<br />
p<strong>la</strong>ntes<br />
ONP :<br />
orthonitrophénol<br />
3-oxo-C 6 -HSL : N-(3-oxohexanoyl)-homosérine <strong>la</strong>ctone<br />
PAGE :<br />
é<strong>le</strong>ctrophorèse en gel <strong>de</strong> polyacry<strong>la</strong>mi<strong>de</strong><br />
PCR :<br />
réaction <strong>de</strong> polymérisation en chaîne<br />
Pel :<br />
pectate lyase<br />
PGA :<br />
polyga<strong>la</strong>cturonate<br />
pH :<br />
potentiel hydrogène<br />
pI :<br />
point isoé<strong>le</strong>ctrique<br />
Pir :<br />
p<strong>la</strong>nt-inducib<strong>le</strong> regu<strong>la</strong>tor<br />
PNP :<br />
paranitropnénol<br />
ppGpp :<br />
guanosine 3′,5′ bisphosphate<br />
ps :<br />
parental strain<br />
PSB :<br />
poids sec bactérien<br />
pv. :<br />
pathovar<br />
QS :<br />
quorum sensing<br />
RNA :<br />
aci<strong>de</strong> ribonucléique<br />
RNAP :<br />
RNA polymerase<br />
rpm :<br />
rotations par minute<br />
12
RT-PCR : reverse transcriptase – polymerase chain reaction<br />
s :<br />
secon<strong>de</strong><br />
SA :<br />
specific activity<br />
SDS :<br />
sodium dodécyl sulfate<br />
Sm :<br />
streptomycine<br />
SN :<br />
supernatant<br />
ssp. :<br />
sous-espèce<br />
STEC :<br />
Escherichia coli producteurs <strong>de</strong> Shiga-toxines<br />
T :<br />
aci<strong>de</strong> thymidylique<br />
TBS :<br />
Tris Buffered Saline<br />
Tris :<br />
Tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane<br />
U :<br />
units<br />
UCBL : université C<strong>la</strong>u<strong>de</strong> Bernard Lyon 1<br />
uGA 2 :<br />
diga<strong>la</strong>cturonate insaturé<br />
uGA n :<br />
oligoga<strong>la</strong>cturoni<strong>de</strong>s insaturés<br />
UMR :<br />
unité mixte <strong>de</strong> recherche<br />
UP :<br />
upstream e<strong>le</strong>ment<br />
v/v :<br />
volume to volume<br />
w/v :<br />
weight to volume<br />
13
Résumé<br />
<strong>Rô<strong>le</strong></strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> <strong>associée</strong> <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce chez <strong>la</strong><br />
bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi.<br />
Erwinia chrysanthemi est une entérobactérie phytopathogène responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
pourriture mol<strong>le</strong> et qui engendre <strong>de</strong>s pertes économiques importantes sur différentes p<strong>la</strong>ntes.<br />
Une colonisation efficace <strong>de</strong> l’hôte requiert l’action séquentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> plusieurs facteurs <strong>de</strong><br />
viru<strong>le</strong>nce. Certains <strong>de</strong> ces facteurs sont essentiel<strong>le</strong>ment requis <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s étapes précoces du<br />
processus infectieux tels que <strong>la</strong> harpine HrpN, <strong>le</strong> système <strong>de</strong> détoxification Sap ou <strong>le</strong>s<br />
f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s assurant <strong>la</strong> mobilité bactérienne. D’<strong>au</strong>tres agissent par contre <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s étapes tardives<br />
du processus tels que <strong>le</strong>s enzymes dégradatives. Parmi ces enzymes, <strong>le</strong>s pectate lyases (Pels)<br />
jouent un rô<strong>le</strong> déterminant <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir pathogène, en raison <strong>de</strong> <strong>le</strong>ur capacité à reproduire<br />
<strong>le</strong> symptôme <strong>de</strong> pourriture mol<strong>le</strong>. La synthèse <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce est finement régulée<br />
pour conduire une infection efficace.<br />
L’essentiel <strong>de</strong>s trav<strong>au</strong>x <strong>de</strong> cette thèse a consisté à caractériser <strong>le</strong> rô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>protéine</strong><br />
<strong>associée</strong> <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce chez E. chrysanthemi.<br />
Un mutant fis présente une synthèse diminuée <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce impliqués <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s<br />
étapes précoces <strong>de</strong> l’infection (f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s, harpine et système <strong>de</strong> détoxification). De plus,<br />
l’induction <strong>de</strong> l’activité pectate lyase est retardée et <strong>au</strong>gmente durant <strong>la</strong> phase stationnaire <strong>de</strong><br />
croissance <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis. Le contrô<strong>le</strong> exercé par <strong>Fis</strong> sur l’expression <strong>de</strong>s gènes codant ces<br />
facteurs se fait par un mécanisme direct. In p<strong>la</strong>nta, <strong>le</strong> mutant fis présente une viru<strong>le</strong>nce<br />
atténuée qui serait <strong>le</strong> résultat <strong>de</strong> <strong>la</strong> modification du profil <strong>de</strong> synthèse <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong><br />
viru<strong>le</strong>nce.<br />
Le mécanisme molécu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion exercée par <strong>Fis</strong> a été étudié plus en détail<br />
sur <strong>le</strong>s gènes pel dont l’expression est modulée par un grand nombre <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>teurs (8 sont<br />
déjà caractérisés). Une étu<strong>de</strong> intégrative réalisée en adoptant une doub<strong>le</strong> approche in vivo et in<br />
vitro a montré que <strong>Fis</strong> réprime directement l’expression <strong>de</strong>s gènes pel <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> l’initiation<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription. Dans certaines conditions, <strong>Fis</strong> agit <strong>de</strong> concert avec KdgR, un <strong>au</strong>tre<br />
répresseur essentiel, pour verrouil<strong>le</strong>r l’expression <strong>de</strong>s gènes pel.<br />
L’ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong> ces données met en évi<strong>de</strong>nce un rô<strong>le</strong> pivot <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>la</strong> coordination<br />
<strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s princip<strong>au</strong>x gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce d’E. chrysanthemi <strong>au</strong> cours du processus<br />
infectieux.<br />
MOTS-CLES : Bactérie phytopathogène / <strong>Fis</strong> / gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce / régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
transcription / Erwinia chrysanthemi.<br />
14
Summary<br />
Ro<strong>le</strong> of the nuc<strong>le</strong>oid associated protein <strong>Fis</strong> in the control of the viru<strong>le</strong>nce of the<br />
phytopathogenic bacteria Erwinia chrysanthemi.<br />
Erwinia chrysanthemi is a soft-rotting Gram-negative bacterium that attacks a wi<strong>de</strong><br />
range of p<strong>la</strong>nt species, including many crops of economical importance. Efficient host<br />
colonisation requires a sequential action of various viru<strong>le</strong>nce factors. Some of these factors<br />
are nee<strong>de</strong>d in the early steps of the infectious process: the harpin HrpN, the <strong>de</strong>toxification<br />
system Sap or the f<strong>la</strong>gellum, responsib<strong>le</strong> for bacterial motility. Others factors, such as<br />
<strong>de</strong>gradative enzymes, act in advanced steps of the infection. Among these enzymes, the<br />
pectate lyases (Pels) p<strong>la</strong>y a key ro<strong>le</strong> in the pathogenicity since, purified, they can reproduce<br />
the soft-rot symptoms. Production of these viru<strong>le</strong>nce factors is tightly regu<strong>la</strong>ted to allow the<br />
correct <strong>de</strong>velopment of the infectious process.<br />
The main aim of the investigations of this thesis was to evaluate the ro<strong>le</strong> of the<br />
nuc<strong>le</strong>oid associated protein <strong>Fis</strong> in the control of the viru<strong>le</strong>nce in the phytopathogenic bacteria<br />
Erwinia chrysanthemi.<br />
A fis mutant shows a reduced synthesis of the viru<strong>le</strong>nce factors involved in the early<br />
steps of infection (f<strong>la</strong>gellum, harpin and <strong>de</strong>toxification system). Moreover, induction of Pel<br />
activity is <strong>de</strong><strong>la</strong>yed and increased during the stationary growth phase in the fis mutant. <strong>Fis</strong><br />
regu<strong>la</strong>tes the expression of the genes encoding these various factors by a direct mechanism. In<br />
p<strong>la</strong>nta, the fis mutant has a <strong>de</strong>creased viru<strong>le</strong>nce, which probably results from the modification<br />
of appropriate viru<strong>le</strong>nce factors synthesis.<br />
The mo<strong>le</strong>cu<strong>la</strong>r mechanism of the <strong>Fis</strong> action has been studied in more <strong>de</strong>tail on the pel<br />
genes, which are regu<strong>la</strong>ted by at <strong>le</strong>ast eight other regu<strong>la</strong>tors. By using in vivo and in vitro<br />
integrative studies it appeared that <strong>Fis</strong> directly represses the pel gene expression at the<br />
transcription initiation step. In addition, <strong>Fis</strong> acts in concert with KdgR, the main repressor<br />
responding to the presence of pectin compounds, to shut down the pel gene transcription.<br />
Together, these data indicate that <strong>Fis</strong> p<strong>la</strong>ys a pivotal ro<strong>le</strong> in the coordination of the<br />
expression of the main viru<strong>le</strong>nce genes of E. chrysanthemi during pathogenesis.<br />
KEY WORDS : phytopathogenic bacteria / <strong>Fis</strong> / viru<strong>le</strong>nce genes / transcription regu<strong>la</strong>tion /<br />
Erwinia chrysanthemi<br />
15
Introduction bibliographique<br />
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE<br />
I<br />
IA<br />
Les interactions hôte-pathogène<br />
Définir un pathogène<br />
L’interaction entre un micro-organisme et un hôte conduit à différentes issues : neutre<br />
(micro-organisme saprophyte), bénéfique pour <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux acteurs (symbiose) ou délétère pour<br />
l’un <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux (élimination du micro-organisme ou <strong>de</strong> l’hôte). (Figure 1).<br />
Figure 1 : L’interaction entre un micro-organisme et un hôte conduit à différentes<br />
issues (d’après Casa<strong>de</strong>vall et Pirofski, 2000).<br />
Historiquement, <strong>la</strong> définition d’un micro-organisme pathogène, du grec παθογένεια<br />
«naissance <strong>de</strong> <strong>la</strong> dou<strong>le</strong>ur», est basée sur sa capacité à entraîner une ma<strong>la</strong>die chez l’hôte. En<br />
1870, Louis Pasteur i<strong>de</strong>ntifie <strong>le</strong> premier microbe responsab<strong>le</strong> d'une ma<strong>la</strong>die infectieuse, <strong>la</strong><br />
16
Introduction bibliographique<br />
ma<strong>la</strong>die <strong>de</strong>s vers à soie et met fin à <strong>la</strong> théorie <strong>de</strong> <strong>la</strong> génération spontanée en publiant " La<br />
théorie <strong>de</strong>s germes " en 1878.<br />
En 1882, <strong>le</strong> mé<strong>de</strong>cin al<strong>le</strong>mand Robert Koch, pionnier avec Louis Pasteur <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
bactériologie, iso<strong>le</strong> <strong>le</strong> bacil<strong>le</strong> Mycobacterium tuberculosis, responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> tuberculose.<br />
Combinée avec <strong>le</strong>s trav<strong>au</strong>x <strong>de</strong> Pasteur, cette découverte pose <strong>le</strong>s principes <strong>de</strong> l'asepsie pour<br />
éviter <strong>la</strong> transmission <strong>de</strong>s microbes d'un opéré à l'<strong>au</strong>tre, et prône l'hygiène hospitalière pour<br />
éviter <strong>le</strong>s transmissions d'infections entre ma<strong>la</strong><strong>de</strong>s contagieux. En 1883, <strong>au</strong> cours d'une<br />
expédition en Égypte, Koch iso<strong>le</strong> <strong>la</strong> bactérie Vibrio cho<strong>le</strong>rae, agent responsba<strong>le</strong> du choléra,<br />
avec l'ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> Gaffky et <strong>de</strong> Bernhard <strong>Fis</strong>cher. Il prouve, peu après, <strong>le</strong> rô<strong>le</strong> <strong>de</strong> l'e<strong>au</strong> <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
transmission <strong>de</strong> <strong>la</strong> ma<strong>la</strong>die.<br />
A <strong>la</strong> suite <strong>de</strong> ces trav<strong>au</strong>x, Robert Koch établit en 1890 un postu<strong>la</strong>t définissant <strong>le</strong>s<br />
caractéristiques d’une bactérie pathogène :<br />
1- Le micro-organisme doit être présent <strong>dans</strong> chaque cas <strong>de</strong> <strong>la</strong> ma<strong>la</strong>die étudiée.<br />
2- Il ne doit pas apparaître <strong>dans</strong> d’<strong>au</strong>tres ma<strong>la</strong>dies ou <strong>dans</strong> <strong>de</strong>s organismes sains.<br />
3- Après avoir été isolé <strong>de</strong> l’hôte et cultivé en milieu pur, <strong>le</strong> micro-organisme doit induire à<br />
nouve<strong>au</strong> <strong>la</strong> ma<strong>la</strong>die.<br />
Toutefois, ce postu<strong>la</strong>t fait apparaître certaines limites. En effet, l’agent pathogène doit<br />
pouvoir être cultivé en milieu synthétique, ce qui en exclue <strong>le</strong>s bactéries non cultivab<strong>le</strong>s ou <strong>le</strong>s<br />
virus. Il ne prend pas en compte <strong>le</strong> portail d’entrée <strong>dans</strong> l’hôte, <strong>la</strong> niche écologique du microorganisme<br />
ou <strong>la</strong> notion <strong>de</strong> dose infectieuse (Isenberg, 1988).<br />
Sur ce <strong>de</strong>rnier point, <strong>de</strong> nombreuses étu<strong>de</strong>s ultérieures quantifient <strong>le</strong> pouvoir<br />
pathogène suivant trois données : <strong>la</strong> Dose Minima<strong>le</strong> Mortel<strong>le</strong> (DMM), <strong>la</strong> Dose Léta<strong>le</strong> 50<br />
(DL50) et <strong>la</strong> Dose Minima<strong>le</strong> Infectante (DMI).<br />
- La DMM est <strong>la</strong> dose <strong>la</strong> plus faib<strong>le</strong> qui tue <strong>dans</strong> un dé<strong>la</strong>i déterminé par un groupe<br />
expérimental.<br />
- La DL50 est <strong>la</strong> dose où <strong>le</strong> nombre d'agents pathogènes est capab<strong>le</strong> <strong>de</strong> tuer 50% <strong>de</strong>s hôtes<br />
d'un groupe expérimental en un temps donné.<br />
- La DMI est <strong>la</strong> dose minima<strong>le</strong> d'agents pathogènes donnée permettant <strong>la</strong> contamination et <strong>le</strong><br />
développement <strong>de</strong> <strong>la</strong> ma<strong>la</strong>die.<br />
Des progrès spectacu<strong>la</strong>ires ont été réalisés <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s domaines <strong>de</strong> <strong>la</strong> microbiologie, <strong>de</strong><br />
l'immunologie, <strong>de</strong> <strong>la</strong> biologie molécu<strong>la</strong>ire, <strong>dans</strong> l'amélioration <strong>de</strong>s techniques <strong>de</strong> diagnostic,<br />
en épidémiologie. Ces nouvel<strong>le</strong>s avancées ont permis d’affiner <strong>le</strong> postu<strong>la</strong>t <strong>de</strong> Koch et mettent<br />
17
Introduction bibliographique<br />
en évi<strong>de</strong>nce que <strong>la</strong> définition d’un pathogène est en perpétuel changement et s’adapte <strong>au</strong>x<br />
résultats apportés par <strong>le</strong>s nouve<strong>au</strong>x outils <strong>de</strong> <strong>la</strong> biologie.<br />
En 1988, en accord avec ces nouvel<strong>le</strong>s données, Stan<strong>le</strong>y Falkow définit une version<br />
molécu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong>s trois postu<strong>la</strong>ts <strong>de</strong> Koch :<br />
1- Le phénotype ou <strong>la</strong> propriété étudiée doit être associé à <strong>de</strong>s membres pathogènes d’un<br />
genre ou <strong>de</strong>s souches pathogènes d’une espèce.<br />
2- Isolé par <strong>de</strong>s métho<strong>de</strong>s molécu<strong>la</strong>ires, l’inactivation spécifique du ou <strong>de</strong>s gènes associés<br />
avec <strong>le</strong> trait <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce étudié doit conduire à une perte <strong>de</strong> fonction <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pathogène qui<br />
peut se traduire par une baisse significative du pouvoir pathogène.<br />
3- Le remp<strong>la</strong>cement allélique du gène muté par <strong>le</strong> gène s<strong>au</strong>vage doit conduire à <strong>la</strong> rest<strong>au</strong>ration<br />
du pouvoir pathogène.<br />
Cette nouvel<strong>le</strong> définition permet d’affiner <strong>la</strong> compréhension <strong>de</strong>s mécanismes mis en<br />
jeu par <strong>le</strong> pathogène, notamment en recherchant <strong>le</strong>s gènes impliqués <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir<br />
pathogène. Toutefois, cette définition reste centrée sur <strong>le</strong> micro-organisme et ne prend en<br />
compte que <strong>le</strong>s micro-organismes provoquant une infection sévère. Ainsi en sont exclus <strong>le</strong>s<br />
agents possédant un pouvoir pathogène re<strong>la</strong>tivement limité comme <strong>le</strong>s pathogènes<br />
opportunistes. Casa<strong>de</strong>vall et Pirofski propose en 1999 <strong>de</strong> définir un pathogène par <strong>le</strong>s dégâts<br />
générés chez l’hôte par <strong>le</strong> pathogène mais <strong>au</strong>ssi par <strong>le</strong>s réactions <strong>de</strong> défenses <strong>de</strong> l’hôte. Dans<br />
<strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s interactions entre un pathogène et son hôte, il y a un continuum entre <strong>le</strong>s<br />
dommages c<strong>au</strong>sés par <strong>le</strong> pathogène et ceux c<strong>au</strong>sés par l’hôte. Ceci conduit à <strong>la</strong> ma<strong>la</strong>die<br />
seu<strong>le</strong>ment quand <strong>la</strong> nature <strong>de</strong>s dommages modifie <strong>le</strong>s fonctions norma<strong>le</strong>s <strong>de</strong> l’hôte. De ce fait,<br />
<strong>la</strong> ma<strong>la</strong>die est une issue comp<strong>le</strong>xe qui survient à c<strong>au</strong>se <strong>de</strong>s dommages provoqués par <strong>le</strong><br />
pathogène (par exemp<strong>le</strong> <strong>le</strong>s pathogènes induisant <strong>la</strong> nécrose <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s) et/ou à c<strong>au</strong>se <strong>de</strong>s<br />
dommages induits par l’hôte (par exemp<strong>le</strong> une réponse immunitaire aberrante). Ainsi,<br />
Streptococcus pneumoniae s’établit <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s tissus pulmonaires sans induire une nécrose <strong>de</strong>s<br />
cellu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> l’hôte, mais ce<strong>la</strong> peut conduire à une intense réaction inf<strong>la</strong>mmatoire. De même,<br />
Staphylococcus <strong>au</strong>reus induit une nécrose <strong>de</strong>s tissus et stimu<strong>le</strong> <strong>la</strong> réponse inf<strong>la</strong>mmatoire <strong>de</strong><br />
l’hôte. Au contraire, Mycobacterium tuberculosis provoque une forte réponse immunitaire <strong>de</strong><br />
l’hôte qui entraîne une sévère inf<strong>la</strong>mmation aboutissant à <strong>de</strong>s dommages <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s tissus <strong>de</strong><br />
l’hôte. Définir un micro-organisme pathogène en terme <strong>de</strong> dommages induits chez l’hôte<br />
permet d’inclure <strong>de</strong> nombreux paramètres qui affectent <strong>la</strong> re<strong>la</strong>tion hôte-pathogène. De ce<br />
point <strong>de</strong> vue, <strong>la</strong> pathogénie est <strong>la</strong> c<strong>au</strong>se du pathogène mais est modulée par <strong>la</strong> résistance <strong>de</strong><br />
l’hôte (Casa<strong>de</strong>vall et Pirofski, 2000).<br />
18
Introduction bibliographique<br />
L’ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong> ces données met en évi<strong>de</strong>nce <strong>la</strong> difficulté <strong>de</strong> trouver une définition<br />
interdisciplinaire d’un pathogène. Dans ce travail, un pathogène est considéré comme un<br />
micro-organisme dont <strong>la</strong> survie dépend <strong>de</strong> sa capacité à se multiplier et à persister sur ou <strong>dans</strong><br />
d’<strong>au</strong>tres espèces en franchissant ou en détruisant <strong>la</strong> barrière cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> l’hôte qui empêche<br />
norma<strong>le</strong>ment <strong>le</strong> passage d’<strong>au</strong>tres micro-organismes.<br />
IB<br />
Les facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce : acteurs molécu<strong>la</strong>ires <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
pathogénie<br />
La mise en p<strong>la</strong>ce d’un processus infectieux, régie par différentes étapes c<strong>le</strong>fs, permet<br />
parfois <strong>au</strong> micro-organisme <strong>de</strong> réussir à infecter son hôte. Il doit pouvoir survivre <strong>dans</strong> l’hôte,<br />
s’y multiplier et y c<strong>au</strong>ser <strong>de</strong>s dommages. Pour ce faire, il doit être compétitif vis à vis <strong>de</strong>s<br />
bactéries commensa<strong>le</strong>s, neutraliser <strong>le</strong>s mécanismes <strong>de</strong> défense <strong>de</strong> l’hôte et y assurer sa<br />
propagation. Une partie <strong>de</strong> ces propriétés est conférée par <strong>le</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce. Définir <strong>le</strong>s<br />
gènes codant ces facteurs reste un problème délicat (Figure 2) (Wassenaar et Gaastra, 2001).<br />
Dans ce travail, <strong>le</strong> terme <strong>de</strong> gène <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce sera utilisé pour <strong>le</strong>s gènes codant <strong>de</strong>s facteurs<br />
indispensab<strong>le</strong>s à <strong>la</strong> colonisation <strong>de</strong> l’hôte par <strong>le</strong> pathogène.<br />
19
Introduction bibliographique<br />
Gènes <strong>de</strong><br />
viru<strong>le</strong>nce<br />
vrais<br />
Gènes associés<br />
à <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce<br />
Gènes <strong>de</strong> survie <strong>au</strong><br />
cours <strong>de</strong> l’infection<br />
Gènes restants<br />
Les gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce vrais<br />
co<strong>de</strong>nt <strong>de</strong>s facteurs ou <strong>de</strong>s<br />
enzymes produisant <strong>de</strong>s facteurs<br />
qui sont:<br />
-impliqués <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s interactions<br />
avec l’hôte<br />
-directement responsab<strong>le</strong>s <strong>de</strong>s<br />
dommages <strong>au</strong> cours <strong>de</strong> l’infection<br />
-absent <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s souches<br />
aviru<strong>le</strong>ntes<br />
Les gènes associés à <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce<br />
co<strong>de</strong>nt <strong>de</strong>s facteurs ou <strong>de</strong>s<br />
enzymes synthétisant <strong>de</strong>s produits<br />
qui:<br />
-régu<strong>le</strong>nt l’expression <strong>de</strong>s gènes<br />
<strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce<br />
-ou activent <strong>le</strong>s facteurs <strong>de</strong><br />
viru<strong>le</strong>nce par modification<br />
conformationnel<strong>le</strong> ou sécrétion<br />
-ou sont requis pour l’activité <strong>de</strong>s<br />
facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce vrais<br />
Les gènes <strong>de</strong> survie <strong>au</strong> cours <strong>de</strong><br />
l’infection co<strong>de</strong>nt <strong>de</strong>s facteurs ou<br />
<strong>de</strong>s enzymes produisant <strong>de</strong>s<br />
facteurs qui:<br />
-permettent <strong>la</strong> colonisation <strong>de</strong><br />
l’hôte<br />
-ou permettent d’échapper <strong>au</strong><br />
système immunitaire <strong>de</strong> l’hôte<br />
-ou permettent <strong>la</strong> survie<br />
intracellu<strong>la</strong>ire<br />
-ou utilisent <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> l’hôte<br />
pour survivre<br />
Figure 2: C<strong>la</strong>ssification <strong>de</strong>s gènes impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce (L<strong>au</strong>tier et Nasser, 2005<br />
adapté <strong>de</strong> Wassenaar et Gaastra, 2001).<br />
Le nombre <strong>de</strong> gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce et <strong>de</strong> gènes associés à <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce est représenté par <strong>de</strong>s<br />
cerc<strong>le</strong>s concentriques. La limite entre <strong>le</strong>s cerc<strong>le</strong>s n’est pas toujours bien établie.<br />
L’infection peut être considérée comme un processus où <strong>le</strong> passage à l’étape suivante<br />
est globa<strong>le</strong>ment régi par <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance (Figure 3). La première étape du processus<br />
infectieux consiste généra<strong>le</strong>ment à l’adhésion du pathogène à l’hôte et débute durant <strong>la</strong> phase<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong>tence, qui est un temps d’adaptation à ce nouvel environnement. En conditions<br />
favorab<strong>le</strong>s, <strong>la</strong> croissance bactérienne <strong>de</strong>vient exponentiel<strong>le</strong>, conduisant <strong>au</strong> <strong>de</strong>uxième nive<strong>au</strong> <strong>de</strong><br />
20
Introduction bibliographique<br />
l’infection appelé phase <strong>de</strong> multiplication. Lorsqu’el<strong>le</strong>s sont en quantité suffisamment<br />
importante pour arriver à conduire une attaque brusque et forte <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> l’hôte, <strong>le</strong>s<br />
bactéries synthétisent massivement <strong>le</strong>urs facteurs <strong>de</strong> propagation permettant une invasion <strong>de</strong><br />
l’hôte. Cette étape a lieu généra<strong>le</strong>ment lorsque <strong>le</strong> pathogène est en phase exponentiel<strong>le</strong><br />
avancée ou en phase stationnaire <strong>de</strong> croissance, durant <strong>la</strong>quel<strong>le</strong> <strong>la</strong> bactérie est plus résistante à<br />
un environnement défavorab<strong>le</strong>.<br />
Processus infectieux<br />
adhésion<br />
multiplication<br />
invasion<br />
Facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce<br />
précoces<br />
tardifs<br />
Densité cellu<strong>la</strong>ire<br />
Phase d e<br />
<strong>la</strong>tence<br />
Phase<br />
exponentiel<strong>le</strong><br />
Phase stationnaire<br />
Croissance<br />
Figure 3: Etapes du processus infectieux en fonction <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance<br />
(L<strong>au</strong>tier et Nasser, 2005).<br />
I.B.1<br />
Les facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce précoces<br />
Ils interviennent <strong>au</strong> début du processus infectieux et permettent <strong>au</strong>x micro-organismes<br />
<strong>de</strong> rejoindre <strong>la</strong> zone cib<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’hôte, <strong>de</strong> s’y établir pour s’y multiplier.<br />
I.B.1.1<br />
La mobilité<br />
La mobilité est supposée être une très ancienne caractéristique <strong>de</strong>s bactéries. El<strong>le</strong> est<br />
intimement liée <strong>au</strong> chimiotactisme, <strong>la</strong> capacité <strong>de</strong> s’orienter <strong>dans</strong> certains gradients chimiques.<br />
La combinaison <strong>de</strong> <strong>la</strong> mobilité et du chimiotactisme permet <strong>au</strong>x bactéries <strong>de</strong> détecter et<br />
rejoindre <strong>le</strong>urs niches écologiques préférées.<br />
21
Introduction bibliographique<br />
Le mo<strong>de</strong> <strong>de</strong> locomotion <strong>le</strong> plus connu met en jeu un organe rotatif spécialisé, <strong>le</strong><br />
f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong> (Figure 4). Il est constitué <strong>de</strong> trois parties (Aizawa et al., 2000 ; Macnab, 1999):<br />
- Le fi<strong>la</strong>ment f<strong>la</strong>gel<strong>la</strong>ire : c'est <strong>la</strong> plus longue et <strong>la</strong> plus évi<strong>de</strong>nte, el<strong>le</strong> s'étend <strong>de</strong>puis <strong>la</strong><br />
surface cellu<strong>la</strong>ire : c'est cette partie qui est mise en évi<strong>de</strong>nce lors <strong>de</strong> colorations et observation<br />
en microscopie optique. C'est un cylindre creux et rigi<strong>de</strong> constitué <strong>de</strong> nombreux monomères<br />
d'une seu<strong>le</strong> <strong>protéine</strong> : <strong>la</strong> f<strong>la</strong>gelline. Il existe cependant <strong>de</strong>s f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s comp<strong>le</strong>xes, composés <strong>de</strong><br />
plusieurs <strong>protéine</strong>s distinctes. Ces monomères semb<strong>le</strong>nt <strong>dans</strong> tous <strong>le</strong>s cas emprunter <strong>le</strong> canal<br />
central pour être fina<strong>le</strong>ment assemblés à l'extrémité dista<strong>le</strong>.<br />
- Le crochet : d'un diamètre supérieur <strong>au</strong> fi<strong>la</strong>ment, il est situé <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> surface<br />
cellu<strong>la</strong>ire. Il fait <strong>la</strong> liaison entre <strong>le</strong> corps basal et <strong>le</strong> fi<strong>la</strong>ment f<strong>la</strong>gel<strong>la</strong>ire. Son rô<strong>le</strong> est <strong>de</strong><br />
transmettre <strong>le</strong> mouvement du corps basal <strong>au</strong> fi<strong>la</strong>ment.<br />
- Le corps basal : il est enfoui <strong>dans</strong> <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> et sa structure diffère <strong>de</strong>s bactéries Gram<br />
négatives et Gram positives. On peut <strong>le</strong> définir comme une tige centra<strong>le</strong> insérée <strong>dans</strong> un<br />
système d'anne<strong>au</strong>x, l’ensemb<strong>le</strong> étant inséré <strong>dans</strong> <strong>la</strong> membrane p<strong>la</strong>smique et <strong>la</strong> paroi. Cette<br />
partie du f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong> est reliée à une casca<strong>de</strong> <strong>de</strong> transduction du signal répondant <strong>au</strong><br />
chimiotactisme.<br />
Figure 4 : Structure du f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong> bactérien.<br />
Dans <strong>le</strong> cas <strong>de</strong>s bactéries pathogènes, <strong>la</strong> nécessité d’organes <strong>de</strong> mobilité varie selon <strong>le</strong><br />
mo<strong>de</strong> <strong>de</strong> colonisation du micro-organisme :<br />
- comme précé<strong>de</strong>mment indiqué, <strong>la</strong> mobilité est nécessaire <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s phases précoces <strong>de</strong><br />
l’infection : el<strong>le</strong> permet à <strong>la</strong> bactérie <strong>de</strong> rejoindre sa niche écologique pour y adhérer. Ainsi,<br />
22
Introduction bibliographique<br />
<strong>le</strong>s Escherichia coli pathogènes STEC doivent être mobi<strong>le</strong>s pour rejoindre <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s<br />
épithélia<strong>le</strong>s <strong>de</strong> <strong>la</strong> muqueuse intestina<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’homme. Une fois <strong>le</strong>ur cib<strong>le</strong> atteinte, el<strong>le</strong>s per<strong>de</strong>nt<br />
<strong>le</strong>ur mobilité en créant <strong>de</strong>s attachements intimes avec <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s intestina<strong>le</strong>s.<br />
- <strong>la</strong> mobilité est nécessaire pour établir et maintenir l’infection. C’est <strong>le</strong> cas <strong>de</strong><br />
Legionel<strong>la</strong> pneumophi<strong>la</strong> qui colonise <strong>le</strong>s macrophages humains (Dietrich et al., 2001). Une<br />
fois <strong>dans</strong> <strong>le</strong> macrophage, <strong>la</strong> bactérie perd sa mobilité jusqu’à ce que <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> hôte lyse. A ce<br />
sta<strong>de</strong>, <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s est <strong>de</strong> nouve<strong>au</strong> activée pour permettre d’infecter une <strong>au</strong>tre<br />
cellu<strong>le</strong>.<br />
Un exemp<strong>le</strong> original est <strong>la</strong> mobilité par l'actine utilisée par Shigel<strong>la</strong> f<strong>le</strong>xneri à<br />
l'intérieur <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s épithélia<strong>le</strong>s, nommée "rocket motility" (Figure 5). Après <strong>la</strong> pénétration<br />
<strong>dans</strong> l’hôte, <strong>la</strong> bactérie se libère <strong>de</strong> <strong>la</strong> vacuo<strong>le</strong> phagocytaire et induit ensuite <strong>la</strong> formation <strong>de</strong><br />
fi<strong>la</strong>ments d'actine qui <strong>la</strong> propulseront vers une cellu<strong>le</strong> adjacente. La formation <strong>de</strong> fi<strong>la</strong>ments<br />
d'actine requiert <strong>la</strong> participation <strong>de</strong> <strong>protéine</strong>s bactériennes comme IcsA et <strong>le</strong> recrutement <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
vinculine et <strong>de</strong> l'actine (éléments du cytosque<strong>le</strong>tte <strong>de</strong> <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> eucaryote); <strong>la</strong> vinculine se lie à<br />
IcsA et initie <strong>la</strong> polymérisation <strong>de</strong> l'actine.<br />
Figure 5 : La mobilité par l'actine utilisée par Shigel<strong>la</strong> f<strong>le</strong>xneri à l'intérieur <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s<br />
épithélia<strong>le</strong>s, nommée "rocket motility". A. Représentation <strong>de</strong> l’invasion <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s<br />
épithélia<strong>le</strong>s par <strong>la</strong> bactérie. B. Schématisation <strong>de</strong> <strong>la</strong> polymérisation <strong>de</strong> l’actine <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
bactérie.<br />
Chez <strong>le</strong>s bactéries phytopathogènes, l’implication <strong>de</strong> <strong>la</strong> mobilité <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir<br />
pathogène a été re<strong>la</strong>tivement bien étudiée chez Agrobacterium tumefaciens. Cette bactérie<br />
produit <strong>de</strong>s f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s disposés <strong>de</strong> façon circu<strong>la</strong>ire à une extrémité <strong>de</strong> <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> en forme <strong>de</strong><br />
bacil<strong>le</strong>. Trois gènes, f<strong>la</strong>A, f<strong>la</strong>B et f<strong>la</strong>C sont impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s<br />
(Chesnokova et al., 1997), déterminants <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir pathogène <strong>de</strong> cette bactérie. Dans <strong>le</strong><br />
23
Introduction bibliographique<br />
cas <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie phytopathogène Erwinia carotovora, <strong>de</strong>s mutants non mobi<strong>le</strong>s présentent<br />
une viru<strong>le</strong>nce atténuée (Mulho<strong>la</strong>nd et al., 1993 ; Pirhonen et al., 1991). Ces souches sont<br />
mutées <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong>s gènes mop codant <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s homologues <strong>au</strong>x <strong>protéine</strong>s<br />
d’assemb<strong>la</strong>ge et <strong>de</strong> sécrétion <strong>de</strong>s f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s chez Salmonel<strong>la</strong>, Bacillus, Shigel<strong>la</strong>, Yersinia et<br />
Pseudomonas. L’apport en trans <strong>de</strong> ces gènes s<strong>au</strong>vages rest<strong>au</strong>re à <strong>la</strong> fois <strong>la</strong> mobilité<br />
bactérienne et <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce. L’existence <strong>de</strong> f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s permettrait à <strong>la</strong> bactérie <strong>de</strong> se dép<strong>la</strong>cer<br />
<strong>dans</strong> <strong>le</strong> sol à <strong>la</strong> recherche d’une p<strong>la</strong>nte hôte et d’y pénétrer par <strong>de</strong>s ouvertures naturel<strong>le</strong>s ou<br />
<strong>de</strong>s b<strong>le</strong>ssures. Ainsi, <strong>le</strong>s f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s <strong>au</strong>raient un rô<strong>le</strong> non négligeab<strong>le</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir pathogène<br />
<strong>de</strong>s Erwinia.<br />
I.B.1.2<br />
L’adhérence<br />
Adhérer à l’hôte est indispensab<strong>le</strong> pour <strong>le</strong> micro-organisme afin <strong>de</strong> s’y imp<strong>la</strong>nter<br />
(Fin<strong>la</strong>y et Falkow, 1997). La charge é<strong>le</strong>ctrostatique négative présente à <strong>la</strong> surface du microorganisme<br />
et <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> l’hôte provoque une répulsion é<strong>le</strong>ctrostatique, qui empêche <strong>la</strong><br />
formation <strong>de</strong> liaisons faib<strong>le</strong>s ou aspécifiques. De ce fait, l’adhésion bactérienne requiert <strong>de</strong>s<br />
interactions fortes et h<strong>au</strong>tement spécifiques entre un ligand molécu<strong>la</strong>ire situé sur <strong>la</strong> surface du<br />
pathogène et <strong>le</strong> récepteur correspondant présent sur <strong>la</strong> surface <strong>de</strong> <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> hôte. La nature <strong>de</strong><br />
ces facteurs conditionnent <strong>la</strong> spécificité (espèces cib<strong>le</strong>s plus ou moins nombreuses) et <strong>le</strong><br />
tropisme (tissus cib<strong>le</strong>s plus ou moins nombreux).<br />
I.B.1.2.a<br />
Les adhésines<br />
Les adhésines bactériennes sont <strong>le</strong>s structures principa<strong>le</strong>s d’adhésion du pathogène à<br />
d'<strong>au</strong>tres cellu<strong>le</strong>s. Le terme adhésine définit un ligand produit par <strong>le</strong> micro-organisme qui se lie<br />
spécifiquement à un récepteur <strong>de</strong> <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> hôte (Nougayrè<strong>de</strong> et al., 2003). Pour être qualifié<br />
d’adhésine, <strong>le</strong> produit microbien doit remplir certains critères. La molécu<strong>le</strong> purifiée doit se<br />
lier <strong>de</strong> façon stab<strong>le</strong> et saturab<strong>le</strong> à <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> hôte (ou <strong>au</strong>x produits extracellu<strong>la</strong>ires). La<br />
spécificité est déterminée en montrant qu’un excès <strong>de</strong> ligand non marqué inhibe <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong><br />
ligands marqués. Le caractère saturant <strong>de</strong> <strong>la</strong> fixation montre qu’il existe un nombre fini <strong>de</strong><br />
récepteurs qui lient <strong>le</strong> ligand. La constance <strong>de</strong> liaison pour cette interaction doit se situer <strong>dans</strong><br />
une gamme biologique p<strong>la</strong>usib<strong>le</strong>. Les bactéries utilisent comme adhésine une gran<strong>de</strong> variété<br />
<strong>de</strong> structures <strong>de</strong> surface. La plupart <strong>de</strong>s pili <strong>de</strong>s bactéries gram négatif fonctionne comme <strong>de</strong>s<br />
24
Introduction bibliographique<br />
adhésines, mais <strong>dans</strong> be<strong>au</strong>coup <strong>de</strong> cas, c'est une sous unité protéique mineure à l’extrémité<br />
<strong>de</strong>s fimbriae qui est l'adhésine réel<strong>le</strong>. Chez <strong>le</strong>s bactéries gram positives, une <strong>protéine</strong> ou un<br />
polysacchari<strong>de</strong> <strong>de</strong> surface sert d'adhésine spécifique.<br />
Les Escherichia coli entéropathogéniques ou entérohémoragiques sont <strong>de</strong>s pathogènes<br />
humains responsab<strong>le</strong>s d’un t<strong>au</strong>x <strong>de</strong> morbidité et <strong>de</strong> mortalité é<strong>le</strong>vé chez <strong>le</strong>s enfants <strong>de</strong>s pays<br />
en voie <strong>de</strong> développement. Ces pathogènes extracellu<strong>la</strong>ires adhèrent <strong>au</strong>x cellu<strong>le</strong>s <strong>de</strong><br />
l’épithélium intestinal <strong>de</strong> l’hôte, induisant <strong>la</strong> formation d’un pié<strong>de</strong>stal riche en actine (Kenny<br />
et al., 2002). La formation <strong>de</strong> ce pié<strong>de</strong>stal requiert l’intimine, une adhésine dont <strong>le</strong> gène est<br />
porté sur <strong>le</strong> chromosome bactérien (Jerse et al., 1990 ; Donnenberg et al., 1993). Dans ce<br />
coup<strong>le</strong> adhésine-récepteur, <strong>le</strong> récepteur, nommé Tir, a <strong>la</strong> particu<strong>la</strong>rité d’être une molécu<strong>le</strong><br />
bactérienne. Tir est une <strong>protéine</strong> effectrice du système <strong>de</strong> sécrétion <strong>de</strong> type III, qui une fois<br />
transloquée <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cytosol, s’insère <strong>dans</strong> <strong>la</strong> membrane <strong>de</strong> <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> eucaryote pour remplir<br />
son rô<strong>le</strong> <strong>de</strong> récepteur (Kenny et al., 1997). Cet exemp<strong>le</strong> met en évi<strong>de</strong>nce <strong>le</strong> caractère<br />
déterminant <strong>de</strong> <strong>la</strong> spécificité adhésine-récepteur.<br />
Pour <strong>le</strong>s bactéries phytopathogènes, <strong>le</strong>s mécanismes impliquant <strong>de</strong>s adhésines sont<br />
moins bien connus. Toutefois, <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cas <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie Agrobacterium tumefaciens,<br />
l’adhésion <strong>au</strong>x tissus végét<strong>au</strong>x nécessite principa<strong>le</strong>ment une adhésine calcium dépendante<br />
(Smit et al., 1992) ainsi qu’un ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>protéine</strong>s codées par <strong>le</strong>s gènes du locus att<br />
(attachement) (Matthysse et al., 1996, 1998, 2000). Un <strong>au</strong>tre exemp<strong>le</strong> concerne <strong>la</strong> bactérie<br />
Erwinia chrysanthemi EC16, qui provoque une nécrose chez différentes p<strong>la</strong>ntes hôtes. El<strong>le</strong><br />
possè<strong>de</strong> un gène hecA codant une adhésine <strong>de</strong> 3850 aci<strong>de</strong>s aminés appartenant à <strong>la</strong> famil<strong>le</strong> <strong>de</strong>s<br />
hémagglutinine fi<strong>la</strong>menteuse <strong>de</strong> Bor<strong>de</strong>tel<strong>la</strong> pertussis (Rojas et al., 2002). Les <strong>au</strong>teurs ont<br />
montré qu’une souche mutée <strong>dans</strong> <strong>le</strong> gène hecA présente une viru<strong>le</strong>nce atténuée sur <strong>de</strong>s<br />
p<strong>la</strong>ntu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> Nicotiana c<strong>le</strong>ve<strong>la</strong>ndii, infectées sans b<strong>le</strong>ssures. De plus, <strong>le</strong>s Erwinae produisent<br />
<strong>de</strong>s pili qui <strong>le</strong>ur permettraient d’adhérer à <strong>la</strong> surface <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s végéta<strong>le</strong>s. En effet, l’addition<br />
d’anticorps anti-piline inhibe <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong>s bactéries sur <strong>le</strong>s racines <strong>de</strong>s p<strong>la</strong>ntes (Haahte<strong>la</strong> et<br />
al., 1985).<br />
I.B.1.2.b<br />
Les lipopolysacchari<strong>de</strong>s<br />
Les lipopolysacchari<strong>de</strong>s (LPS) sont <strong>de</strong>s comp<strong>le</strong>xes macromolécu<strong>la</strong>ires présents <strong>de</strong><br />
manière constitutive <strong>dans</strong> <strong>la</strong> membrane externe <strong>de</strong> toutes <strong>le</strong>s bactéries à Gram négatif. Sur <strong>le</strong><br />
25
Introduction bibliographique<br />
p<strong>la</strong>n structural, <strong>le</strong>s LPS sont constitués d'un lipi<strong>de</strong> A et d'une partie polysaccharidique<br />
débordant <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrane externe (Figure 6).<br />
Figure 6 : La structure du LPS.<br />
Le lipi<strong>de</strong> A est doué <strong>de</strong> propriétés toxiques et il correspond à l'endotoxine <strong>de</strong>s<br />
bactéries à Gram négatif. La fraction polysaccharidique constitue l'antigène O et est<br />
responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> spécificité antigénique O permettant <strong>de</strong> décrire <strong>de</strong>s sérovars <strong>au</strong> sein d'une<br />
même espèce bactérienne. Les lipopolysacchari<strong>de</strong>s (LPS) jouent éga<strong>le</strong>ment un rô<strong>le</strong> <strong>dans</strong><br />
l’adhérence, notamment chez Agrobacterium tumefaciens (Reuhs et al., 1997). D’<strong>au</strong>tres<br />
étu<strong>de</strong>s mettent en évi<strong>de</strong>nce <strong>le</strong> rô<strong>le</strong> du LPS <strong>dans</strong> l’adhérence <strong>de</strong> Vibrio cho<strong>le</strong>rae. En effet, un<br />
mutant <strong>dans</strong> <strong>le</strong> gène rfp, essentiel pour <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s LPS, présente une colonisation <strong>de</strong><br />
l’hôte mil<strong>le</strong> fois plus faib<strong>le</strong> par rapport à <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> (Merrell et al., 2002). Chez<br />
Erwinia carotovora subsp. atroseptica, un mutant altéré <strong>dans</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> LPS présente une<br />
viru<strong>le</strong>nce diminuée (Toth et al., 1999). Il est proposé que ces composés <strong>de</strong> <strong>la</strong> surface<br />
membranaire pourraient être impliqués <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s phénomènes <strong>de</strong> reconnaissance entre <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte<br />
et <strong>la</strong> bactérie.<br />
26
Introduction bibliographique<br />
I.B.1.2.c<br />
Les exopolysacchari<strong>de</strong>s<br />
Les exopolysacchari<strong>de</strong>s (EPS) forment une capsu<strong>le</strong> mucoï<strong>de</strong> protectrice <strong>au</strong>tour <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
cellu<strong>le</strong> bactérienne. La production <strong>de</strong> ces EPS est souvent liée à <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce <strong>de</strong> différents<br />
pathogènes (Agrobacterium, Erwinia, Pseudomonas,…). Au cours <strong>de</strong> l’infection, ces EPS,<br />
grâce à <strong>le</strong>urs propriétés anioniques et hydrophi<strong>le</strong>s, fournissent un avantage sé<strong>le</strong>ctif à <strong>la</strong><br />
bactérie qui <strong>le</strong>s produit (Suther<strong>la</strong>nd, 1988). En effet, ils permettent <strong>de</strong> maintenir une forte<br />
hydratation <strong>de</strong> <strong>la</strong> zone colonisée et/ou <strong>de</strong> séquestrer <strong>le</strong>s molécu<strong>le</strong>s toxiques en général<br />
chargées positivement. Chez <strong>la</strong> bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, ils<br />
interviennent <strong>dans</strong> <strong>la</strong> pathogénèse, en obstruant probab<strong>le</strong>ment <strong>le</strong>s vaisse<strong>au</strong>x du xylème.<br />
L’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’infection <strong>de</strong> p<strong>la</strong>nts <strong>de</strong> Saintp<strong>au</strong>lia par <strong>de</strong>s mutants d’E. chrysanthemi ne<br />
synthétisant pas d’EPS a montré que <strong>le</strong> développement <strong>de</strong>s symptômes était retardé et que <strong>le</strong><br />
sta<strong>de</strong> <strong>de</strong> macération systémique n’était jamais atteint (Con<strong>de</strong>mine et al., 1999).<br />
I.B.1.2.d<br />
Les f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s<br />
Outre <strong>le</strong>urs rô<strong>le</strong>s <strong>dans</strong> <strong>la</strong> mobilité, <strong>le</strong>s f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s peuvent éga<strong>le</strong>ment servir d’appendices<br />
adhésifs <strong>au</strong> début <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> colonisation <strong>de</strong> l’hôte. Dans ce cas, ils per<strong>de</strong>nt <strong>le</strong>ur fonction<br />
<strong>de</strong> mobilité puisqu’ils <strong>de</strong>viennent attachés (Josenhans et Suerb<strong>au</strong>m, 2002). La structure<br />
c<strong>la</strong>ssique du fi<strong>la</strong>ment f<strong>la</strong>gel<strong>la</strong>ire est composé <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux <strong>protéine</strong>s : FliC, constituant majoritaire,<br />
et FliD, constituant <strong>la</strong> coiffe du f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong> <strong>dans</strong> <strong>la</strong> partie dista<strong>le</strong>. Ainsi, il a été mis en évi<strong>de</strong>nce <strong>le</strong><br />
rô<strong>le</strong> <strong>de</strong> FliD <strong>dans</strong> l’adhésion <strong>de</strong> Pseudomonas aeruginosa lors <strong>de</strong> trachéites (Arora et al.,<br />
1998). Les f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s apparaissent donc comme une structure assurant <strong>la</strong> mobilité <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie<br />
mais éga<strong>le</strong>ment comme acteurs <strong>de</strong>s premières étapes <strong>de</strong> l’adhésion.<br />
I.B.1.3<br />
Les harpines<br />
Les harpines sont <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s thermostab<strong>le</strong>s sécrétées <strong>dans</strong> <strong>le</strong> milieu extérieur par <strong>le</strong>s<br />
bactéries phytopathogènes. Le mo<strong>de</strong> d’action <strong>de</strong>s harpines reste à c<strong>la</strong>rifier, toutefois, il a été<br />
montré que <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> harpine perturbe <strong>le</strong>s échanges ioniques <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s végéta<strong>le</strong>s avec<br />
<strong>le</strong> milieu extérieur (El-Maarouf et al., 2001 ; Popham et al., 1995) et provoque l’inhibition<br />
rapi<strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse d’ATP (Xie et Chen, 2000). Celà conduit à une alcalinisation du milieu<br />
intercellu<strong>la</strong>ire initia<strong>le</strong>ment aci<strong>de</strong>, modification bénéfique à <strong>la</strong> bactérie pathogène (Hoyos et<br />
27
Introduction bibliographique<br />
al., 1996 ; Popham et al., 1995). Il a éga<strong>le</strong>ment été observé une inhibition <strong>de</strong>s pompes à<br />
protons ATP dépendantes, entraînant une dépo<strong>la</strong>risation <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrane (Pike et al., 1998).<br />
Les mécanismes conduisant ensuite à <strong>la</strong> mort <strong>de</strong> <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> eucaryote reste inconnus.<br />
Cependant, <strong>la</strong> harpine HrpZ <strong>de</strong> Pseudomonas syringae ssp phaseolico<strong>la</strong> forme in vitro un<br />
pore <strong>dans</strong> une bicouche lipidique, permettant <strong>le</strong> passage sé<strong>le</strong>ctif <strong>de</strong> cations (Lee et al., 2001).<br />
Ce pore pourrait favoriser l’invasion du pathogène en provoquant une sortie <strong>de</strong> nutriments<br />
<strong>dans</strong> <strong>le</strong> milieu intercellu<strong>la</strong>ire et en facilitant l’entrée <strong>de</strong> facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce à l’intérieur <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
cellu<strong>le</strong> végéta<strong>le</strong>.<br />
I.B.2<br />
Les facteurs <strong>de</strong> propagation<br />
Pour réussir à infecter son hôte, <strong>le</strong> pathogène doit passer <strong>la</strong> barrière extérieure <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
cellu<strong>le</strong> eucaryote (Herron et al., 2000). Dans <strong>le</strong> cas <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s végéta<strong>le</strong>s, cette barrière est<br />
essentiel<strong>le</strong>ment composée <strong>de</strong> polysacchari<strong>de</strong>s alors que pour <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s anima<strong>le</strong>s, el<strong>le</strong> est<br />
constituée <strong>de</strong> lipi<strong>de</strong>s.<br />
Une fois que <strong>le</strong> micro-organisme pathogène a rejoint <strong>la</strong> partie <strong>de</strong> l’hôte propice à une<br />
infection, et lorsque <strong>le</strong>s conditions environnementa<strong>le</strong>s sont favorab<strong>le</strong>s, il va produire <strong>le</strong>s<br />
facteurs <strong>de</strong> propagation. Ces <strong>de</strong>rniers permettent <strong>la</strong> multiplication et <strong>la</strong> colonisation <strong>de</strong> l’hôte.<br />
Il existe un grand <strong>de</strong> nombre facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce, impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> colonisation <strong>de</strong> l'hôte.<br />
I.B.2.1<br />
Les enzymes dégradatives <strong>de</strong>s bactéries pathogènes <strong>de</strong>s anim<strong>au</strong>x<br />
Les bactéries pathogènes sont capab<strong>le</strong>s <strong>de</strong> produire un certain nombre d'enzymes<br />
extracellu<strong>la</strong>ires permettant d’envahir <strong>le</strong>s tissus <strong>de</strong> l’hôte :<br />
- <strong>le</strong>s hyaluronidases sont <strong>de</strong>s enzymes qui favorisent <strong>la</strong> dissémination <strong>de</strong>s bactéries <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s<br />
tissus en dégradant l'aci<strong>de</strong> hyaluronique du tissu conjonctif;<br />
- <strong>le</strong>s fibrinolysines dissolvent <strong>le</strong>s caillots <strong>de</strong> fibrine que l'hôte constitue souvent pour contenir<br />
loca<strong>le</strong>ment <strong>le</strong>s micro-organismes invasifs et empêcher <strong>le</strong>ur dissémination;<br />
- <strong>le</strong>s protéases, <strong>le</strong>s nucléases et <strong>le</strong>s lipases sont toutes <strong>de</strong>s enzymes qui <strong>au</strong>gmentent l'invasivité<br />
bactérienne en dégradant <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s, <strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s nucléiques ou <strong>de</strong>s lipi<strong>de</strong>s;<br />
- <strong>le</strong>s hémolysines sont <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s toxiques extracellu<strong>la</strong>ires capab<strong>le</strong>s d'attaquer <strong>le</strong>s<br />
membranes <strong>de</strong> différentes cellu<strong>le</strong>s, dont cel<strong>le</strong>s <strong>de</strong>s globu<strong>le</strong>s rouges, et <strong>de</strong> provoquer par là <strong>le</strong>ur<br />
lyse;<br />
28
Introduction bibliographique<br />
- <strong>le</strong>s <strong>le</strong>ucocidines sont capab<strong>le</strong>s <strong>de</strong> lyser <strong>le</strong>s polynucléaires, ce qui entraîne l'affaiblissement <strong>de</strong><br />
<strong>la</strong> résistance <strong>de</strong> l'hôte.<br />
L’arsenal enzymatique bactérien serait donc déterminant <strong>dans</strong> l’adaptation du<br />
pathogène à l’hôte <strong>au</strong> cours du processus infectieux. Ainsi, Pseudomonas aeruginosa produit<br />
une batterie d’enzyme dégradative comme <strong>le</strong>s é<strong>la</strong>stases LasA et LasB qui dégra<strong>de</strong>nt l'é<strong>la</strong>stine,<br />
un composant <strong>de</strong> tissu pulmonaire. Ces <strong>de</strong>ux enzymes inactivent <strong>au</strong>ssi <strong>de</strong> nombreuses<br />
<strong>protéine</strong>s tel<strong>le</strong>s que <strong>le</strong>s immunoglobulines (IgA et IgG) (Heck et al., 1990).<br />
I.B.2.2<br />
Les enzymes dégradatives <strong>de</strong>s bactéries phytopathogènes<br />
L’obstac<strong>le</strong> essentiel pour <strong>le</strong>s bactéries phytopathogènes est <strong>la</strong> paroi <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s<br />
végéta<strong>le</strong>s, dite paroi pectocellulosique. El<strong>le</strong> est constituée <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux matrices <strong>de</strong><br />
polysacchari<strong>de</strong>s : <strong>le</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> pectine et <strong>le</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> cellulose-hémicellulose :<br />
La cellulose est constituée <strong>de</strong> monomères <strong>de</strong> glucose liés entre eux par <strong>de</strong>s<br />
liaisons β 1-4, conduisant à <strong>de</strong>s polymères linéaires. Ces polymères s'associent entre eux par<br />
<strong>de</strong>s liaisons intermolécu<strong>la</strong>ires <strong>de</strong> type liaisons hydrogène, conférant ainsi une structure<br />
fibril<strong>la</strong>ire à <strong>la</strong> cellulose.<br />
L'hémicellulose est faite <strong>de</strong> monomères glucidiques. Par rapport à <strong>la</strong> cellulose,<br />
l'hémicellulose ne contient pas que <strong>de</strong>s glucoses anhydres. Par exemp<strong>le</strong>, en plus du glucose,<br />
<strong>le</strong>s monomères <strong>de</strong> l'hémicellulose peuvent être du xylose, du mannose, du ga<strong>la</strong>ctose, du<br />
rhamnose, ou <strong>de</strong> l'arabinose.<br />
La pectine est un polymère <strong>de</strong> polysacchari<strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s. La chaîne principa<strong>le</strong> est<br />
composée d'aci<strong>de</strong> ga<strong>la</strong>cturonique lié en α1-4. Régulièrement entre ces monomères<br />
s'interca<strong>le</strong>nt <strong>de</strong>s molécu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> rhamnoses par <strong>de</strong>s liaisons 1-2 et 1-4. Ce type <strong>de</strong> liaison entre<br />
<strong>le</strong>s molécu<strong>le</strong>s d'aci<strong>de</strong> uronique et <strong>de</strong> rhamnose forme <strong>de</strong>s cou<strong>de</strong>s. La macromolécu<strong>le</strong> <strong>de</strong><br />
pectine ressemb<strong>le</strong> à un zigzag. Cet agencement donne <strong>de</strong>s propriétés particulières <strong>au</strong>x<br />
pectines. Pour compléter <strong>la</strong> composition chimique <strong>de</strong>s pectines il f<strong>au</strong>t préciser qu'il existe <strong>de</strong>s<br />
ramifications <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong>s aci<strong>de</strong>s uroniques comme <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> du rhamnose par <strong>de</strong>s<br />
molécu<strong>le</strong>s (ex ga<strong>la</strong>ctane, arabinane etc…). Cette gran<strong>de</strong> hétérogénéité fait que l'on doit plutôt<br />
par<strong>le</strong>r <strong>de</strong>s pectines que <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine.<br />
29
Introduction bibliographique<br />
Cette préva<strong>le</strong>nce <strong>de</strong> polysacchari<strong>de</strong>s conduit <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s phytopathogènes à produire<br />
un arsenal <strong>de</strong> saccharidases comme principal système d’attaque.<br />
Ainsi <strong>le</strong>s Erwiniae pectinolytiques synthétisent <strong>de</strong>s enzymes qui dégra<strong>de</strong>nt <strong>le</strong>s<br />
polymères <strong>de</strong>s parois végéta<strong>le</strong>s (Barras et al., 1994 ; Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996).<br />
Les plus importantes sont <strong>le</strong>s pectinases, qui permettent <strong>la</strong> dégradation et l'assimi<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
pectine. De nombreuses pectinases ont été caractérisées chez E. chrysanthemi 3937 et seront<br />
détaillées par <strong>la</strong> suite. E. chrysanthemi 3937 synthétise éga<strong>le</strong>ment <strong>de</strong>ux cellu<strong>la</strong>ses, <strong>la</strong> cellu<strong>la</strong>se<br />
périp<strong>la</strong>smique CelY (EGY) et <strong>la</strong> cellu<strong>la</strong>se extracellu<strong>la</strong>ire Cel5 (EGZ), qui ont une action<br />
synergique sur <strong>la</strong> cellulose (Boyer et al., 1987; Zhou et Ingram, 2000). La faib<strong>le</strong> inci<strong>de</strong>nce <strong>de</strong>s<br />
mutations cel sur <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce malgré l’importance quantitative <strong>de</strong> <strong>la</strong> cellulose <strong>dans</strong> <strong>la</strong> paroi<br />
primaire végéta<strong>le</strong> suggère un rô<strong>le</strong> mineur <strong>de</strong>s cellu<strong>la</strong>ses <strong>dans</strong> <strong>la</strong> pathogénicité (Boccara et al.,<br />
1988). D'<strong>au</strong>tres enzymes dégradatives sécrétées par E. chrysanthemi ont été caractérisées <strong>dans</strong><br />
différentes souches, dont une endoxy<strong>la</strong>nases chez E. chrysanthemi D1 (Keen et al., 1996;<br />
Hurlbert et Preston, 2001) et plusieurs protéases (Wan<strong>de</strong>rsman et al., 1990 ; résultats non<br />
publiés).<br />
I.B.2.3<br />
Les toxines<br />
A côté <strong>de</strong>s facteurs extracellu<strong>la</strong>ires qui favorisent l'invasivité, <strong>le</strong>s bactéries peuvent<br />
produire <strong>de</strong>s toxines qui sont responsab<strong>le</strong>s <strong>de</strong> symptômes ou même <strong>de</strong> certains syndromes<br />
associés à l'infection: <strong>le</strong>s exotoxines et <strong>le</strong>s endotoxines. Ces facteurs n’ayant été pour<br />
l’essentiel été étudiés que chez <strong>le</strong>s pathogènes d’anim<strong>au</strong>x, nous n’en ferons qu’une<br />
présentation succincte.<br />
I.B.2.3.a<br />
Exotoxines<br />
Les exotoxines bactériennes présentent en général une structure comportant un<br />
domaine A (activité) et un domaine B ("binding", liaison <strong>au</strong> récepteur). Le domaine B est<br />
responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong> l'introduction du domaine A <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cytop<strong>la</strong>sme <strong>de</strong> <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> eucaryotique à<br />
travers sa membrane.<br />
Le cas décrit porte sur Vibrio cho<strong>le</strong>rae (Spang<strong>le</strong>r, 1992). La toxine produite a pour<br />
cib<strong>le</strong> <strong>le</strong>s entérocytes, c’est-à-dire <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> l'épithélium intestinal dont <strong>la</strong> principa<strong>le</strong><br />
fonction est l'absorption <strong>de</strong>s produits <strong>de</strong> <strong>la</strong> digestion. Les vibrions cholériques ne pénètrent<br />
30
Introduction bibliographique<br />
pas <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s tissus : ils restent à <strong>la</strong> surface <strong>de</strong>s entérocytes <strong>au</strong>xquels ils adhèrent et sur <strong>le</strong>squels<br />
ils se multiplient. La toxine diffuse loca<strong>le</strong>ment et dérèg<strong>le</strong> <strong>le</strong>s fonctions cellu<strong>la</strong>ires en stimu<strong>la</strong>nt<br />
l'activité <strong>de</strong> l'adény<strong>la</strong>te cyc<strong>la</strong>se. Située principa<strong>le</strong>ment <strong>dans</strong> <strong>la</strong> membrane cytop<strong>la</strong>smique,<br />
l'adény<strong>la</strong>te cyc<strong>la</strong>se joue un rô<strong>le</strong> prépondérant <strong>dans</strong> <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong>s échanges cellu<strong>la</strong>ires assurés<br />
par <strong>le</strong>s entérocytes. Ces échanges sont gravement perturbés par l'adény<strong>la</strong>te cyc<strong>la</strong>se que<br />
contient <strong>la</strong> toxine bactérienne. Quand cette adény<strong>la</strong>te cyc<strong>la</strong>se bactérienne pénètre <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s<br />
entérocytes, el<strong>le</strong> se substitue à l'adény<strong>la</strong>te cyc<strong>la</strong>se cellu<strong>la</strong>ire. Sous son action, <strong>le</strong>s mécanismes<br />
<strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion cellu<strong>la</strong>ire sont détruits. Non seu<strong>le</strong>ment <strong>le</strong>s liqui<strong>de</strong>s et <strong>le</strong>s éléments nutritifs ne<br />
peuvent plus traverser <strong>le</strong>s entérocytes pour gagner <strong>le</strong> système circu<strong>la</strong>toire mais <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s<br />
<strong>la</strong>issent fuir l'e<strong>au</strong> et <strong>le</strong>s é<strong>le</strong>ctrolytes corporels vers l'intestin. Cette fuite liquidienne grave,<br />
irrépressib<strong>le</strong> tant que <strong>la</strong> toxine n'a pas été neutralisée, entraîne l'acidose et <strong>la</strong> déshydratation. A<br />
son tour <strong>la</strong> déshydratation mène à <strong>la</strong> diminution du volume sanguin (hypovolémie), à <strong>la</strong><br />
réduction du débit cardiaque et <strong>au</strong> ra<strong>le</strong>ntissement <strong>de</strong>s fonctions réna<strong>le</strong>s. Un ma<strong>la</strong><strong>de</strong> souffrant<br />
du choléra peut perdre 15 à 20 litres <strong>de</strong> liqui<strong>de</strong> par jour.<br />
I.B.2.3.b<br />
Endotoxines<br />
L'endotoxine <strong>de</strong>s bactéries à gram négatif fait partie <strong>de</strong> <strong>le</strong>ur paroi et est constituée par<br />
<strong>le</strong>s lipopolysacchari<strong>de</strong>s <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrane externe. El<strong>le</strong> est relâchée en gran<strong>de</strong> quantité lors <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
lyse cellu<strong>la</strong>ire. Sa toxicité est variab<strong>le</strong> et dépend en particulier <strong>de</strong> sa composition chimique<br />
qui est fonction <strong>de</strong> l'espèce bactérienne.<br />
Le lipi<strong>de</strong> A, constituant du LPS, est généra<strong>le</strong>ment composé d'une ossature <strong>de</strong><br />
glucosamine portant <strong>de</strong>s chaînes aliphatiques: il est responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> toxicité <strong>de</strong> <strong>la</strong> molécu<strong>le</strong>.<br />
Du point <strong>de</strong> vue fonctionnel, une partie saccharidique, même très limitée, est indispensab<strong>le</strong><br />
car el<strong>le</strong> assure <strong>la</strong> solubilité du lipi<strong>de</strong> A.<br />
Au cours <strong>de</strong>s septicémies, <strong>la</strong> lyse bactérienne peut être à l'origine d'un choc<br />
endotoxinique via une libération massive <strong>de</strong> lipopolysacchari<strong>de</strong>s. Le LPS se fixe à une<br />
<strong>protéine</strong> sérique, <strong>la</strong> LBP (LPS binding protein). Le comp<strong>le</strong>xe LBP+LPS est reconnu à <strong>la</strong><br />
surface <strong>de</strong>s macrophages par <strong>le</strong> CD14 et <strong>le</strong> TLR-4. Ceci va activer un facteur transcriptionnel<br />
cellu<strong>la</strong>ire NF-kB, qui induit <strong>la</strong> production massive <strong>de</strong> très nombreux gènes impliqués <strong>dans</strong><br />
l’inf<strong>la</strong>mmation.<br />
31
Introduction bibliographique<br />
IC<br />
Résistance <strong>au</strong>x systèmes <strong>de</strong> défenses <strong>de</strong> l’hôte<br />
En permanence, <strong>le</strong>s organismes vivants sont susceptib<strong>le</strong>s d’être en contact avec <strong>de</strong>s<br />
micro-organismes pathogènes. Ils ont développé <strong>de</strong>s mécanismes <strong>de</strong> défense pour lutter contre<br />
ces agents infectieux. Ces mécanismes <strong>de</strong> défense sont tout d'abord physiques comme par<br />
exemp<strong>le</strong> <strong>le</strong>s épithélia ou <strong>la</strong> cuticu<strong>le</strong> chez <strong>le</strong>s insectes, <strong>la</strong> paroi pectocellulosique <strong>de</strong>s p<strong>la</strong>ntes.<br />
I.C.1<br />
Défenses <strong>de</strong>s anim<strong>au</strong>x<br />
Chez <strong>le</strong>s anim<strong>au</strong>x, il existe surtout une réponse immunitaire qui repose sur <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> lignée sanguine qui vont par exemp<strong>le</strong> sécréter <strong>de</strong>s molécu<strong>le</strong>s inf<strong>la</strong>mmatoires ou<br />
cytokines, <strong>de</strong>s molécu<strong>le</strong>s toxiques et phagocyter <strong>le</strong>s pathogènes. Chez <strong>le</strong>s vertébrés, on<br />
distingue c<strong>la</strong>ssiquement <strong>de</strong>ux types <strong>de</strong> réponse, une réponse immédiate dite innée et une<br />
réponse dite adaptative ou spécifique. La réponse immunitaire innée est un système <strong>de</strong><br />
défense ancien présent <strong>dans</strong> <strong>la</strong> majorité <strong>de</strong>s métazoaires comme chez <strong>le</strong>s insectes dont <strong>la</strong><br />
drosophi<strong>le</strong> et chez l’homme. C’est une réponse efficace <strong>au</strong>x infections qui repose notamment<br />
sur <strong>la</strong> reconnaissance <strong>de</strong> motifs microbiens, sur <strong>la</strong> sécrétion d'agents microbici<strong>de</strong>s à spectre<br />
d'activité plus ou moins <strong>la</strong>rge ainsi que sur <strong>la</strong> phagocytose <strong>de</strong>s pathogènes. De plus, chez <strong>le</strong>s<br />
vertébrés, <strong>la</strong> réponse immunitaire innée est nécessaire à l'activation <strong>de</strong> <strong>la</strong> réponse immunitaire<br />
adaptative. L'immunité adaptative dépend <strong>de</strong> l'activation <strong>de</strong>s lymphocytes et <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse<br />
par <strong>le</strong>s lymphocytes B d'immunoglobulines ou anticorps capab<strong>le</strong>s <strong>de</strong> reconnaître <strong>de</strong>s antigènes<br />
précis et qui sont nécessaires à l'élimination du pathogène.<br />
I.C.2<br />
Réactions <strong>de</strong> défenses <strong>de</strong>s p<strong>la</strong>ntes<br />
I.C.2.1<br />
La réaction hypersensib<strong>le</strong>, induite par <strong>le</strong> stress oxydant<br />
Dans <strong>le</strong>s cas <strong>de</strong>s bactéries phytopathogènes, l’apparition <strong>de</strong> <strong>la</strong> ma<strong>la</strong>die résulte <strong>de</strong><br />
l’infection par <strong>le</strong> pathogène d’une p<strong>la</strong>nte dite hôte <strong>au</strong> cours d’une réaction dite compatib<strong>le</strong>.<br />
Par contre, si une bactérie pathogène attaque une p<strong>la</strong>nte non hôte <strong>au</strong> cours d’une réaction<br />
incompatib<strong>le</strong>, cel<strong>le</strong>-ci met en p<strong>la</strong>ce un système <strong>de</strong> résistance très efficace appelé réaction<br />
hypersensib<strong>le</strong>. Cette réaction aboutit <strong>au</strong> confinement du pathogène <strong>au</strong> site <strong>de</strong> l’attaque et en sa<br />
32
Introduction bibliographique<br />
neutralisation. La mise en p<strong>la</strong>ce <strong>de</strong> <strong>la</strong> réaction incompatib<strong>le</strong> est déterminée <strong>au</strong> nive<strong>au</strong><br />
génétique par une réaction dite « gène pour gène », avec <strong>le</strong>s gènes d’aviru<strong>le</strong>nce avr chez <strong>la</strong><br />
bactérie et <strong>le</strong>s gènes R <strong>de</strong> résistance chez <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte. La présence d’un gène avr chez <strong>le</strong><br />
pathogène induit une réponse hypersensib<strong>le</strong> si <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte infectée porte <strong>le</strong> gène R correspondant<br />
(Staskawicz et al., 1995). Dans <strong>le</strong> cas d’E. chrysanthemi qui possè<strong>de</strong> un arsenal d’enzymes<br />
dégradatives, l’infection est si bruta<strong>le</strong> que <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte n’a pas <strong>le</strong> temps <strong>de</strong> mettre en p<strong>la</strong>ce une<br />
réponse hypersensib<strong>le</strong>. Cependant, si <strong>la</strong> souche utilisée est mutée pour <strong>le</strong>s principa<strong>le</strong>s pectate<br />
lyases (PelABCE), participant à <strong>la</strong> dégradation <strong>de</strong> <strong>la</strong> paroi végéta<strong>le</strong>, alors <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte met en<br />
p<strong>la</strong>ce une réponse hypersensib<strong>le</strong> qui conduit à une nécrose localisée <strong>au</strong> site d’infection<br />
(Figure 7). Cette réaction hypersensib<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte serait liée à <strong>la</strong> production <strong>de</strong> <strong>la</strong> harpine<br />
HrpN. En effet, une souche ne produisant ni <strong>le</strong>s cinq Pels majeures, ni HrpN, perd sa capacité<br />
d’induire <strong>la</strong> réaction hypersensib<strong>le</strong>. Ainsi, <strong>dans</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> l’effet <strong>de</strong> <strong>la</strong> harpine HrpN<br />
serait masqué par l’action <strong>de</strong>s cinq Pels majeures.<br />
Figure 7 : Réponse hypersensib<strong>le</strong> élicitée par E. chrysanthemi sur feuil<strong>le</strong> <strong>de</strong> tabac (B<strong>au</strong>er<br />
et al., 1995).<br />
La feuil<strong>le</strong> <strong>de</strong> tabac a été photographiée 24h après l’infection. Les souches d’E.<br />
chrysanthemi qui ont été utilisées dérivent <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> EC16 : 1, ∆pelABCE ; 2,<br />
5, ∆pelABCE hrpN - ; 3, 6, ∆pelABCE hrpN - complémentée en trans par hrpN. 4: témoin<br />
négatif, inocu<strong>la</strong>tion avec du tampon ne contenant pas <strong>de</strong> bactéries.<br />
33
Introduction bibliographique<br />
Parmi <strong>le</strong>s mécanismes impliqués <strong>dans</strong> une interaction compatib<strong>le</strong> ou non entre <strong>la</strong><br />
p<strong>la</strong>nte et <strong>le</strong> pathogène, <strong>la</strong> cinétique <strong>de</strong> <strong>la</strong> genèse d’un stress oxydant est primordia<strong>le</strong> (Mehdy,<br />
1994). Un parallè<strong>le</strong> peut être fait avec <strong>le</strong> stress oxydant observé lors <strong>de</strong> <strong>la</strong> phagocytose <strong>de</strong><br />
pathogènes par <strong>le</strong>s macrophages chez <strong>le</strong>s mammifères (Babior, 1992). Dès <strong>la</strong> première heure<br />
suivant l’infection, <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s végéta<strong>le</strong>s émettent transitoirement une première vague <strong>de</strong><br />
radic<strong>au</strong>x oxygénés activés tels que <strong>le</strong>s peroxy<strong>de</strong>s (H 2 O 2 ), <strong>de</strong>s radic<strong>au</strong>x hydroxy<strong>le</strong>s (OH·) ou<br />
<strong>de</strong>s ions superoxy<strong>de</strong>s O - 2 : c’est <strong>la</strong> réponse primaire aspécifique.<br />
Dans <strong>le</strong> cas d’une interaction incompatib<strong>le</strong>, cette réponse aspécifique est suivie <strong>au</strong><br />
bout <strong>de</strong> 3 à 6 heures d’une réponse secondaire spécifique consistant en une <strong>de</strong>uxième vague<br />
oxydative plus importante et plus soutenue (Figure 8).<br />
Radic<strong>au</strong>x oxygénés activés<br />
I<br />
II<br />
Incompatib<strong>le</strong><br />
Compatib<strong>le</strong><br />
0 2 4 6<br />
Temps après l’infection (heures)<br />
Figure 8 : Production <strong>de</strong> composés oxygénés activés lors d’une interaction p<strong>la</strong>ntepathogène<br />
compatib<strong>le</strong> ou incompatib<strong>le</strong>.<br />
La production biphasique <strong>de</strong> composés oxygénés activés est caractéristique d’une<br />
réaction incompatib<strong>le</strong>. Dans <strong>le</strong> cas d’une réaction compatib<strong>le</strong>, seu<strong>le</strong> <strong>la</strong> première phase<br />
oxydative a lieu.<br />
Ces radic<strong>au</strong>x oxygénés proviennent du détournement du flux é<strong>le</strong>ctronique <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
respiration vers une oxydase <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrane cellu<strong>la</strong>ire végéta<strong>le</strong> (Mehdy, 1994). Ce stress<br />
oxydant provoque <strong>la</strong> mort <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s végéta<strong>le</strong>s proches du site infectieux mais permet <strong>au</strong>ssi<br />
34
Introduction bibliographique<br />
d’activer <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> lignine ainsi que <strong>de</strong> catalyser <strong>le</strong> pontage intermolécu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong>s<br />
<strong>protéine</strong>s riches en proline ou en hydroxyproline <strong>de</strong> <strong>la</strong> paroi végéta<strong>le</strong> (Brad<strong>le</strong>y et al., 1992).<br />
Cette con<strong>de</strong>nsation <strong>de</strong> <strong>la</strong> paroi <strong>la</strong> rend plus résistante à l’action <strong>de</strong>s enzymes lytiques du<br />
pathogène et gène sa progression <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s tissus végét<strong>au</strong>x (Brisson et al., 1994). La lyse <strong>de</strong>s<br />
cellu<strong>le</strong>s végéta<strong>le</strong>s par <strong>le</strong> stress oxydant ou par l’action <strong>de</strong>s enzymes lytiques du pathogène<br />
aboutit à <strong>la</strong> libération <strong>de</strong> fragments <strong>de</strong> paroi végéta<strong>le</strong>. Ces fragments oligosaccharidiques<br />
contribuent à l’activation <strong>de</strong>s réactions <strong>de</strong> défense <strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte en stimu<strong>la</strong>nt notamment <strong>la</strong><br />
synthèse <strong>de</strong> peroxy<strong>de</strong>s (Hahn et al., 1993). Enfin, ces radic<strong>au</strong>x oxygénés participent à <strong>la</strong><br />
peroxydation <strong>de</strong>s lipi<strong>de</strong>s membranaires <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s végéta<strong>le</strong>s lysées, qui génère <strong>de</strong>s composés<br />
à activité biostatique ou antibiotique (Kepp<strong>le</strong>r et Baker, 1989 ; Peng et Kuc, 1992). Parmi ces<br />
composés, <strong>le</strong> jasmonate, produit <strong>de</strong> <strong>la</strong> peroxydation du linoléate, serait impliqué <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
protection <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s végéta<strong>le</strong>s saines, proches du site d’infection, <strong>de</strong>s composés oxygénés<br />
toxiques. Ceci permettrait <strong>de</strong> confiner <strong>la</strong> réaction hypersensib<strong>le</strong> <strong>au</strong> site d’infection. Enfin, <strong>la</strong><br />
réponse hypersensib<strong>le</strong> aboutit à <strong>la</strong> production par <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s végéta<strong>le</strong>s d’un pic d’aci<strong>de</strong><br />
salicylique, responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’induction <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> gènes codant <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s liées à <strong>la</strong><br />
pathogenèse (De<strong>la</strong>ney et al., 1994). Parmi ces <strong>protéine</strong>s, on trouve <strong>de</strong>s enzymes pouvant<br />
dégra<strong>de</strong>r <strong>la</strong> paroi du pathogène (chitinases, glucanases). Par ail<strong>le</strong>urs, l’aci<strong>de</strong> salicylique s’est<br />
révélé être un bon inhibiteur <strong>de</strong>s pectate lyases produites par E. chrysanthemi (Tardy et al.<br />
1997).<br />
I.C.2.2<br />
Les systèmes <strong>de</strong> défenses contre <strong>le</strong> stress oxydant<br />
Les ions superoxy<strong>de</strong>s ainsi que tout radical oxygéné activé sont <strong>de</strong>s métabolites très<br />
toxiques attaquant l’ADN ainsi que toutes <strong>le</strong>s enzymes du métabolisme cellu<strong>la</strong>ire impliquées<br />
<strong>dans</strong> <strong>de</strong>s fonctions d’oxydoréduction (Farr et al., 1986). En initiant <strong>la</strong> peroxydation <strong>de</strong>s<br />
lipi<strong>de</strong>s, ils peuvent éga<strong>le</strong>ment entraîner <strong>de</strong> graves lésions <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong>s membranes et mettre<br />
ainsi en danger l’intégrité cellu<strong>la</strong>ire (Storz et Im<strong>la</strong>y, 1999). Les bactéries ont donc développé<br />
<strong>de</strong>s systèmes <strong>le</strong>ur permettant <strong>de</strong> se protéger <strong>de</strong> l’action <strong>de</strong>s agents oxydants. Plusieurs <strong>de</strong> ces<br />
systèmes sont bien caractérisés chez E. coli et éga<strong>le</strong>ment chez E. chrysanthemi.<br />
Le cas du régu<strong>la</strong>teur OxyR a été bien décrit. OxyR est un facteur <strong>de</strong> transcription<br />
répondant spécifiquement à <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> peroxy<strong>de</strong> d’hydrogène (H 2 O 2 ). En présence <strong>de</strong><br />
peroxy<strong>de</strong> d’hydrogène, cette <strong>protéine</strong> tétramérique subit une oxydation conduisant à <strong>la</strong><br />
formation <strong>de</strong> ponts disulfures intramolécu<strong>la</strong>ires. Sous forme oxydée, OxyR active<br />
l’expression <strong>de</strong>s gènes du régulon oxyR, dont <strong>la</strong> plupart sont c<strong>la</strong>irement impliqués <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s<br />
réactions <strong>de</strong> défense contre <strong>le</strong> stress oxydant (To<strong>le</strong>dano et al., 1994 ; Pomposiello et Demp<strong>le</strong>,<br />
35
Introduction bibliographique<br />
2001)). Ainsi, l’expression du gène katG est induite en présence d’OxyR sous forme oxydée.<br />
katG co<strong>de</strong> <strong>la</strong> cata<strong>la</strong>se hydroperoxydase I, qui constitue <strong>le</strong> système majeur <strong>de</strong> détoxification du<br />
peroxy<strong>de</strong> d’hydrogène (Gonza<strong>le</strong>z-F<strong>le</strong>cha et Demp<strong>le</strong>, 1997). Les cellu<strong>le</strong>s phagocytaires<br />
anima<strong>le</strong>s (neutrophi<strong>le</strong>s, monocytes, macrophages,…) sont capab<strong>le</strong>s <strong>de</strong> générer <strong>de</strong>s ions<br />
superoxy<strong>de</strong>s grâce à un transfert d’é<strong>le</strong>ctrons du NADPH vers <strong>le</strong> dioxygène (Segal, 1989).<br />
Pour contrer ces défenses, <strong>le</strong> rô<strong>le</strong> <strong>de</strong>s cata<strong>la</strong>ses bactériennes est déterminant. En effet, chez <strong>le</strong>s<br />
bactéries Staphylococcus <strong>au</strong>reus, Listeria monocytogenes et Mycobacterium tuberculosis, il a<br />
été observé qu’une forte concentration intracellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> cata<strong>la</strong>se est corrélée avec une<br />
résistance à ces défenses produites par <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s phagocytaires (Man<strong>de</strong>ll, 1975 ; Welch et<br />
al., 1979 ; Kusunose et al., 1976).<br />
De même, <strong>le</strong> gène oxyR d’E. chrysanthemi co<strong>de</strong> une <strong>protéine</strong> présentant 88% <strong>de</strong><br />
simi<strong>la</strong>rité avec cel<strong>le</strong> d’E. coli (Miguel et al., 2000). Le mutant oxyR d’E. chrysanthemi<br />
possè<strong>de</strong> une sensibilité accrue <strong>au</strong> peroxy<strong>de</strong> d’hydrogène, cependant il ne présente pas une<br />
viru<strong>le</strong>nce significativement réduite sur tubercu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre ou sur p<strong>la</strong>nts <strong>de</strong> tabac<br />
(Miguel et al., 2000). Une hypothèse est qu’E. chrysanthemi possè<strong>de</strong> plusieurs systèmes<br />
redondants <strong>de</strong> détoxification du peroxy<strong>de</strong> d’hydrogène.<br />
E. chrysanthemi possè<strong>de</strong> éga<strong>le</strong>ment une superoxy<strong>de</strong> dismutase cytop<strong>la</strong>smique, SodA,<br />
impliquée <strong>dans</strong> <strong>la</strong> détoxification <strong>de</strong>s ions superoxy<strong>de</strong>s. Dans ce cas éga<strong>le</strong>ment, <strong>la</strong> <strong>protéine</strong><br />
d’E. chrysanthemi possè<strong>de</strong> une forte homologie (85% <strong>de</strong> simi<strong>la</strong>rité) avec cel<strong>le</strong> d’E. coli<br />
(Santos et al., 2001). Le mutant sodA d’E. chrysanthemi est plus sensib<strong>le</strong> que <strong>la</strong> souche<br />
parenta<strong>le</strong> à <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> paraquat, capab<strong>le</strong> <strong>de</strong> générer l’ion O - 2 (Santos et al., 2001). Sur<br />
tubercu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre, ce mutant possè<strong>de</strong> une capacité <strong>de</strong> macération i<strong>de</strong>ntique à cel<strong>le</strong><br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong>. En revanche, sa viru<strong>le</strong>nce est fortement diminuée sur p<strong>la</strong>nts <strong>de</strong><br />
Saintp<strong>au</strong>lia ionantha. Il existe éga<strong>le</strong>ment, chez cette bactérie, d’<strong>au</strong>tres systèmes <strong>de</strong> résistance<br />
<strong>au</strong> stress oxydant, tels que <strong>la</strong> pepti<strong>de</strong> méthionine sulfoxy<strong>de</strong> réductase MsrA, <strong>la</strong><br />
f<strong>la</strong>vohémoglobine HmpX ou <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> SufC (El Hassouni et al., 1999 ; Favey et al., 1995 ;<br />
Nachin et al., 2001).<br />
L’ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong> ces systèmes met en évi<strong>de</strong>nce <strong>le</strong> rô<strong>le</strong> déterminant d’une bonne<br />
résistance <strong>au</strong> stress oxydant pour une bactérie pathogène.<br />
36
Introduction bibliographique<br />
ID<br />
Conclusion sur <strong>le</strong>s intéractions hôte-pathogène<br />
A <strong>la</strong> vue <strong>de</strong> ces différents exemp<strong>le</strong>s, il ressort que <strong>le</strong>s interactions entre <strong>le</strong>s bactéries<br />
pathogènes et <strong>le</strong>urs hôtes anim<strong>au</strong>x ou végét<strong>au</strong>x mettent en jeu <strong>de</strong>s systèmes et <strong>de</strong>s<br />
mécanismes simi<strong>la</strong>ires ; <strong>le</strong>s spécificités <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce <strong>de</strong> ces <strong>de</strong>ux types <strong>de</strong><br />
pathogène étant en liaison étroite avec <strong>le</strong>s caractéristiques du règne animal et végétal.<br />
II Régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’expression génique chez <strong>le</strong>s procaryotes<br />
Il est indispensab<strong>le</strong> pour <strong>le</strong>s bactéries <strong>de</strong> répondre et <strong>de</strong> s’adapter <strong>au</strong>x changements <strong>de</strong>s<br />
conditions environnementa<strong>le</strong>s. Une <strong>de</strong>s manières essentiel<strong>le</strong>s par <strong>le</strong>squel<strong>le</strong>s ces mécanismes<br />
adaptatifs sont réalisés consiste en une régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes requis <strong>dans</strong> <strong>de</strong>s<br />
conditions données. Ainsi <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s réponses adaptatives bactériennes est régie par<br />
l’ARN polymérase et <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> transcription qui, en réponse à <strong>de</strong>s sign<strong>au</strong>x, déc<strong>le</strong>nchent<br />
<strong>le</strong>s réponses transcriptionnel<strong>le</strong>s requises. Chaque étape du passage entre <strong>le</strong> gène et son produit<br />
est exploitée pour exercer ce contrô<strong>le</strong>, mais par souci d’une économie d’énergie, l’étape c<strong>le</strong>f<br />
se situe <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription.<br />
IIA<br />
Au nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription<br />
Cette étape crucia<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’expression génique requiert l’interaction <strong>de</strong> l’ARN<br />
polymérase avec <strong>le</strong>s promoteurs <strong>de</strong> l’ADN et l’ouverture <strong>de</strong> l’ADN doub<strong>le</strong> brin <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> du<br />
point d’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription. L’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> ce phénomène chez <strong>la</strong> bactérie modè<strong>le</strong> E. coli,<br />
a permis <strong>de</strong> comprendre <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription <strong>dans</strong> tous <strong>le</strong>s règnes vivants.<br />
II.A.1<br />
L’ARN polymérase est l’élément central <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription<br />
La composante centra<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription chez <strong>le</strong>s<br />
bactéries est l’ARN polymérase, qui est responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription à proprement par<strong>le</strong>r<br />
(Ebright, 2000). L’ARN polymérase est constitué <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux parties : l’enzyme core et <strong>le</strong> facteur<br />
sigma. Réunis, ils forment l’holoenzyme. Le rô<strong>le</strong> du facteur sigma est détaillé plus bas.<br />
37
Introduction bibliographique<br />
II.A.1.1 L’enzyme core, <strong>la</strong> partie catalytique <strong>de</strong> l’ARN polymerase<br />
L’enzyme core est responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription mais non <strong>de</strong> <strong>la</strong> reconnaissance du<br />
promoteur. El<strong>le</strong> est constituée <strong>de</strong> cinq sous unités : β, β′, <strong>de</strong>ux sous unités α i<strong>de</strong>ntiques et une<br />
petite sous unité ω (Figure 9). Les étu<strong>de</strong>s structura<strong>le</strong>s ont montré que l’enzyme core adopte<br />
une structure en pince <strong>de</strong> crabes, qui est simi<strong>la</strong>ire à <strong>la</strong> structure <strong>de</strong> l’ARN polymérase II <strong>de</strong>s<br />
<strong>le</strong>vures (Zhang et al., 1999 ; Fu et al., 1999). Le site actif <strong>de</strong> l’ARN polymérase est formé <strong>de</strong>s<br />
sous unités β et β’ (1342 et 1407 aci<strong>de</strong>s aminés respectivement chez E. coli (Korzheva et al.,<br />
2000), un ion Mg 2+ est indispensab<strong>le</strong> <strong>au</strong> bon fonctionnement du site actif. Chacune <strong>de</strong>s sous<br />
unité α (329 aci<strong>de</strong>s aminés) est formée par <strong>de</strong>ux domaines repliés indépendamment et reliés<br />
par une région charnière, partie f<strong>le</strong>xib<strong>le</strong> d’une vingtaine d’aci<strong>de</strong>s aminés (B<strong>la</strong>tter et al., 1994).<br />
La partie amino-termina<strong>le</strong> est <strong>la</strong> plus gran<strong>de</strong> (résidus 1 à 235). Sa dimérisation permet<br />
d’assemb<strong>le</strong>r <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux sous unités β et β′. La petite partie carboxy-termina<strong>le</strong> <strong>de</strong>s sous unités α<br />
(résidus 250 à 329) est un domaine <strong>de</strong> fixation à l’ADN, qui joue un rô<strong>le</strong> <strong>dans</strong> l’interaction<br />
avec certains promoteurs (Gourse et al., 2000). La petite sous-unité ω n’a pas <strong>de</strong> rô<strong>le</strong> direct<br />
<strong>dans</strong> <strong>la</strong> transcription, mais semb<strong>le</strong> fonctionner comme une chaperonne pour <strong>le</strong> repliement <strong>de</strong><br />
<strong>la</strong> sous unité β′.<br />
38
Introduction bibliographique<br />
Figure 9 : Structure <strong>de</strong> l’ARN polymérase et son interaction avec un promoteur (d’après<br />
Browning et Busby, 2004).<br />
II.A.1.2<br />
La région promotrice : à <strong>la</strong> fois structurée et modu<strong>la</strong>ire<br />
Figure 10 : Eléments princip<strong>au</strong>x du gène procaryote.<br />
39
Introduction bibliographique<br />
L’étape c<strong>le</strong>f <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription est <strong>la</strong> reconnaissance du promoteur par<br />
l’ARN polymérase. Les différents éléments <strong>de</strong> <strong>la</strong> séquence d’ADN constituants un promoteur<br />
ont été étudiés intensivement (Busby et Ebright, 1994) (Figure 10). Quatre éléments<br />
différents ont été i<strong>de</strong>ntifiés. Les <strong>de</strong>ux princip<strong>au</strong>x sont l’hexamère -10 (Pribnow, 1975) et<br />
l’hexamère -35 qui sont centrés à 10 et 35 paires <strong>de</strong> bases en amont du point d’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
transcription et distant entre eux généra<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> 17 bases.<br />
L’hexamère -10 est reconnu par <strong>le</strong> domaine 2 <strong>de</strong> <strong>la</strong> sous unité σ <strong>de</strong> l’ARN polymérase<br />
alors que l’hexamère -35 est reconnu par <strong>le</strong> domaine 4 du facteur σ. Des séquences consensus<br />
pour <strong>le</strong>s éléments -10 et -35 ont été établies : <strong>la</strong> séquence consensus TATAAT forme<br />
l’hexamère -10 et <strong>la</strong> séquence TTGACA constitue <strong>le</strong> consensus <strong>de</strong> l’élément -35. Des étu<strong>de</strong>s<br />
cristallographiques ont permis l’é<strong>la</strong>boration <strong>de</strong> modè<strong>le</strong>s qui expliquent <strong>le</strong>s mécanismes <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
reconnaissance <strong>de</strong> ces séquences par l’ARN polymérase (Campbell et al., 2002, Murakami et<br />
al., 2002). Les <strong>de</strong>ux <strong>au</strong>tres éléments importants <strong>de</strong> <strong>la</strong> structure d’un promoteur sont <strong>le</strong>s<br />
éléments -10 étendus et <strong>le</strong>s éléments UP. Le -10 étendu est un motif <strong>de</strong> 3 à 4 paires <strong>de</strong> bases<br />
situées immédiatement en amont <strong>de</strong> l’hexamère -10. Il est reconnu par <strong>le</strong> domaine 3 du<br />
facteur σ (Murakami et al., 2002 ; San<strong>de</strong>rson et al., 2003). L’élément UP est composé d’une<br />
vingtaine <strong>de</strong> paires <strong>de</strong> bases située en amont <strong>de</strong> l’hexamère -35. Il est reconnu par <strong>le</strong>s<br />
domaines carboxytermin<strong>au</strong>x <strong>de</strong>s sous unités α <strong>de</strong> l’ARN polymérase (Ross et al., 2001).<br />
Ainsi, <strong>le</strong>s éléments -10, -35, -10 étendus et UP assurent une fixation spécifique <strong>de</strong> l’ARN<br />
polymérase <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> du promoteur (Figure 10), mais <strong>la</strong> contribution re<strong>la</strong>tive <strong>de</strong> chaque<br />
élément diffère d’un promoteur à un <strong>au</strong>tre.<br />
Le rô<strong>le</strong> <strong>de</strong> ces éléments est donc <strong>de</strong> permettre <strong>la</strong> fixation initia<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’ARN polymérase<br />
qui conduit à <strong>la</strong> formation du comp<strong>le</strong>xe ouvert puis <strong>au</strong>x étapes suivantes <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription.<br />
Dans <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> bactérienne, l’ARN polymérase est face à un ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong> presque 2000<br />
séquences promotrices (Salgado et al., 2001). Les différences entre ces séquences participent<br />
fortement à <strong>la</strong> distribution inéga<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’ARN polymérase entre <strong>le</strong>s différentes unités <strong>de</strong><br />
transcription. Plus un promoteur à une séquence proche du consensus, plus il est efficace. Le<br />
fait que <strong>la</strong> quasi-totalité <strong>de</strong>s promoteurs possè<strong>de</strong>nt une séquence qui diffère du consensus met<br />
en évi<strong>de</strong>nce que l’activité <strong>de</strong> chaque promoteur est en ba<strong>la</strong>nce avec cel<strong>le</strong> <strong>de</strong>s <strong>au</strong>tres<br />
promoteurs (Tab<strong>le</strong><strong>au</strong> 1). Même si <strong>le</strong>s différences <strong>de</strong> séquences permettent une régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong><br />
l’activité <strong>de</strong>s promoteurs, cette régu<strong>la</strong>tion est statique et ne peut pas être modulée en fonction<br />
<strong>de</strong>s conditions environnementa<strong>le</strong>s perçues par <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong>. La plupart <strong>de</strong>s régu<strong>la</strong>tions<br />
adaptatives sont médiées par <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> transcription, comme décrit plus bas.<br />
40
Introduction bibliographique<br />
-35 -10<br />
T T G A C A T A T A A T<br />
A 10 6 9 56 21 54 5 76 15 61 56 6<br />
C 10 7 12 17 54 13 10 6 11 13 20 7<br />
G 10 8 61 11 9 16 8 6 14 14 8 5<br />
T 69 79 18 16 16 17 77 12 60 12 15 82<br />
Tab<strong>le</strong><strong>au</strong> 1 : Fréquence d’apparition <strong>de</strong>s nucléoti<strong>de</strong>s <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s éléments -35 et -10 du promoteur<br />
bactérien. Les fréquences sont indiquées en pourcentage, cel<strong>le</strong>s concernant <strong>le</strong>s bases <strong>de</strong>s<br />
consensus apparaissent en gras (Lisser et Margalit, 1993).<br />
II.A.1.3 Les étapes <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription<br />
Le processus <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription se divise en trois principa<strong>le</strong>s étapes : l’initiation,<br />
l’élongation et <strong>la</strong> terminaison. L’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription requiert l’interaction <strong>de</strong> l’ARN<br />
polymérase avec <strong>la</strong> région d’ADN correspondant à un promoteur (Figure 11). Cette fixation<br />
<strong>de</strong> l’ARN polymérase se fait via <strong>le</strong>s domaines 2 et 4 du facteur σ qui vont interagir avec <strong>le</strong>s<br />
hexamères -10 et -35, respectivement (De Haseth et al., 1998).<br />
Après <strong>la</strong> fixation initia<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’ARN polymérase, <strong>le</strong>s brins d’ADN compris entre <strong>le</strong>s<br />
positions -10 et +2 par rapport <strong>au</strong> point d’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription s’ouvrent pour former<br />
une « bul<strong>le</strong> » appelée <strong>le</strong> comp<strong>le</strong>xe ouvert (Tsujikawa et al., 2002 ; Tomsic et al., 2001). La<br />
formation du comp<strong>le</strong>xe ouvert est due à une isomérisation. Cette isomérisation est encore mal<br />
comprise, mais il en résulte un mouvement <strong>de</strong> l’ADN simp<strong>le</strong> brin <strong>de</strong> <strong>la</strong> « bul<strong>le</strong> » vers <strong>le</strong> site<br />
actif <strong>de</strong> l’ARN polymérase, étape qui se poursuit par <strong>la</strong> formation <strong>de</strong> <strong>la</strong> première liaison<br />
phosphodiester entre <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux premiers nucléosi<strong>de</strong>s triphosphates. Après que 9 à 12<br />
nucléosi<strong>de</strong>s d’ARN aient été synthétisés, <strong>le</strong> comp<strong>le</strong>xe d’initiation entre <strong>dans</strong> <strong>le</strong> sta<strong>de</strong><br />
d’élongation. Cette transition est marquée par un changement conformationnel significatif qui<br />
conduit notamment <strong>au</strong> re<strong>la</strong>rgage du facteur σ (Ishihama, 2000).<br />
Ainsi, <strong>la</strong> synthèse d’ARN implique plusieurs étapes, qui peuvent toutes être sujet à<br />
régu<strong>la</strong>tion. Par soucis d’économie, <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong> ces régu<strong>la</strong>tions ont lieu <strong>au</strong>x étapes initia<strong>le</strong>s <strong>de</strong><br />
<strong>la</strong> transcription. Le facteur limitant à cette étape est généra<strong>le</strong>ment <strong>la</strong> disponibilité <strong>de</strong> l’ARN<br />
polymérase. En effet, <strong>le</strong> nombre total <strong>de</strong> molécu<strong>le</strong>s d’enzyme core <strong>dans</strong> <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s en<br />
croissance d’E. coli est d’environ 2000, ce qui est moins que <strong>le</strong> nombre <strong>de</strong> gènes d’E. coli<br />
(environ 5000) (Ishihama, 1981 ; Ishihama, 1997 ; B<strong>la</strong>ttner et al., 1997). Dans ces conditions,<br />
<strong>la</strong> majorité <strong>de</strong> l’holoenzyme active est engagée <strong>dans</strong> <strong>la</strong> transcription <strong>de</strong>s gènes codant <strong>le</strong>s<br />
ARNs stab<strong>le</strong>s (ARN ribosom<strong>au</strong>x et <strong>de</strong> transferts), nécessaire à <strong>la</strong> traduction. Donc <strong>la</strong> quantité<br />
41
Introduction bibliographique<br />
d’ARN polymérase disponib<strong>le</strong> pour transcrire <strong>le</strong>s quatre à cinq mil<strong>le</strong> gènes <strong>de</strong> <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> est<br />
limitée (Ishihama, 2000). Il y a donc une compétition intense entre <strong>le</strong>s différents promoteurs<br />
pour <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> l’holoenzyme (Ishihama, 2000 ; Maeda et al., 2000). Ceci explique en<br />
partie comment <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s peuvent synthétiser une gran<strong>de</strong> quantité d’un ARN messager<br />
donné mais peu ou pas d’un <strong>au</strong>tre. Ce constat a conduit à l’hypothèse selon <strong>la</strong>quel<strong>le</strong> <strong>la</strong><br />
fixation <strong>de</strong> l’ARN polymérase sur <strong>le</strong>s promoteurs et <strong>la</strong> formation du comp<strong>le</strong>xe ouvert<br />
constituent <strong>le</strong>s étapes c<strong>le</strong>fs <strong>de</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion transcriptionnel<strong>le</strong>. Cinq éléments essentiels<br />
semb<strong>le</strong>nt diriger <strong>la</strong> répartition <strong>de</strong> l’ARN polymérase sur <strong>le</strong>s différents promoteurs. Il s’agit,<br />
comme précé<strong>de</strong>mment indiqué, <strong>de</strong> <strong>la</strong> séquence en ADN <strong>de</strong>s régions promotrices, <strong>la</strong> proportion<br />
re<strong>la</strong>tive <strong>de</strong>s différents facteurs σ, mais <strong>au</strong>ssi <strong>de</strong> <strong>la</strong> présence <strong>de</strong>s petits ligands, <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong><br />
transcription et <strong>de</strong> l’organisation structura<strong>le</strong> du chromosome bactérien.<br />
42
Introduction bibliographique<br />
Figure 11 : Les étapes <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription bactérienne (d’après Browning et<br />
Busby, 2004).<br />
43
Introduction bibliographique<br />
II.A.2<br />
La régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription<br />
II.A.2.1<br />
Les acteurs<br />
II.A.2.1.a Les facteurs sigma : acteurs <strong>de</strong> <strong>la</strong> reconnaissance <strong>de</strong>s promoteurs<br />
II.A.2.1.a.i<br />
La sous-unité sigma (σ)<br />
Comme précé<strong>de</strong>mment indiqué, <strong>la</strong> transcription commence par une interaction <strong>de</strong><br />
l’enzyme core <strong>de</strong> l’ARN polymérase avec <strong>le</strong>s régions promotrices <strong>de</strong> l’ADN. Cette interaction<br />
se fait par <strong>le</strong> biais <strong>de</strong> <strong>la</strong> sous-unité σ. Le premier facteur σ bactérien a été découvert en 1969<br />
comme <strong>la</strong> sous unité <strong>de</strong> l’ARN polymérase d’E. coli essentiel<strong>le</strong> pour <strong>la</strong> sé<strong>le</strong>ction du<br />
promoteur (Burgess et al., 1969).<br />
La sous unité σ, ou facteur σ, a trois fonctions principa<strong>le</strong>s : assurer <strong>la</strong> reconnaissance<br />
<strong>de</strong>s séquences spécifiques d’un promoteur, positionner l’holoenzyme <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> du promoteur<br />
cib<strong>le</strong> et faciliter l’ouverture <strong>de</strong> <strong>la</strong> doub<strong>le</strong> hélice d’ADN <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> du site d’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
transcription (Wösten, 1998). La plupart <strong>de</strong>s bactéries possè<strong>de</strong> plusieurs facteurs σ qui<br />
permettent <strong>de</strong> reconnaître différents ensemb<strong>le</strong>s <strong>de</strong> promoteurs. A l’exception <strong>de</strong> <strong>la</strong> famil<strong>le</strong> σ 54 ,<br />
tous <strong>le</strong>s facteurs σ partagent <strong>le</strong>s mêmes caractéristiques (Merrick, 1993 ; Campbell et al.,<br />
2002). Ils possè<strong>de</strong>nt généra<strong>le</strong>ment quatre domaines reliés par <strong>de</strong>s régions charnières. Les<br />
domaines 2, 3 et 4 sont connus pour être impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> reconnaissance du promoteur<br />
(Murakami et al., 2002; Vassylyev et al., 2002). Le rô<strong>le</strong> du domaine 1 reste mal compris.<br />
E. coli possè<strong>de</strong> un facteur σ 70 , dit facteur végétatif, qui permet <strong>la</strong> reconnaissance par<br />
l’holoenzyme <strong>de</strong> <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s promoteurs. Cependant <strong>le</strong> génome d’E. coli contient six <strong>au</strong>tres<br />
facteurs σ qui s’accumu<strong>le</strong>nt en réponse à différents stress plus ou moins spécifiques<br />
(Ishihama, 2000). En raison <strong>de</strong> <strong>le</strong>ur caractère inductib<strong>le</strong>, ces facteurs σ alternatifs peuvent<br />
entrer en compétition avec <strong>le</strong> facteur σ 70 pour <strong>la</strong> fixation à l’enzyme core. Ils se lient à une<br />
certaine quantité d’enzyme core et permettent d’initier <strong>la</strong> transcription <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong><br />
promoteurs portant <strong>de</strong>s éléments <strong>de</strong> séquences particuliers (Maeda et al., 2000).<br />
Le nombre <strong>de</strong> facteur σ varie d’un pour Mycop<strong>la</strong>sma genitalium à 63 pour<br />
Streptomyces coelicolor (Gruber et Gross, 2003). Il apparaît une étroite corré<strong>la</strong>tion entre <strong>le</strong><br />
nombre <strong>de</strong> facteur σ et <strong>la</strong> diversité d’environnements <strong>dans</strong> <strong>le</strong>squels <strong>le</strong> micro-organisme peut<br />
survivre.<br />
44
Introduction bibliographique<br />
II.A.2.1.a.ii Les facteurs σ impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> transcription <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce<br />
Chez <strong>le</strong>s bactéries pathogènes, <strong>le</strong>s facteurs σ alternatifs sont souvent impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce (Tab<strong>le</strong><strong>au</strong> 2). Ces effets se manifestent par une action directe sur <strong>la</strong><br />
régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce ou par un effet indirect, en régu<strong>la</strong>nt <strong>le</strong>s gènes qui<br />
<strong>au</strong>gmentent <strong>le</strong> fitness <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie durant l’infection. Ainsi, <strong>le</strong> facteur σ B <strong>de</strong> Listeria<br />
monocytogenes active directement <strong>la</strong> transcription du gène inlA, qui co<strong>de</strong> l’internaline A,<br />
<strong>protéine</strong> participant à l’invasion <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s phagocytaire non professionnel<strong>le</strong>s (Lingn<strong>au</strong> et<br />
al., 1995 ; Sue et al., 2004). Chez <strong>le</strong>s souches pathogènes entérohémorrhagiques (EHEC) d’E.<br />
coli, <strong>le</strong> mécanisme d’adhésion <strong>au</strong>x cellu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> l’épithélium intestinal nécessite un système <strong>de</strong><br />
sécrétion <strong>de</strong> type III, codé par <strong>le</strong>s gènes du locus LEE dont l’expression est activée par <strong>le</strong><br />
facteur <strong>de</strong> transcription σ S (Beltrametti et al., 1999). L’implication <strong>de</strong> ce facteur σ <strong>dans</strong> <strong>le</strong><br />
contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce est encore plus marquée chez <strong>de</strong>s bactéries comme Salmonel<strong>la</strong><br />
thyphimurium. En effet, <strong>de</strong>s mutants rpoS, codant σ S , <strong>de</strong> cette bactérie sont tota<strong>le</strong>ment<br />
aviru<strong>le</strong>nts sur <strong>de</strong>s modè<strong>le</strong>s murins (Hengge-Aronis, 2000a). Ce phénotype résulterait <strong>de</strong><br />
l’absence <strong>de</strong> <strong>la</strong> mise en p<strong>la</strong>ce <strong>de</strong> <strong>la</strong> réponse généra<strong>le</strong> <strong>au</strong> stress ainsi que d’une régu<strong>la</strong>tion<br />
inappropriée <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce.<br />
σ S<br />
est éga<strong>le</strong>ment impliqué <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce chez <strong>de</strong>s bactéries<br />
phytopathogènes comme Erwinia carotovora. Chez cette bactérie, σ S contrô<strong>le</strong> négativement <strong>la</strong><br />
synthèse d’enzymes extracellu<strong>la</strong>ires, responsab<strong>le</strong>s <strong>de</strong> <strong>la</strong> dégradation <strong>de</strong> <strong>la</strong> paroi <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s<br />
végéta<strong>le</strong>s et considérées comme un facteur <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce essentiel (An<strong>de</strong>rsson et al., 1999). Un<br />
mutant rpoS d’E. carotovora a une capacité macératrice <strong>au</strong>gmentée in p<strong>la</strong>nta par rapport à<br />
cel<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> mais est incapab<strong>le</strong> <strong>de</strong> croître à <strong>de</strong> fortes <strong>de</strong>nsités et d’entrer en<br />
compétition avec <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> <strong>au</strong>ssi bien in vitro qu’in p<strong>la</strong>nta. Ce déf<strong>au</strong>t <strong>de</strong> croissance<br />
in vivo du mutant rpoS serait lié à une plus gran<strong>de</strong> sensibilité <strong>au</strong>x stress oxydant et osmotique.<br />
Ces <strong>de</strong>ux exemp<strong>le</strong>s suggèrent qu’un gène rpoS fonctionnel est requis pour <strong>la</strong> survie <strong>de</strong>s<br />
bactéries S. typhimurium et E. carotovora <strong>dans</strong> un environnement compétitif et <strong>dans</strong> <strong>de</strong>s<br />
conditions stressantes. Ceci met en évi<strong>de</strong>nce l’importance du coup<strong>la</strong>ge du contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
réponse <strong>au</strong> stress et <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce.<br />
45
Introduction bibliographique<br />
Famil<strong>le</strong>, c<strong>la</strong>sse et facteur sigma<br />
Espèces bactériennes<br />
Famil<strong>le</strong> σ 70 :<br />
réponse <strong>au</strong> stress<br />
σ B B. anthracis, L. monocytogenes, M.<br />
tuberculosis, S. <strong>au</strong>reus, S. epi<strong>de</strong>rmidis<br />
σ S<br />
E. coli, P. aeruginosa, S. enterica serovar<br />
Typhimurium, Erwinia carotovora<br />
σ F<br />
M. tuberculosis<br />
ECF<br />
RpoE<br />
H. influenzae, S. enterica serovar<br />
Typhimurium, V. cho<strong>le</strong>rae<br />
AlgU<br />
P. aeruginosa<br />
PvdS, Fpvl<br />
P. aeruginosa<br />
σ C<br />
M. tuberculosis<br />
σ D<br />
M. tuberculosis<br />
σ E<br />
M. tuberculosis<br />
σ H<br />
M. tuberculosis<br />
HrpL<br />
Erwinia spp., P. syringae<br />
σ 28 FliA<br />
C. jejuni, H. pylori, S. enterica serovar<br />
Typhimurium, V. cho<strong>le</strong>rae, Y. enterocolitica<br />
Famil<strong>le</strong> σ 54<br />
σ N C. jejuni, H. pylori, L. monocytogenes, P.<br />
aeruginosa, P. syringae, V. cho<strong>le</strong>rae, V.<br />
parahaemolyticus<br />
Tab<strong>le</strong><strong>au</strong> 2 : facteurs sigma alternatifs impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce (d’après Kazmierczak et<br />
al., 2005). Les facteurs sigma sont regroupés par c<strong>la</strong>sse. Les c<strong>la</strong>sses réponse <strong>au</strong> stress, ECF et<br />
σ 28 font toutes partie <strong>de</strong> <strong>la</strong> famil<strong>le</strong> σ 70 <strong>de</strong>s facteurs sigma.<br />
46
Introduction bibliographique<br />
II.A.2.1.a.iii Régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’activité <strong>de</strong>s facteurs sigma<br />
Etant donné que différents facteurs σ régu<strong>le</strong>nt <strong>le</strong>s réponses cellu<strong>la</strong>ires à <strong>de</strong>s stress<br />
variés, <strong>le</strong>ur activité est étroitement contrôlée. Cette régu<strong>la</strong>tion peut s’effectuer en contrô<strong>la</strong>nt <strong>la</strong><br />
synthèse du facteur σ, mais <strong>dans</strong> <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s cas, <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion est exercée par <strong>de</strong>s facteurs<br />
anti-σ qui modu<strong>le</strong>nt l’activité d’un facteur σ indépendamment <strong>de</strong> sa transcription et <strong>de</strong> sa<br />
traduction (Hughes et Mathee, 1998). Be<strong>au</strong>coup <strong>de</strong> facteurs anti-σ séquestrent <strong>le</strong> facteurs σ<br />
dont ils modu<strong>le</strong>nt l’activité <strong>de</strong> façon à ce qu’ils ne puissent plus se lier à l’enzyme core. Le<br />
cas du facteur σ S sera traité en détail <strong>dans</strong> <strong>le</strong> paragraphe IIB « Autres mécanismes <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse protéique chez <strong>le</strong>s procaryotes ».<br />
II.A.2.1.b Les petits ligands<br />
Les petits ligands permettent un mécanisme alternatif par <strong>le</strong>quel l’ARN polymérase<br />
peut répondre rapi<strong>de</strong>ment et efficacement <strong>au</strong>x variations <strong>de</strong> l’environnement. Un bon exemp<strong>le</strong><br />
est <strong>la</strong> guanosine 3′,5′ bisphosphate (ppGpp), qui est produite lors d’une carence en aci<strong>de</strong>s<br />
aminés (Chatterji et Ojha, 2001). Le ppGpp déstabilise <strong>le</strong>s comp<strong>le</strong>xes ouverts <strong>de</strong>s promoteurs<br />
qui contrô<strong>le</strong>nt <strong>le</strong>s gènes codant <strong>la</strong> machinerie <strong>de</strong> traduction (Barker et al., 2001). Les<br />
promoteurs sensib<strong>le</strong>s <strong>au</strong> ppGpp ont une courte séquence riche en GC près du point d’initiation<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription. L’activité <strong>de</strong> ces promoteurs requiert éga<strong>le</strong>ment une forte concentration du<br />
nucléoti<strong>de</strong> initiant <strong>la</strong> traduction, généra<strong>le</strong>ment l’ATP (Gaal et al., 1997). Il a été proposé que<br />
<strong>le</strong> ppGpp contrô<strong>le</strong> l’expression <strong>de</strong> <strong>la</strong> machinerie <strong>de</strong> traduction en réponse à une carence en<br />
nutriments alors que <strong>la</strong> disponibilité en ATP permet une régu<strong>la</strong>tion en fonction du t<strong>au</strong>x <strong>de</strong><br />
croissance (Schnei<strong>de</strong>r et al., 2003).<br />
La plupart <strong>de</strong> ces promoteurs recrutent l’ARN polymérase avec une gran<strong>de</strong> efficacité<br />
et peuvent initier <strong>la</strong> transcription à un t<strong>au</strong>x é<strong>le</strong>vé. Cependant pour atteindre ces ren<strong>de</strong>ments, <strong>le</strong><br />
comp<strong>le</strong>xe ouvert doit être stabilisé ce qui <strong>de</strong>man<strong>de</strong> une forte concentration en ATP et un<br />
faib<strong>le</strong> t<strong>au</strong>x <strong>de</strong> ppGpp. Cet exemp<strong>le</strong> met en évi<strong>de</strong>nce une régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
transcription par l’action directe <strong>de</strong> petits ligands.<br />
47
Introduction bibliographique<br />
II.A.2.1.c Les facteurs <strong>de</strong> transcription<br />
Un facteur <strong>de</strong> transcription est une <strong>protéine</strong> nécessaire à l’activation ou <strong>la</strong> répression<br />
<strong>de</strong> l’expression d’un gène. Ils régu<strong>le</strong>nt spécifiquement <strong>la</strong> transcription <strong>de</strong> gènes en se fixant<br />
sur <strong>de</strong>s séquences régu<strong>la</strong>trices situées <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong>s promoteurs <strong>de</strong> ces gènes. Les facteurs <strong>de</strong><br />
transcription peuvent être c<strong>la</strong>ssés en différentes famil<strong>le</strong>s sur <strong>la</strong> base <strong>de</strong> simi<strong>la</strong>rités entre <strong>le</strong>urs<br />
séquences. Une douzaine <strong>de</strong> famil<strong>le</strong>s ont été i<strong>de</strong>ntifiées, dont <strong>le</strong>s mieux caractérisées sont <strong>le</strong>s<br />
famil<strong>le</strong>s LacI, AraC, LysR, CRP et OmpR. Lorsqu’un facteur <strong>de</strong> transcription se lie<br />
spécifiquement à un promoteur, il peut soit activer soit réprimer l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription<br />
(Gral<strong>la</strong>, 1996 ; Barnard et al., 2004). Un facteur <strong>de</strong> transcription peut être activateur,<br />
répresseur ou peut remplir <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux rô<strong>le</strong>s en fonction du promoteur cib<strong>le</strong>. On estime que <strong>le</strong><br />
génome d’E. coli K12 contient 314 facteurs <strong>de</strong> transcription dont 35% sont activateurs, 43%<br />
répresseurs et 22% peuvent exercés <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux fonctions (Perez-Rueda et Col<strong>la</strong>do-Vi<strong>de</strong>s, 2000).<br />
Quelque uns <strong>de</strong> ces facteurs contrô<strong>le</strong>nt une gran<strong>de</strong> quantité <strong>de</strong> gènes, alors que<br />
d’<strong>au</strong>tres régu<strong>le</strong>nt seu<strong>le</strong>ment un ou <strong>de</strong>ux gènes. Il a été estimé que 7 facteurs <strong>de</strong> transcription<br />
contrô<strong>le</strong>nt 50% <strong>de</strong>s gènes régulés, alors qu’environ 60 facteurs régu<strong>le</strong>nt chacun un promoteur<br />
(Martinez-Antonio et Col<strong>la</strong>do-Vi<strong>de</strong>s, 2003). Ces 7 facteurs <strong>de</strong> transcriptions, dits glob<strong>au</strong>x,<br />
sont CRP, FNR, IHF, <strong>Fis</strong>, ArcA, NarL et Lrp. Les facteurs <strong>de</strong> transcriptions glob<strong>au</strong>x :<br />
- contrô<strong>le</strong>nt un grand nombre <strong>de</strong> gènes qui appartiennent à <strong>de</strong>s c<strong>la</strong>sses <strong>de</strong> fonctions<br />
différentes,<br />
- contrô<strong>le</strong>nt une casca<strong>de</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tions comp<strong>le</strong>xe par <strong>de</strong>s mécanismes directs (fixation<br />
du régu<strong>la</strong>teur sur <strong>le</strong> promoteur cib<strong>le</strong>) et indirects (régu<strong>la</strong>tions <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>teurs du<br />
promoteur cib<strong>le</strong>),<br />
- agissent sur <strong>de</strong>s promoteurs qui interagissent avec différents facteurs σ.<br />
Les facteurs <strong>de</strong> transcription coup<strong>le</strong>nt l’expression <strong>de</strong>s gènes avec <strong>le</strong>s sign<strong>au</strong>x<br />
environnement<strong>au</strong>x. Leur propre activité est donc être finement contrôlée par différents<br />
mécanismes. En premier lieu, l’affinité du facteur <strong>de</strong> transcription pour sa séquence d’ADN<br />
cib<strong>le</strong> peut être modifiée par <strong>de</strong>s ligands, dont <strong>le</strong>s concentrations fluctuent en fonction <strong>de</strong>s<br />
conditions nutritives ou <strong>de</strong> certains stress. Un exemp<strong>le</strong> est <strong>la</strong> forte <strong>au</strong>gmentation <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
spécificité <strong>de</strong> liaison à l’ADN <strong>de</strong> l’activateur CRP par l’AMPc. Un second mécanisme<br />
implique <strong>de</strong>s modifications cova<strong>le</strong>ntes <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> transcription. Ainsi, NarL se lie à sa<br />
cib<strong>le</strong> ADN uniquement lorsqu’il a été phosphorilé par <strong>le</strong>s kinases NarX ou NarQ, qui<br />
répon<strong>de</strong>nt à <strong>la</strong> présence d’ions nitrite ou nitrate (Darwin et al., 1996). Troisièmement, <strong>la</strong><br />
48
Introduction bibliographique<br />
concentration intracellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> certains facteurs <strong>de</strong> transcription contrô<strong>le</strong> <strong>le</strong>ur activité.<br />
L’expression mais <strong>au</strong>ssi <strong>la</strong> protéolyse sont donc déterminantes <strong>dans</strong> l’activité <strong>de</strong> ces facteurs.<br />
Ainsi, une <strong>de</strong>s réponses cellu<strong>la</strong>ires à un stress oxydant est dépendante <strong>de</strong> <strong>la</strong> concentration <strong>de</strong><br />
SoxS, un facteur <strong>de</strong> transcription régu<strong>la</strong>nt un ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong> gènes impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> résistance<br />
<strong>au</strong> stress oxydant. La transcription <strong>de</strong> soxS est activée par SoxR sous forme oxydée. Ainsi, en<br />
présence <strong>de</strong> composé oxydant, comme <strong>de</strong>s ions superoxy<strong>de</strong>s, SoxR passe sous forme oxydée<br />
et induit <strong>la</strong> transcription <strong>de</strong> soxS (Demp<strong>le</strong>, 1996). Enfin, un mécanisme moins commun pour<br />
régu<strong>le</strong>r <strong>la</strong> concentration d’un facteur <strong>de</strong> transcription est <strong>la</strong> séquestration par une <strong>protéine</strong><br />
membranaire. Ainsi, PtsG, sous sa forme déphosphorilée, fixe <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrane <strong>le</strong><br />
répresseur Mlc, impliqué <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> plusieurs gènes du<br />
métabolisme du glucose (Plumbridge, 2002).<br />
II.A.2.1.c.i<br />
Les activateurs<br />
Un activateur améliore l’activité d’un promoteur en <strong>au</strong>gmentant son affinité pour<br />
l’ARN polymérase. Dans <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s cas, l’activateur fonctionne en se liant d’abord <strong>au</strong><br />
promoteur cib<strong>le</strong> avant d’interagir avec l’ARN polymérase. Cependant, un mécanisme<br />
alternatif a été mis en évi<strong>de</strong>nce pour <strong>le</strong>s régu<strong>la</strong>teurs MarA et SoxS, qui interagissent avec<br />
l’ARN polymérase libre avant <strong>de</strong> se lier <strong>au</strong> promoteur (Griffith et Wolf, 2002 ; Martin et al.,<br />
2002). Pour <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s promoteurs, l’activation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription est simp<strong>le</strong> et implique<br />
un seul facteur <strong>de</strong> transcription activateur. Trois mécanismes génér<strong>au</strong>x sont utilisés (Figure<br />
12).<br />
L’activateur <strong>de</strong> C<strong>la</strong>sse I se lie à sa séquence ADN cib<strong>le</strong>, localisée en amont <strong>de</strong><br />
l’élément -35 du promoteur, puis recrute l’ARN polymérase par une interaction directe avec<br />
<strong>la</strong> partie carboxytermina<strong>le</strong> <strong>de</strong>s sous-unités α. La région charnière reliant <strong>le</strong>s domaines carboxy<br />
et amino termin<strong>au</strong>x <strong>de</strong>s sous unités α est f<strong>le</strong>xib<strong>le</strong>, ce qui permet <strong>au</strong>x activateurs <strong>de</strong> c<strong>la</strong>sse I <strong>de</strong><br />
se lier à différentes zones en amont du promoteur, tout en permettant un contact avec <strong>le</strong>s sous<br />
unités α. Le meil<strong>le</strong>ur exemp<strong>le</strong> d’activateur <strong>de</strong> c<strong>la</strong>sse I est <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> réceptrice <strong>de</strong> l’AMP<br />
cyclique (CRP) et <strong>le</strong> promoteur <strong>la</strong>c (Ebright, 1993).<br />
L’activateur <strong>de</strong> c<strong>la</strong>sse II se lie à une séquence proche <strong>de</strong> l’élément -35 du promoteur,<br />
ce qui lui permet d’interagir avec <strong>le</strong> domaine 4 <strong>de</strong> <strong>la</strong> sous unité σ (Dove et al., 2003). Ce<br />
contact permet <strong>de</strong> recruter l’ARN polymérase <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> du promoteur cib<strong>le</strong> mais peut <strong>au</strong>ssi<br />
affecter d’<strong>au</strong>tres étapes <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription. Du fait <strong>de</strong> <strong>la</strong> faib<strong>le</strong> f<strong>le</strong>xibilité <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
liaison entre <strong>le</strong> domaine 4 du facteur σ et l’élément -35 du promoteur, <strong>le</strong>s positions <strong>de</strong> fixation<br />
49
Introduction bibliographique<br />
<strong>de</strong>s activateurs <strong>de</strong> c<strong>la</strong>sse II varient peu par rapport <strong>au</strong> point d’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription. Un<br />
exemp<strong>le</strong> d’activateur <strong>de</strong> c<strong>la</strong>sse II est <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> CI du bactériophage λ pour l’activation du<br />
promoteur prm (Nickels et al., 2002). Certains activateurs <strong>de</strong> c<strong>la</strong>sse II reconnaissent d’<strong>au</strong>tres<br />
parties <strong>de</strong> l’ARN polymérase comme <strong>la</strong> partie amino termina<strong>le</strong> <strong>de</strong>s sous unités α, mais ils<br />
conservent <strong>la</strong> liaison avec l’ADN <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> l’élément -35 (Busby et Ebright, 1997).<br />
Dans <strong>le</strong> troisième mécanisme d’activation, l’activateur altère <strong>la</strong> conformation du<br />
promoteur cib<strong>le</strong> pour favoriser <strong>le</strong>s interactions entre l’ARN polymérase et <strong>le</strong>s éléments -10 ou<br />
-35 du promoteur. Ceci requiert, en général, que l’activateur se lie très près <strong>de</strong>s éléments du<br />
promoteur. Ainsi, pour <strong>le</strong>s promoteurs activés par <strong>le</strong>s facteurs <strong>de</strong> transcription <strong>de</strong> <strong>la</strong> famil<strong>le</strong><br />
MerR, l’espacement entre <strong>le</strong>s éléments -10 et -35 n’est pas optimal pour <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> l’ARN<br />
polymérase. Les activateurs <strong>de</strong> type MerR se lie entre ces <strong>de</strong>ux éléments et vril<strong>le</strong> l’ADN <strong>de</strong><br />
façon à <strong>le</strong>s réorienter pour permettre <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> <strong>la</strong> sous unité σ <strong>de</strong> l’holoenzyme (Brown et<br />
al. 2003 ; Heldwein et Brennan, 2001).<br />
Figure 12 : Les différents types d’activateurs transcriptionnels (d’après Browning et Busby,<br />
2004).<br />
50
Introduction bibliographique<br />
II.A.2.1.c.ii Les répresseurs<br />
Dans <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s cas, <strong>la</strong> répression <strong>de</strong> l’expression d’un promoteur implique un seul<br />
facteur <strong>de</strong> transcription. Trois mécanismes sont utilisés (Figure 13).<br />
L’encombrement stérique gênant <strong>la</strong> liaison promoteur-ARN polymérase est <strong>le</strong><br />
mécanisme <strong>de</strong> répression <strong>le</strong> plus simp<strong>le</strong>. Dans ce cas, <strong>le</strong> site <strong>de</strong> fixation du promoteur est<br />
localisé <strong>dans</strong> ou à proximité <strong>de</strong>s éléments c<strong>le</strong>fs du promoteur, comme par exemp<strong>le</strong> <strong>le</strong> site <strong>de</strong><br />
fixation du répresseur du promoteur <strong>la</strong>c (Mül<strong>le</strong>r et al., 1996). Cependant, <strong>dans</strong> certains cas, <strong>le</strong><br />
répresseur peut agir à une étape ultérieure à <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> l’ARN polymérase, en empêchant<br />
l’ARN polymérase d’initier <strong>la</strong> transcription, en se liant à l’ARN messager ou en empêchant <strong>le</strong><br />
ribosome d’effectuer <strong>la</strong> traduction.<br />
Pour d’<strong>au</strong>tres promoteurs, comme par exemp<strong>le</strong> <strong>le</strong> promoteur gal qui est réprimé par<br />
GalR (Choy et Adhya, 1996 ), plusieurs molécu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> répresseur se lient à <strong>de</strong>s sites dist<strong>au</strong>x du<br />
promoteur. La répression est c<strong>au</strong>sée par <strong>la</strong> formation d’une bouc<strong>le</strong> d’ADN qui piège l’ARN<br />
polymérase <strong>au</strong> début <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription.<br />
Des cas plus comp<strong>le</strong>xes existent où <strong>le</strong> répresseur agit comme un anti-activateur. Ainsi,<br />
<strong>le</strong>s promoteurs, qui sont réprimés par CytR, sont dépendants d’une activation par CRP. La<br />
répression exercée par CytR est une interaction directe entre CytR et CRP, empêchant<br />
l’activation par CRP (Shin et al., 2001). Dans <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong> ces promoteurs CytR ne reconnaît<br />
pas son promoteur cib<strong>le</strong> mais <strong>le</strong> comp<strong>le</strong>xe promoteur cib<strong>le</strong>-CRP (Va<strong>le</strong>ntin-Hansen et al.,<br />
1996).<br />
51
Introduction bibliographique<br />
Figure 13 : Les différents types <strong>de</strong> répresseurs transcriptionnels (d’après Browning et Busby,<br />
2004).<br />
52
Introduction bibliographique<br />
II.A.3<br />
La chromatine bactérienne a une organisation dynamique<br />
L’implication <strong>de</strong> l’organisation structura<strong>le</strong> du génome <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong><br />
l’expression génique a été mise en évi<strong>de</strong>nce <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s années 1990 (Higgins et al., 1988 ;<br />
Dorman et al., 1990). En effet, Higgins et col<strong>la</strong>borateurs avaient proposé, à cette époque, que<br />
<strong>la</strong> variation <strong>de</strong> l’état d’enrou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> l’ADN intervenait <strong>dans</strong> l’osmoadaptation d’E. coli.<br />
Une extension du rô<strong>le</strong> régu<strong>la</strong>teur <strong>de</strong> l’état d’enrou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> l’ADN à d’<strong>au</strong>tres conditions<br />
physiologiques dont l’anaérobiose a par <strong>la</strong> suite incité ces <strong>au</strong>teurs à proposer ce contrô<strong>le</strong><br />
comme étant un mécanisme global <strong>de</strong> l’adaptation bactérienne <strong>au</strong>x changements <strong>de</strong>s<br />
conditions environnementa<strong>le</strong>s (Dorman et al., 1988 et 1990). Ce concept, initia<strong>le</strong>ment<br />
controversé, est <strong>de</strong>venu une évi<strong>de</strong>nce <strong>de</strong>puis l’avènement <strong>de</strong>s métho<strong>de</strong>s d’analyses globa<strong>le</strong>s<br />
<strong>de</strong> l’expression génique (Travers et Muskhelishvili, 2005b ; Dorman, 2006). L’utilisation <strong>de</strong><br />
ces approches a non seu<strong>le</strong>ment conforté <strong>le</strong> rô<strong>le</strong> régu<strong>la</strong>teur <strong>de</strong> l’état d’enrou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> l’ADN<br />
mais surtout fait ressortir l’importance crucia<strong>le</strong> <strong>de</strong> ce paramètre <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s mécanismes glob<strong>au</strong>x<br />
du contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’expression génique (Dorman, 2006). En effet, il s’est avéré que <strong>le</strong><br />
surenrou<strong>le</strong>ment négatif agit sur l’expression du génome entier. Chez E. coli, une re<strong>la</strong>xation<br />
rapi<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’ADN entraîne une diminution <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> 30% <strong>de</strong>s gènes alors que cel<strong>le</strong><br />
<strong>de</strong>s gènes restant <strong>au</strong>gmente (Travers et Muskhelishvili, 2005b et 2006).<br />
Le nucléoï<strong>de</strong> bactérien (chromosome et <strong>protéine</strong>s <strong>associée</strong>s) <strong>au</strong>rait donc une structure<br />
dynamique dont l’organisation varie en fonction <strong>de</strong>s changements <strong>de</strong>s conditions<br />
environnementa<strong>le</strong>s (Travers et Muskhelishvili, 2005a). L’exigence <strong>de</strong> compaction et <strong>la</strong><br />
nécessité d’une adaptation <strong>de</strong> l’expression génique en fonction <strong>de</strong>s changements <strong>de</strong><br />
l’environnement nécessitent un h<strong>au</strong>t <strong>de</strong>gré d’organisation spatia<strong>le</strong> pour <strong>la</strong> bactérie. Par<br />
exemp<strong>le</strong>, <strong>le</strong> chromosome d’une bactérie comme E. coli contient environ 4,7 millions <strong>de</strong> bases<br />
et mesure près <strong>de</strong> 1,5 mm <strong>de</strong> long. Compacter cette molécu<strong>le</strong> <strong>dans</strong> une cellu<strong>le</strong> mesurant 1<br />
micron <strong>de</strong> <strong>la</strong>rge sur 2 microns <strong>de</strong> long rend compte <strong>de</strong> <strong>la</strong> comp<strong>le</strong>xité <strong>de</strong> <strong>la</strong> situation. L’ADN<br />
forme une doub<strong>le</strong> hélice où <strong>de</strong>s nucléoti<strong>de</strong>s complémentaires s’enrou<strong>le</strong>nt <strong>au</strong>tour d’un axe<br />
unique. La doub<strong>le</strong> hélice peut s’enrou<strong>le</strong>r à son tour <strong>dans</strong> l’espace pour former une nouvel<strong>le</strong><br />
hélice d’ordre supérieur : on dit alors que l’ADN est surenroulé. L'ADN circu<strong>la</strong>ire isolé à<br />
partir <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s procaryotes ou eucaryotes adopte une forme surenroulée négativement. Les<br />
domaines sont surenroulés négativement car l’hélice ADN qui <strong>le</strong>s compose possè<strong>de</strong> un déficit<br />
<strong>de</strong> tours sur el<strong>le</strong>-même.<br />
53
Introduction bibliographique<br />
Le chromosome est organisé en domaines <strong>de</strong> surenrou<strong>le</strong>ment indépendants. Leur<br />
nombre a été diffici<strong>le</strong> à déterminer et <strong>le</strong>s estimations récentes indiquent <strong>la</strong> présence d’environ<br />
400 domaines surenroulés par chromosome (Stein et al., 2005 ; Deng et al., 2005 ; Postow et<br />
al., 2004). Ainsi, <strong>la</strong> tail<strong>le</strong> <strong>de</strong> certains domaines est réduite et pourrait contenir un seul opéron.<br />
La nature <strong>de</strong>s frontières entre domaines reste à c<strong>la</strong>rifier. Aucun facteur constituant<br />
définitivement un élément <strong>de</strong>s frontières a été i<strong>de</strong>ntifié, <strong>de</strong> même qu’<strong>au</strong>cune séquence du<br />
chromosome agissant en cis, ou une molécu<strong>le</strong> d’ARN agissant en trans. Cependant, il y a <strong>de</strong><br />
nombreux candidats tels que <strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s <strong>associée</strong>s <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong>, détaillées plus bas, ou <strong>le</strong>s<br />
séquences d’ADN répétées formant <strong>de</strong>s motifs agissant en cis (Trun et Marko, 1998 ; Stein et<br />
al., 2005 ; Deng et al., 2005 ; Postow et al., 2004). Une <strong>de</strong>s caractéristiques <strong>de</strong>s frontières <strong>de</strong><br />
domaines est qu’el<strong>le</strong>s sont éphémères. El<strong>le</strong>s sont abondantes <strong>dans</strong> <strong>le</strong> chromosome d’une<br />
bactérie en phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance mais <strong>de</strong>viennent rares quand <strong>la</strong> bactérie entre en<br />
phase stationnaire <strong>de</strong> croissance. Le nucléoï<strong>de</strong> a donc une structure dynamique qui influence<br />
l’expression génique (Figure 14).<br />
Figure 14 : Schéma illustrant l’effet <strong>de</strong> l’organisation spatia<strong>le</strong> du chromosome sur<br />
l’expression génique.<br />
La structuration du chromosome dépend <strong>de</strong> plusieurs facteurs mais <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux plus<br />
importants sont <strong>le</strong>s ADN topoisomérases et <strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s <strong>associée</strong>s <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong> abondantes<br />
(NAP). Les ADN topoisomérases sont <strong>de</strong>s enzymes qui modu<strong>le</strong>nt <strong>le</strong> <strong>de</strong>gré <strong>de</strong> surenrou<strong>le</strong>ment<br />
<strong>de</strong> l’ADN. Chez E. coli, cette fonction est assurée par <strong>le</strong>s activités opposées <strong>de</strong>s<br />
topoisomérases, enzymes favorisant <strong>la</strong> re<strong>la</strong>xation <strong>de</strong> l’ADN, et <strong>de</strong> <strong>la</strong> gyrase, qui en présence<br />
d’ATP introduit du surenrou<strong>le</strong>ment négatif <strong>dans</strong> l’ADN relâché.<br />
54
Introduction bibliographique<br />
Le surenrou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> l’ADN peut influencer <strong>la</strong> transcription à différents nive<strong>au</strong>x<br />
(Travers et Muskhelishvili, 2005b). Ainsi une étape sensib<strong>le</strong> <strong>au</strong> surenrou<strong>le</strong>ment est<br />
l’isomérisation <strong>au</strong> cours du passage du comp<strong>le</strong>xe fermé vers <strong>le</strong> comp<strong>le</strong>xe ouvert. Les<br />
supertours négatifs facilitent l’ouverture <strong>de</strong> <strong>la</strong> doub<strong>le</strong> hélice d’ADN. La cassure <strong>de</strong>s liaisons<br />
hydrogène reliant <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux brins d’ADN <strong>de</strong>man<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’énergie qui peut être fournie par <strong>le</strong><br />
dérou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> l’ADN. Cependant, avant d’atteindre l’étape du comp<strong>le</strong>xe ouvert, l’ARN<br />
polymérase doit être recrutée <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> du promoteur et <strong>le</strong> surenrou<strong>le</strong>ment peut influencer<br />
cette étape <strong>de</strong> différentes façons. Une d’entre el<strong>le</strong>s concerne <strong>le</strong>s promoteurs dont <strong>le</strong>s éléments<br />
-10 et -35 sont espacés par une distance empêchant une fixation efficace du facteur σ. Ainsi,<br />
ajouter ou en<strong>le</strong>ver <strong>de</strong>s bases altère <strong>la</strong> disposition <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux hexamères sur <strong>la</strong> surface <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
doub<strong>le</strong> hélice d’ADN. Cette distorsion rotationnel<strong>le</strong> peut être corrigée en modifiant <strong>le</strong> t<strong>au</strong>x<br />
d’enrou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> <strong>la</strong> doub<strong>le</strong> hélice (Figure 15).<br />
Figure 15 : Effet du nive<strong>au</strong> du surenrou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> l’ADN sur l’expression <strong>de</strong>s gènes.<br />
Le recrutement <strong>de</strong> l’ARN polymérase à un promoteur peut <strong>au</strong>ssi dépendre <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
présence d’un facteur <strong>de</strong> transcription et <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> ce facteur peut modifier loca<strong>le</strong>ment <strong>la</strong><br />
55
Introduction bibliographique<br />
topologie <strong>de</strong> l’ADN. Inversement, <strong>le</strong> surenrou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> l’ADN peut participer à l’interaction<br />
du facteur <strong>de</strong> transcription avec l’ARN polymérase. Par exemp<strong>le</strong>, <strong>le</strong>s promoteurs répondant <strong>au</strong><br />
contrô<strong>le</strong> stringent, médié par <strong>le</strong> ppGpp, possè<strong>de</strong>nt une région riche en bases G et C<br />
immédiatement en aval <strong>de</strong> l’hexamère -10 (Travers et Muskhelishvili, 2005b). Ces<br />
promoteurs contrô<strong>le</strong>nt l’expression <strong>de</strong> gènes impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> <strong>la</strong> machinerie <strong>de</strong><br />
traduction. Cette synthèse doit être réprimée quand <strong>la</strong> bactérie manque <strong>de</strong> nutriments, et <strong>la</strong><br />
réponse stringente permet <strong>de</strong> remplir cette fonction. La région riche en GC est diffici<strong>le</strong> à<br />
dénaturer car el<strong>le</strong> contient plus <strong>de</strong> liaisons hydrogènes qu’une région riche en AT, trouvée<br />
c<strong>la</strong>ssiquement <strong>dans</strong> <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s promoteurs. L’énergie supplémentaire nécessaire pour<br />
dénaturer <strong>la</strong> région riche en GC peut être fournie par une modification <strong>de</strong> l’état <strong>de</strong><br />
surenrou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> l’ADN. Cette modification est médiée par <strong>la</strong> gyrase dont l’activité est<br />
fonction <strong>de</strong> <strong>la</strong> concentration en ATP. Un fort t<strong>au</strong>x en ATP, favorab<strong>le</strong> à l’activité <strong>de</strong> <strong>la</strong> gyrase<br />
est disponib<strong>le</strong> en présence <strong>de</strong> nutriments (Dorman, 2002).<br />
II.A.3.1 Les « Nuc<strong>le</strong>oid Associated Proteins » (NAP)<br />
En plus du surenrou<strong>le</strong>ment, <strong>la</strong> con<strong>de</strong>nsation du chromosome implique l’interaction<br />
entre l’ADN et plusieurs <strong>protéine</strong>s. La composition en <strong>protéine</strong>s du nucléoï<strong>de</strong> est<br />
majoritairement constituée par <strong>le</strong>s « Nuc<strong>le</strong>oid Associated Proteins » (NAP), un groupe <strong>de</strong><br />
petites et abondantes <strong>protéine</strong>s se liant à l’ADN (Azam et Ishihama, 1999 ; Drlica et al.,<br />
1999 ; McLeod et Johnson, 2001). Les NAPs structurent <strong>le</strong> chromosome et exerce un contrô<strong>le</strong><br />
sur <strong>la</strong> transcription, <strong>la</strong> recombinaison et <strong>la</strong> réplication <strong>de</strong> l’ADN. Les NAPs modifient <strong>la</strong><br />
géométrie <strong>de</strong> l’ADN en créant ou en accentuant <strong>le</strong>s courbures <strong>de</strong> <strong>la</strong> molécu<strong>le</strong> et en modifiant<br />
<strong>le</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> surenrou<strong>le</strong>ment local <strong>de</strong> l’ADN. Chez E. coli, <strong>le</strong>s principa<strong>le</strong>s NAPs sont HU<br />
(heat-unstab<strong>le</strong> nuc<strong>le</strong>oid protein), IHF (integration host factor), H-NS (histone-like nuc<strong>le</strong>oid<br />
structuring protein) et <strong>Fis</strong> (factor for inversion stimu<strong>la</strong>tion). Ils agissent directement ou<br />
indirectement, souvent en rése<strong>au</strong>, sur <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> d’une <strong>la</strong>rge variété <strong>de</strong> gènes. Ces gènes sont<br />
impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> viabilité <strong>de</strong> <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong>, comme ceux intervenant <strong>dans</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s<br />
<strong>protéine</strong>s ou <strong>dans</strong> <strong>le</strong> métabolisme du carbonne. Les NAPs régu<strong>le</strong>nt souvent <strong>le</strong>s gènes dont<br />
l’expression varie en fonction <strong>de</strong> stimuli extérieurs, comme <strong>la</strong> température et l’osmo<strong>la</strong>rité<br />
(Drlica et al., 1999 ; McLeod et Johnson, 2001).<br />
Les séquences en aci<strong>de</strong>s aminés <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s HU et IHF sont voisines alors que <strong>Fis</strong> et<br />
H-NS sont structura<strong>le</strong>ment distincts. IHF se lie avec une forte affinité à l’ADN (Ali et al.,<br />
56
Introduction bibliographique<br />
2001) et possè<strong>de</strong> une gran<strong>de</strong> spécificité <strong>de</strong> liaison à l’ADN. La séquence consensus reconnue<br />
par IHF est bien définie (Tab<strong>le</strong><strong>au</strong> 3) (Ussery et al., 2001). La situation avec <strong>Fis</strong> et H-NS est<br />
moins c<strong>la</strong>ire mais une séquence consensus dégénérée a été i<strong>de</strong>ntifiée pour ces <strong>de</strong>ux <strong>protéine</strong>s<br />
(Pan et al., 1996 ; Lang et al., 2007). Dans <strong>le</strong> cas <strong>de</strong> HU, il n’a pas été mis en évi<strong>de</strong>nce une<br />
séquence consensus, <strong>la</strong> fixation semb<strong>le</strong> être aspécifique (Grove et Saavedra, 2002 ; Schrö<strong>de</strong>r<br />
et Wagner, 2002). H-NS se lie préférentiel<strong>le</strong>ment à l’ADN contenant une forte proportion en<br />
bases A et T, susceptib<strong>le</strong>s d’adopter une structure courbe (Dame et al., 2001).<br />
NAP Propriétés et abondance Structure Gènes Fonctions principa<strong>le</strong>s<br />
H-NS<br />
- non-basique<br />
- 20000-40000<br />
dimères/cellu<strong>le</strong>s<br />
- oligomérisation sur<br />
l’ADN<br />
-Séquence consensus <strong>de</strong><br />
fixation : tCGATAAATT<br />
Homodimère<br />
2 x 15.4 kDa<br />
hns<br />
- reconnaît l’ADN courbé<br />
- modifie <strong>la</strong> topologie <strong>de</strong> l’ADN<br />
- induit <strong>de</strong>s courbures <strong>de</strong> l’ADN<br />
- impliqué <strong>dans</strong> <strong>la</strong> recombinaison<br />
<strong>Fis</strong><br />
- basique<br />
- abondant en phase<br />
exponentiel<strong>le</strong> (20000-<br />
40000 dimères/cellu<strong>le</strong>s)<br />
-Séquence consensus <strong>de</strong><br />
fixation :<br />
GNYAWWWTRNC<br />
Homodimère<br />
2 x 11.2 kDa<br />
fis<br />
- induit une forte courbure <strong>de</strong><br />
l’ADN (jusqu’à 90°)<br />
- modifie <strong>la</strong> topologie <strong>de</strong> l’ADN<br />
- participe <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
recombinaison, <strong>la</strong> transposition<br />
et <strong>la</strong> réplication <strong>de</strong> l’ADN<br />
IHF<br />
- basique<br />
- abondant en phase<br />
stationnaire (25000-30000<br />
dimères/cellu<strong>le</strong>s)<br />
-Séquence consensus <strong>de</strong><br />
fixation :<br />
WATCAANNNNTTR<br />
Hétérodimère ;<br />
IHFα : 11.2 kDa<br />
IHFβ : 10.7 kDa<br />
himA et<br />
himB<br />
- induit une forte courbure <strong>de</strong><br />
l’ADN (jusqu’à 140°)<br />
- participe <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
recombinaison, <strong>la</strong> transposition<br />
et <strong>la</strong> réplication <strong>de</strong> l’ADN<br />
HU<br />
- basique<br />
- abondant en phase<br />
exponentiel<strong>le</strong> (15000-<br />
30000 dimères/cellu<strong>le</strong>s)<br />
Hétérodimère ;<br />
HUα : 9.2 kDa<br />
HUβ : 9.2 kDa<br />
hupA et<br />
hupB<br />
- compacte l’ADN<br />
- induit <strong>de</strong>s courbures <strong>de</strong> l’ADN<br />
- impliqué <strong>dans</strong> <strong>le</strong> réplication et<br />
<strong>la</strong> recombinaison <strong>de</strong> l’ADN<br />
Tab<strong>le</strong><strong>au</strong> 3 : Les principa<strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s <strong>associée</strong>s <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong> (NAP) (d’après Prosseda et al.,<br />
2002). Les co<strong>de</strong>s <strong>de</strong>s séquences consensus sont <strong>le</strong>s suivants : N= A,G,C ou T ; R=A ou G ;<br />
W=T ou A ; Y=C ou T.<br />
57
Introduction bibliographique<br />
Un aspect important conditionnant <strong>le</strong> rô<strong>le</strong> <strong>de</strong>s NAPs est <strong>la</strong> variation <strong>de</strong> <strong>le</strong>urs<br />
concentrations cellu<strong>la</strong>ires. En effet, el<strong>le</strong>s sont produites à différents nive<strong>au</strong>x <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance<br />
bactérienne. Ainsi, <strong>Fis</strong> est synthétisée à un nive<strong>au</strong> très é<strong>le</strong>vé en début <strong>de</strong> phase exponentiel<strong>le</strong><br />
<strong>de</strong> croissance (Figure 16), puis sa concentration diminue rapi<strong>de</strong>ment (Ali-Azam et al., 1999).<br />
Au contraire, IHF est à forte concentration <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s entrant en phase stationnaire <strong>de</strong><br />
croissance alors que <strong>la</strong> concentration d’H-NS est à peu près constante <strong>au</strong> cours <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
croissance (Free et Dorman, 1995). La situation avec HU est plus comp<strong>le</strong>xe <strong>dans</strong> <strong>la</strong> mesure où<br />
<strong>la</strong> composition <strong>de</strong> ses <strong>de</strong>ux sous unités varie avec <strong>la</strong> croissance. In fine, <strong>le</strong> t<strong>au</strong>x <strong>de</strong> HU<br />
diminue en phase stationnaire (Ba<strong>la</strong>ndina et al., 2001). Ces variations <strong>de</strong> concentrations<br />
introduisent une dynamique <strong>dans</strong> <strong>la</strong> composition en NAP du nucléoï<strong>de</strong>, permettant une<br />
régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes.<br />
Ainsi <strong>le</strong> chromosome bactérien qui a un <strong>de</strong>gré d’enrou<strong>le</strong>ment re<strong>la</strong>tivement important<br />
durant <strong>la</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance, adopte une structure plus relâchée à l’entrée <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
phase stationnaire. Parallè<strong>le</strong>ment, <strong>le</strong> facteur σ 70 qui transcrit <strong>de</strong> manière efficace <strong>de</strong> l’ADN<br />
surenroulé, est remp<strong>la</strong>cé par <strong>le</strong> facteur σ S , qui a une préférence pour l’ADN relâché <strong>de</strong><br />
manière à adapter l’expression génique.<br />
L’organisation topologique <strong>de</strong>s différents promoteurs d’un génome dépend<br />
effectivement <strong>de</strong> l’état d’enrou<strong>le</strong>ment local qui est fixé à <strong>la</strong> fois par <strong>le</strong>s activités <strong>de</strong>s<br />
topoisomérases et <strong>de</strong> <strong>la</strong> gyrase mais <strong>au</strong>ssi <strong>de</strong> <strong>la</strong> dynamique <strong>de</strong> fixation <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s <strong>associée</strong>s<br />
<strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong>. Le rô<strong>le</strong> <strong>de</strong> ces <strong>protéine</strong>s <strong>dans</strong> l’expression <strong>de</strong>s différents promoteurs reste<br />
toutefois assez peu étudié. H-NS est <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> dont <strong>le</strong> mécanisme d’action a été <strong>le</strong> plus<br />
intensivement étudié. Cette <strong>protéine</strong> est capab<strong>le</strong> <strong>de</strong> réduire fortement l’expression génique en<br />
formant <strong>de</strong>s structures nucléo-protéiques étendues comme observé <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> du promoteur<br />
virF (Falconi et al., 1998).<br />
58
Introduction bibliographique<br />
Concentration<br />
cellu<strong>la</strong>ire en<br />
<strong>protéine</strong>s<br />
« NAP »<br />
Densité<br />
cellu<strong>la</strong>ire<br />
HU<br />
HN-S<br />
<strong>Fis</strong><br />
IHF<br />
Phase <strong>de</strong> <strong>la</strong>tence<br />
Phase<br />
exponentiel<strong>le</strong><br />
Phase stationnaire<br />
Croissance<br />
Figure 16 : Concentrations cellu<strong>la</strong>ires <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s H-NS, <strong>Fis</strong>, HU et IHF <strong>au</strong> cours<br />
<strong>de</strong>s différentes phases <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance bactérienne.<br />
L’une <strong>de</strong>s caractéristiques <strong>de</strong>s NAPs <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’expression génique est<br />
<strong>le</strong>ur implication <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s mécanismes adaptatifs dont <strong>la</strong> pathogénie.<br />
II.A.3.1.a Les principa<strong>le</strong>s NAP impliquées <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce<br />
II.A.3.1.a.i<br />
H-NS<br />
Le rô<strong>le</strong> <strong>de</strong> H-NS a été abondamment décrit chez E. coli et <strong>le</strong>s bactéries voisines<br />
comme Shigel<strong>la</strong> f<strong>le</strong>xneri ou Salmonel<strong>la</strong> typhimurium. L’analyse du transcriptome, en utilisant<br />
<strong>de</strong>s puces à ADN, a montré que H-NS est impliqué <strong>dans</strong> l’expression <strong>de</strong> plus <strong>de</strong> 5% <strong>de</strong>s gènes<br />
chez E. coli, cultivée en milieu comp<strong>le</strong>xe LB. H-NS est donc un régu<strong>la</strong>teur global qui contrô<strong>le</strong><br />
entre <strong>au</strong>tres <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l'expression <strong>de</strong> gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce (Hommais et al., 2001). H-NS<br />
agit essentiel<strong>le</strong>ment comme répresseur et son mécanisme d'action a été récemment caractérisé<br />
(Dame et al., 2002). H-NS se fixe à l'ADN via une séquence consensus dégénérée localisée<br />
<strong>dans</strong> <strong>de</strong>s régions d'ADN présentant une structure courbe en amont <strong>de</strong>s promoteurs à réprimer.<br />
La liaison <strong>de</strong> plusieurs <strong>protéine</strong>s H-NS conduit à <strong>la</strong> formation d’une bouc<strong>le</strong> <strong>dans</strong> <strong>la</strong>quel<strong>le</strong> est<br />
piégée l’ARN polymérase.<br />
En général, H-NS régu<strong>le</strong> indirectement l’expression <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce. Par<br />
exemp<strong>le</strong> chez <strong>le</strong>s souches EIEC d'E. coli, l’expression <strong>de</strong>s gènes permettant l’adhésion, <strong>la</strong><br />
59
Introduction bibliographique<br />
pénétration et <strong>la</strong> dissémination intra et inter cellu<strong>la</strong>ire est activée par <strong>de</strong>ux régu<strong>la</strong>teurs<br />
transcriptionnels : VirF et VirB (Ad<strong>le</strong>r et al., 1989). En réponse à différents stimuli<br />
(température, pression osmotique, pH) il y a une <strong>au</strong>gmentation <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> VirF qui va<br />
activer l'expression <strong>de</strong> VirB, régu<strong>la</strong>teur spécifique <strong>de</strong>s gènes codant <strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s IPA<br />
nécessaires à l'invasion <strong>de</strong> <strong>la</strong> barrière intestina<strong>le</strong> (Sasakawa et al., 1993). A température<br />
inférieure à 32°C, H-NS réprime l'expression <strong>de</strong> virF en se liant spécifiquement à une région<br />
présentant une structure courbée et localisée <strong>dans</strong> <strong>la</strong> région promotrice <strong>de</strong> ce gène (Figure 17)<br />
(Falconi et al., 1998). A <strong>de</strong>s températures voisines <strong>de</strong> cel<strong>le</strong> <strong>de</strong> l'hôte (37°C), une modification<br />
topologique <strong>de</strong> cette région s'oppose à <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> H-NS, permettant une dérépression <strong>de</strong><br />
l'expression <strong>de</strong> virF qui va conduire à une forte production <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s IPA et <strong>de</strong> l'appareil<br />
<strong>de</strong> sécrétion. La courbure <strong>de</strong> l’ADN, permettant <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> H-NS, pourrait agir comme un<br />
senseur <strong>de</strong> <strong>la</strong> température et disparaîtrait à plus <strong>de</strong> 32°C. Cet exemp<strong>le</strong> met en évi<strong>de</strong>nce <strong>la</strong><br />
connexion entre <strong>la</strong> <strong>le</strong>vée <strong>de</strong> <strong>la</strong> répression exercée par H-NS et <strong>le</strong>s conditions<br />
environnementa<strong>le</strong>s. Un mécanisme simi<strong>la</strong>ire serait mis en œuvre en réponse à un stress<br />
osmotique ou thermique. En effet , ces différents stress modifient <strong>la</strong> topologie <strong>de</strong> l’ADN<br />
(Dorman et Deighan, 2003).<br />
Température<br />
20°C<br />
32°C<br />
37°C<br />
H-NS<br />
virF<br />
<strong>Fis</strong><br />
ARN<br />
polymérase<br />
ARNm virF<br />
VirF<br />
VirB Protéines<br />
IPA<br />
Figure 17 : Mo<strong>de</strong> d’action du répresseur H-NS et <strong>de</strong> l’activateur <strong>Fis</strong> en fonction<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> température sur l’expression du gène virF chez <strong>le</strong>s souches d’Escherichia<br />
coli entéroinvasives.<br />
Dans certains cas, H-NS peut avoir un rô<strong>le</strong> activateur <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong><br />
viru<strong>le</strong>nce. Par exemp<strong>le</strong>, chez <strong>la</strong> bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, l’expression<br />
60
Introduction bibliographique<br />
<strong>de</strong>s gènes pel, codant <strong>le</strong>s pectate lyases, facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce majeurs, est fortement diminuée<br />
<strong>dans</strong> un mutant hns. Ce phénotype d’activateur est <strong>le</strong> résultat d’un contrô<strong>le</strong> indirect mettant en<br />
jeu PecT, un répresseur <strong>de</strong>s gènes pel (Nasser et Reverchon, 2002). Dans <strong>le</strong> mutant hns,<br />
l’<strong>au</strong>gmentation <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> PecT conduit à une répression <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes pel.<br />
Le signal <strong>au</strong>quel répond PecT n’est pas encore i<strong>de</strong>ntifié.<br />
II.A.3.1.a.ii <strong>Fis</strong><br />
Un <strong>de</strong>s rô<strong>le</strong>s essentiels <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> est d’activer <strong>la</strong> transcription <strong>de</strong> gènes codant <strong>le</strong>s ARN<br />
stab<strong>le</strong>s (ARN <strong>de</strong> transfert et ribosom<strong>au</strong>x) en début <strong>de</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance. <strong>Fis</strong><br />
est éga<strong>le</strong>ment impliqué <strong>dans</strong> divers processus biologiques tel que l’intégration <strong>dans</strong> <strong>le</strong><br />
chromosome du phage Mu. <strong>Fis</strong> se lie à l’ADN sous forme <strong>de</strong> dimère via un consensus assez<br />
dégénéré et peut jouer soit un rô<strong>le</strong> d’activateur soit <strong>de</strong> répresseur. La répression par <strong>Fis</strong><br />
s’effectue via une compétition avec l’ARN polymérase ou <strong>de</strong>s activateurs pour l’occupation<br />
d’une même région d’ADN. Dans <strong>le</strong> cas d’une activation, <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> à l’ADN induit<br />
une modification loca<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> topologie <strong>de</strong> l’ADN, facilitant <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> l’ARN polymérase<br />
sur <strong>le</strong>s promoteurs (Muskhelishvili et Travers, 2003). Ainsi, <strong>Fis</strong> active <strong>le</strong> gène virF d’E. coli<br />
(figure 17) (Falconi et al., 2001). <strong>Fis</strong> permet donc l’expression <strong>de</strong>s gènes d’adhésion et <strong>de</strong><br />
colonisation <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie. De même, <strong>Fis</strong> active l’expression <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> l’îlot <strong>de</strong> pathogénie<br />
SPI-1 chez S. typhimurium. Les produits <strong>de</strong> ces gènes permettent <strong>le</strong> franchissement <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
barrière intestina<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’hôte (Wilson et al., 2001). Récemment, l’analyse du transcriptome <strong>de</strong><br />
S. typhimurium a montré un rô<strong>le</strong> central <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>la</strong> coordination <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes<br />
<strong>de</strong> ménage et <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce nécessaires à <strong>la</strong> survie <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s poumons<br />
ou <strong>au</strong> cours d’une infection systémique (Kelly et al., 2004). L’adhésion <strong>au</strong>x cellu<strong>le</strong>s<br />
épithélia<strong>le</strong>s <strong>de</strong>s souches enteropathogéniques d’E. coli est médiée par <strong>le</strong>s bund<strong>le</strong>-forming pili<br />
(BFP). Ce processus est activé par <strong>Fis</strong> (Goldberg et al., 2001). Dans ces différents cas, <strong>Fis</strong><br />
active <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce précoces (adhésion). Il existerait donc une bonne<br />
adéquation entre <strong>la</strong> forte concentration cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> en début <strong>de</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong><br />
croissance et <strong>la</strong> fonction <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce dont il active l’expression. <strong>Fis</strong> contrô<strong>le</strong> par<br />
ail<strong>le</strong>urs l’expression <strong>de</strong> H-NS (Falconi et al., 1996) et du facteur σ S chez S. typhimurium (O<br />
Croinin et Dorman, 2007).<br />
61
Introduction bibliographique<br />
II.A.3.1.a.iii IHF<br />
Contrairement à H-NS et <strong>Fis</strong>, IHF reconnaît un consensus bien défini pour sa fixation<br />
à l’ADN (Ali et al., 2001).<br />
Plusieurs étu<strong>de</strong>s mettent en évi<strong>de</strong>nce <strong>le</strong> rô<strong>le</strong> <strong>de</strong> IHF <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce<br />
chez <strong>le</strong>s entérobactéries. L’un <strong>de</strong>s cas <strong>le</strong>s mieux étudiés porte sur <strong>le</strong>s gènes spv <strong>de</strong> S.<br />
typhimurirum. Dans ce cas, <strong>le</strong> facteur σ S et <strong>le</strong> régu<strong>la</strong>teur SpvR activent conjointement<br />
l’expression <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce spv à l’entrée <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase stationnaire. L’expression <strong>de</strong><br />
spvR est éga<strong>le</strong>ment activée par IHF à forte <strong>de</strong>nsité cellu<strong>la</strong>ire (Marshall et al., 1999). Afin<br />
d’exprimer <strong>le</strong>s gènes spv <strong>au</strong> moment opportun, <strong>la</strong> bactérie exerce un doub<strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> sur<br />
l’expression <strong>de</strong> ces gènes impliquant σ S et IHF qui sont présents durant <strong>la</strong> phase stationnaire.<br />
Un cas atypique a été décrit chez <strong>le</strong>s coli entéropathogènes chez <strong>le</strong>squel<strong>le</strong>s IHF active<br />
l’expression <strong>de</strong>s gènes LEE codant <strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s nécessaires à <strong>la</strong> formation <strong>de</strong>s lésions<br />
attachement/effacement sur <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s épithélia<strong>le</strong>s. IHF stimu<strong>le</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>protéine</strong><br />
Ler, activateur <strong>de</strong> <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s gènes du locus LEE (Bustamante et al., 2001 ; Friedberg et<br />
al., 1999).<br />
IHF active par ail<strong>le</strong>urs l’expression <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> en début <strong>de</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong><br />
croissance (Pratt et al., 1997).<br />
II.A.3.1.a.iv HU<br />
Les distorsions <strong>de</strong> l’ADN provoquées par HU permettent <strong>de</strong> former <strong>de</strong>s comp<strong>le</strong>xes<br />
nucléoprotéiques spécifiques avec <strong>de</strong>s séquences d’ADN distants. Ainsi HU stimu<strong>le</strong> <strong>la</strong><br />
fixation <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s régu<strong>la</strong>trices sur <strong>le</strong> promoteur cib<strong>le</strong>, notamment <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cas <strong>de</strong> l’opéron<br />
<strong>la</strong>c. HU peut éga<strong>le</strong>ment induire <strong>la</strong> formation d’une bouc<strong>le</strong> qui va stabiliser <strong>le</strong>s interactions<br />
entre <strong>protéine</strong>s régu<strong>la</strong>trices, comme pour l’opéron gal (Drlica et al., 1999 ; McLeod et<br />
Johnson, 2001 ; Perez-Martin et <strong>de</strong> Lorenzo, 1997).<br />
HU semb<strong>le</strong> peu impliqué <strong>dans</strong> <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce.<br />
Ainsi, chez <strong>la</strong> bactérie pathogène Salmonel<strong>la</strong> typhimurium, HU active l’expression <strong>de</strong> hilA,<br />
dont <strong>le</strong> produit est impliqué <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse du système <strong>de</strong> sécrétion <strong>de</strong> type<br />
III (Schechter et al., 2003).<br />
62
Introduction bibliographique<br />
II.A.4<br />
Dynamique <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion<br />
II.A.4.1 Un régu<strong>la</strong>teur spécifique couplé à un régu<strong>la</strong>teur général<br />
L’activité <strong>de</strong> <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s promoteurs bactériens est dépendante <strong>de</strong> multip<strong>le</strong>s<br />
conditions environnementa<strong>le</strong>s plutôt que d’un seul signal. Be<strong>au</strong>coup <strong>de</strong> promoteurs sont<br />
contrôlés par plusieurs facteurs <strong>de</strong> transcription, où chaque acteur re<strong>la</strong>is <strong>la</strong> perception d’un<br />
signal. Cependant, <strong>dans</strong> certains cas, une <strong>protéine</strong> régu<strong>la</strong>trice peut intégrer plusieurs sign<strong>au</strong>x.<br />
Ainsi <strong>le</strong> système NifL-NifA chez Azotobacter vine<strong>la</strong>ndii contrô<strong>le</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes<br />
impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> l’azote en fonction du t<strong>au</strong>x d’oxygène, <strong>de</strong> <strong>la</strong> disponibilité en<br />
carbone et en azote. Les systèmes <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> cette comp<strong>le</strong>xité sont assez rares et, <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
plupart <strong>de</strong>s cas, pour un promoteur régulé par plusieurs sign<strong>au</strong>x, plusieurs facteurs <strong>de</strong><br />
transcription sont nécessaires.<br />
En général, lorsque <strong>de</strong>ux facteurs <strong>de</strong> transcription sont impliqués, un <strong>de</strong>s facteurs<br />
répond à un signal d’un métabolisme spécifique alors que <strong>le</strong> <strong>de</strong>uxième facteur re<strong>la</strong>is un signal<br />
du métabolisme général. Un bon exemp<strong>le</strong> est <strong>le</strong> régulon gal chez E. coli qui contient <strong>de</strong>s<br />
gènes impliqués <strong>dans</strong> <strong>le</strong> transport et <strong>le</strong> métabolisme du ga<strong>la</strong>ctose. La transcription <strong>de</strong>s gènes<br />
du régulon gal est réprimée par <strong>de</strong>ux régu<strong>la</strong>teurs isoformes, GalR (Gal repressor) et GalS (Gal<br />
isorepressor) (Weickert et Adhya, 1993). Ces <strong>de</strong>ux répresseurs reconnaissent <strong>le</strong> même site <strong>de</strong><br />
fixation à l’ADN (Weickert et Adhya, 1992). Cette fixation est inhibée par <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> D-<br />
ga<strong>la</strong>ctose, métabolite responsab<strong>le</strong> du signal spécifique. La plupart <strong>de</strong>s gènes du régulon gal<br />
sont par contre activés par <strong>le</strong> comp<strong>le</strong>xe CRP-AMPc, <strong>le</strong> régu<strong>la</strong>teur général <strong>de</strong> <strong>la</strong> répression<br />
catabolique (Weickert et Adhya, 1993). Cet exemp<strong>le</strong> met en évi<strong>de</strong>nce un dialogue cellu<strong>la</strong>ire<br />
entre métabolisme général et métabolisme spécifique, permettant une adaptation <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie<br />
<strong>au</strong>x conditions environnementa<strong>le</strong>s.<br />
Il y a peu d’exemp<strong>le</strong>s <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tions intégrées impliquant seu<strong>le</strong>ment <strong>de</strong>s répresseurs,<br />
mais, <strong>dans</strong> <strong>la</strong> majorité <strong>de</strong>s cas étudiés, <strong>le</strong>s régu<strong>la</strong>tions comp<strong>le</strong>xes dépen<strong>de</strong>nt <strong>de</strong> combinaisons<br />
d’activateurs et <strong>de</strong> répresseurs. En général, <strong>le</strong>s régu<strong>la</strong>teurs agissent indépendamment sur <strong>le</strong><br />
promoteur, cependant, <strong>dans</strong> certains cas comme pour <strong>le</strong>s promoteurs qui sont réprimés par<br />
CytR, <strong>le</strong> répresseur et l’activateur interagissent entre eux directement (Chah<strong>la</strong> et al., 2003).<br />
Pour <strong>le</strong>s promoteurs qui sont régulés par <strong>de</strong>ux ou plusieurs régu<strong>la</strong>teurs, <strong>de</strong>s mécanismes plus<br />
comp<strong>le</strong>xes sont mis en œuvre. Quatre mécanismes génér<strong>au</strong>x ont été trouvés chez E. coli,<br />
impliquant <strong>le</strong> repositionnement <strong>de</strong> l’activateur, <strong>le</strong>s contacts avec l’ARN polymérase<br />
63
Introduction bibliographique<br />
indépendants entre <strong>le</strong>s activateurs, <strong>le</strong>s contacts coopératifs entre activateurs ainsi que <strong>le</strong>s<br />
interactions conduisant à une anti-répression par un activateur (Figure 18).<br />
Pour <strong>le</strong> mécanisme <strong>de</strong> repositionnement, <strong>le</strong> promoteur cib<strong>le</strong> peut être activé<br />
p<strong>le</strong>inement par un activateur primaire, mais en absence <strong>de</strong> l’activateur secondaire, l’activateur<br />
primaire est mal positionné. Le repositionnement peut impliquer <strong>le</strong> dép<strong>la</strong>cement <strong>de</strong><br />
l’activateur primaire d’un site <strong>de</strong> fixation à l’ADN à un <strong>au</strong>tre, comme par exemp<strong>le</strong> pour <strong>le</strong><br />
repositionnement <strong>de</strong> MalT par CRP <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> du promoteur malK (Richet et al., 1991).<br />
Par ail<strong>le</strong>urs, l’activateur secondaire peut altérer <strong>la</strong> conformation <strong>de</strong> l’ADN, par exemp<strong>le</strong> en<br />
créant une courbure, pour permettre l’interaction entre l’activateur primaire et l’ARN<br />
polymérase qui conduit à l’activation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription. Un mécanisme différent existe pour<br />
<strong>le</strong>s promoteurs où <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux activateurs se lient <strong>de</strong> façon indépendante par rapport à l’ARN<br />
polymérase. Ces promoteurs contrastent avec <strong>le</strong>s promoteurs dépendant <strong>de</strong>s activateurs<br />
simp<strong>le</strong>s <strong>de</strong> c<strong>la</strong>sse I et II, où <strong>le</strong>s interactions avec un seul facteur <strong>de</strong> transcription sont<br />
suffisantes pour une transcription optima<strong>le</strong> (Joung et al., 1994 ; Scott et al., 1995). Dans<br />
certains cas, <strong>de</strong>s promoteurs comp<strong>le</strong>xes sont dépendants d’un activateur <strong>de</strong> c<strong>la</strong>sse I et d’un <strong>de</strong><br />
c<strong>la</strong>sse II, comme <strong>le</strong> promoteur proP P2, où <strong>Fis</strong> et CRP fonctionnent comme activateurs <strong>de</strong><br />
c<strong>la</strong>sse I et II respectivement (McLeod et al., 2002 ; Belyaeva et al., 1998). Une <strong>au</strong>tre<br />
combinaison est l’action <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux activateurs <strong>de</strong> c<strong>la</strong>sse I, comme pour <strong>le</strong> promoteur acs P2, qui<br />
est dépendant <strong>de</strong> <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux dimères CRP <strong>au</strong>x sites d’activation <strong>de</strong> c<strong>la</strong>sse I (Beatty et<br />
al. 2003 ; Tebbutt et al., 2002). Le mécanisme d’activation sans contact direct permet <strong>de</strong><br />
coup<strong>le</strong>r un promoteur avec <strong>de</strong>ux activateurs. Ce mo<strong>de</strong> d’action semb<strong>le</strong> ubiquitaire, en effet il<br />
permet <strong>de</strong> combiner <strong>de</strong> nombreux régu<strong>la</strong>teurs ensemb<strong>le</strong> puisque <strong>au</strong>cune interaction entre eux<br />
est nécessaire, donc <strong>le</strong> mécanisme présente be<strong>au</strong>coup <strong>de</strong> possibilités d’évolution. La plupart<br />
<strong>de</strong>s activateurs se fixent à <strong>le</strong>ur promoteur cib<strong>le</strong> <strong>de</strong> façon indépendante par rapport <strong>au</strong>x <strong>au</strong>tres<br />
régu<strong>la</strong>teurs <strong>de</strong> ce promoteur. Cependant, il y a quelques promoteurs dont <strong>le</strong>s activateurs se<br />
fixent <strong>de</strong> façon coopérative, ce mécanisme assure une co-dépendance puisqu’un activateur ne<br />
peut se fixer <strong>de</strong> façon efficace sans l’<strong>au</strong>tre. Un bon exemp<strong>le</strong> est <strong>le</strong> promoteur melAB, pour<br />
<strong>le</strong>quel CRP est incapab<strong>le</strong> <strong>de</strong> se fixer sans <strong>la</strong> fixation préa<strong>la</strong>b<strong>le</strong> <strong>de</strong> MelR (Wa<strong>de</strong> et al., 2001).<br />
Les répresseurs qui empêchent l’activation par l’activateur primaire peuvent <strong>au</strong>ssi créer une<br />
co-dépendance entre <strong>de</strong>ux activateurs (Wu et al., 1998). La présence <strong>de</strong> l’activateur<br />
secondaire est nécessaire pour modifier l’action du répresseur <strong>de</strong> façon à ce qu’il n’interfère<br />
plus avec l’action <strong>de</strong> l’activateur primaire. Ainsi <strong>le</strong>s promoteurs nir et nrf d’E. coli sont<br />
dépendants <strong>de</strong> FNR, un régu<strong>la</strong>teur répondant à l’anaérobiose, et <strong>de</strong> NarL ou NarP, facteurs <strong>de</strong><br />
transcription activés par <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> nitrite ou <strong>de</strong> nitrate (Browning et al., 2000 ; Browning<br />
64
Introduction bibliographique<br />
et al., 2002). Les <strong>de</strong>ux promoteurs sont fortement activés par l’activateur primaire FNR, qui<br />
interagit avec l’ARN polymérase par un mécanisme <strong>de</strong> c<strong>la</strong>sse II. Cependant l’action <strong>de</strong> FNR<br />
est abolie par <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> IHF et <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> sites adjacents. La fixation <strong>de</strong><br />
l’activateur secondaire NarL ou NarP est requise pour contrecarrer <strong>le</strong>s effets <strong>de</strong> IHF ou <strong>Fis</strong>,<br />
notamment en inhibant <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> IHF (Browning et al., 2002).<br />
65
Introduction bibliographique<br />
Figure 18 : Les mécanismes <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tions mettant en jeu plusieurs facteurs <strong>de</strong> transcriptions<br />
(d’après Browning et Busby, 2004).<br />
66
Introduction bibliographique<br />
II.A.4.2 Connexion entre régu<strong>la</strong>teurs : rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion génétique<br />
En plus <strong>de</strong>s mécanismes <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> gènes impliqués <strong>dans</strong> une fonction<br />
particulière, il existe un ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion ayant un <strong>de</strong>gré <strong>de</strong> hiérarchisation plus é<strong>le</strong>vé.<br />
En effet, <strong>le</strong>s régu<strong>la</strong>teurs glob<strong>au</strong>x sont eux-mêmes régulés. L’existence d’un rése<strong>au</strong> <strong>de</strong><br />
régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> ce nive<strong>au</strong> assure à <strong>la</strong> bactérie un contrô<strong>le</strong> plus fin <strong>de</strong> l’ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong> son<br />
métabolisme.<br />
Ainsi l’expression <strong>de</strong>s gènes codant <strong>de</strong>s régu<strong>la</strong>teurs glob<strong>au</strong>x tels que CRP ou <strong>le</strong>s NAP est<br />
régie par un système <strong>de</strong> rétrocontrô<strong>le</strong> interdépendant (Figure 19). Il a été mis en évi<strong>de</strong>nce que<br />
<strong>Fis</strong> réprime <strong>la</strong> transcription <strong>de</strong> crp (Gonzá<strong>le</strong>z-Gil et al., 1998), <strong>de</strong> même que CRP influence<br />
directement l’expression <strong>de</strong> fis (Nasser et al., 2001b). Aussi bien <strong>Fis</strong> que CRP se fixent <strong>au</strong>x<br />
promoteurs <strong>de</strong> hupA et hupB (C<strong>la</strong>ret et Rouvière-Yaniv, 1996). <strong>Fis</strong> est éga<strong>le</strong>ment impliqué<br />
<strong>dans</strong> <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> hns (Falconi et al., 1996). La comp<strong>le</strong>xité <strong>de</strong> ces<br />
interactions reste pour <strong>le</strong> moment mal comprise, en particulier <strong>la</strong> nature <strong>de</strong>s changements en<br />
composition <strong>de</strong> NAP <strong>dans</strong> un mutant inactivé <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> du gène codant l’une <strong>de</strong>s <strong>au</strong>tres NAP.<br />
Toutefois, <strong>le</strong>s données actuel<strong>le</strong>s indiquent que <strong>le</strong> rése<strong>au</strong> d’interactions entre régu<strong>la</strong>teurs est un<br />
élément essentiel <strong>de</strong> <strong>la</strong> modu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’expression génique.<br />
Figure 19 : Rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tions entre <strong>le</strong>s régu<strong>la</strong>teurs glob<strong>au</strong>x. Le schéma est simplifié en<br />
omettant <strong>le</strong>s <strong>au</strong>torégu<strong>la</strong>tions <strong>de</strong> certains gènes tels que fis, hns, crp. Les gènes sont indiqués<br />
en italique, <strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s en type droit. Les effets activateurs sont représentés par une flèche<br />
b<strong>le</strong>ue, <strong>le</strong>s effets répresseurs par une ligne rouge. L’expression <strong>de</strong>s gènes est signalée par une<br />
flèche grise (d’après Travers et Muskhelishvili, 2005b).<br />
67
Introduction bibliographique<br />
II.A.4.3 La régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce est un<br />
processus comp<strong>le</strong>xe.<br />
Au cours <strong>de</strong> l’infection, <strong>la</strong> bactérie pathogène doit faire face à un environnement<br />
comp<strong>le</strong>xe et hosti<strong>le</strong>. El<strong>le</strong> doit donc être capab<strong>le</strong> <strong>de</strong> mettre en p<strong>la</strong>ce <strong>de</strong>s réponses adaptatives<br />
appropriées, médiées par une modification <strong>de</strong> l’expression génique (Cotter et Mil<strong>le</strong>r, 1998).<br />
Les facteurs <strong>de</strong> transcription régu<strong>la</strong>nt l’expression <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce peuvent sentir <strong>le</strong>s<br />
sign<strong>au</strong>x rencontrés <strong>dans</strong> l’hôte, comme <strong>de</strong>s changements <strong>de</strong> température, l’osmo<strong>la</strong>rité, <strong>le</strong> pH,<br />
<strong>la</strong> concentration en fer, <strong>la</strong> disponibilité en nutriments, <strong>le</strong>s agents anti-microbiens, <strong>le</strong> t<strong>au</strong>x<br />
d’oxygène,… (MacKichan et al., 2004 ; Mandin et al., 2005 ; Lamy et al., 2004 ; Dramsi et<br />
al., 2004 ; Rickman et al.,2005 ; Deziel et al., 2005 ; Dong et al., 2005). En plus <strong>de</strong> <strong>le</strong>ur<br />
action directe sur l’expression <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce, <strong>le</strong>s régu<strong>la</strong>teurs <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce sont<br />
généra<strong>le</strong>ment organisés en rése<strong>au</strong>x qui permettent d’imposer une chronologie <strong>dans</strong> <strong>la</strong> synthèse<br />
<strong>de</strong>s différents facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce. En effet, comme précé<strong>de</strong>mment indiqué, l’infection <strong>de</strong><br />
l’hôte par <strong>le</strong> pathogène requiert une production adéquate par ce <strong>de</strong>rnier <strong>de</strong>s facteurs requis <strong>au</strong>x<br />
différents sta<strong>de</strong>s du processus infectieux. Le cas du rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong><br />
viru<strong>le</strong>nce d’E. chrysanthemi sera traité <strong>dans</strong> <strong>le</strong> chapitre suivant.<br />
IIB<br />
Autres mécanismes <strong>de</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse protéique<br />
chez <strong>le</strong>s procaryotes<br />
Le contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’expression génique peut éga<strong>le</strong>ment avoir lieu à d’<strong>au</strong>tres nive<strong>au</strong>x <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
chaîne <strong>de</strong> production. Ainsi, il existe <strong>de</strong>s régu<strong>la</strong>tions post transcriptionnel<strong>le</strong>s et post<br />
traductionnel<strong>le</strong>s. Ces <strong>de</strong>ux types <strong>de</strong> contrô<strong>le</strong> possè<strong>de</strong>nt <strong>de</strong>ux avantages princip<strong>au</strong>x : <strong>le</strong> premier<br />
est <strong>de</strong> réaliser <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s produits quand <strong>le</strong>s conditions environnementa<strong>le</strong>s sont<br />
favorab<strong>le</strong>s et non quand <strong>la</strong> bactérie est en stress nutritionnel par exemp<strong>le</strong>, condition limitante<br />
pour l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription. Le <strong>de</strong>uxième avantage est <strong>de</strong> disposer immédiatement du<br />
produit requis, en s’affranchissant du temps <strong>de</strong> synthèse et du coût énergétique à cet instant<br />
précis. La régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’activité du facteur σ S illustre bien ces <strong>de</strong>ux cas. Comme<br />
précé<strong>de</strong>mment indiqué, <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> σ S est fortement stimulée lors <strong>de</strong> l’entrée en phase<br />
stationnaire <strong>de</strong> croissance et par divers stress environnement<strong>au</strong>x (Hengge-Aronis, 2000b).<br />
Cette <strong>protéine</strong>, codée par <strong>le</strong> gène rpoS, a un poids molécu<strong>la</strong>ire d’environ 38 kDa. Les facteurs<br />
68
Introduction bibliographique<br />
σ S et σ 70 peuvent reconnaître un même promoteur avec <strong>la</strong> même efficacité in vitro (Ding et<br />
al., 1995; Jishage et al., 1996). Pourtant ils contrô<strong>le</strong>nt l’expression <strong>de</strong> gènes différents<br />
puisqu’une inactivation <strong>de</strong> rpoS réduit fortement ou élimine l’expression <strong>de</strong>s gènes cib<strong>le</strong>s <strong>de</strong><br />
σ S . Comment est assurée <strong>la</strong> spécificité <strong>de</strong> σ S pour ses séquences promotrices? La structuration<br />
<strong>de</strong>s régions régu<strong>la</strong>trices <strong>de</strong>s gènes cib<strong>le</strong>s (présence d’éléments UP proxima<strong>le</strong> ou dista<strong>le</strong>) et<br />
l’<strong>au</strong>gmentation <strong>de</strong> <strong>la</strong> concentration cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> σ S <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s conditions où il est requis pourrait<br />
favoriser <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> ce facteur <strong>de</strong> transcription sur <strong>le</strong>s promoteurs <strong>de</strong> ses gènes cib<strong>le</strong>s <strong>au</strong><br />
détriment <strong>de</strong> σ 70 . Par ail<strong>le</strong>urs, comme précé<strong>de</strong>mment indiqué, l’ADN génomique est associé<br />
in vivo à différentes <strong>protéine</strong>s, appartenant à <strong>la</strong> famil<strong>le</strong> <strong>de</strong>s NAP (« <strong>protéine</strong>s <strong>associée</strong>s <strong>au</strong><br />
nucléoï<strong>de</strong> »), pour former <strong>le</strong> nucléoï<strong>de</strong> ; certaines <strong>de</strong> ces <strong>protéine</strong>s, notamment H-NS et <strong>Fis</strong>,<br />
interviennent éga<strong>le</strong>ment <strong>dans</strong> <strong>la</strong> spécificité <strong>de</strong>s facteurs sigma (Arnqvist et al., 1994; Hengge-<br />
Aronis, 1999). En fait, l’ARN polymérase ne reconnaît pas <strong>de</strong>s séquences sur un ADN<br />
linéaire mais plutôt une structure nucléoprotéique comp<strong>le</strong>xe <strong>dans</strong> <strong>la</strong>quel<strong>le</strong> l’accessibilité à<br />
l’ADN est modulée par <strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s NAP. La sé<strong>le</strong>ction <strong>de</strong>s promoteurs par L’ARN<br />
polymérase σ 70 ou l’ARN polymérase σ S serait donc liée à <strong>la</strong> re<strong>la</strong>tive disponibilité <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux<br />
facteurs σ et à l’action <strong>de</strong> certaines <strong>protéine</strong>s NAP. Cet exemp<strong>le</strong> met encore une fois en<br />
évi<strong>de</strong>nce l’existence d’une connexion entre <strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s NAP et σ S .<br />
En plus <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance, il a été observé que <strong>la</strong> concentration cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> σ S<br />
est régulée par différents stimuli tels que : une forte osmo<strong>la</strong>rité, une température faib<strong>le</strong>, un pH<br />
aci<strong>de</strong>… (Figure 20). La régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> σ S s’avère donc très comp<strong>le</strong>xe.<br />
69
Introduction bibliographique<br />
Diminution <strong>de</strong><br />
<strong>la</strong> croissance<br />
Densité<br />
cellu<strong>la</strong>ire<br />
Faib<strong>le</strong><br />
température<br />
Forte<br />
osmo<strong>la</strong>rité<br />
Absence <strong>de</strong><br />
source <strong>de</strong><br />
carbone<br />
Température<br />
h<strong>au</strong>te pH aci<strong>de</strong><br />
Transcription<br />
Traduction<br />
σS<br />
Protéolyse<br />
rpoS<br />
ARNm<br />
Enzyme core<br />
ARN<br />
polymérase<br />
Expression <strong>de</strong>s gènes:<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> réponse<br />
généra<strong>le</strong> <strong>au</strong><br />
stress<br />
<strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce<br />
Figure 20 : Régu<strong>la</strong>tion du nive<strong>au</strong> cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> σ S en fonction <strong>de</strong>s stimuli extérieurs chez<br />
<strong>la</strong> bactérie Escherichia coli (Hengge-Aronis, 2000b).<br />
Stimulus extérieur activateur<br />
Stimulus extérieur répresseur<br />
La transcription du gène rpoS se fait via un promoteur majeur <strong>de</strong> type σ 70 . Durant <strong>la</strong><br />
phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance, chez E. coli, <strong>le</strong> gène rpoS est significativement transcrit et<br />
<strong>le</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> transcription <strong>au</strong>gmente d’un facteur trois à quatre lors <strong>de</strong> l’entrée en phase<br />
stationnaire (Takayanagi et al., 1994). Ce contrô<strong>le</strong> transcriptionnel implique essentiel<strong>le</strong>ment<br />
<strong>de</strong>s métabolites s’accumu<strong>la</strong>nt en phase stationnaire (<strong>le</strong> guanosine-3’ 5’bispyrophosphate<br />
(ppGpp), l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et <strong>le</strong> polyphosphate). Les mécanismes<br />
d’actions <strong>de</strong> ces métabolites <strong>de</strong>meurent non élucidés. Toutefois, <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion<br />
transcriptionnel<strong>le</strong> influe peu sur <strong>la</strong> concentration cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> σ S chez E. coli ; c’est par contre<br />
<strong>le</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion principal <strong>dans</strong> <strong>le</strong> genre Pseudomonas où <strong>la</strong> transcription du gène rpoS<br />
est fortement activée en phase stationnaire <strong>de</strong> croissance (Fujita et al., 1994).<br />
Chez E. coli, il y a une quasi absence du facteur σ S durant <strong>la</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong><br />
croissance, malgré l’existence d’une transcription effective du gène rpoS, <strong>la</strong>issant présager<br />
une régu<strong>la</strong>tion post-transcriptionnel<strong>le</strong>. L’utilisation <strong>de</strong> différentes approches expérimenta<strong>le</strong>s a<br />
montré que <strong>la</strong> traduction <strong>de</strong>s transcrits rpoS est activée par <strong>le</strong>s divers stimuli qui modu<strong>le</strong>nt <strong>la</strong><br />
concentration cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> σ S (Figure 20) (Lange et Hengge-Aronis, 1994). L’<strong>au</strong>gmentation<br />
<strong>de</strong> l’efficacité <strong>de</strong> <strong>la</strong> traduction implique une interaction entre <strong>le</strong>s ARNms rpoS et différentes<br />
<strong>protéine</strong>s régu<strong>la</strong>trices d’ARNs (Hfq, RprA, DsrA, <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> NAP HU), rendant <strong>le</strong>urs<br />
70
Introduction bibliographique<br />
séquences <strong>de</strong> Shine et Dalgarno plus accessib<strong>le</strong>s <strong>au</strong>x ARNs ribosom<strong>au</strong>x. Les régu<strong>la</strong>teurs<br />
DsrA et RprA seraient impliqués <strong>dans</strong> l’induction <strong>de</strong> <strong>la</strong> traduction <strong>de</strong> rpoS par <strong>le</strong> froid et <strong>le</strong><br />
stress osmotique, respectivement (Majda<strong>la</strong>ni et al., 2002; Repoi<strong>la</strong> et Gottesman, 2001). En<br />
plus <strong>de</strong> ces systèmes d’activation, <strong>de</strong>ux mécanismes <strong>de</strong> répression impliquant <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> NAP<br />
H-NS et <strong>le</strong> régu<strong>la</strong>teur OxyS ont éga<strong>le</strong>ment été mis en évi<strong>de</strong>nce ; H-NS et OxyS antagonisent<br />
l’action <strong>de</strong> HU et Hfq, respectivement (Hengge-Aronis, 2000b).<br />
Le facteur σ S est soumis à une forte protéolyse lors <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong><br />
croissance. Cette dégradation requiert <strong>de</strong>ux partenaires : <strong>la</strong> protéase ClpXP et <strong>le</strong> régu<strong>la</strong>teur<br />
RssB (Muff<strong>le</strong>r et al., 1996; Schwe<strong>de</strong>r et al., 1996). Un modè<strong>le</strong> du fonctionnement <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
protéolyse a été proposé par Hengge-Aronis (Hengge-Aronis, 2000b): sous sa forme<br />
phosphorylée, RssB se lie à σ S , <strong>le</strong> comp<strong>le</strong>xe est reconnu par ClpXP et σ S est dégradé. Les<br />
mécanismes <strong>de</strong> signalisation contrô<strong>la</strong>nt <strong>la</strong> phosphory<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> RssB sont inconnus.<br />
Il apparaît donc que σ S est un facteur <strong>de</strong> transcription <strong>de</strong> <strong>la</strong> réponse généra<strong>le</strong> <strong>au</strong> stress<br />
plutôt qu’un régu<strong>la</strong>teur spécifique <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase stationnaire <strong>de</strong> croissance. La régu<strong>la</strong>tion du<br />
nive<strong>au</strong> cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> σ S est donc essentiel<strong>le</strong>ment régie par <strong>de</strong>s contrô<strong>le</strong>s post-transcriptionnels<br />
chez E. coli et transcriptionnels chez <strong>le</strong>s Pseudomonas. Cette différence <strong>de</strong> contrô<strong>le</strong> pourrait<br />
être lié <strong>au</strong> fait que σ S a un rô<strong>le</strong> re<strong>la</strong>tivement limité <strong>dans</strong> <strong>la</strong> réponse généra<strong>le</strong> <strong>au</strong> stress chez<br />
Pseudomonas.<br />
III Erwinia chrysan hemi, t une bactérie phytopathogène<br />
IIIA Taxonomie <strong>de</strong>s Erwiniae<br />
Le genre Erwinia, nommé d’après <strong>le</strong> phytobactériologiste Erwin F. Smith, a été fondé<br />
en 1920 pour réunir <strong>le</strong>s bactéries phytopathogènes à Gram négatif, en forme <strong>de</strong> bacil<strong>le</strong>,<br />
anaérobies facultatives et mobi<strong>le</strong>s (Winslow et al., 1920). Les Erwiniae appartiennent à <strong>la</strong><br />
famil<strong>le</strong> <strong>de</strong>s Enterobacteriaceae, el<strong>le</strong>-même incluse <strong>dans</strong> <strong>le</strong> phylum <strong>de</strong>s protéobactéries.<br />
Pendant <strong>de</strong> nombreuses années, une c<strong>la</strong>ssification proposée par Dye et basée sur <strong>de</strong>s critères<br />
<strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce a <strong>la</strong>rgement été adoptée (Dye, 1968, 1969a, b, c). El<strong>le</strong> subdivisait <strong>le</strong> genre<br />
Erwinia en 4 groupes : <strong>le</strong>s Erwiniae provoquant une nécrose, <strong>le</strong>s Erwiniae pectinolytiques, <strong>le</strong>s<br />
Erwiniae à pigment j<strong>au</strong>ne et <strong>le</strong>s Erwiniae atypiques.<br />
71
Introduction bibliographique<br />
La comparaison d’une trentaine <strong>de</strong> séquences d’ADNr 16S d’espèces différentes du<br />
genre Erwinia (H<strong>au</strong>ben et al., 1998; Kwon et al., 1997) et <strong>la</strong> comparaison <strong>de</strong> <strong>la</strong> structure<br />
secondaire <strong>de</strong>s ARNr correspondants ont conduit H<strong>au</strong>ben et al. (1998) à répartir <strong>le</strong>s Erwinia<br />
<strong>dans</strong> quatre genres différents :<br />
- Le genre Erwinia regroupe désormais <strong>le</strong>s Erwiniae nécrotiques strictes tel<strong>le</strong>s que<br />
E. amylovora ou E. rhapontici.<br />
- Le genre Pectobacterium regroupe <strong>le</strong>s espèces pectinolytiques dont E.<br />
chrysanthemi, E. cypripedii et <strong>le</strong>s cinq sous-espèces d’E. carotovora. Ce genre,<br />
comprend <strong>le</strong>s espèces possédant une forte activité pectinolytique qui provoquent <strong>la</strong><br />
macération <strong>de</strong>s tissus végét<strong>au</strong>x.<br />
- Le genre Brenneria rassemb<strong>le</strong> <strong>de</strong>s espèces responsab<strong>le</strong>s <strong>de</strong>s ma<strong>la</strong>dies affectant <strong>le</strong>s<br />
arbres tel<strong>le</strong>s que E. alni ou E. nigrifluens.<br />
- Enfin, <strong>le</strong> genre Pantoea déjà existant (Gavini et al., 1989) comprend <strong>le</strong>s espèces E.<br />
herbico<strong>la</strong> et E. stewartii qui sécrètent un pigment j<strong>au</strong>ne.<br />
Quelques <strong>au</strong>tres espèces d’Erwinia ont été rec<strong>la</strong>ssées <strong>dans</strong> <strong>le</strong> genre Enterobacter, comme<br />
E. dissolvens.<br />
Certains microbiologistes s'opposent toutefois <strong>au</strong> c<strong>la</strong>ssement d'E. chrysanthemi <strong>dans</strong> <strong>le</strong><br />
genre Pectobacterium, notamment suite à <strong>la</strong> comparaison <strong>de</strong> diverses séquences nucléiques<br />
qui tendraient à rapprocher E. chrysanthemi du genre Yersinia.<br />
De récentes analyses <strong>de</strong> ce groupe <strong>de</strong> bactéries suggèrent qu’E. chrysanthemi <strong>de</strong>vrait<br />
être renommée Dickeya dadantii (Samson et al., 2005). Cette nouvel<strong>le</strong> proposition démontre<br />
que <strong>la</strong> c<strong>la</strong>ssification <strong>de</strong>s entérobactéries phytopathogènes reste à c<strong>la</strong>rifier. Ces remises en<br />
questions perpétuel<strong>le</strong>s et l’usage be<strong>au</strong>coup plus courant du terme Erwinia chrysanthemi nous<br />
conduisent à continuer d’utiliser l’ancienne dénomination.<br />
IIIB Distribution géographique<br />
E. chrysanthemi est couramment rencontrée <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s sols (saprophyte) ou à <strong>la</strong> surface<br />
<strong>de</strong>s p<strong>la</strong>ntes (épiphyte). D’<strong>au</strong>tres Erwiniae pectinolytiques, comme Erwinia carotovora<br />
atroseptica et Erwinia carotovora carotovora, produisent <strong>le</strong> même type <strong>de</strong> symptômes. Les<br />
pertes économiques <strong>associée</strong>s <strong>au</strong>x Erwiniae pectinolytiques varient en fonction du climat,<br />
mais <strong>au</strong>ssi <strong>de</strong>s pratiques cultura<strong>le</strong>s et <strong>de</strong>s conditions <strong>de</strong> conservation post-récolte. Jusqu’à<br />
présent, ces bactéries étaient retrouvées <strong>dans</strong> <strong>de</strong>s niches écologiques distinctes : Erwinia<br />
72
Introduction bibliographique<br />
carotovora atroseptica spécifiquement sur pomme <strong>de</strong> terre en milieu tempéré, E.<br />
chrysanthemi sur <strong>de</strong> nombreux hôtes en milieu tropical, et Erwinia carotovora carotovora sur<br />
une gran<strong>de</strong> diversité d’hôtes et une <strong>la</strong>rge répartition géographique (Pérombelon, 2002).<br />
Depuis quelques années, <strong>le</strong>s producteurs d’endive et <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre du nord <strong>de</strong> <strong>la</strong> France<br />
font face <strong>au</strong> développement <strong>de</strong> bactérioses c<strong>au</strong>sées par E. chrysanthemi (Hélias et al., 2006).<br />
Réch<strong>au</strong>ffement et variations climatiques brusques pourraient en être <strong>la</strong> c<strong>au</strong>se. L’émergence en<br />
milieu tempéré <strong>de</strong> cette bactérie d’origine tropica<strong>le</strong> est d’<strong>au</strong>tant plus inquiétante qu’<strong>au</strong>cun<br />
cultivar résistant n’est connu à ce jour et que <strong>le</strong>s moyens <strong>de</strong> lutte sont limités.<br />
Les Erwiniae pectinolytiques sont donc caractérisées par <strong>le</strong>ur répartition géographique<br />
mondia<strong>le</strong>. E. chrysanthemi et E. carotovora sont retrouvées <strong>au</strong>ssi bien sous <strong>de</strong>s climats<br />
tropic<strong>au</strong>x ou subtropic<strong>au</strong>x que tempérés. Selon <strong>le</strong>s données <strong>de</strong> l'O.E.P.P., E. chrysanthemi est<br />
définitivement présente <strong>dans</strong> <strong>de</strong> nombreuses régions du mon<strong>de</strong> (Figure 21). Dans certaines<br />
d'entre el<strong>le</strong>s, comme l'Australie, l'Afrique du sud, <strong>le</strong> Brésil ou Cuba, <strong>la</strong> bactérie est très<br />
<strong>la</strong>rgement répandue. Dans <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s pays concernés, E. chrysanthemi est répertoriée <strong>dans</strong><br />
<strong>la</strong> liste <strong>de</strong>s organismes phytopathogènes <strong>de</strong> quarantaine.<br />
Figure 21 : Distribution géographique d’Erwinia chrysanthemi (O.E.P.P, 2006).<br />
73
Introduction bibliographique<br />
IIIC Le pouvoir pathogène d’E. chrysanthemi<br />
Comme précé<strong>de</strong>mment indiqué, E. chrysanthemi infecte une <strong>la</strong>rge gamme d'hôtes<br />
parmi <strong>le</strong>squels <strong>de</strong>s p<strong>la</strong>ntes monocotylédones et dicotylédones, ornementa<strong>le</strong>s (chrysanthème,<br />
Saintp<strong>au</strong>lia ionantha) ou d'intérêt économique (maïs, pomme <strong>de</strong> terre) (Perombelon et<br />
Salmond, 1994). El<strong>le</strong> s'attaque <strong>au</strong>ssi bien <strong>au</strong>x feuil<strong>le</strong>s, qu'<strong>au</strong>x tiges et <strong>au</strong>x organes <strong>de</strong> réserve<br />
<strong>de</strong> ses hôtes (Figure 22).<br />
A<br />
B<br />
C<br />
D<br />
E<br />
Figure 22 : Symptômes c<strong>au</strong>sés par E. chrysanthemi.<br />
A et B : Pourriture <strong>de</strong> feuil<strong>le</strong>s <strong>de</strong> chrysanthème (Institut national <strong>de</strong> production végéta<strong>le</strong> et <strong>de</strong> <strong>la</strong> protection<br />
<strong>de</strong>s p<strong>la</strong>ntes, <strong>de</strong> Mayence, Al<strong>le</strong>magne)<br />
C : Macération d’un tubercu<strong>le</strong> <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre (Laboratoire Microbiologie Adaptation Pathogénie)<br />
D : Macération d’un p<strong>la</strong>nt d’aloe vera (National Research Centre for Medicinal and Aromatic P<strong>la</strong>nts, India)<br />
E : Macération d’une feuil<strong>le</strong> d’endive (Laboratoire Microbiologie Adaptation Pathogénie).<br />
74
Introduction bibliographique<br />
Avant d'initier une infection, <strong>le</strong>s Erwiniae se comportent comme <strong>de</strong>s bactéries<br />
saprophytes <strong>dans</strong> <strong>le</strong> sol et l'e<strong>au</strong> (Toth et al., 2003). El<strong>le</strong>s peuvent pénétrer <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s p<strong>la</strong>ntes par<br />
l'intermédiaire <strong>de</strong>s ouvertures naturel<strong>le</strong>s (<strong>le</strong>s stomates ou <strong>le</strong>s <strong>le</strong>nticel<strong>le</strong>s) et artificiel<strong>le</strong>s (<strong>le</strong>s<br />
b<strong>le</strong>ssures). El<strong>le</strong>s peuvent alors rester <strong>la</strong>tentes ou proliférer (Perombelon et Salmond, 1994). La<br />
mobilité <strong>de</strong>s bactéries <strong>le</strong>ur permet d'atteindre <strong>le</strong>s différents organes <strong>de</strong> l'hôte. Même après être<br />
parvenues <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s espaces intercellu<strong>la</strong>ires, <strong>le</strong>s bactéries peuvent rési<strong>de</strong>r <strong>dans</strong> ces zones,<br />
parfois pendant plusieurs mois, <strong>dans</strong> un état <strong>de</strong> quiescence (Perombelon, 2002; Toth et al.,<br />
2003).<br />
La prolifération <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s tissus vascu<strong>la</strong>ires déc<strong>le</strong>nche une ma<strong>la</strong>die dont <strong>le</strong>s symptômes<br />
dépen<strong>de</strong>nt <strong>de</strong>s conditions environnementa<strong>le</strong>s. Généra<strong>le</strong>ment, <strong>le</strong>s Erwiniae pectinolytiques<br />
envahissent <strong>le</strong> parenchyme et provoquent <strong>la</strong> macération <strong>de</strong>s tissus. Le symptôme <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
ma<strong>la</strong>die provoquée par E. chrysanthemi est appelé "pourriture mol<strong>le</strong>", celui dû à E.<br />
carotovora est appelé "jambe noire" sur p<strong>la</strong>nts <strong>de</strong> pomme <strong>de</strong> terre. Le processus <strong>de</strong><br />
macération implique <strong>la</strong> déstructuration <strong>de</strong>s parois intercellu<strong>la</strong>ires végéta<strong>le</strong>s. Pour ce faire, <strong>le</strong>s<br />
bactéries sécrètent un arsenal d’enzymes dégradatives.<br />
III.C.1 Un pouvoir pathogène multifactoriel<br />
L’interaction entre E. chrysanthemi et ses hôtes est un processus multifactoriel<br />
comp<strong>le</strong>xe impliquant <strong>de</strong> nombreux facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce. Au cours <strong>de</strong> l’interaction, <strong>le</strong>s<br />
Erwiniae pectinolytiques vont progressivement passer d’un état biotrophe à un état<br />
nécrotrophe ce qui implique une chronologie <strong>dans</strong> <strong>la</strong> mise en p<strong>la</strong>ce <strong>de</strong>s fonctions nécessaires à<br />
<strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce et à <strong>la</strong> survie <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie <strong>dans</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte. La première phase <strong>de</strong> l’infection passe<br />
par une étape d’adhésion <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie à <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte qui implique <strong>de</strong>s structures <strong>de</strong> surface tel<strong>le</strong>s<br />
que <strong>le</strong> lipopolysacchari<strong>de</strong> (LPS), <strong>le</strong>s exopolysacchari<strong>de</strong>s (EPS) et l’adhésine HecA.<br />
Dans un <strong>de</strong>uxième temps, E. chrysanthemi doit se multiplier et survivre <strong>dans</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte.<br />
Cette multiplication est liée à une adaptation à <strong>de</strong>s conditions particulières. Ainsi, E.<br />
chrysanthemi, en réponse à <strong>la</strong> faib<strong>le</strong> disponibilité en fer libre <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s espaces intercellu<strong>la</strong>ires,<br />
produit <strong>de</strong>ux sidérophores : <strong>la</strong> chrysobactine et l’achromobactine qui lui permettent d’entrer<br />
en compétition avec <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s végéta<strong>le</strong>s vis-à-vis <strong>de</strong> l’assimi<strong>la</strong>tion du fer (Expert, 1999). Le<br />
fer, toxique à l’état libre et très peu solub<strong>le</strong>, n’existe pratiquement que sous forme comp<strong>le</strong>xée<br />
<strong>dans</strong> <strong>le</strong>s p<strong>la</strong>ntes et <strong>la</strong> quantité <strong>de</strong> fer libre <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s flui<strong>de</strong>s intercellu<strong>la</strong>ires est très faib<strong>le</strong>. E.<br />
75
Introduction bibliographique<br />
chrysanthemi 3937 possè<strong>de</strong> plusieurs voies d’acquisition du fer. Outre <strong>le</strong>s gènes fct et acr qui<br />
correspon<strong>de</strong>nt respectivement <strong>au</strong>x récepteurs <strong>de</strong>s comp<strong>le</strong>xes ferri-chrysobactine et ferriachromobactine,<br />
el<strong>le</strong> possè<strong>de</strong> éga<strong>le</strong>ment un gène fepA qui co<strong>de</strong> <strong>le</strong> récepteur <strong>de</strong><br />
l’entérobactine, un sidérophore produit par d’<strong>au</strong>tres entérobactéries notamment Escherichia<br />
coli, un gène fhuA qui co<strong>de</strong> <strong>le</strong> récepteur du ferrichrome, un sidérophore produit par <strong>de</strong>s<br />
champignons, ainsi que trois <strong>au</strong>tres gènes codant d’<strong>au</strong>tres récepteurs <strong>de</strong> ferri-sidérophores<br />
potentiels. E. chrysanthemi peut donc assimi<strong>le</strong>r, en plus <strong>de</strong> ses propres sidérophores, <strong>de</strong>s<br />
comp<strong>le</strong>xes ferriques produits par d’<strong>au</strong>tres microorganismes (Enard et al., 1988; Enard et<br />
Expert, 2000; Persmark et al., 1992). La disponibilité du fer coordonne l’expression <strong>de</strong> gènes<br />
impliqués <strong>dans</strong> <strong>le</strong> transport du fer et <strong>de</strong> plusieurs pectate lyases (Franza et al., 1999; Franza et<br />
al., 2002).<br />
Au cours <strong>de</strong> l’interaction avec <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte, E. chrysanthemi produit <strong>de</strong>s sign<strong>au</strong>x éliciteurs<br />
qui induisent <strong>le</strong>s défenses <strong>de</strong> l’hôte. Ces sign<strong>au</strong>x sont <strong>le</strong>s oligoga<strong>la</strong>cturoni<strong>de</strong>s issus <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
dégradation <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine (Legendre et al., 1993; Norman et al., 1999; Reymond et al., 1995)<br />
ou <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s bactériennes comme <strong>la</strong> f<strong>la</strong>gelline (Zipfel et al., 2004), <strong>la</strong> harpine HprN<br />
(B<strong>au</strong>er et al., 1995; Yang et al., 2002), <strong>la</strong> pectate lyase PelI-3 d’E. chrysanthemi (Shevchik et<br />
al., 1998). La mise en p<strong>la</strong>ce <strong>de</strong>s réactions <strong>de</strong> défenses <strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte aboutit à <strong>la</strong> production <strong>de</strong><br />
pepti<strong>de</strong>s antimicrobiens, <strong>de</strong> composés phénoliques et d’agents oxydants qui ont un fort<br />
pouvoir bactérici<strong>de</strong>. Pour survivre, E. chrysanthemi va alors <strong>de</strong>voir contrer ces réactions <strong>de</strong><br />
défense en induisant <strong>la</strong> synthèse d’un ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong> facteurs impliqués d’une part <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
détoxification <strong>de</strong>s composés bactérici<strong>de</strong>s et d’<strong>au</strong>tre part <strong>dans</strong> <strong>de</strong>s mécanismes <strong>de</strong> réparation<br />
<strong>de</strong>s composants cellu<strong>la</strong>ires (El Hassouni et al., 1999; Lopez-So<strong>la</strong>nil<strong>la</strong> et al., 1998; Miguel et<br />
al., 2000; Reverchon et al., 2002; Santos et al., 2001). E. chrysanthemi a éga<strong>le</strong>ment <strong>la</strong><br />
capacité <strong>de</strong> manipu<strong>le</strong>r et <strong>de</strong> supprimer <strong>le</strong>s réactions <strong>de</strong> défense <strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte. En effet, cette<br />
bactérie produit <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s effectrices DspE qui, grâce à un système <strong>de</strong> sécrétion <strong>de</strong> type<br />
III, sont injectées <strong>dans</strong> <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong> végéta<strong>le</strong> où el<strong>le</strong>s vont interférer avec <strong>de</strong>s casca<strong>de</strong>s <strong>de</strong><br />
phosphory<strong>la</strong>tion et supprimer l’activation <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> défenses (DebRoy et al., 2004; Ho<strong>le</strong>va<br />
et al., 2004).<br />
Enfin <strong>dans</strong> une <strong>de</strong>rnière phase du processus infectieux, <strong>la</strong> bactérie libère une quantité<br />
massive <strong>de</strong>s enzymes dégradatives <strong>de</strong> <strong>la</strong> paroi végéta<strong>le</strong> provoquant <strong>la</strong> pourriture mol<strong>le</strong>. Parmi<br />
ces enzymes, <strong>le</strong>s pectinases ont un rô<strong>le</strong> prépondérant puisque purifiées ces enzymes sont<br />
capab<strong>le</strong>s à el<strong>le</strong>s seu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> reproduire <strong>le</strong>s symptômes <strong>de</strong> <strong>la</strong> pourriture mol<strong>le</strong> (Collmer et Keen,<br />
1986). De concert avec ces pectinases, d’<strong>au</strong>tres enzymes participent à <strong>la</strong> dégradation <strong>de</strong>s<br />
parois végéta<strong>le</strong>s. Deux cellu<strong>la</strong>ses, CelY et Cel5, ont été i<strong>de</strong>ntifiées <strong>dans</strong> <strong>la</strong> souche 3937 et<br />
76
Introduction bibliographique<br />
participent à <strong>la</strong> dégradation <strong>de</strong>s fibres <strong>de</strong> cellulose. D’<strong>au</strong>tres enzymes dégradatives sécrétées<br />
par E. chrysanthemi ont été caractérisées <strong>dans</strong> différentes souches s<strong>au</strong>vages, parmi <strong>le</strong>squel<strong>le</strong>s<br />
quatre métalloprotéases PrtA, PrtB, PrtC et PrtG qui sont sécrétées par l’ABC transporteur<br />
spécifique PrtDEF (Barras et al., 1994; De<strong>le</strong>pe<strong>la</strong>ire et Wan<strong>de</strong>rsman, 1990), une endoxy<strong>la</strong>nase<br />
chez E. chrysanthemi D1 (Hurlbert et Preston, 2001; Keen et al., 1996) et <strong>la</strong> phospholipase<br />
PlcA chez E. chrysanthemi EC16 (Keen et al., 1992). Les gènes correspondant à ces<br />
différentes <strong>protéine</strong>s caractérisées chez d’<strong>au</strong>tres souches d’E. chrysanthemi sont présents <strong>au</strong><br />
sein du génome <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche 3937 (G<strong>la</strong>ssner et al., en préparation).<br />
III.C.1.1 La paroi végéta<strong>le</strong> et <strong>la</strong> pectine<br />
Comme décrit brièvement <strong>dans</strong> <strong>la</strong> première partie, <strong>la</strong> paroi végéta<strong>le</strong> est constituée <strong>de</strong><br />
matrices polysaccharidiques comp<strong>le</strong>xes comprenant <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine, <strong>de</strong> <strong>la</strong> cellulose et <strong>de</strong>s<br />
hémicelluloses (Albersheim et al., 1996). Tous <strong>le</strong>s composants <strong>de</strong> cette paroi sont<br />
interconnectés <strong>de</strong> façon à former un sque<strong>le</strong>tte rigi<strong>de</strong> capab<strong>le</strong> <strong>de</strong> maintenir <strong>la</strong> cohésion <strong>de</strong>s<br />
tissus végét<strong>au</strong>x et <strong>de</strong> résister à <strong>la</strong> pression <strong>de</strong> turgescence <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s végéta<strong>le</strong>s. Les<br />
polymères <strong>de</strong> pectine sont <strong>le</strong>s plus comp<strong>le</strong>xes <strong>de</strong>s polysacchari<strong>de</strong>s pariét<strong>au</strong>x. La pectine<br />
comprend <strong>de</strong> longues chaînes linéaires d'homoga<strong>la</strong>cturonanes interrompues par <strong>de</strong>s<br />
rhamnoga<strong>la</strong>cturonanes ramifiés, <strong>le</strong> RG-I et <strong>le</strong> RG-II (Schols et Voragen, 1996) (Figure 23).<br />
Figure 23 : La paroi végéta<strong>le</strong> et <strong>la</strong> structure biochimique <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine<br />
A : Composition <strong>de</strong> <strong>la</strong> paroi végéta<strong>le</strong>.<br />
77
Introduction bibliographique<br />
B : La pectine est un polymère d’aci<strong>de</strong>s ga<strong>la</strong>cturoniques (GA) liés en α 1-4. Ce sque<strong>le</strong>tte<br />
contient <strong>de</strong>s zones riches en rhamnose (R), liés en β 1-2 avec <strong>le</strong>s ga<strong>la</strong>cturonates suivant, qui<br />
introduisent <strong>de</strong>s courbures <strong>dans</strong> <strong>le</strong> sque<strong>le</strong>tte <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine. D’<strong>au</strong>tre part, <strong>dans</strong> <strong>le</strong> RGI ces<br />
résidus <strong>de</strong> rhamnose servent d’ancrage <strong>au</strong>x chaînes d’arabino-ga<strong>la</strong>ctanes (molécu<strong>le</strong>s <strong>de</strong><br />
pectine neutre) riche en arabinose (A) et en ga<strong>la</strong>ctose (GL). Le RGI et <strong>le</strong> RGII constituent <strong>le</strong>s<br />
régions ramifiées <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine. Les résidus ga<strong>la</strong>cturonates peuvent être méthylés sur <strong>le</strong><br />
carbone 6 ou acétylés sur <strong>le</strong> carbone 2 et/ou 3. G : D-glucose, X : D-xylose, A : L-arabinose,<br />
GA : aci<strong>de</strong> D-ga<strong>la</strong>cturonique, R : L-rhamnose, GL : D-ga<strong>la</strong>ctose, HA : aci<strong>de</strong> 3-désoxy-Dlyxo-heptulosarique,<br />
OA : aci<strong>de</strong> 3-désoxy-D-manno-octulosonique, Ap : D-apiose, F : L-<br />
fucose, AA : aci<strong>de</strong> L-acérique, GU : aci<strong>de</strong> D-glucuronique.<br />
L'homoga<strong>la</strong>cturonane est un homopolymère <strong>de</strong> résidus D-ga<strong>la</strong>cturonate liés par <strong>de</strong>s<br />
liaisons α 1-4 , parfois interrompu par <strong>de</strong>s résidus rhamnose solitaires qui servent d’ancrage à<br />
<strong>de</strong>s chaînes <strong>la</strong>téra<strong>le</strong>s d’oses neutres (arabinoga<strong>la</strong>ctanes) <strong>dans</strong> <strong>le</strong> RGI. La présence <strong>de</strong><br />
rhamnose, lié en α 1-2 <strong>au</strong> ga<strong>la</strong>cturonate suivant introduit <strong>de</strong>s courbures <strong>dans</strong> <strong>la</strong> molécu<strong>le</strong> <strong>de</strong><br />
pectine. Le RG-I est composé d'un sque<strong>le</strong>tte <strong>de</strong> disacchari<strong>de</strong>s (2-α-L-rhamnose-(1-4)α-Dga<strong>la</strong>cturonate-1)<br />
portant <strong>de</strong>s chaînes ramifiées riches en ga<strong>la</strong>ctose et en arabinose (<strong>le</strong>s<br />
arabinoga<strong>la</strong>ctanes) (Mc Neil, 1980). Le RG-II est composé d'un sque<strong>le</strong>tte<br />
d'oligoga<strong>la</strong>cturonates (7 à 12 résidus liés en α 1-4) portant <strong>de</strong>s chaînes <strong>la</strong>téra<strong>le</strong>s incluant <strong>de</strong>s<br />
monosacchari<strong>de</strong>s divers, dont certains rares et avec <strong>de</strong>s liaisons inhabituel<strong>le</strong>s (Schols et<br />
Voragen, 1996; Thomas et Darvill, 1989).<br />
La pectine est liée à <strong>la</strong> cellulose grâce <strong>au</strong>x hémicelluloses (B<strong>au</strong>er et al., 1973).<br />
L’ensemb<strong>le</strong> est maintenu en cohésion grâce <strong>au</strong>x ions Ca 2+ qui assurent un pontage entre <strong>le</strong>s<br />
molécu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> pectine mais <strong>au</strong>ssi grâce à <strong>de</strong>s liaisons cova<strong>le</strong>ntes entre <strong>le</strong>s différents<br />
constituants pariét<strong>au</strong>x. La pectine n’est pas un polymère homogène, el<strong>le</strong> varie par <strong>le</strong> <strong>de</strong>gré <strong>de</strong><br />
méthy<strong>la</strong>tion du C 6 et d’acéty<strong>la</strong>tion du C 3 ou C 2 <strong>de</strong>s résidus ga<strong>la</strong>cturonates (on par<strong>le</strong>ra <strong>de</strong><br />
pectine lorsque l’homoga<strong>la</strong>cturonane est estérifié et <strong>de</strong> polyga<strong>la</strong>cturonate (PGA) lorsqu’il ne<br />
l’est pas), par <strong>la</strong> longueur <strong>de</strong> <strong>la</strong> chaîne principa<strong>le</strong>, par <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> RGI et <strong>la</strong> longueur <strong>de</strong>s<br />
chaînes d’arabinoga<strong>la</strong>ctanes et enfin par <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> RGII.<br />
III.C.1.2 Les pectinases, facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce majeurs chez E. chrysanthemi<br />
Du fait <strong>de</strong> <strong>la</strong> comp<strong>le</strong>xité <strong>de</strong>s pectines se trouvant <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s parois végéta<strong>le</strong>s, E.<br />
chrysanthemi produit diverses pectinases. El<strong>le</strong>s peuvent être séparées en <strong>de</strong>ux groupes<br />
différents : <strong>le</strong>s pectine estérases et <strong>le</strong>s dépolymérases. Une dégradation efficace <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine<br />
par E. chrysanthemi résulte <strong>de</strong> l’action concertée <strong>de</strong> ces <strong>de</strong>ux groupes d’enzymes (Shevchik et<br />
78
Introduction bibliographique<br />
Hugouvieux-Cotte-Pattat, 1997) (Figure 24). Nous ne décrirons que <strong>le</strong>s enzymes <strong>le</strong>s plus<br />
importantes pour <strong>le</strong> pouvoir pathogène.<br />
Figure 24 : La voie <strong>de</strong> dégradation et d’assimi<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine<br />
Les pectinases extracellu<strong>la</strong>ires (Pem : pectine méthy<strong>le</strong>stérase, Pae : pectine acéty<strong>le</strong>stérase, Pnl<br />
: pectine lyase, Pel : pectate lyase, RhiE : rhamnoga<strong>la</strong>cturonate lyase) dégra<strong>de</strong>nt <strong>le</strong>s polymères<br />
pectiques en oligoga<strong>la</strong>cturoni<strong>de</strong>s, majoritairement insaturés (uGAn), qui entrent <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
cellu<strong>le</strong>. Ils sont alors dégradés par <strong>le</strong>s pectinases périp<strong>la</strong>smiques (PehV, W et X :<br />
exopolyga<strong>la</strong>cturonases ainsi que PelX et PaeX) et traversent <strong>la</strong> membrane interne. Dans <strong>le</strong><br />
cytop<strong>la</strong>sme, ils sont catabolisés en pyruvate et 3-phosphoglycéraldéhy<strong>de</strong> qui entrent <strong>dans</strong> <strong>le</strong><br />
79
Introduction bibliographique<br />
métabolisme cellu<strong>la</strong>ire. La pectine peut donc être utilisée comme source <strong>de</strong> carbone pour <strong>la</strong><br />
croissance d’E. chrysanthemi. La localisation cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> PelN, PehN, PehK, PnlG et PnlH<br />
n’est pas encore connue. L’activité enzymatique <strong>de</strong> PelN, PehK, PnlG, PnlH n’a pas encore<br />
été démontrée.<br />
III.C.1.2.a Les pectine estérases<br />
Les pectine estérases hydrolysent <strong>le</strong>s groupements méthy<strong>le</strong>s et acéty<strong>le</strong>s <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine.<br />
Ces enzymes, en diminuant <strong>le</strong>s estérifications présentes <strong>dans</strong> <strong>la</strong> pectine, donnent naissance <strong>au</strong><br />
polyga<strong>la</strong>cturonate (PGA) qui est un substrat plus faci<strong>le</strong>ment accessib<strong>le</strong> <strong>au</strong>x principa<strong>le</strong>s pectine<br />
dépolymérases produites par E. chrysanthemi. Les pectine méthyl-estérases (Pem) clivent <strong>le</strong>s<br />
méthy<strong>la</strong>tions <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong>s régions d’homoga<strong>la</strong>cturonanes, libérant du méthanol<br />
et du PGA. Les pectine acétyl-estérases (Pae) hydrolysent <strong>le</strong>s groupes O-acéty<strong>le</strong> <strong>de</strong>s<br />
homoga<strong>la</strong>cturonanes et libèrent <strong>de</strong> l’aci<strong>de</strong> acétique et du PGA. E. chrysanthemi 3937<br />
synthétise <strong>de</strong>ux pectine méthyl-estérases, PemA sécrétée et PemB qui est ancrée <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
membrane externe (L<strong>au</strong>rent et al., 1993; Shevchik et al., 1996), et <strong>de</strong>ux pectine acéty<strong>le</strong>stérases,<br />
PaeY sécrétée et PaeX localisée <strong>dans</strong> <strong>le</strong> périp<strong>la</strong>sme (Shevchik et Hugouvieux-<br />
Cotte-Pattat, 1997, 2003) (Figure 25).<br />
O-CH 3 O-CH 3<br />
O<br />
CO<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
CO<br />
OH<br />
O<br />
COOH<br />
COOH<br />
O<br />
O<br />
COCH<br />
O OH<br />
O 3 O<br />
O<br />
COOH<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
COOH<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
COOH<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
COCH 3<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
pectin<br />
methy<strong>le</strong>sterase<br />
pectate lyase<br />
acety<strong>le</strong>sterase<br />
PelE<br />
PemB<br />
PelD<br />
PemA<br />
PelC<br />
PelB<br />
PaeY<br />
PaeX<br />
PelA<br />
Figure 25 : Production <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux pectine méthyl-estérases et <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux pectine acétyl-estérases<br />
ches Erwinia chrysanthemi 3937. E<strong>le</strong>ctrofocalisation d’extraits d’Erwinia suivie <strong>de</strong> révé<strong>la</strong>tion<br />
80
Introduction bibliographique<br />
enzymatique spécifique. L’action <strong>de</strong>s pectate lyases, principa<strong>le</strong>s dépolymérases, est éga<strong>le</strong>ment<br />
représentée et utilisée comme marqueur <strong>de</strong> pI.<br />
III.C.1.2.b Les dépolymérases<br />
En ce qui concerne <strong>le</strong>s dépolymérases, on distingue <strong>de</strong>ux types d’activités selon <strong>le</strong><br />
mo<strong>de</strong> <strong>de</strong> clivage <strong>de</strong> <strong>la</strong> liaison glycosidique. D’une part, <strong>le</strong>s pectate lyases qui clivent <strong>le</strong>s<br />
liaisons glycosidiques par β-élimination en en<strong>le</strong>vant un proton et créant une insaturation à<br />
l’extrémité non réductrice du polymère. D’<strong>au</strong>tre part, <strong>le</strong>s polyga<strong>la</strong>cturonases qui clivent <strong>la</strong><br />
liaison glycosidique par un mécanisme d’hydrolyse en incorporant une molécu<strong>le</strong> d’e<strong>au</strong> par<br />
une catalyse aci<strong>de</strong>. Les dépolymérases se distinguent éga<strong>le</strong>ment par <strong>le</strong>ur mo<strong>de</strong> d’attaque du<br />
substrat (endo : clivage aléatoire à l’intérieur <strong>de</strong> <strong>la</strong> chaîne peptidique ou exo : clivage à partir<br />
d’une extrémité <strong>de</strong> <strong>la</strong> chaîne <strong>de</strong> pectine) et par <strong>le</strong>ur substrat préférentiel (<strong>de</strong>gré <strong>de</strong> méthy<strong>la</strong>tion,<br />
longueur <strong>de</strong>s polymères…) (Figure 26).<br />
O-CH 3<br />
O-CH 3<br />
COOH<br />
COOH<br />
CO<br />
CO<br />
COOH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
COCH 3<br />
O<br />
OH<br />
O OH<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
COCH 3 COCH 3<br />
souche<br />
s<strong>au</strong>vage<br />
mutant<br />
∆ pel<br />
PelE<br />
PelI<br />
PelD<br />
PelC<br />
PelB<br />
PelL<br />
PehX, PehW, PehV<br />
PelX<br />
PelW<br />
PelA<br />
(cc x 1 x 30)<br />
Figure 26 : Production <strong>de</strong> dépolymérases chez Erwinia chrysanthemi 3937.<br />
E<strong>le</strong>ctrofocalisation d’extraits d’Erwinia suivie <strong>de</strong> révé<strong>la</strong>tion enzymatique spécifique.<br />
Le récent séquençage du génome <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche 3937 d’E. chrysanthemi (G<strong>la</strong>sner et al.,<br />
en préparation) a prédit l’existence <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux pectine lyases potentiel<strong>le</strong>s (PnlG et PnlH), onze<br />
pectate lyases (PelA, PelB, PelC, PelD, PelE, PelI, PelL, PelN, PelW, PelX, PelZ), cinq<br />
81
Introduction bibliographique<br />
polyga<strong>la</strong>cturonases (PehK, PehN, PehV, PehW et PehX) ainsi qu’une rhamnoga<strong>la</strong>cturonate<br />
lyase, RhiE.<br />
Les pectate lyases jouent un rô<strong>le</strong> déterminant <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s symptômes <strong>de</strong> pourriture mol<strong>le</strong>.<br />
El<strong>le</strong>s clivent <strong>la</strong> pectine faib<strong>le</strong>ment méthylée et libèrent <strong>de</strong>s oligoga<strong>la</strong>cturoni<strong>de</strong>s insaturés<br />
(uGA n ). Chez E. chrysanthemi, parmi <strong>le</strong>s dix pectate lyases caractérisées biochimiquement,<br />
neuf sont <strong>de</strong>s endo-pectate lyases et <strong>de</strong>ux <strong>de</strong>s exo-pectate lyases. Au moins 11 pectinases<br />
(PemA, PaeY, PelA, PelB, PelC, PelD, PelE, PelI, PelL, PelZ et RhiE) sont sécrétées <strong>dans</strong> <strong>le</strong><br />
milieu extérieur par <strong>le</strong> système <strong>de</strong> sécrétion <strong>de</strong> type II Out, où el<strong>le</strong>s génèrent <strong>de</strong>s oligomères<br />
pectiques (Laatu et Con<strong>de</strong>mine, 2003; Roy et al., 1999). Les oligomères extracellu<strong>la</strong>ires<br />
entrent <strong>dans</strong> <strong>le</strong> périp<strong>la</strong>sme <strong>dans</strong> <strong>le</strong>quel ils sont désestérifiés et clivés par <strong>de</strong>s enzymes<br />
périp<strong>la</strong>smiques (PemB, PaeY, PelX, PehV, PehW, PehX) (Shevchik et al., 1999b). Les petits<br />
oligomères, <strong>de</strong>s dimères <strong>au</strong>x tétramères, entrent <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cytop<strong>la</strong>sme grâce à <strong>de</strong>ux systèmes <strong>de</strong><br />
transport : TogT et l’ABC transporteur TogMNAB. Dans <strong>le</strong> cytop<strong>la</strong>sme, ils sont dégradés en<br />
monomères, générant essentiel<strong>le</strong>ment du 5-céto-4-désoxyuronate (DKI) et <strong>de</strong> faib<strong>le</strong>s quantités<br />
<strong>de</strong> ga<strong>la</strong>cturonate (Shevchik et al., 1999a) (Figure 24).<br />
III.C.1.2.c Les endo-pectate lyases : déterminantes <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir pathogène<br />
Parmi <strong>le</strong>s endo-pectate lyases, cinq isoenzymes à forte activité in vitro, PelA, PelB,<br />
PelC, PelD et PelE, représentent 95% <strong>de</strong> l’activité pectate lyase en culture. El<strong>le</strong>s jouent un<br />
rô<strong>le</strong> crucial <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir pathogène et el<strong>le</strong>s sont capab<strong>le</strong>s hormis PelA <strong>de</strong> provoquer <strong>la</strong><br />
pourriture mol<strong>le</strong> sur divers organes végét<strong>au</strong>x dont <strong>de</strong>s tubercu<strong>le</strong>s <strong>de</strong> pommes <strong>de</strong> terre et <strong>de</strong>s<br />
feuil<strong>le</strong>s d’endives (Barras et al., 1994; Collmer et Keen, 1986). Les <strong>au</strong>tres endo-pectate<br />
lyases, PelI, PelL et PelZ (Lojkowska et al., 1995; Pissavin et al., 1998; Shevchik et<br />
Hugouvieux-Cotte-Pattat, 1997), sont dites secondaires car el<strong>le</strong>s présentent une activité plus<br />
faib<strong>le</strong> sur <strong>le</strong> polyga<strong>la</strong>cturonate en dosage in vitro.<br />
Les endo-pectate lyases ont été arbitrairement séparées en trois groupes en fonction <strong>de</strong><br />
<strong>le</strong>ur point isoé<strong>le</strong>ctrique (pI) (Figure 26). La <strong>protéine</strong> PelA est <strong>la</strong> seu<strong>le</strong> à possé<strong>de</strong>r un pI aci<strong>de</strong>,<br />
<strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s PelB, PelC, PelI et PelZ ont un pI légèrement alcalin (<strong>de</strong> 8 à 9.0), enfin <strong>le</strong> pI <strong>de</strong><br />
PelD, PelE et PelL est fortement alcalin (>9) (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996;<br />
Lojkowska et al., 1995; Shevchik et Hugouvieux-Cotte-Pattat, 1997). Par contre toutes ces<br />
enzymes possè<strong>de</strong>nt un pH optimum d’activité alcalin, variant entre 8.0 et 9.3. Cependant, à<br />
pH neutre, PelA, PelD et PelE conservent une partie non négligeab<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>le</strong>ur activité, (25 à<br />
82
Introduction bibliographique<br />
30%), alors que PelB et PelC sont quasiment inactives (Tardy et al., 1997). Au début <strong>de</strong><br />
l’infection, <strong>le</strong> milieu intercellu<strong>la</strong>ire végétal colonisé par Erwinia présente un pH légèrement<br />
aci<strong>de</strong> (entre 5,0 et 6,5 selon <strong>le</strong> végétal), ce qui suggère que <strong>le</strong>s enzymes PelA, PelD et PelE<br />
sont probab<strong>le</strong>ment <strong>le</strong>s plus actives lors <strong>de</strong> cette étape.<br />
L’activité <strong>de</strong>s endo-pectate lyases dépend éga<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> <strong>la</strong> présence d'un cofacteur<br />
ionique diva<strong>le</strong>nt, <strong>le</strong> calcium (Lojkowska et al., 1995; Shevchik et Hugouvieux-Cotte-Pattat,<br />
1997; Tardy et al., 1997). El<strong>le</strong>s peuvent être séparées en <strong>de</strong>ux groupes : PelA, PelD et PelE<br />
agissent préférentiel<strong>le</strong>ment sur <strong>la</strong> pectine non méthylée, <strong>le</strong>s <strong>au</strong>tres pectate lyases ont une<br />
activité optima<strong>le</strong> sur <strong>la</strong> pectine partiel<strong>le</strong>ment méthylée (Tardy et al., 1997). L’activité in vitro<br />
<strong>de</strong>s Pels varie selon <strong>la</strong> longueur <strong>de</strong> <strong>la</strong> chaîne du substrat. Ainsi, PelD a une activité optima<strong>le</strong><br />
sur <strong>de</strong>s tétramères, PelB sur <strong>de</strong>s hexamères et PelA, PelI et PelL sont plus actives sur <strong>de</strong>s<br />
heptamères et octamères (Roy et al., 1999). Cette diversité <strong>de</strong>s pectate lyases permet à<br />
E. chrysanthemi <strong>de</strong> dégra<strong>de</strong>r <strong>de</strong>s pectines variées et d’infecter un <strong>la</strong>rge spectre d’hôtes. Des<br />
tests d’infection sur <strong>de</strong>s p<strong>la</strong>nts <strong>de</strong> Saint p<strong>au</strong>lia, hôte naturel d’E. chrysanthemi, ont révélé une<br />
re<strong>la</strong>tive forte implication <strong>de</strong>s pectate lyases E, A et D <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir pathogène <strong>de</strong> cette<br />
bactérie (Figure 27).<br />
Figure 27 : <strong>Rô<strong>le</strong></strong> <strong>de</strong> différentes pectinases <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir pathogène d’Erwinia sur<br />
Saintp<strong>au</strong>lia. Le pourcentage <strong>de</strong>s p<strong>la</strong>nts présentant une infection généralisée, 15 jours après<br />
inocu<strong>la</strong>tion, est indiqué en rouge. Au contraire, <strong>le</strong> pourcentage <strong>de</strong> p<strong>la</strong>nts pour <strong>le</strong>squels une<br />
absence <strong>de</strong> symptômes ou une macération localisée a été observée après <strong>le</strong> même dé<strong>la</strong>i est<br />
indiqué en b<strong>le</strong>u (d’après Boccara et al., 1988).<br />
83
Introduction bibliographique<br />
III.C.1.2.d Organisation génétique <strong>de</strong>s pectinases<br />
28).<br />
Les gènes <strong>de</strong> pectinases sont dispersés en 14 loci sur <strong>le</strong> chromosome bactérien (Figure<br />
pel<br />
pehV pehW<br />
pelB pelC<br />
Ori<br />
4572 4910/<br />
4433 0<br />
630<br />
pnl<br />
pelA pelE<br />
pae<br />
peh<br />
pe<br />
Erwinia chrysanthemi<br />
3937<br />
3856<br />
1030<br />
3573<br />
1306<br />
(4922 kb)<br />
3430<br />
rhi<br />
peh<br />
cel5 pelL<br />
pnl<br />
3099<br />
2879<br />
2575<br />
2014<br />
2225<br />
pem<br />
kduI<br />
ogl<br />
Organisation transcriptionnel<strong>le</strong> :<br />
P P P P<br />
pelA pelE pelD paeY pemA<br />
pelN pnlG pehK<br />
ADN<br />
} ARNm<br />
pelX pnlH pehN<br />
PpelB PpelC PpelZ<br />
ADN<br />
} ARNm<br />
kduI<br />
kduD<br />
pelI<br />
pelW<br />
rhiE<br />
pemB<br />
togM togN togA togB kdgM paeX<br />
P P<br />
pehV pehW<br />
P<br />
pehX<br />
ADN<br />
ARNm<br />
cel5<br />
pelL<br />
Figure 28 : Organisation génétique <strong>de</strong>s pectinases.<br />
A: Localisation chromosomique <strong>de</strong>s gènes codant <strong>le</strong>s pectinases. La direction <strong>de</strong>s flèches<br />
indique <strong>le</strong> sens <strong>de</strong> transcription sur <strong>le</strong> chromosome et <strong>le</strong>s chiffres correspon<strong>de</strong>nt à <strong>la</strong><br />
position en kb par rapport à l’origine <strong>de</strong> réplication OriC.<br />
B : Organisation transcriptionnel<strong>le</strong> <strong>de</strong>s pectinases. Les différentes pectinases sont indiquées<br />
par <strong>de</strong>s cou<strong>le</strong>urs : vert, pectate lyases; rose, polyga<strong>la</strong>cturonases ; rouge, pectine<br />
méthy<strong>le</strong>stérases ; b<strong>le</strong>u, pectine acéty<strong>le</strong>stérases, b<strong>le</strong>u ciel, rhamnoga<strong>la</strong>cturonate lyase.<br />
Certains loci contiennent un gène isolé, c'est <strong>le</strong> cas pour rhiE, pelI, pelL, pelX, pelN,<br />
pnlG, pnlH, pehK, pehN et pemB alors que d'<strong>au</strong>tres loci regroupent plusieurs gènes <strong>de</strong><br />
pectinases, notamment <strong>dans</strong> <strong>le</strong> locus pelA, pelE, pelD, paeY, pemA, <strong>le</strong> locus pelB, pelC, pelZ,<br />
ainsi que <strong>le</strong> locus pehV, pehW, pehX (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1989; Pissavin et al.,<br />
1996). Lorsque <strong>le</strong>s ARN issus <strong>de</strong> ces loci sont étudiés, on constate qu'à l'exception du gène<br />
paeY, chaque gène peut être exprimé comme une unité transcriptionnel<strong>le</strong> indépendante<br />
(Figure 28). Il existe un ARN polycistronique couvrant <strong>le</strong>s gènes pelD, paeY et pemA, ainsi<br />
84
Introduction bibliographique<br />
qu'un ARN polycistronique pour <strong>le</strong>s gènes pelC et pelZ (Shevchik et Hugouvieux-Cotte-<br />
Pattat. 1997 ; Pissavin et al. 1996). Les gènes pelW et paeX sont quant à eux insérés <strong>dans</strong> un<br />
locus qui réunit différents gènes impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> voie catabolique <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine, notamment<br />
kdgM codant une porine <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrane externe spécifique <strong>de</strong>s oligoga<strong>la</strong>cturoni<strong>de</strong>s, <strong>le</strong>s gènes<br />
togMNAB codant l’ABC transporteur impliqué <strong>dans</strong> l'entrée <strong>de</strong>s oligoga<strong>la</strong>cturoni<strong>de</strong>s <strong>dans</strong> <strong>le</strong><br />
cytop<strong>la</strong>sme ainsi que <strong>le</strong>s gènes kduI et kduD permettant l'isomérisation et l'oxydation du 5-<br />
céto-4-désoxyuronate (DKI), <strong>le</strong> monomère principal issu du clivage <strong>de</strong>s oligoga<strong>la</strong>cturoni<strong>de</strong>s.<br />
L’existence <strong>de</strong> promoteurs indépendants pour <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> pectinases suggère que<br />
chaque gène va pouvoir être exprimé <strong>de</strong> façon différentiel<strong>le</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s conditions particulières<br />
rencontrées <strong>dans</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte.<br />
IIID Régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> dégradation <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine chez Erwinia<br />
chrysanthemi<br />
La synthèse <strong>de</strong>s Pels est soumise à un contrô<strong>le</strong> très fin qui permet à <strong>la</strong> bactérie <strong>de</strong><br />
s’adapter rapi<strong>de</strong>ment <strong>au</strong>x conditions rencontrées lors <strong>de</strong> l’infection. La présence <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine<br />
et <strong>la</strong> <strong>de</strong>nsité cellu<strong>la</strong>ire sont <strong>le</strong>s facteurs agissant <strong>le</strong> plus fortement sur <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s<br />
pectinases. D’<strong>au</strong>tres facteurs environnement<strong>au</strong>x (présence d’extraits <strong>de</strong> p<strong>la</strong>nte, température,<br />
pH, osmo<strong>la</strong>rité, carence en fer, en azote ou en oxygène, nature du sucre métabolisab<strong>le</strong>)<br />
contrô<strong>le</strong>nt <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> ces enzymes (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996; Nasser et<br />
Reverchon, 2002; Reverchon et al., 1998). Pour certains <strong>de</strong> ces sign<strong>au</strong>x, <strong>le</strong>s régu<strong>la</strong>teurs<br />
associés ont été caractérisés.<br />
III.D.1 Inductions par <strong>le</strong>s composés végét<strong>au</strong>x<br />
III.D.1.1 Le répresseur KdgR<br />
KdgR est un régu<strong>la</strong>teur global <strong>de</strong>s gènes impliqués <strong>dans</strong> <strong>le</strong> catabolisme <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine et<br />
<strong>de</strong>s fonctions <strong>associée</strong>s dont <strong>le</strong> système Out nécessaire à <strong>la</strong> sécrétion <strong>de</strong>s pectinases et <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
cellu<strong>la</strong>se Cel5 (Con<strong>de</strong>mine et al., 1992; Reverchon et al., 1991). Le gène kdgR co<strong>de</strong> une<br />
<strong>protéine</strong> <strong>de</strong> 30 kDa appartenant à <strong>la</strong> famil<strong>le</strong> du répresseur transcriptionnel IclR (Reverchon et<br />
al., 1991; Thomson et al., 1999). L’induction <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectinolyse par <strong>la</strong> pectine est<br />
85
Introduction bibliographique<br />
principa<strong>le</strong>ment contrôlée par ce répresseur qui se fixe sous forme <strong>de</strong> dimère sur <strong>le</strong>s régions<br />
régu<strong>la</strong>trices <strong>de</strong>s gènes cib<strong>le</strong>s in vivo (Nasser et al., 1994). KdgR interagit avec une séquence<br />
d’ADN <strong>de</strong> 25 pb qui comprend <strong>le</strong> motif palindromique AAATGAAACANTGTTTCATTT<br />
(Nasser et al., 1994). En absence <strong>de</strong> pectine, KdgR réprime l’expression <strong>de</strong>s gènes pel en<br />
masquant <strong>le</strong> site <strong>de</strong> fixation <strong>de</strong> l’ARN polymérase ou en s’opposant à l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
transcription (Nasser et al., 1994; Robert-B<strong>au</strong>douy et al., 2000; Shevchik et al., 1997a). En<br />
revanche, en présence <strong>de</strong> pectine, <strong>le</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> base <strong>de</strong> synthèse <strong>de</strong>s pectinases permet <strong>la</strong><br />
formation <strong>de</strong> KDG (2-céto-3-désoxygluconate), un produit <strong>de</strong> dégradation <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine<br />
(Figure 24). Ce <strong>de</strong>rnier, qui est l’inducteur intracellu<strong>la</strong>ire vrai, va se comp<strong>le</strong>xer avec <strong>le</strong><br />
répresseur KdgR qui perd alors son affinité pour l’ADN et <strong>le</strong>s gènes pel sont efficacement<br />
transcrits (Nasser et al., 1994). Les comp<strong>le</strong>xes KdgR-ADN peuvent être dissociés par <strong>le</strong> KDG<br />
(Nasser et al., 1992).<br />
Bien que <strong>la</strong> fixation directe <strong>de</strong> KdgR sur <strong>le</strong>s régions régu<strong>la</strong>trices <strong>de</strong> nombreux gènes<br />
contrôlés in vivo ait été mise en évi<strong>de</strong>nce in vitro (Nasser et al., 1994), d'<strong>au</strong>tres gènes, comme<br />
pemA, pelZ, kdgA et outC, semb<strong>le</strong>nt indirectement régulés par KdgR. Les régions régu<strong>la</strong>trices<br />
<strong>de</strong>s gènes pemA, pelZ, outC, kduD et kdgA ne fixent pas KdgR in vitro <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s conditions<br />
testées. KdgR pourrait régu<strong>le</strong>r l'expression <strong>de</strong> ces gènes <strong>de</strong> manière indirecte, soit en<br />
impliquant <strong>le</strong> promoteur d’un gène situé en amont via <strong>la</strong> formation d’un messager<br />
polycistronique soit via une casca<strong>de</strong> <strong>de</strong> réactions impliquant d’<strong>au</strong>tres <strong>protéine</strong>s régu<strong>la</strong>trices.<br />
Par exemp<strong>le</strong>, KdgR contrô<strong>le</strong> directement l'expression du gène outT dont <strong>le</strong> produit est un<br />
activateur <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription <strong>de</strong> l'opéron outC-M (Con<strong>de</strong>mine et Robert-B<strong>au</strong>douy, 1995). Le<br />
gène pelZ peut être transcrit comme une unité transcriptionnel<strong>le</strong> indépendante mais éga<strong>le</strong>ment<br />
en opéron avec pelC, dont <strong>la</strong> région régu<strong>la</strong>trice comporte un site <strong>de</strong> fixation <strong>de</strong> KdgR<br />
(Pissavin et al., 1996).<br />
Récemment, l’utilisation d’une approche bioinformatique, couplée à une vérification<br />
expérimenta<strong>le</strong>, a révélé l’existence <strong>de</strong> nouve<strong>au</strong>x gènes contrôlés par <strong>le</strong> régu<strong>la</strong>teur KdgR<br />
(Rodionov et al., 2004). Dix nouve<strong>au</strong>x gènes présentent un site <strong>de</strong> fixation <strong>de</strong> KdgR et sont<br />
fortement régulés in vivo par KdgR. La fonction <strong>de</strong> ces gènes n’est pas encore connue. Les<br />
gènes pecT et sotA, codant un régu<strong>la</strong>teur et un transporteur <strong>de</strong> sucres sont éga<strong>le</strong>ment régulés<br />
par KdgR, mais à un nive<strong>au</strong> plus faib<strong>le</strong>. De plus, <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cas <strong>de</strong> pecT, KdgR agit en tant<br />
qu’activateur. Cette fonction d’activation par KdgR n’avait jamais été soupçonnée pour cette<br />
<strong>protéine</strong> considérée précé<strong>de</strong>mment comme répresseur uniquement (Rodionov et al., 2004).<br />
Le régu<strong>la</strong>teur KdgR n’est pas <strong>la</strong> seu<strong>le</strong> <strong>protéine</strong> responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’induction <strong>de</strong>s gènes<br />
pel par <strong>le</strong>s composés pectiques. En effet, <strong>le</strong>s gènes pel sont déréprimés <strong>dans</strong> un mutant kdgR<br />
86
Introduction bibliographique<br />
mais restent inductib<strong>le</strong>s en présence <strong>de</strong> pectine (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996). De<br />
plus, l’expression du gène pelL est induite en présence <strong>de</strong> PGA, mais ce gène n'est pas une<br />
cib<strong>le</strong> <strong>de</strong> KdgR (Lojkowska et al., 1995). Ces observations suggèrent l'existence d'<strong>au</strong>tres<br />
mécanismes <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion répondant à <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> pectine.<br />
III.D.1.2 Le régu<strong>la</strong>teur Pir<br />
Chez E. chrysanthemi EC16, <strong>dans</strong> un mutant pir (pour p<strong>la</strong>nt-inducib<strong>le</strong> regu<strong>la</strong>tor), <strong>la</strong><br />
synthèse <strong>de</strong>s Pels est fortement diminuée et n’est plus inductib<strong>le</strong> par <strong>le</strong>s extraits <strong>de</strong> p<strong>la</strong>ntes. La<br />
viru<strong>le</strong>nce <strong>de</strong> ce mutant est atténuée (Nomura et al., 1998). Pir agirait donc comme un<br />
activateur. Pir active éga<strong>le</strong>ment l’expression <strong>de</strong> son propre gène (Nomura et al., 1999). La<br />
<strong>protéine</strong> Pir a une masse molécu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> 30 kDa et appartient tout comme KdgR à <strong>la</strong> famil<strong>le</strong><br />
<strong>de</strong>s régu<strong>la</strong>teurs transcriptionnels IclR. El<strong>le</strong> se fixe à l’ADN sous forme <strong>de</strong> dimère sur une<br />
séquence <strong>de</strong> 35 pb, i<strong>de</strong>ntifiée à ce jour uniquement sur <strong>le</strong> promoteur <strong>de</strong> pelE <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche<br />
EC16 (Nomura et al., 1998). Le site <strong>de</strong> fixation à l’ADN <strong>de</strong> Pir recouvre celui <strong>de</strong> KdgR<br />
suggérant une compétition entre <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux régu<strong>la</strong>teurs pour <strong>le</strong>ur fixation sur <strong>la</strong> région<br />
régu<strong>la</strong>trice <strong>de</strong> pelE. En présence <strong>de</strong> PGA, <strong>le</strong>s inducteurs intracellu<strong>la</strong>ires comme <strong>le</strong> KDG<br />
empêchent <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> KdgR, ce qui permettrait <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong> Pir et une surinduction en<br />
présence du signal <strong>au</strong>quel répond Pir, ce composé n’étant pas encore i<strong>de</strong>ntifié. Dans <strong>la</strong> souche<br />
d’E. chrysanthemi 3937, un mutant pir présente par contre une <strong>au</strong>gmentation <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse<br />
<strong>de</strong>s pectinases en condition non induite ce qui suggère plutôt un rô<strong>le</strong> <strong>de</strong> répresseur pour <strong>la</strong><br />
<strong>protéine</strong> Pir (Reverchon et al., résultats non publiés).<br />
III.D.2 La répression catabolique<br />
La synthèse <strong>de</strong>s Pels est fortement diminuée en présence <strong>de</strong> glucose (Hugouvieux-<br />
Cotte-Pattat et al., 1996). Ce phénomène connu sous <strong>le</strong> terme <strong>de</strong> répression catabolique<br />
implique <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> CRP (cyclic AMP Receptor Protein) et <strong>la</strong> molécu<strong>le</strong> signal AMP cyclique<br />
(AMPc). CRP est une <strong>protéine</strong> <strong>de</strong> 210 aci<strong>de</strong>s aminés qui présente 98% d’i<strong>de</strong>ntité avec <strong>le</strong>s<br />
<strong>protéine</strong>s CRP d'E. coli, S. typhimurium ou K. pneumoniae. Le comp<strong>le</strong>xe CRP-AMPc<br />
activerait <strong>la</strong> transcription <strong>de</strong>s gènes pel par un mécanisme direct en favorisant <strong>la</strong> fixation <strong>de</strong><br />
l’ARN polymérase (Nasser et al., 1997). En présence <strong>de</strong> glucose, <strong>le</strong> t<strong>au</strong>x d’AMPc <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
cellu<strong>le</strong> chute, ce qui aboutit à une diminution <strong>de</strong> <strong>la</strong> disponibilité du comp<strong>le</strong>xe CRP-AMPc et<br />
87
Introduction bibliographique<br />
par voie <strong>de</strong> conséquence à une diminution <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes pel. Un mutant crp est<br />
déficient <strong>dans</strong> <strong>la</strong> production <strong>de</strong>s pectinases et son pouvoir pathogène est sévèrement affecté.<br />
D’<strong>au</strong>tre part, un mutant crp se développe sur glucose mais est incapab<strong>le</strong> d'assimi<strong>le</strong>r <strong>la</strong> plupart<br />
<strong>de</strong>s <strong>au</strong>tres sources <strong>de</strong> carbone comme <strong>le</strong> PGA, <strong>le</strong> ga<strong>la</strong>cturonate, <strong>le</strong> glycérol et <strong>le</strong> mannitol<br />
(Reverchon et al., 1997). CRP active l'expression <strong>de</strong>s gènes pelB, pelC, pelD et pelE mais pas<br />
<strong>de</strong> pelA (Reverchon et al., 1997). En l’absence <strong>de</strong> KdgR, l’expression <strong>de</strong> pelA semb<strong>le</strong> <strong>au</strong><br />
contraire être réprimée par CRP (Reverchon et al., 1997). L'affinité <strong>de</strong> CRP pour <strong>la</strong> région<br />
régu<strong>la</strong>trice <strong>de</strong> ses gènes cib<strong>le</strong>s est bien corrélée <strong>au</strong> t<strong>au</strong>x <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion observé in vivo. Cette<br />
affinité est maxima<strong>le</strong> pour <strong>le</strong>s promoteurs <strong>de</strong> pelD et pelE, ce qui est parfaitement en accord<br />
avec <strong>le</strong> fort nive<strong>au</strong> d'expression <strong>de</strong> ces gènes en conditions induites (Nasser et al., 1997).<br />
III.D.3 Régu<strong>la</strong>tion par diverses conditions physico-chimiques<br />
III.D.3.1 Osmo<strong>la</strong>rité<br />
La pression osmotique est une variab<strong>le</strong> importante <strong>de</strong> l’environnement qui peut<br />
affecter <strong>le</strong> pouvoir pathogène. Chez E. chrysanthemi, <strong>la</strong> pression osmotique affecte à <strong>la</strong> fois <strong>la</strong><br />
croissance <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie et <strong>la</strong> production <strong>de</strong>s Pels. Une forte osmo<strong>la</strong>rité induit l’expression <strong>de</strong><br />
pelE mais diminue cel<strong>le</strong>s <strong>de</strong> pelD et pelL (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992; Lojkowska et<br />
al., 1995). L’expression <strong>de</strong>s gènes pelA, pelB, pelC, pelI et pelZ ne semb<strong>le</strong> pas régulée par<br />
l'osmo<strong>la</strong>rité (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992; Pissavin et al., 1996; Shevchik et al.,<br />
1997b). L'effet inhibiteur d'une forte osmo<strong>la</strong>rité peut être re<strong>le</strong>vé par <strong>le</strong>s osmoprotectants<br />
(glycine bétaïne, proline, ectoïne, aci<strong>de</strong> pipecolique...) (Gouesbet et al., 1995; Prior et al.,<br />
1994) qui s'accumu<strong>le</strong>nt <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s via <strong>de</strong>s systèmes <strong>de</strong> transport spécifiques comme<br />
OusA, et OusB (Choquet et al., 2005; Gouesbet et al., 1996).<br />
Les princip<strong>au</strong>x régu<strong>la</strong>teurs glob<strong>au</strong>x contrô<strong>la</strong>nt <strong>le</strong> stress osmotique chez E. coli, à<br />
savoir sigma S, H-NS et Hfq sont présents chez E. chrysanthemi et sont éga<strong>le</strong>ment impliqués<br />
<strong>dans</strong> <strong>le</strong> stress osmotique (Gouesbet et al., 1996). Chez E. chrysanthemi, un mutant hns<br />
présente une plus gran<strong>de</strong> sensibilité <strong>au</strong>x fortes osmo<strong>la</strong>rités, suggérant une implication <strong>de</strong> cette<br />
<strong>protéine</strong> <strong>dans</strong> l’osmoadaptation <strong>de</strong> cette bactérie (Nasser et al., 2001a).<br />
88
Introduction bibliographique<br />
III.D.3.2 Température<br />
La production <strong>de</strong>s pectate lyases diminue généra<strong>le</strong>ment lorsque <strong>la</strong> température est<br />
supérieure à <strong>la</strong> température optima<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie (30°C). Cette<br />
thermorégu<strong>la</strong>tion est plus importante pour <strong>le</strong>s gènes pelA, pelD et pelE que pour <strong>le</strong>s <strong>au</strong>tres<br />
gènes pel (Hugouvieux-Cotte-Pattat et Robert-B<strong>au</strong>douy, 1992; Lojkowska et al., 1995). Chez<br />
E. chrysanthemi, <strong>la</strong> modu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s Pels en fonction <strong>de</strong> <strong>la</strong> température pourrait<br />
faire intervenir <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> H-NS. En effet, l’induction <strong>de</strong> l’activité Pel à 25°C n’est plus<br />
observée <strong>dans</strong> un mutant hns (Nasser et al., 2001a).<br />
III.D.3.3 pH<br />
Quand <strong>le</strong>s Erwiniae spp. infectent <strong>le</strong>s p<strong>la</strong>ntes, el<strong>le</strong>s colonisent <strong>dans</strong> un premier temps<br />
<strong>le</strong> flui<strong>de</strong> intercellu<strong>la</strong>ire apop<strong>la</strong>stique dont <strong>le</strong> pH varie entre 5 et 6,5 (Nachin et Barras, 2000).<br />
Dans <strong>le</strong>s étapes plus avancées <strong>de</strong> <strong>la</strong> colonisation, <strong>le</strong>s bactéries induisent <strong>la</strong> lyse <strong>de</strong>s cellu<strong>le</strong>s<br />
végéta<strong>le</strong>s et provoquent une alcalinisation du milieu. Les feuil<strong>le</strong>s <strong>de</strong> chicorée passent ainsi<br />
d’un pH aci<strong>de</strong> à basique lors <strong>de</strong> l’infection par E. chrysanthemi. La synthèse <strong>de</strong>s Pels est<br />
affectée par <strong>le</strong> pH qui peut donc jouer un rô<strong>le</strong> important <strong>dans</strong> <strong>le</strong>ur production lors <strong>de</strong><br />
l’infection (Nachin et Barras, 2000). Les gènes pelA et pelD sont plutôt exprimés en milieu<br />
aci<strong>de</strong> alors que pelE est transcrit à pH alcalin. Ces résultats suggèrent que PelA et PelD<br />
seraient importants lors <strong>de</strong>s étapes précoces <strong>de</strong> l’infection quand <strong>le</strong> pH environnant est aci<strong>de</strong><br />
et inversement, PelE serait nécessaire lors <strong>de</strong>s étapes plus tardives <strong>de</strong> l’infection lorsque <strong>le</strong> pH<br />
<strong>de</strong>vient basique. Ainsi <strong>le</strong> pH pourrait être responsab<strong>le</strong> d’une production séquentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong>s Pels<br />
<strong>au</strong> cours <strong>de</strong> l'infection. Le mécanisme <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l'expression <strong>de</strong>s gènes pel en réponse<br />
<strong>au</strong> pH est inconnu.<br />
III.D.3.4 Carence en fer<br />
En réponse à une carence en fer, E. chrysanthemi synthétise <strong>de</strong>ux sidérophores, <strong>la</strong><br />
chrysobactine et l’achromobactine (Expert et al., 1996). La chrysobactine a be<strong>au</strong>coup plus<br />
d’affinité pour <strong>le</strong> fer et sa synthèse est nécessaire lorsque <strong>la</strong> carence en fer est très sévère. La<br />
disponibilité du fer est très importante <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce d’E. chrysanthemi.<br />
La privation <strong>de</strong> fer induit <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> pelB, pelC, pelD, pelE et pelL (Masc<strong>la</strong>ux et al., 1996;<br />
89
Introduction bibliographique<br />
S<strong>au</strong>vage et Expert, 1994). Le répresseur transcriptionnel Fur (pour ferric uptake regu<strong>la</strong>tion)<br />
qui utilise l’ion fer comme co-facteur, est responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong> cette régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s pectinases. Dans<br />
un mutant fur, l’expression <strong>de</strong>s gènes pelD et pelE est déréprimée indépendamment <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
concentration en fer <strong>dans</strong> <strong>le</strong> milieu (Franza et al., 1999). Les sites <strong>de</strong> fixation <strong>de</strong> Fur sont<br />
situés <strong>au</strong> voisinage <strong>de</strong>s séquences d’ADN reconnues par CRP. Fur inhiberait ainsi <strong>la</strong> fixation<br />
<strong>de</strong> CRP et donc l’activation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription qui en résulte (Franza et al., 2002). Cependant<br />
<strong>le</strong> maintien <strong>de</strong> l'induction <strong>de</strong> l'expression <strong>de</strong> pelD et pelE <strong>dans</strong> un mutant fur en carence en fer<br />
suggère l'existence d'un <strong>au</strong>tre système <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion par <strong>le</strong> fer (Franza et al., 1999). Fur régu<strong>le</strong><br />
éga<strong>le</strong>ment directement l’expression <strong>de</strong>s gènes impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> biosynthèse et <strong>le</strong> transport <strong>de</strong><br />
<strong>la</strong> chrysobactine et <strong>de</strong> l’achromobactine (Franza et al., 1999; Franza et al., 2002; Franza et al.,<br />
2005; S<strong>au</strong>vage et al., 1996).<br />
III.D.3.5 Carence en oxygène et en azote<br />
La ma<strong>la</strong>die provoquée par <strong>le</strong>s Erwiniae pectinolytiques est plus sévère si <strong>la</strong><br />
concentration en oxygène est faib<strong>le</strong> (Perombelon, 1990). Bien que <strong>la</strong> synthèse globa<strong>le</strong> <strong>de</strong>s<br />
pectate lyases <strong>au</strong>gmente en semi-anaérobiose, chaque gène répond différemment à <strong>la</strong><br />
limitation en oxygène. Ainsi l’expression <strong>de</strong> pelA, pelD, pelE et pelI est stimulée, cel<strong>le</strong> <strong>de</strong><br />
pelB, pelC et pelL n'est pas affectée, et cel<strong>le</strong> <strong>de</strong> pelZ est réduite (Hugouvieux-Cotte-Pattat et<br />
al., 1992).<br />
La carence en azote inhibe l’expression <strong>de</strong> l’ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong>s gènes codant <strong>le</strong>s endopectate<br />
lyases (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992; Lojkowska et al., 1995; Pissavin et al.,<br />
1996; Shevchik et al., 1997b). La respiration anaérobie sur <strong>le</strong> nitrate, qui se trouve en quantité<br />
suffisante <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s tissus végét<strong>au</strong>x, faciliterait <strong>la</strong> prolifération bactérienne (Smid et al., 1993).<br />
Les fertilisants azotés favoriseraient ainsi <strong>la</strong> pourriture mol<strong>le</strong>, à l'inverse d'une carence en<br />
azote (Canaday, 1992; Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992).<br />
Les régu<strong>la</strong>teurs contrô<strong>la</strong>nt l’expression <strong>de</strong>s gènes pel en réponse <strong>au</strong> t<strong>au</strong>x d’oxygène et<br />
d’azote n’ont pas encore été i<strong>de</strong>ntifiés.<br />
III.D.4 Les régu<strong>la</strong>teurs répondant à <strong>de</strong>s sign<strong>au</strong>x encore inconnus<br />
Lors d’expériences <strong>de</strong> mutagenèses aléatoires, <strong>de</strong>ux régu<strong>la</strong>teurs PecS et PecT ont été<br />
i<strong>de</strong>ntifiés comme <strong>de</strong>s répresseurs <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes pel. Le rô<strong>le</strong> précis <strong>de</strong> ces <strong>de</strong>ux<br />
90
Introduction bibliographique<br />
régu<strong>la</strong>teurs ainsi que celui <strong>de</strong> H-NS restent mal définis en raison <strong>de</strong> l’absence d’informations<br />
concernant <strong>le</strong>s sign<strong>au</strong>x qui modu<strong>le</strong>nt l’activité <strong>de</strong> ces régu<strong>la</strong>teurs. Cependant, il apparaît<br />
c<strong>la</strong>irement que ces régu<strong>la</strong>teurs participent à <strong>la</strong> coordination <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> diverses<br />
fonctions impliquées <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir pathogène, incluant <strong>le</strong>s Pels, ce qui permet à E.<br />
chrysanthemi d’ajuster <strong>de</strong> façon coordonnée <strong>la</strong> production <strong>de</strong>s divers facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce.<br />
III.D.4.1 PecS<br />
L’inactivation du gène pecS chez E. chrysanthemi aboutit à <strong>la</strong> dérepression <strong>de</strong>s gènes<br />
pel, du gène cel5, <strong>de</strong>s gènes prtA, B, C et G codant quatre métalloprotéases extracellu<strong>la</strong>ires,<br />
<strong>de</strong>s gènes out impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> machinerie <strong>de</strong> type II nécessaire à <strong>la</strong> sécrétion <strong>de</strong>s pectinases<br />
et <strong>de</strong>s cellu<strong>la</strong>ses, et <strong>de</strong>s gènes indA, B et C impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> production d’un pigment b<strong>le</strong>u,<br />
l’indigoïdine (Reverchon et al., 1994). Des mutants déficients <strong>dans</strong> <strong>la</strong> production<br />
d’indigoïdine sont incapab<strong>le</strong>s d’envahir <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte hôte et l’indigoïdine confère une résistance<br />
accrue <strong>au</strong> stress oxydant, indiquant que ce composé pourrait protéger <strong>le</strong>s bactéries contre <strong>le</strong>s<br />
radic<strong>au</strong>x oxygénés générés pendant <strong>la</strong> réaction <strong>de</strong> défense <strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte (Reverchon et al.,<br />
2002). D’<strong>au</strong>tre part, PecS réprime éga<strong>le</strong>ment <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> harpine HrpN (Nasser<br />
et al., 2005) qui induit <strong>le</strong>s réactions <strong>de</strong> défense <strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte et en particulier <strong>la</strong> production <strong>de</strong><br />
radic<strong>au</strong>x oxygénés suspectés d’inactiver <strong>le</strong> régu<strong>la</strong>teur PecS (Reverchon et al. 2002).<br />
La <strong>protéine</strong> PecS, <strong>de</strong> 20 kDa, appartient à <strong>la</strong> famil<strong>le</strong> <strong>de</strong>s régu<strong>la</strong>teurs transcriptionnels<br />
<strong>de</strong> type MarR qui sont généra<strong>le</strong>ment impliqués <strong>dans</strong> <strong>de</strong>s processus <strong>de</strong> détoxification (Su<strong>la</strong>vik<br />
et al., 1995). Le signal <strong>au</strong>quel répond PecS est encore inconnu mais <strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s <strong>de</strong> <strong>la</strong> famil<strong>le</strong><br />
MarR reconnaissent généra<strong>le</strong>ment <strong>de</strong>s composés phénoliques. PecS se fixe sous forme <strong>de</strong><br />
dimère <strong>au</strong>x promoteurs <strong>de</strong> ses gènes cib<strong>le</strong>s (Prail<strong>le</strong>t et al., 1996; Reverchon et al., 2002b).<br />
PecS réprime éga<strong>le</strong>ment l’expression <strong>de</strong> son propre gène. Le site <strong>de</strong> fixation <strong>de</strong> PecS sur<br />
l’ADN peut recouvrir <strong>le</strong> promoteur comme <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cas <strong>de</strong> pecS et cel5 (Prail<strong>le</strong>t et al., 1996,<br />
Rouanet et al., 2004), ou se trouve en aval <strong>de</strong>s promoteurs <strong>de</strong>s gènes contrôlés comme <strong>dans</strong> <strong>le</strong><br />
cas <strong>de</strong>s gènes outC et expI (Prail<strong>le</strong>t et al., 1996 ; Reverchon et al., 1998).<br />
III.D.4.2 PecT<br />
Le répresseur PecT contrô<strong>le</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> <strong>la</strong> plupart <strong>de</strong>s Pels mais éga<strong>le</strong>ment cel<strong>le</strong><br />
<strong>de</strong>s EPS et <strong>de</strong> <strong>la</strong> harpine HrpN (Con<strong>de</strong>mine et al., 1999; Pissavin et al., 1996; Shevchik et al.,<br />
91
Introduction bibliographique<br />
1997; Surgey et al., 1996; Nasser et al., 2005). Outre sa capacité à surproduire <strong>de</strong>s pectate<br />
lyases, un mutant pecT forme <strong>de</strong>s colonies muqueuses sur milieu minimum soli<strong>de</strong> et <strong>le</strong>s<br />
cellu<strong>le</strong>s flocu<strong>le</strong>nt en milieu minimum liqui<strong>de</strong>. PecT agit donc à plusieurs nive<strong>au</strong>x <strong>dans</strong><br />
l'expression <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce.<br />
PecT est un régu<strong>la</strong>teur <strong>de</strong> type LysR et, comme be<strong>au</strong>coup <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>teurs <strong>de</strong> cette<br />
famil<strong>le</strong>, il contrô<strong>le</strong> fortement sa propre synthèse (Castillo et Reverchon, 1997).<br />
III.D.4.3 H-NS<br />
La <strong>protéine</strong> H-NS d’E. chrysanthemi contrô<strong>le</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> différents facteurs <strong>de</strong><br />
viru<strong>le</strong>nce parmi <strong>le</strong>squels <strong>le</strong>s pectate lyases (Nasser et al., 2001a). H-NS exerce un effet global<br />
d’activateur sur l’expression <strong>de</strong>s gènes pel. Comme précé<strong>de</strong>mment indiqué, cette activation<br />
résulte principa<strong>le</strong>ment d’un contrô<strong>le</strong> négatif direct <strong>de</strong> H-NS sur l’expression du gène pecT<br />
(Nasser et Reverchon, 2002). Ainsi, <strong>dans</strong> un mutant hns, <strong>la</strong> surproduction du répresseur PecT<br />
aboutit à une forte inhibition <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s pectinases. H-NS contrô<strong>le</strong> éga<strong>le</strong>ment <strong>la</strong><br />
mobilité et <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s EPS.<br />
III.D.5 Régu<strong>la</strong>tion en fonction <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance<br />
III.D.5.1 Sigma S<br />
Chez <strong>le</strong>s Erwinia pectinolytiques, l'expression <strong>de</strong>s gènes pel est fortement induite à <strong>la</strong><br />
fin <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992). Chez E.<br />
coli, l'expression <strong>de</strong>s gènes induits en phase stationnaire et <strong>dans</strong> certaines conditions <strong>de</strong> stress<br />
requiert <strong>le</strong> facteur sigma S <strong>de</strong> l'ARN polymérase. L’analyse d’un mutant rpoS d’E. carotovora<br />
révè<strong>le</strong> qu’il présente une plus gran<strong>de</strong> sensibilité <strong>au</strong> stress oxydant et produit plus <strong>de</strong> pectinases<br />
(An<strong>de</strong>rsson et al., 1999; Mukherjee et al., 1998). Ce <strong>de</strong>rnier phénotype serait en fait lié <strong>au</strong><br />
contrô<strong>le</strong> positif qu'exerce RpoS sur <strong>la</strong> transcription du gène rsmA qui participe à <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s Pels via un mécanisme post-transcriptionnel. La construction d’un mutant<br />
rpoS <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche d’E. chrysanthemi 3937 a éga<strong>le</strong>ment révélé une légère <strong>au</strong>gmentation <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
synthèse <strong>de</strong>s pectinases <strong>dans</strong> ce contexte génétique mais cette synthèse reste dépendante <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
phase <strong>de</strong> croissance (Reverchon et al., résultats non publiés).<br />
92
Introduction bibliographique<br />
III.D.5.2 Régu<strong>la</strong>tion par <strong>la</strong> <strong>de</strong>nsité cellu<strong>la</strong>ire : <strong>le</strong> quorum sensing<br />
Un mécanisme couramment utilisé par <strong>le</strong>s bactéries pour assujettir l’expression <strong>de</strong>s<br />
gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce à <strong>la</strong> <strong>de</strong>nsité cellu<strong>la</strong>ire est <strong>le</strong> « quorum sensing » (QS). Il s’agit d’un<br />
mécanisme <strong>de</strong> communication intercellu<strong>la</strong>ire via <strong>de</strong> petites molécu<strong>le</strong>s diffusib<strong>le</strong>s dont <strong>la</strong><br />
concentration est <strong>le</strong> ref<strong>le</strong>t <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>nsité cellu<strong>la</strong>ire. Chez <strong>le</strong>s bactéries à Gram négatif, ce<br />
contrô<strong>le</strong> se fait principa<strong>le</strong>ment par <strong>le</strong> biais <strong>de</strong>s N-acyl-homosérine <strong>la</strong>ctones (acyl-HSLs)<br />
(Fuqua et al., 1994). Ce système a été décrit pour <strong>la</strong> première fois chez <strong>la</strong> bactérie Vibrio<br />
fischeri où <strong>le</strong> QS implique <strong>le</strong> coup<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>protéine</strong>s LuxI/LuxR. LuxI est une synthétase<br />
catalysant <strong>la</strong> formation d’acyl-HSLs tandis que LuxR est un régu<strong>la</strong>teur transcriptionnel<br />
(Fuqua et al., 1994).<br />
Chez E. chrysanthemi, <strong>de</strong>ux acyl-HSLs différentes ont été caractérisées : <strong>la</strong> N-(3-<br />
oxohexanoyl)-homosérine <strong>la</strong>ctone (3-oxo-C 6 -HSL) et <strong>la</strong> N-hexanoyl-homosérine <strong>la</strong>ctone (C 6 -<br />
HSL) (Nasser et al., 1998). Un troisième composé capab<strong>le</strong> d’activer <strong>de</strong>s systèmes rapporteurs<br />
sensib<strong>le</strong>s <strong>au</strong>x acyl-HSLs a éga<strong>le</strong>ment été détecté <strong>dans</strong> <strong>le</strong> surnageant <strong>de</strong> culture <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche<br />
3937 mais <strong>la</strong> structure <strong>de</strong> ce composé reste inconnue. De plus, <strong>de</strong>ux gènes convergents, expI<br />
et expR, codant <strong>de</strong>ux <strong>protéine</strong>s homologues à LuxI et LuxR <strong>de</strong> V. fischeri ont été caractérisés<br />
(Nasser et al., 1998). ExpI catalyse <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s composés 3-oxo-C 6 -HSL et C 6 -HSL. En<br />
revanche, <strong>le</strong> locus responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> production du troisième composé n’est pas connu. Le<br />
mutant expR ne présente pas <strong>de</strong> phénotype notab<strong>le</strong> en ce qui concerne <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s Pels.<br />
Cependant, <strong>de</strong>s expériences d’interaction ADN-<strong>protéine</strong> réalisées in vitro ont montré que <strong>la</strong><br />
<strong>protéine</strong> ExpR purifiée se fixe <strong>de</strong> façon spécifique sur <strong>le</strong>s régions régu<strong>la</strong>trices <strong>de</strong>s gènes pelA,<br />
B, C, D et E (Nasser et al., 1998). L’absence <strong>de</strong> phénotype du mutant expR <strong>la</strong>isse donc<br />
présager l’existence chez E. chrysanthemi, d’un ou plusieurs homologues fonctionnels <strong>de</strong><br />
ExpR. Par ail<strong>le</strong>urs, <strong>dans</strong> un mutant expI, l’activité Pel tota<strong>le</strong> n’est pas significativement<br />
affectée et, parmi <strong>le</strong>s gènes codant <strong>le</strong>s Pels majeures, seu<strong>le</strong> l’expression <strong>de</strong> pelA et pelB est<br />
diminuée (Nasser et al., 1998). ExpR se fixe sur <strong>le</strong>s régions régu<strong>la</strong>trices <strong>de</strong>s gènes pel mais<br />
<strong>au</strong>ssi sur cel<strong>le</strong>s du gène expI et <strong>de</strong> son propre gène (Reverchon et al., 1998). La 3-oxo-C 6 -<br />
HSL dissocie <strong>le</strong>s comp<strong>le</strong>xes ExpR-ADN <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cas du gène expR et modifie <strong>la</strong> migration <strong>de</strong>s<br />
comp<strong>le</strong>xes obtenus avec <strong>le</strong>s gènes expI ou pel, ce qui suggère que l’interaction <strong>de</strong> ExpR avec<br />
cette acyl-HSL modifie sa fixation à l’ADN (Nasser et al., 1998; Reverchon et al., 1998;<br />
Castang et al., 2006). Les sites <strong>de</strong> fixation <strong>de</strong> ExpR sont situés en amont <strong>de</strong>s régions –10 et –<br />
35 <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cas <strong>de</strong>s gènes pel et expI. En revanche, <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cas <strong>de</strong> expR, <strong>la</strong> zone protégée par <strong>la</strong><br />
fixation <strong>de</strong> ExpR recouvre en gran<strong>de</strong> partie <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux promoteurs <strong>de</strong> ce gène (Nasser et al.,<br />
93
Introduction bibliographique<br />
1998; Reverchon et al., 1998a; Castang et al., 2006). De manière cohérente, <strong>de</strong>s trav<strong>au</strong>x<br />
récents ont montré que ExpR réprime directement l’expression <strong>de</strong> son propre gène en agissant<br />
<strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription et que cette action est <strong>le</strong>vée en présence <strong>de</strong> 3-oxo-<br />
C 6 -HSL (Castang et al., 2006).<br />
III.D.6 Modu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>teurs : rése<strong>au</strong><br />
Comme nous venons <strong>de</strong> <strong>le</strong> voir, <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s Pels met en jeu<br />
plusieurs régu<strong>la</strong>teurs répondant à différents sign<strong>au</strong>x. Une étu<strong>de</strong> intégrative a montré que <strong>le</strong>s<br />
régu<strong>la</strong>teurs sont interconnectés, <strong>la</strong>issant présager une organisation en rése<strong>au</strong> (Reverchon et<br />
al., 1998 ; Nasser et Reverchon, 2002). Cette hypothèse a été récemment confirmé par<br />
modélisation mathématique (Sepulchre et al., 2007) (Figure 29).<br />
94
Introduction bibliographique<br />
Figure 29: Rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion contrô<strong>la</strong>nt l’expression <strong>de</strong>s gènes pel chez Erwinia<br />
chrysanthemi. Les régu<strong>la</strong>tions négatives et positives sont représentées en b<strong>le</strong>u et en rouge,<br />
respectivement. L’épaisseur <strong>de</strong>s traits traduit l’importance d’une régu<strong>la</strong>tion. Les formes<br />
inactives <strong>de</strong>s régu<strong>la</strong>teurs apparaissent en j<strong>au</strong>ne.<br />
95
Introduction bibliographique<br />
Le régu<strong>la</strong>teur global H-NS réprime l’expression <strong>de</strong> expI, expR et pecT (Nasser et<br />
Reverchon, 2002). CRP active <strong>la</strong> transcription <strong>de</strong> expR et réprime cel<strong>le</strong> <strong>de</strong> expI ce qui pourrait<br />
expliquer l'effet répresseur <strong>de</strong> CRP sur l'expression <strong>de</strong> pelA (Reverchon et al., 1998). En effet,<br />
<strong>dans</strong> un mutant crp l’expression <strong>de</strong> pelA est <strong>au</strong>gmentée alors qu’<strong>au</strong>cune interaction directe<br />
entre ce régu<strong>la</strong>teur et <strong>la</strong> région promotrice <strong>de</strong> pelA n’a pas été mise en évi<strong>de</strong>nce (Nasser et al.,<br />
1997). L’accumu<strong>la</strong>tion d’acyl-HSLs chez un mutant crp pourrait être responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong><br />
l’induction <strong>de</strong> pelA (Reverchon et al., 1998). PecS réprime l'expression <strong>de</strong> expI et ExpR<br />
active l’expression <strong>de</strong> pecS (Reverchon et al., 1998). La régu<strong>la</strong>tion par <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> Pir semb<strong>le</strong><br />
indépendante <strong>de</strong> KdgR, PecS et CRP puisque <strong>au</strong>cun <strong>de</strong> ces régu<strong>la</strong>teurs ne semb<strong>le</strong> contrô<strong>le</strong>r<br />
l'expression du gène pir (Nomura et al., 1999). L’effet activateur <strong>de</strong> KdgR sur <strong>la</strong> synthèse du<br />
régu<strong>la</strong>teur PecT est un nouvel exemp<strong>le</strong> <strong>de</strong> connexion entre <strong>de</strong>ux systèmes <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
synthèse <strong>de</strong>s Pels (Rodionov et al., 2004). En résumé, il apparaît que <strong>le</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion<br />
<strong>de</strong>s gènes pel est hiérarchisé avec un rô<strong>le</strong> prépondérant pour <strong>le</strong>s régu<strong>la</strong>teurs génér<strong>au</strong>x CRP et<br />
H-NS ; ces <strong>de</strong>ux régu<strong>la</strong>teurs pourraient constituer <strong>de</strong>s nœuds permettant une mise en œuvre<br />
séquentiel<strong>le</strong> du rése<strong>au</strong> (Sepulchre et al., 2007).<br />
L’existence d’un tel rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion pourrait permettre à E. chrysanthemi <strong>de</strong><br />
modu<strong>le</strong>r finement <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s Pels en fonction <strong>de</strong>s conditions <strong>de</strong> l’environnement et <strong>de</strong><br />
son état physiologique. Ainsi <strong>la</strong> bactérie pourrait induire l’expression <strong>de</strong>s différents gènes pel<br />
<strong>au</strong> bon moment et <strong>au</strong> bon endroit lors du processus infectieux. Par ail<strong>le</strong>urs, étant donné que <strong>la</strong><br />
plupart <strong>de</strong>s acteurs <strong>de</strong> ce rése<strong>au</strong> contrô<strong>le</strong>nt d’<strong>au</strong>tres facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce en plus <strong>de</strong>s Pels,<br />
cette organisation hiérarchisée pourrait permettre une bonne coordination <strong>de</strong> <strong>la</strong> production <strong>de</strong>s<br />
facteurs requis <strong>au</strong>x différents sta<strong>de</strong>s du processus infectieux.<br />
96
Résultats<br />
1 er artic<strong>le</strong><br />
Objectifs <strong>de</strong> l’étu<strong>de</strong><br />
L’agressivité <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, comme nous<br />
l’avons vu précé<strong>de</strong>mment, est essentiel<strong>le</strong>ment liée à sa capacité à coordonner une production<br />
massive <strong>de</strong> différents facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce dont <strong>le</strong>s pectate lyases (Pels), enzymes essentiels<br />
du pouvoir pathogène. La synthèse <strong>de</strong>s Pels est soumise à une régu<strong>la</strong>tion comp<strong>le</strong>xe et répond<br />
à divers stimuli, tels que <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> pectine ou d’extraits <strong>de</strong> p<strong>la</strong>ntes, <strong>la</strong> phase <strong>de</strong><br />
croissance, <strong>la</strong> température et <strong>la</strong> concentration en fer. Les effets <strong>de</strong> <strong>la</strong> pectine et <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase <strong>de</strong><br />
croissance sont prépondérants. En dépit <strong>de</strong>s trav<strong>au</strong>x déjà réalisés, <strong>le</strong>s réponses à certains<br />
stimuli, notamment <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance, sur <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce n’ont pas<br />
encore été élucidées. Le génome d’E. chrysanthemi étant séquencé, une approche prometteuse<br />
pour éluci<strong>de</strong>r ce mo<strong>de</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion consistait à analyser l’action <strong>de</strong>s homologues <strong>de</strong>s<br />
régu<strong>la</strong>teurs contrô<strong>la</strong>nt <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce en fonction <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase <strong>de</strong><br />
croissance chez <strong>de</strong>s bactéries taxonomiquement proches. Des résultats publiés <strong>au</strong> début <strong>de</strong><br />
cette thèse faisaient état d’une implication <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> <strong>associée</strong> <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
régu<strong>la</strong>tion phase <strong>de</strong> croissance-dépendante s'exerçant sur <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> différents facteurs <strong>de</strong><br />
viru<strong>le</strong>nce chez <strong>de</strong>s bactéries pathogènes <strong>de</strong> l’homme dont <strong>le</strong>s souches entéropathogéniques<br />
d’Escherichia coli et Salmonel<strong>la</strong> typhimurium (Falconi et al., 2001 ; Wilson et al., 2001 ;<br />
Kelly et al., 2004). <strong>Fis</strong> apparaissait donc comme un candidat prometteur pour <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion<br />
<strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce par <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance chez E. chrysanthemi.<br />
L’objectif principal <strong>de</strong> cette thèse était <strong>de</strong> vérifier cette hypothèse. La première partie<br />
du travail a consisté à caractériser génétiquement <strong>le</strong> mutant fis d’E. chrysanthemi, à évaluer<br />
son pouvoir pathogène et à déterminer l’effet <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> sur <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s<br />
princip<strong>au</strong>x facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce, dont <strong>le</strong>s Pels. La <strong>de</strong>uxième partie <strong>de</strong> cette étu<strong>de</strong> a porté sur<br />
une caractérisation plus fine du mécanisme molécu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> sur <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
production <strong>de</strong>s Pels. Pour ce faire, l’action <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> a été intégrée <strong>au</strong> comp<strong>le</strong>xe multiprotéique<br />
agissant <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong>s promoteurs <strong>de</strong>s gènes pel ainsi qu’<strong>au</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> ces gènes.<br />
Ces trav<strong>au</strong>x ont été réalisés en col<strong>la</strong>boration avec <strong>le</strong> <strong>la</strong>boratoire du professeur Georgi<br />
Muskhelishvili (Jacobs University of Bremen, Germany) dont <strong>le</strong>s étu<strong>de</strong>s portent en partie sur<br />
<strong>la</strong> caractérisation fonctionnel<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> <strong>Fis</strong> chez E. coli.<br />
97
Résultats<br />
1 er artic<strong>le</strong><br />
RESULTATS<br />
I<br />
1 er<br />
ARTICLE: La <strong>protéine</strong> <strong>associée</strong> <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong> <strong>Fis</strong><br />
coordonne l’expression <strong>de</strong>s princip<strong>au</strong>x gènes <strong>de</strong><br />
viru<strong>le</strong>nce <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie phytopathogène Erwinia<br />
chrysanthemi.<br />
Les enzymes pectinolytiques, en particulier, <strong>le</strong>s pectate lyases (Pels), jouent un rô<strong>le</strong><br />
c<strong>le</strong>f <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s symptômes <strong>de</strong> pourriture mol<strong>le</strong> générée par Erwinia chrysanthemi. Toutefois une<br />
colonisation efficace <strong>de</strong>s p<strong>la</strong>ntes par <strong>la</strong> bactérie requiert <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce additionnels.<br />
Ces facteurs incluent <strong>la</strong> harpine HrpN, <strong>la</strong> cellu<strong>la</strong>se principa<strong>le</strong> Cel5, <strong>de</strong>s protéases (Prts), <strong>le</strong>s<br />
<strong>protéine</strong>s f<strong>la</strong>gel<strong>la</strong>ires et <strong>le</strong> système Sap, impliqué <strong>dans</strong> <strong>la</strong> détoxification <strong>de</strong>s pepti<strong>de</strong>s<br />
antibactériens produits par <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte en réponse à l’infection. HrpN et <strong>le</strong>s f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s sont<br />
principa<strong>le</strong>ment impliqués <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s étapes initia<strong>le</strong>s <strong>de</strong> l’infection alors que <strong>le</strong>s enzymes<br />
dégradatives (Pels, Cel5, Prts) sont requis <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s sta<strong>de</strong>s avancés <strong>de</strong> l’infection. La<br />
production <strong>de</strong> ces facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce est finement régulée par <strong>le</strong>s conditions<br />
environnementa<strong>le</strong>s.<br />
Ce premier artic<strong>le</strong> décrit <strong>la</strong> caractérisation génétique et biochimique <strong>de</strong> l’opéron fis<br />
d’E. chrysanthemi et l’implication <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce <strong>de</strong> <strong>la</strong> bactérie.<br />
Comme précé<strong>de</strong>mment montré chez Escherichia coli et chez plusieurs entérobactéries<br />
pathogènes <strong>de</strong>s anim<strong>au</strong>x, <strong>Fis</strong> constitue un opéron avec <strong>le</strong> gène orfI. La régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> cet<br />
opéron par <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance et <strong>le</strong> rétro-contrô<strong>le</strong> négatif observés chez E. chrysanthemi<br />
sont éga<strong>le</strong>ment simi<strong>la</strong>ires à ceux précé<strong>de</strong>mment décrits. Notons que <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> est<br />
maxima<strong>le</strong> en tout début <strong>de</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance et que ce pic <strong>de</strong> synthèse est<br />
suivi par une diminution progressive <strong>de</strong> <strong>la</strong> concentration cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> qui <strong>de</strong>vient<br />
quasiment indétectab<strong>le</strong> durant <strong>la</strong> phase stationnaire (voir introduction bibliographique,<br />
chapitre II.A.3.1).<br />
De plus, <strong>le</strong> mutant fis d’E. chrysanthemi présente <strong>de</strong>s caractéristiques communes avec<br />
ceux du pathogène humain Salmonel<strong>la</strong> typhimurium à savoir <strong>la</strong> perte <strong>de</strong> mobilité et une<br />
croissance ra<strong>le</strong>ntie en milieu riche LB. En revanche, <strong>le</strong> mutant fis d’E. chrysanthemi a révélé<br />
98
Résultats<br />
1 er artic<strong>le</strong><br />
une particu<strong>la</strong>rité, non décrite chez <strong>le</strong>s <strong>au</strong>tres bactéries, qui est une forte capacité d’agrégation<br />
en milieu liqui<strong>de</strong> comp<strong>le</strong>xe LB. Cette observation <strong>la</strong>isse présager une implication <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong><br />
<strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse d’une structure <strong>de</strong> surface d’E. chrysanthemi encore inconnue.<br />
Ces analyses phénotypiques généra<strong>le</strong>s ont été complétées par une évaluation <strong>de</strong><br />
l’action <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> sur <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s protéases et <strong>de</strong>s pectate lyases, enzymes dont l’activité est<br />
quantifiab<strong>le</strong> sur <strong>de</strong>s milieux synthétiques. Ainsi <strong>le</strong> mutant fis s’est avéré produire moins <strong>de</strong><br />
protéases que <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong>. Concernant l’activité Pel, el<strong>le</strong> s’est avérée retardée et<br />
<strong>au</strong>gmentée durant <strong>la</strong> phase stationnaire <strong>de</strong> croissance <strong>dans</strong> un mutant fis. La synthèse <strong>de</strong>s Pels<br />
étant sous <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> d’un rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion comp<strong>le</strong>xe, <strong>le</strong>s mécanismes d’action <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> sur<br />
<strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> production <strong>de</strong> ces enzymes sont présentés <strong>dans</strong> <strong>le</strong> <strong>de</strong>uxième artic<strong>le</strong>.<br />
L’effet <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> sur l’expression <strong>de</strong> différents gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce a été par <strong>la</strong> suite<br />
analysé <strong>au</strong> cours <strong>de</strong>s différents sta<strong>de</strong>s <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance bactérienne. Les choix pour cette étu<strong>de</strong><br />
concernent <strong>le</strong>s gènes impliqués <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s étapes initia<strong>le</strong>s (codants <strong>le</strong> composant du f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong><br />
FliC et <strong>la</strong> harpine HrpN), précoces (Sap, un système <strong>de</strong> détoxification) et <strong>de</strong>s étapes avancées<br />
du processus infectieux (Cel5, cellu<strong>la</strong>se majeure et PrtC, une protéase). L’utilisation <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
technique <strong>de</strong> fusion <strong>de</strong> gènes ou <strong>de</strong> <strong>la</strong> RT-PCR quantitative a révélé que <strong>Fis</strong> active<br />
l’expression <strong>de</strong> hrpN, fliC, sap et prtC <strong>au</strong> cours <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance avec une action très marquée<br />
sur l’expression <strong>de</strong> hrpN, prtC et fliC. Pour cel5, une action <strong>de</strong> répresseur est observée<br />
éga<strong>le</strong>ment <strong>le</strong> long <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance mais avec un effet plus prononcé <strong>au</strong> début <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase<br />
exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance. Ainsi, <strong>le</strong> profil <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> ces gènes cib<strong>le</strong>s ne concor<strong>de</strong> pas<br />
strictement avec l’accumu<strong>la</strong>tion temporel<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>la</strong> cellu<strong>le</strong>.<br />
La plupart <strong>de</strong> ces contrô<strong>le</strong>s se fait via un mécanisme d’action direct <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> puisque <strong>la</strong><br />
<strong>protéine</strong> purifiée se lie spécifiquement <strong>au</strong>x régions promotrices <strong>de</strong> fis, hrpN, sapA, cel5 et<br />
fliC. De plus, <strong>le</strong>s empreintes à <strong>la</strong> DNase I et <strong>au</strong> permanganate <strong>de</strong> potassium et <strong>le</strong>s expériences<br />
<strong>de</strong> transcription in vitro ont révélé que <strong>Fis</strong> réprime l’expression <strong>de</strong> cel5 en empêchant<br />
l’élongation <strong>de</strong>s transcrits.<br />
Des tests d’infection ont révélé une absence <strong>de</strong> macération par <strong>le</strong> mutant fis sur <strong>de</strong>s<br />
organes végét<strong>au</strong>x non b<strong>le</strong>ssés alors que <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> développe <strong>de</strong>s symptômes <strong>de</strong><br />
macération significatifs. Par contre, sur <strong>de</strong>s organes b<strong>le</strong>ssés, <strong>le</strong> pouvoir pathogène du mutant<br />
n’est qu’atténué en comparaison <strong>de</strong> celui <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong>.<br />
L’absence <strong>de</strong> macération provoquée par <strong>le</strong> mutant fis sur <strong>le</strong>s organes végét<strong>au</strong>x est<br />
certainement liée à <strong>la</strong> faib<strong>le</strong> synthèse, <strong>dans</strong> cette souche, <strong>de</strong>s systèmes requis durant <strong>le</strong>s étapes<br />
initia<strong>le</strong>s et précoces <strong>de</strong> l’infection. Nous proposons un modè<strong>le</strong> intégratif <strong>de</strong> l’action <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> sur<br />
<strong>le</strong>s différents facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce <strong>au</strong> cours du processus infectieux.<br />
99
Résultats<br />
1 er artic<strong>le</strong><br />
The DNA nuc<strong>le</strong>oid-associated protein <strong>Fis</strong> coordinates the expression of the main<br />
viru<strong>le</strong>nce genes in the phytopathogenic bacterium Erwinia chrysanthemi<br />
Thomas L<strong>au</strong>tier and William Nasser *<br />
Université <strong>de</strong> Lyon, F-69003, France ; Université Lyon 1, F-69622 ; INSA-Lyon,<br />
Vil<strong>le</strong>urbanne, F-69621 ; CNRS, UMR 5240, Unité Microbiologie Adaptation et Pathogénie,<br />
F-69622.<br />
* For Correspondance: E-mail:William.nasser@insa-lyon.fr; Tel.: (33) 4 72 43 26 95; Fax:<br />
(33) 4 72 43 15 84;<br />
Accepted in Mo<strong>le</strong>cu<strong>la</strong>r Microbiology, the 15 th october 2007<br />
Key words: phytopathogenic bacteria/ <strong>Fis</strong>/ viru<strong>le</strong>nce genes/ regu<strong>la</strong>tion<br />
Running tit<strong>le</strong>: E. chrysanthemi fis and viru<strong>le</strong>nce gene regu<strong>la</strong>tion<br />
Summary<br />
Erwinia chrysanthemi strain 3937 is a necrotrophic bacterial p<strong>la</strong>nt pathogen.<br />
Pectinolytic enzymes and, in particu<strong>la</strong>r, pectate lyases (Pels) p<strong>la</strong>y a key ro<strong>le</strong> in soft rot<br />
symptoms but the efficient colonization of p<strong>la</strong>nts by E. chrysanthemi requires additional<br />
factors. These factors inclu<strong>de</strong> the harpin HrpN, the cellu<strong>la</strong>se Cel5, proteases (Prts),<br />
f<strong>la</strong>gel<strong>la</strong>r proteins and the Sap system, involved in the <strong>de</strong>toxification of p<strong>la</strong>nt<br />
antimicrobial pepti<strong>de</strong>s. HrpN and f<strong>la</strong>gellum are mostly involved in the early steps of<br />
infection whereas the <strong>de</strong>gradative enzymes (Pels, Cel5, Prts) are mainly required in the<br />
advanced stages. Production of these viru<strong>le</strong>nce factors is tightly regu<strong>la</strong>ted by<br />
environmental conditions. This report shows that the nuc<strong>le</strong>oid-associated protein <strong>Fis</strong><br />
p<strong>la</strong>ys a pivotal ro<strong>le</strong> in the expression of the main viru<strong>le</strong>nce genes. Its production is<br />
regu<strong>la</strong>ted in a growth phase-<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>nt manner and is un<strong>de</strong>r negative <strong>au</strong>toregu<strong>la</strong>tion.<br />
An E. chrysanthemi fis mutant disp<strong>la</strong>ys a reduced motility and expression of hrpN, prtC<br />
and the sap operon. In contrast, the expression of the cel5 gene is increased in this<br />
mutant. Furthermore, the induction of the Pel activity is <strong>de</strong><strong>la</strong>yed and increased during<br />
the stationary growth phase in the fis mutant. Most of these controls occur through a<br />
direct effect since purified <strong>Fis</strong> binds to the promoter regions of fis, hrpN, sapA, cel5 and<br />
fliC. Moreover, potassium permanganate footprinting and in vitro transcription assays<br />
have revea<strong>le</strong>d that <strong>Fis</strong> prevents transcription initiation at the fis promoter and also<br />
transcript elongation from the cel5 promoter. Finally, the fis mutant has a <strong>de</strong>creased<br />
viru<strong>le</strong>nce. These results suggest a coordinated regu<strong>la</strong>tion by <strong>Fis</strong> of viru<strong>le</strong>nce factors<br />
involved in certain key steps of infection, early (asymptomatic) and advanced<br />
(symptomatic) phases.<br />
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Résultats<br />
1 er artic<strong>le</strong><br />
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Résultats<br />
1 er artic<strong>le</strong><br />
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2 ème artic<strong>le</strong><br />
II 2 eme<br />
ARTICLE : Intégration <strong>de</strong> <strong>de</strong>ux sign<strong>au</strong>x essentiels<br />
modu<strong>la</strong>nt <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong>s promoteurs <strong>de</strong>s<br />
gènes pel d’Er winia chrysanthemi : un rô<strong>le</strong> pour <strong>Fis</strong><br />
<strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion par <strong>le</strong> phase <strong>de</strong> croissance.<br />
La production <strong>de</strong>s pectate lyases (Pels), facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nces essentiels d’Erwinia<br />
chrysanthemi, est contrôlée par un rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion comp<strong>le</strong>xe et réponds à différents<br />
sign<strong>au</strong>x environnement<strong>au</strong>x, tels que <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> pectine ou d’extraits <strong>de</strong> p<strong>la</strong>nte, <strong>la</strong> phase <strong>de</strong><br />
croissance, <strong>la</strong> température ou <strong>la</strong> concentration en fer. La présence <strong>de</strong> pectine et <strong>la</strong> phase <strong>de</strong><br />
croissance sont <strong>le</strong>s plus importants sign<strong>au</strong>x i<strong>de</strong>ntifiés. Huit régu<strong>la</strong>teurs modu<strong>la</strong>nt l’expression<br />
<strong>de</strong>s gènes pel ont été caractérisés. Ces régu<strong>la</strong>teurs sont organisés en rése<strong>au</strong> permettant <strong>le</strong>ur<br />
mise en œuvre séquentiel<strong>le</strong> <strong>au</strong> cours <strong>de</strong> l’infection. Malgré <strong>le</strong>s nombreuses étu<strong>de</strong>s<br />
précé<strong>de</strong>ntes, <strong>le</strong> mécanisme <strong>de</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> production <strong>de</strong> Pels par <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance n’a<br />
pas été encore élucidé.<br />
Dans ce second artic<strong>le</strong>, nous montrons qu’un mutant fis d’E. chrysanthemi présente<br />
une forte <strong>au</strong>gmentation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription <strong>de</strong>s gènes pel durant <strong>la</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong><br />
croissance alors que l’induction <strong>de</strong> l’expression <strong>dans</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> n’a lieu qu’à <strong>la</strong> fin<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance. De plus, <strong>le</strong> t<strong>au</strong>x d’induction <strong>de</strong>s gènes pel par <strong>le</strong>s<br />
dérivés pectiques est plus fort <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis que <strong>dans</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong>. Ces données<br />
suggèrent que KdgR, <strong>le</strong> répresseur majeur répondant à <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> composés pectiques, et<br />
<strong>Fis</strong> répriment <strong>de</strong> manière coopérative l’expression <strong>de</strong>s gènes pel. Cette hypothèse a été<br />
confirmée <strong>dans</strong> un premier temps par <strong>de</strong>s expériences in vitro qui ont révélé que <strong>Fis</strong> et KdgR<br />
réprime chacun l’expression <strong>de</strong>s gènes pel en agissant <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
transcription et que <strong>la</strong> présence simultannée <strong>de</strong>s <strong>de</strong>ux régu<strong>la</strong>teurs se traduit par une<br />
diminution encore plus forte <strong>de</strong> l’accumu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s transcrits. Ces expériences in vitro ont été<br />
complétées par une quantification in vivo <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes pel. Il s’est avéré que <strong>le</strong><br />
nive<strong>au</strong> d’expression observé <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux mutants simp<strong>le</strong>s fis et kdgR, notamment <strong>au</strong> début<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance, sont plus faib<strong>le</strong>s que ceux obtenus <strong>dans</strong> <strong>le</strong> doub<strong>le</strong><br />
mutant kdgR-fis.<br />
Au vu <strong>de</strong>s résultats décrits ci-<strong>de</strong>ssus, il apparaît que <strong>la</strong> répression <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s<br />
gènes pel par <strong>Fis</strong> est plus marquée <strong>au</strong> début <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance. En<br />
132
Résultats<br />
2 ème artic<strong>le</strong><br />
revanche, <strong>de</strong>s expériences <strong>de</strong> quantification réalisées sur <strong>de</strong>s surnageants <strong>de</strong> culture avaient<br />
montré que l’induction <strong>de</strong> l’activité Pel est <strong>au</strong>gmentée durant <strong>la</strong> phase stationnaire <strong>de</strong><br />
croissance <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis. Ce constat suggère une implication <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>la</strong> translocation<br />
<strong>de</strong>s Pels <strong>dans</strong> <strong>le</strong> milieu extérieur. Cette hypothèse a été validée par une comparaison <strong>de</strong><br />
l’activité Pel présente à <strong>la</strong> fois <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s surnageants <strong>de</strong> culture et <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s cellu<strong>le</strong>s. Ces<br />
expériences ont révélé que l’activité Pel intracellu<strong>la</strong>ire du mutant fis est be<strong>au</strong>coup plus forte,<br />
notamment en début <strong>de</strong> phase exponentiel<strong>le</strong>, que cel<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong>.<br />
L’ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong> ces données suggèrent fortement que <strong>Fis</strong> contrô<strong>le</strong> finement <strong>la</strong><br />
disponibilité en Pels durant <strong>le</strong> processus infectieux en agissant <strong>au</strong>ssi bien sur <strong>le</strong>ur production<br />
que sur <strong>le</strong>ur translocation <strong>dans</strong> <strong>le</strong> milieu extérieur. Nous présentons un modè<strong>le</strong> intégrant <strong>le</strong>s<br />
actions <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> et <strong>de</strong> KdgR pour contrô<strong>le</strong>r <strong>la</strong> disponibilité <strong>de</strong>s Pels <strong>au</strong> cours du processus<br />
infectieux.<br />
133
Résultats<br />
2 ème artic<strong>le</strong><br />
Integration of two essential viru<strong>le</strong>nce modu<strong>la</strong>ting signals at the Erwinia chrysanthemi pel<br />
gene promoters: a ro<strong>le</strong> for <strong>Fis</strong> in the growth phase regu<strong>la</strong>tion<br />
Thomas L<strong>au</strong>tier 1 , Nico<strong>la</strong>s Blot 2 , Georgi Muskhelishvili 3 and William Nasser 1*<br />
1 Université <strong>de</strong> Lyon, F-69003, France ; Université Lyon 1, F-69622 ; INSA-Lyon,<br />
Vil<strong>le</strong>urbanne, F-69621 ; CNRS, UMR 5240, Unité Microbiologie Adaptation et Pathogénie,<br />
F-69622.<br />
2 Present adress: Station Biologique <strong>de</strong> Roscoff; CNRS, UMR7144 ; Roscoff, F-29680<br />
3 Jacobs University, Bremen, Campus Ring1, D-28759 Bremen, Germany<br />
*For Correspondance: E-mail:William.nasser@insa-lyon.fr; Tel.: (33) 4 72 43 26 95; Fax:<br />
(33) 4 72 43 15 84;<br />
Accepted in Mo<strong>le</strong>cu<strong>la</strong>r Microbiology, the 13 th october 2007<br />
Key words: phytopathogenic bacteria/ <strong>Fis</strong>/ viru<strong>le</strong>nce genes/ growth-phase regu<strong>la</strong>tion<br />
Running tit<strong>le</strong>: E. chrysanthemi fis and viru<strong>le</strong>nce growth-phase regu<strong>la</strong>tion<br />
Summary<br />
Production of the essential viru<strong>le</strong>nce factors, cal<strong>le</strong>d pectate lyases (Pels), in the<br />
phytopathogenic bacterium Erwinia chrysanthemi is control<strong>le</strong>d by a comp<strong>le</strong>x regu<strong>la</strong>tion<br />
system and responds to various stimuli, such as the presence of pectin or p<strong>la</strong>nt extracts,<br />
growth phase, temperature and iron concentration. The presence of pectin and growth<br />
phase are the most important signals i<strong>de</strong>ntified. Eight regu<strong>la</strong>tors modu<strong>la</strong>ting the<br />
expression of the pel genes (encoding Pels) have been characterized. These regu<strong>la</strong>tors<br />
are organized in a network allowing a sequential functioning of the regu<strong>la</strong>tors during<br />
infection. Although many studies have been carried out, the mechanisms of control of<br />
Pel production by growth phase have not yet been elucidated. Here we report that a fis<br />
mutant of E. chrysanthemi showed a strong increase in transcription of the pel genes<br />
during exponential growth whereas induction of expression in the parental strain<br />
occurred at the end of exponential growth. This reveals that <strong>Fis</strong> acts to prevent an<br />
efficient transcription of pel genes at the beginning of exponential growth and also<br />
provi<strong>de</strong>s evi<strong>de</strong>nce of the involvement of <strong>Fis</strong> in the growth-phase regu<strong>la</strong>tion of the pel<br />
genes. By using in vitro DNA-protein interactions and ranscription experiments, we find<br />
that <strong>Fis</strong> directly represses the pel gene expression at the transcription initiation step. In<br />
addition, we show that <strong>Fis</strong> acts in concert with KdgR, the main repressor responding to<br />
the presence of pectin compounds, to shut down the pel gene transcription. Finally, we<br />
find that active <strong>Fis</strong> is required for the efficient translocation of the Pels in growth<br />
medium. Together, these data indicate that <strong>Fis</strong> tightly controls the avai<strong>la</strong>bility of Pels<br />
during pathogenesis by acting both on their production and their translocation in the<br />
external medium.<br />
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Résultats<br />
2 ème artic<strong>le</strong><br />
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Résultats non publiés<br />
III Résultats non publiés : intégration <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> rése<strong>au</strong><br />
<strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s gènes pel.<br />
En présence <strong>de</strong> dérivés pectiques, une <strong>au</strong>gmentation <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes pel,<br />
notamment cel<strong>le</strong> <strong>de</strong> pelD et pelE, est observée <strong>le</strong> long <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis, avec<br />
toutefois un effet plus marqué <strong>au</strong> début <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance (2 ème artic<strong>le</strong>).<br />
Le profil <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s gènes pel ne s’accor<strong>de</strong> donc pas strictement avec celui <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
concentration cellu<strong>la</strong>ire en <strong>Fis</strong>. Pour expliquer cette différence, l’hypothèse émise <strong>dans</strong> <strong>le</strong> 2 ème<br />
artic<strong>le</strong> serait que <strong>la</strong> faib<strong>le</strong> concentration cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> durant <strong>la</strong> phase stationnaire soit<br />
suffisante pour exercer une répression <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes pel à ce sta<strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
croissance. Une <strong>au</strong>tre possibilité serait que <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion par <strong>Fis</strong> durant <strong>la</strong> phase stationnaire se<br />
fasse par un mécanisme indirect impliquant un ou plusieurs <strong>au</strong>tres régu<strong>la</strong>teurs du rése<strong>au</strong> <strong>de</strong>s<br />
gènes pel (voir introduction bibliographique, chapitre III.D.6).<br />
Afin <strong>de</strong> c<strong>la</strong>rifier ce <strong>de</strong>rnier point, l’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’action <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> sur l’expression <strong>de</strong>s gènes<br />
essentiels du rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion a été initiée. Les investigations ont porté sur <strong>le</strong>s gènes<br />
codant :<br />
-CRP, l’activateur principal <strong>de</strong>s gènes pel,<br />
-Pir, un régu<strong>la</strong>teur répondant à <strong>de</strong>s composés <strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte,<br />
-PecS et PecT, <strong>de</strong>ux répresseurs dont <strong>le</strong>s sign<strong>au</strong>x n’ont pas été encore caractérisés,<br />
-H-NS, <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> <strong>associée</strong> <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong> qui joue un rô<strong>le</strong> central <strong>dans</strong> <strong>le</strong> rése<strong>au</strong>,<br />
-KdgR, <strong>le</strong> principal répresseur répondant à <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> composés pectiques.<br />
La plupart <strong>de</strong>s régu<strong>la</strong>teurs du rése<strong>au</strong> étant soumis à un rétro contrô<strong>le</strong>, nous avons <strong>dans</strong><br />
un premier temps retenu <strong>la</strong> métho<strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> RT-PCR quantitative (voir 1 er et 2 ème artic<strong>le</strong>) pour<br />
évaluer l’accumu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s transcrits <strong>dans</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> et <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis cultivées<br />
en LB et en LB supplémenté en PGA (Figure R1 ). Les métho<strong>de</strong>s utilisées pour <strong>le</strong> calcul <strong>de</strong>s<br />
nive<strong>au</strong>x d’expression et pour <strong>le</strong>s normalisations sont cel<strong>le</strong>s décrites <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux artic<strong>le</strong>s<br />
précé<strong>de</strong>nts.<br />
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Résultats<br />
Résultats non publiés<br />
Figure R1 : Comparaison par RT-PCR quantitative <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes crp, hns, kdgR,<br />
pir, pecT et pecS <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis par rapport à <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> à différents sta<strong>de</strong>s <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
croissance et <strong>dans</strong> différents milieux <strong>de</strong> culture (LB ou LB+PGA). La normalisation a été<br />
effectuée en utilisant <strong>le</strong>s transcrits rsmA et pAW 109 comme décrit <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s artic<strong>le</strong>s<br />
précé<strong>de</strong>nts. La ligne rouge met en évi<strong>de</strong>nce <strong>la</strong> va<strong>le</strong>ur 1 correspondant à une expression<br />
équiva<strong>le</strong>nte du gène étudié <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis et <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong>.<br />
Au vu <strong>de</strong> ces résultats, il ressort que <strong>Fis</strong> régu<strong>le</strong> négativement l’expression <strong>de</strong> :<br />
- crp, pir et pecS à <strong>la</strong> fin <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> uniquement en présence <strong>de</strong> PGA,<br />
- pecT <strong>au</strong> début et à <strong>la</strong> fin <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance en présence <strong>de</strong> PGA,<br />
avec un effet plus marqué en début <strong>de</strong> croissance.<br />
Par contre, <strong>Fis</strong> a un effet activateur sur l’expression du gène hns en début <strong>de</strong><br />
croissance, suivie d’une légère répression à <strong>la</strong> fin <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase exponentiel<strong>le</strong>. Aucun effet<br />
significatif <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> n’a été observé sur l’expression <strong>de</strong> kdgR <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s conditions <strong>de</strong> cultures<br />
réalisées.<br />
Les résultats <strong>de</strong> RT-PCR quantitative ont été complétés par <strong>de</strong>s dosages <strong>de</strong> fusions<br />
transcriptionnel<strong>le</strong>s mettant en jeu <strong>le</strong>s régions régu<strong>la</strong>trices <strong>de</strong> kdgR, crp et pecT (Figure R2).<br />
167
Résultats<br />
Résultats non publiés<br />
Figure R2 : Expression <strong>de</strong>s fusions transcriptionnel<strong>le</strong>s kdgR::uidA, crp::uidA et pecT::uidA<br />
en fonction <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>nsité cellu<strong>la</strong>ire <strong>dans</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> et <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis. Les cultures<br />
ont été réalisées en LB (A) et en LB supplémenté <strong>de</strong> PGA (4g L -1 ) (B). L’activité spécifique<br />
β-glucuronidase est exprimée en nmo<strong>le</strong>s <strong>de</strong> p-nitrophenol produit par minute par mg <strong>de</strong> poids<br />
sec bactérien.<br />
Les résultats obtenus par ces <strong>de</strong>ux approches sont globa<strong>le</strong>ment concordants mis à part<br />
<strong>dans</strong> <strong>le</strong>s cas <strong>de</strong> kdgR et <strong>de</strong> crp. En effet, en LB supplémenté <strong>de</strong> PGA, un effet d’activation<br />
significatif par <strong>Fis</strong> sur l’expression <strong>de</strong> <strong>la</strong> fusion kdgR::uidA a été observé <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s phases<br />
exponentiel<strong>le</strong>s tardives alors qu’<strong>au</strong>cune action significative n’a été mise en évi<strong>de</strong>nce sur<br />
l’expression <strong>de</strong> <strong>la</strong> fusion impliquant <strong>la</strong> région régu<strong>la</strong>trice <strong>de</strong> crp. La raison <strong>de</strong> ces différences<br />
n’est pas encore élucidée mais <strong>le</strong>s expériences mettant en jeu <strong>le</strong>s fusions n’ayant été réalisées<br />
qu’une fois, nous avons surtout considéré <strong>le</strong>s résultats <strong>de</strong> RT-PCR quantitative. Ces résultats<br />
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Résultats<br />
Résultats non publiés<br />
préliminaires permettent tout <strong>de</strong> même d’intégrer <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s gènes<br />
pel (Figure R3).<br />
Figure R3 : Intégration <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s gènes pel.<br />
Le rô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>vra être précisé en évaluant l’impact <strong>de</strong>s<br />
régu<strong>la</strong>tions en casca<strong>de</strong>s mises en évi<strong>de</strong>nce sur l’expression <strong>de</strong>s gènes pel. Toutefois, quelques<br />
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Résultats<br />
Résultats non publiés<br />
hypothèses peuvent être émises. PecT étant un répresseur dont l’activité est intimement liée à<br />
sa concentration cellu<strong>la</strong>ire (Castillo et Reverchon, 1997 ; Nasser et Reverchon, 2002), une<br />
<strong>au</strong>gmentation <strong>de</strong> <strong>la</strong> concentration <strong>de</strong> ce régu<strong>la</strong>teur <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis, notamment <strong>au</strong> début <strong>de</strong><br />
<strong>la</strong> croissance, pourrait retar<strong>de</strong>r et réduire <strong>la</strong> dérépression <strong>de</strong>s gènes pel. Par contre,<br />
l’<strong>au</strong>gmentation <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> l’activateur CRP <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis durant <strong>la</strong> phase<br />
stationnaire en présence <strong>de</strong> composés pectiques pourrait contribuer à <strong>la</strong> stimu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong><br />
l’expression <strong>de</strong>s gènes pel ou compenser l’<strong>au</strong>gmentation <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> certains gènes<br />
répresseurs (pecT, pecS et pir) à ce sta<strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance.<br />
Concernant l’action <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> sur <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s régu<strong>la</strong>teurs génér<strong>au</strong>x CRP et H-NS, un<br />
parallè<strong>le</strong> peut être établi avec <strong>le</strong>s résultats obtenus chez l’entérobactérie modè<strong>le</strong> E. coli. Dans <strong>le</strong><br />
cas <strong>de</strong> hns, <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux mécanismes <strong>de</strong> contrô<strong>le</strong> sont sensib<strong>le</strong>ment i<strong>de</strong>ntiques compte tenu du fait que<br />
chez E. coli une activation par <strong>Fis</strong> a été observée durant <strong>la</strong> première moitié <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase<br />
exponentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> croissance (Falconi et al., 1996). Par contre, <strong>de</strong>s différences notab<strong>le</strong>s existent<br />
<strong>dans</strong> <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’expression du gène crp par <strong>Fis</strong> chez ces <strong>de</strong>ux bactéries. Chez E. coli, il a été<br />
montré que <strong>Fis</strong> réprime l’expression <strong>de</strong> crp <strong>au</strong> cours <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance via un mécanisme direct<br />
(Gonza<strong>le</strong>z-Gil et al., 1998) alors que seul un contrô<strong>le</strong> re<strong>la</strong>tivement modéré en phase p<strong>la</strong>te<strong>au</strong> a été<br />
observé chez E. chrysanthemi. Des trav<strong>au</strong>x préliminaires semb<strong>le</strong>nt indiquer que cette différence<br />
serait due à une organisation différente <strong>de</strong>s régions régu<strong>la</strong>trices du gène crp chez <strong>le</strong>s <strong>de</strong>ux<br />
bactéries. En effet, sur <strong>le</strong> gène crp d’E. coli, <strong>de</strong>ux sites <strong>de</strong> fixation <strong>de</strong> CRP et cinq <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> ont été<br />
mis en évi<strong>de</strong>nce par <strong>de</strong>s expériences d’empreintes à <strong>la</strong> DNAse I (Gonza<strong>le</strong>z-Gil et al., 1998) alors<br />
qu’<strong>au</strong>cun site évi<strong>de</strong>nt pour ces <strong>de</strong>ux régu<strong>la</strong>teurs n’a été observé, par <strong>de</strong>s approches i<strong>de</strong>ntiques, sur<br />
<strong>la</strong> région promotrice du gène crp d’E. chrysanthemi (Figure R5).<br />
Les résultats obtenus in vitro sont en accord avec une régu<strong>la</strong>tion re<strong>la</strong>tivement limitée <strong>de</strong><br />
l’expression du gène crp par <strong>Fis</strong> chez E. chrysanthemi. La signification biologique <strong>de</strong> cette<br />
différence <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion du gène crp <strong>de</strong>vra être c<strong>la</strong>rifiée.<br />
Enfin, une intégration appropriée <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion requiert<br />
éga<strong>le</strong>ment d’étudier l’effet <strong>de</strong>s régu<strong>la</strong>teurs précé<strong>de</strong>mment caractérisés sur l’expression du<br />
gène fis. Des étu<strong>de</strong>s préliminaires, réalisées en système hétérologue chez E. coli, à l’ai<strong>de</strong><br />
d’une fusion transcriptionnel<strong>le</strong> p<strong>la</strong>smidique mettant en jeu <strong>le</strong>s régions régu<strong>la</strong>trices <strong>de</strong> fis d’E.<br />
chrysanthemi, ont montré que l’absence <strong>de</strong> CRP se traduit par une diminution <strong>de</strong> l’expression<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> fusion (Figure R4). Ce résultat montre que CRP est un activateur majeur <strong>de</strong> l’expression<br />
du gène fis. Cependant, <strong>le</strong> profil d’expression reste dépendant <strong>de</strong> <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance,<br />
suggérant que CRP agit sur <strong>le</strong> nive<strong>au</strong> d’expression <strong>de</strong> fis mais non sur <strong>le</strong> profil <strong>de</strong><br />
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Résultats<br />
Résultats non publiés<br />
l’expression. Ces premiers résultats montrant une interconnexion entre <strong>le</strong>s régu<strong>la</strong>teurs glob<strong>au</strong>x<br />
CRP et <strong>Fis</strong> <strong>de</strong>vront être confirmés chez E. chrysanthemi.<br />
Figure R4 : Expression <strong>de</strong> <strong>la</strong> fusion transcriptionnel<strong>le</strong> impliquant <strong>la</strong> région régu<strong>la</strong>trice du<br />
gène fis d’E chrysanthemi portée sur <strong>le</strong> p<strong>la</strong>smi<strong>de</strong> pNB4 (Bardonnet et B<strong>la</strong>nco, 1992).<br />
L’activité spécifique β-glucuronidase est exprimée en nmo<strong>le</strong>s <strong>de</strong> p-nitrophenol produit par<br />
minute par mg <strong>de</strong> poids sec bactérien.<br />
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Résultats<br />
Résultats non publiés<br />
Figure R5 : Absence <strong>de</strong> fixation <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> et <strong>de</strong> CRP sur <strong>la</strong> région promotrice du gène crp d’E.<br />
chrysanthemi. Ces expériences d’empreintes à <strong>la</strong> DNAse I ont été réalisées comme décrit <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s<br />
<strong>de</strong>ux artic<strong>le</strong>s précé<strong>de</strong>nts. La région d’ADN utilisée comprend <strong>le</strong>s bases localisées <strong>de</strong> –140 à +293<br />
(position <strong>de</strong> l’ATG) par rapport <strong>au</strong> point d’initiation <strong>de</strong> transcription du gène crp (Reverchon et<br />
al., 1997).<br />
172
Résultats<br />
Résultats non publiés<br />
Tab<strong>le</strong><strong>au</strong> R1 : Souches bactériennes, p<strong>la</strong>smi<strong>de</strong>s et oligonucléoti<strong>de</strong>s utilisés <strong>dans</strong> ce travail.<br />
Souches / P<strong>la</strong>smi<strong>de</strong>s Génotype / Description (a) Référence ou source<br />
/ Oligonucléoti<strong>de</strong>s<br />
Escherichia coli<br />
CHS50 ara ∆(<strong>la</strong>c pro)thi rpsL Mil<strong>le</strong>r, 1972<br />
CHS50 ∆fis ara ∆(<strong>la</strong>c pro)thi rpsL ∆fis Koch et al., 1988<br />
CHS50 ∆crp ara ∆(<strong>la</strong>c pro)thi rpsL ∆crp Gonza<strong>le</strong>z-Gil et al., 1998<br />
Erwinia chrysanthemi<br />
A350 lmrT(con) <strong>la</strong>cZ2 Hugouvieux-Cotte-Pattat<br />
and Robert-B<strong>au</strong>douy, 1985<br />
A4374 lmrT(con) <strong>la</strong>cZ2 fis::Cm Ce travail<br />
A4549 lmrT(con) <strong>la</strong>cZ2 , crp::uidA -Km Reverchon et al., 1997<br />
A4550 lmrT(con) <strong>la</strong>cZ2 fis::Cm, crp::uidA-Km Ce travail<br />
A4591 lmrT(con) <strong>la</strong>cZ2 pecT::uidA-Km Surgey et al., 1996<br />
A4592 lmrT(con) <strong>la</strong>cZ2 fis::Cm, pecT::uidA-Km Ce travail<br />
A4606 lmrT(con) <strong>la</strong>cZ2 kdgR::uidA-Km Ce travail<br />
A4607 lmrT(con) <strong>la</strong>cZ2 fis::Cm, kdgR::uidA-Km Ce travail<br />
P<strong>la</strong>smi<strong>de</strong>s<br />
pTL7 pGEM-T avec <strong>le</strong>s 433 pb contenant <strong>la</strong> région régu<strong>la</strong>trice <strong>de</strong> crp<br />
(<strong>de</strong> -140 à +293 pb (ATG) par rapport <strong>au</strong> point +1 <strong>de</strong> transcription) Ce travail<br />
pTL8 pBluescript, Ap r (Stratagene) avec <strong>la</strong> region codante <strong>de</strong> kdgR<br />
contenant <strong>la</strong> cassette uidA-Km insérée <strong>dans</strong> <strong>le</strong> site HpaI<br />
Ce travail<br />
pNB4 vecteur <strong>de</strong> clonage, Ap r uidA Bardonnet and B<strong>la</strong>nco,<br />
1992<br />
pNB4fis pNB4 avec <strong>le</strong>s 442 pb contenant <strong>la</strong> région régu<strong>la</strong>trice <strong>de</strong> fis issue<br />
du pTL1 (L<strong>au</strong>tier et Nasser, 2007)<br />
Ce travail<br />
Oligonucléoti<strong>de</strong>s<br />
AW158 5’-TGACCACCCAGCCATCCTTC-3’ Applied Biosystems<br />
crp qPCRf 5’-AAACAGACCCGACTCTCGAA-3’ Ce travail<br />
crp qPCRr 5’-ACTGCGTTCCTGACCATCTT-3’ Ce travail<br />
DM152 5’-CATGTCAAATTTCACTGCTTCATCC-3’ Applied Biosystems<br />
hns qPCRf 5’-GCGAAGCACTTAAGATTCTAAACA-3’ Ce travail<br />
hns qPCRr 5’-CTTTACCGGCAACTTTGCTT-3’ Ce travail<br />
kdgR qPCRf 5’-TAAACAACCCGATTCCGTGT-3’ Ce travail<br />
kdgR qPCRr 5’-GCGGATCAGATCAACGTTCT-3’ Ce travail<br />
pecS qPCRf 5’-GGCACGCTACCTGGAAGTAT-3’ Ce travail<br />
pecS qPCRr 5’-TGTTGATCATCAGTGCGTTG-3’ Ce travail<br />
pecT qPCRf 5’-ATACAAGTCGCCCTGTCCTC-3’ Ce travail<br />
pecT qPCRr 5’-AGGCCTCATCGTTAAACTGC-3’ Ce travail<br />
pir qPCRf 5’-CATTGATGACGAGGGAAAGG-3’ Ce travail<br />
pir qPCRr 5’-CCGATAGCGATGAACTTGGT-3’ Ce travail<br />
RR crp <strong>de</strong>b 5’-CTGCATAAGTTTGCCCTCAA-3’ Ce travail<br />
RR crp fin 5’-TTCGAGAGTCGGGTCTGTTT-3’ Ce travail<br />
rsmA qPCRf 5’-GAGTTGGCGAAACCCTCAT-3’ Ce travail<br />
rsmA qPCRr 5’-GCTGAGACTTCTCTGCCTGAA-3’ Ce travail<br />
a Les génotypes sont donnés en utilisant <strong>le</strong>s critères définis par Berlyn (1998). lmrT(con) indique que <strong>le</strong> système <strong>de</strong><br />
transport du mélibiose, du <strong>la</strong>ctose et du raffinose codé par <strong>le</strong> gène lmrT, est constitutivement exprimé <strong>dans</strong> <strong>la</strong> souche.<br />
Résistances <strong>au</strong>x antibiotiques : kanamycine (Km), chloramphenicol (Cm), ampicilline (Ap), streptomycine (Sm).<br />
173
Conclusion et perspectives<br />
CONCLUSION ET PERSPECTIVES<br />
La coordination <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce chez <strong>le</strong>s agents pathogènes est<br />
un prérequis pour conduire une infection appropriée <strong>de</strong> l’hôte. La régu<strong>la</strong>tion en fonction du<br />
nombre <strong>de</strong> cellu<strong>le</strong>s est un <strong>de</strong>s mécanismes <strong>le</strong>s plus utilisés par <strong>le</strong>s agents pathogènes pour<br />
satisfaire cette exigence. La <strong>de</strong>nsité cellu<strong>la</strong>ire ou « quorum sensing » est généra<strong>le</strong>ment <strong>le</strong><br />
mécanisme <strong>de</strong> ce type <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>le</strong> plus décrit <strong>dans</strong> <strong>la</strong> littérature (Burr et al., 2006 ; Lenz<br />
and Bass<strong>le</strong>r, 2007 ; Deziel et al., 2005). Contrairement <strong>au</strong>x observations faites chez <strong>de</strong>s<br />
bactéries taxonomiquement proches tel<strong>le</strong> qu’Erwinia carotovora (Burr et al., 2006), ce<br />
mécanisme ne semb<strong>le</strong> pas jouer un rô<strong>le</strong> prépondérant chez Erwinia chrysanthemi. En effet,<br />
l’inactivation <strong>de</strong>s gènes d’E. chrysanthemi impliqués <strong>dans</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s différents types <strong>de</strong><br />
phéromones (expI et luxS) ne s’accompagne ni d’une perturbation significative <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse<br />
<strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce, ni d’une modification importante <strong>de</strong> son pouvoir pathogène (Nasser<br />
et al., 1998 ; Reverchon et al., résultats non publiés).<br />
Ce constat nous a incité à prendre en considération <strong>de</strong>s mécanismes <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion liés<br />
à <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance, contrôlés d’une manière généra<strong>le</strong> par <strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s <strong>associée</strong>s <strong>au</strong><br />
nucléoï<strong>de</strong>s (NAPs). Parmi ces NAPs, <strong>Fis</strong> a particulièrement retenu notre attention en raison <strong>de</strong><br />
<strong>la</strong> forte variation <strong>de</strong> sa concentration cellu<strong>la</strong>ire <strong>au</strong> cours <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance. De plus <strong>de</strong>s résultats<br />
parus <strong>au</strong> début <strong>de</strong> ma thèse faisaient état d’une implication <strong>de</strong> cette NAP <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion<br />
phase <strong>de</strong> croissance-dépendante <strong>de</strong> différents facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce, impliqués notamment<br />
<strong>dans</strong> <strong>le</strong>s étapes précoces du processus infectieux chez <strong>le</strong>s bactéries pathogènes humaines E.<br />
coli et S. typhimurium (Falconi et al., 2001 ; Goldberg et al., 2001 ; Kelly et al., 2004). Les<br />
mécanismes <strong>de</strong> ces contrô<strong>le</strong>s n’ont généra<strong>le</strong>ment pas été c<strong>la</strong>irement élucidés mais plusieurs<br />
hypothèses al<strong>la</strong>nt du contrô<strong>le</strong> direct (Kelly et al., 2004) à <strong>de</strong>s mécanismes indirects mettant en<br />
jeu d’<strong>au</strong>tres régu<strong>la</strong>teurs (Kelly et al., 2005, O Croinin et al., 2006 ; Lenz et al., 2007) ou via<br />
une action sur l’organisation structura<strong>le</strong> <strong>de</strong>s régions régu<strong>la</strong>trices <strong>de</strong>s gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce (O<br />
Croinin et al., 2006) ont été avancées.<br />
Nous montrons <strong>dans</strong> ce travail que, chez E. chrysanthemi, <strong>le</strong>s étapes clés <strong>de</strong> l’infection<br />
sont régulées <strong>de</strong> manière coordonnée par <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> <strong>associée</strong> <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong> <strong>Fis</strong>. En effet, il s’est<br />
avéré que <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> est requise pour l’induction <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong>s gènes codant <strong>le</strong>s<br />
facteurs impliqués <strong>au</strong> début du processus infectieux. Le contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong><br />
viru<strong>le</strong>nce impliqués <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s phases précoces <strong>de</strong> l’infection par <strong>Fis</strong> semb<strong>le</strong> donc être une<br />
caractéristique retrouvée à <strong>la</strong> fois chez <strong>le</strong>s bactéries pathogènes <strong>de</strong>s anim<strong>au</strong>x et <strong>de</strong>s végét<strong>au</strong>x.<br />
174
Conclusion et perspectives<br />
En revanche, <strong>Fis</strong> réprime <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> propagation essentiels d’E. chrysanthemi.<br />
L’ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong>s résultats obtenus <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cadre <strong>de</strong> ma thèse permet <strong>de</strong> proposer un modè<strong>le</strong> <strong>de</strong><br />
l’action <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>au</strong> cours <strong>de</strong>s différentes étapes du processus infectieux (Figure D1). Le pic <strong>de</strong><br />
production du régu<strong>la</strong>teur en début <strong>de</strong> croissance permet une stimu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s<br />
systèmes requis <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s étapes précoces <strong>de</strong> l’infection (f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s, HrpN et système Sap) ainsi<br />
que <strong>le</strong>s machineries <strong>de</strong> translocation <strong>de</strong>s Pels. Parallè<strong>le</strong>ment, <strong>Fis</strong> réprime <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s<br />
systèmes <strong>de</strong> propagation (Pels et Cel5) afin d’éviter d’éveil<strong>le</strong>r <strong>le</strong>s réactions <strong>de</strong> défense <strong>de</strong><br />
l’hôte. Lorsque <strong>la</strong> concentration intracellu<strong>la</strong>ire du régu<strong>la</strong>teur diminue <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s sta<strong>de</strong>s <strong>de</strong><br />
croissance avancés, <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s Pels et <strong>de</strong> Cel5 est déréprimée. Par ail<strong>le</strong>urs, <strong>la</strong> forte<br />
accumu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong>s systèmes <strong>de</strong> translocation <strong>de</strong>s enzymes à ce sta<strong>de</strong> assure un bon coup<strong>la</strong>ge<br />
entre synthèse et sécrétion <strong>de</strong>s enzymes dégradatives. Il s’en suit une attaque brusque <strong>de</strong> l’hôte<br />
qui n’a pas, <strong>dans</strong> ces conditions, <strong>le</strong> temps <strong>de</strong> mettre en p<strong>la</strong>ce efficacement ses réactions <strong>de</strong><br />
défense.<br />
175
Conclusion et perspectives<br />
Figure D1 : Modè<strong>le</strong> du mécanisme d’action <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> production <strong>de</strong><br />
différents types <strong>de</strong> facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce <strong>au</strong> cours <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance bactérienne.<br />
Des points restent toutefois à éc<strong>la</strong>ircir avant <strong>de</strong> comprendre parfaitement <strong>le</strong>s<br />
mécanismes <strong>de</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce par <strong>Fis</strong> chez E. chrysanthemi. Par exemp<strong>le</strong>, <strong>le</strong> mutant<br />
fis d’E. chrysanthemi s’est révélé être aviru<strong>le</strong>nt lorsque <strong>le</strong>s tests d’infection sont réalisés sur<br />
<strong>de</strong>s organes végét<strong>au</strong>x non b<strong>le</strong>ssés alors que sur <strong>de</strong>s organes b<strong>le</strong>ssés, il présente un pouvoir<br />
pathogène atténué. Ce constat conforte l’implication <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse<br />
<strong>de</strong> facteurs intervenants <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s phases précoces <strong>de</strong> l’infection dont certains n’ont<br />
vraisemb<strong>la</strong>b<strong>le</strong>ment pas encore été i<strong>de</strong>ntifiés. En effet, l’un <strong>de</strong>s phénotypes caractéristique du<br />
mutant fis d’E. chrysanthemi est sa forte capacité d’agrégation <strong>dans</strong> certains milieux <strong>de</strong><br />
culture liqui<strong>de</strong>s. Cette propriété, résultant généra<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> <strong>la</strong> surproduction <strong>de</strong> structures<br />
impliquées <strong>dans</strong> l’adhérence <strong>de</strong>s bactéries, s’est avérée être conservée <strong>dans</strong> toutes <strong>le</strong>s souches<br />
176
Conclusion et perspectives<br />
doub<strong>le</strong>-mutantes inactivées à <strong>la</strong> fois pour <strong>le</strong> gène fis et pour un <strong>de</strong>s gènes codant <strong>le</strong>s différents<br />
facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce étudiés. Ces éventuels systèmes d’adhésion pourraient être i<strong>de</strong>ntifiés en<br />
utilisant une approche protéomique. En effet, <strong>la</strong> comparaison d’extraits contenant <strong>le</strong>s<br />
structures <strong>de</strong> surface <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> et du mutant fis d’E. chrysanthemi sur gel <strong>de</strong><br />
polyacry<strong>la</strong>mi<strong>de</strong> a révélé <strong>la</strong> présence <strong>de</strong> <strong>protéine</strong>s additionnel<strong>le</strong>s <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s extraits du mutant fis<br />
(Figure D2).<br />
Figure D2 : Extraits <strong>de</strong> surnageants <strong>de</strong> cultures <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> et du mutant fis d’E.<br />
chrysanthemi analysés sur gel <strong>de</strong> polyacry<strong>la</strong>mi<strong>de</strong>. Les <strong>protéine</strong>s surproduites <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant<br />
fis sont indiquées par <strong>de</strong>s flèches.<br />
Ces <strong>protéine</strong>s seront purifiées et caractérisées par MALDI-TOF, <strong>le</strong>s gènes<br />
correspondants seront inactivés et <strong>le</strong>urs effets sur <strong>le</strong> pouvoir pathogène d’E. chrysanthemi<br />
évalués. Les structures <strong>de</strong> surface régulées par <strong>Fis</strong> pourront éga<strong>le</strong>ment être recherchées en<br />
caractérisant <strong>le</strong>s gènes codant <strong>de</strong>s structures simi<strong>la</strong>ires mise en évi<strong>de</strong>nce <strong>dans</strong> <strong>de</strong>s bactéries<br />
taxonomiquement proches. Le gène hecA, codant une adhésine chez <strong>la</strong> souche d’E.<br />
chrysanthemi EC16 (Rojas et al., 2002) est un candidat <strong>de</strong> choix. Les premières tentatives en<br />
vue du clonage du gène <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche <strong>de</strong> référence 3937 se sont soldées par <strong>de</strong>s échecs en<br />
raison <strong>de</strong> difficultés rencontrées pour l’amplification du gène.<br />
L’expression <strong>de</strong>s gènes pel est <strong>au</strong>gmentée <strong>le</strong> long <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis<br />
avec toutefois un effet be<strong>au</strong>coup plus marqué en début <strong>de</strong> phase exponentiel<strong>le</strong>. Le mécanisme<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> ces gènes par <strong>Fis</strong> en phase p<strong>la</strong>te<strong>au</strong> n’a pas encore été<br />
tota<strong>le</strong>ment c<strong>la</strong>rifié. Dans <strong>le</strong> <strong>de</strong>uxième artic<strong>le</strong>, il a été suggéré que ce contrô<strong>le</strong> pourrait se faire<br />
via un mécanisme direct par <strong>la</strong> faib<strong>le</strong> quantité cellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> <strong>Fis</strong>. Cette hypothèse repose sur <strong>la</strong><br />
re<strong>la</strong>tive forte affinité <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> pour <strong>le</strong>s régions promotrices <strong>de</strong>s gènes pel. Cependant, <strong>le</strong>s<br />
résultats obtenus sur <strong>le</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion suggèrent que <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> en phase p<strong>la</strong>te<strong>au</strong><br />
pourrait se faire éga<strong>le</strong>ment via un mécanisme indirect mettant en jeu certains régu<strong>la</strong>teurs du<br />
177
Conclusion et perspectives<br />
rése<strong>au</strong>, notamment <strong>le</strong> répresseur PecT. Enfin, une troisième hypothèse pouvant expliquer<br />
l’effet <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> sur l’expression <strong>de</strong>s gènes pel en phase p<strong>la</strong>te<strong>au</strong> serait une structuration différente<br />
<strong>de</strong>s régions régu<strong>la</strong>trices <strong>de</strong> ces gènes <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis et <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong>. Cette hypothèse<br />
est confortée par <strong>de</strong>s résultats préliminaires non présentés qui ont montré que l’expression <strong>de</strong>s<br />
gènes pel est modulée par l’état d’enrou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> l’ADN (expression in vitro plus forte sur<br />
p<strong>la</strong>smi<strong>de</strong> superenroulé par rapport <strong>au</strong> même p<strong>la</strong>smi<strong>de</strong> linéarisé).<br />
La première hypothèse pourra être vérifiée par <strong>de</strong>s expériences d’immunoprécipitation<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> chromatine suivie d’une quantification par RT-PCR <strong>de</strong> <strong>la</strong> quantité <strong>de</strong>s gènes pel<br />
comp<strong>le</strong>xés à <strong>Fis</strong> à différents sta<strong>de</strong>s <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance. La <strong>de</strong>uxième possibilité <strong>de</strong> contrô<strong>le</strong><br />
pourra être appréciée en comparant <strong>la</strong> quantité <strong>de</strong> transcrits <strong>de</strong>s gènes pel en absence <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> à<br />
cel<strong>le</strong> observée <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s mutants doub<strong>le</strong>s impliquant fis et chacun <strong>de</strong>s régu<strong>la</strong>teurs cib<strong>le</strong>s <strong>de</strong> <strong>Fis</strong>.<br />
Par exemp<strong>le</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> cas <strong>de</strong> PecT, il s’agira <strong>de</strong> quantifier <strong>le</strong>s transcrits <strong>de</strong>s gènes pel <strong>dans</strong> <strong>la</strong><br />
souche parenta<strong>le</strong>, <strong>le</strong>s mutants simp<strong>le</strong>s fis et pecT et <strong>dans</strong> <strong>le</strong> doub<strong>le</strong> mutant fis-pecT. Il serait<br />
éga<strong>le</strong>ment informatif d’analyser l’effet <strong>de</strong>s régu<strong>la</strong>teurs du rése<strong>au</strong> précé<strong>de</strong>mment caractérisés<br />
sur l’expression du gène fis et <strong>de</strong> poursuivre l’étu<strong>de</strong> <strong>de</strong>s mécanismes <strong>de</strong> signalisation agissant<br />
sur l’expression <strong>de</strong> ce gène en s’intéressant notamment <strong>au</strong> nucléoti<strong>de</strong> modifié ppGpp, connu<br />
pour agir chez E. coli sur <strong>la</strong> concentration intracellu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> (Ninnemann et al., 1992). Ces<br />
investigations permettront <strong>de</strong> situer précisement <strong>le</strong> nive<strong>au</strong> d’action <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong><br />
régu<strong>la</strong>tion. La troisième hypothèse, l’implication <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> l’organisation structura<strong>le</strong> <strong>de</strong>s<br />
promoteurs <strong>de</strong>s gènes pel, pourra être analysée en adoptant une doub<strong>le</strong> approche in vivo et in<br />
vitro. In vivo, il s’agira <strong>de</strong> comparer, à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> RT-PCR quantitative, l’expression <strong>de</strong>s<br />
gènes pel obtenue <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s conditions standard <strong>de</strong> croissance à cel<strong>le</strong> obtenue <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s<br />
conditions altérant l’état d’enrou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> l’ADN <strong>au</strong>ssi bien <strong>dans</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> que<br />
<strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis. Une évolution différente <strong>de</strong> l’expression génique <strong>dans</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong><br />
et <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis après ajout <strong>de</strong>s composés altérant <strong>la</strong> structuration du chromosome serait<br />
<strong>la</strong> preuve <strong>de</strong> l’implication <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> ce mécanisme. Ces expériences pourront être<br />
complétées par <strong>de</strong>s trav<strong>au</strong>x simi<strong>la</strong>ires réalisés sur <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> et une souche dérivée<br />
comportant <strong>de</strong>s gènes pel inactivés <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> <strong>le</strong>ur(s) site(s) <strong>de</strong> fixation <strong>de</strong> <strong>Fis</strong>. Les<br />
constructions ont déjà été réalisées pour <strong>le</strong>s gènes pelD et pelE. En plus <strong>de</strong> l’avantage <strong>de</strong><br />
s’affranchir <strong>de</strong> l’effet pléiotropique du mutant fis, cette <strong>de</strong>rnière approche permettra <strong>de</strong><br />
vérifier si l’implication éventuel<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> ce mécanisme <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion se fait par une<br />
action directe ou non. In vitro, <strong>de</strong>s expériences <strong>de</strong> transcription pourront être réalisées avec<br />
<strong>de</strong>s matrices d’ADN ayant <strong>de</strong>s nive<strong>au</strong>x d’enrou<strong>le</strong>ment différents en présence et en absence <strong>de</strong><br />
<strong>Fis</strong>.<br />
178
Conclusion et perspectives<br />
Pour <strong>le</strong> cas où ces différents trav<strong>au</strong>x ne permettraient pas <strong>de</strong> c<strong>la</strong>rifier tota<strong>le</strong>ment <strong>la</strong><br />
régu<strong>la</strong>tion phase <strong>de</strong> croissance-dépendante s’exerçant sur <strong>le</strong>s gènes pel, <strong>la</strong> recherche <strong>de</strong><br />
nouvel<strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s régu<strong>la</strong>trices impliquées directement <strong>dans</strong> ce contrô<strong>le</strong> pourra être<br />
entreprise en privilégiant une approche biochimique. El<strong>le</strong> consistera à i<strong>de</strong>ntifier <strong>dans</strong> <strong>de</strong>s<br />
extraits <strong>de</strong> cultures d’E. chrysanthemi à différents sta<strong>de</strong>s <strong>de</strong> <strong>la</strong> croissance, <strong>de</strong>s <strong>protéine</strong>s<br />
susceptib<strong>le</strong>s d’interagir spécifiquement avec <strong>le</strong>s régions régu<strong>la</strong>trices <strong>de</strong>s gènes pel. Les<br />
régu<strong>la</strong>teurs dont l’activité est liée à <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance seront caractérisés. Une tel<strong>le</strong><br />
démarche <strong>de</strong>vrait aboutir à l’i<strong>de</strong>ntification <strong>de</strong> nouvel<strong>le</strong>s <strong>protéine</strong>s contrô<strong>la</strong>nt <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion par<br />
<strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance s’exerçant sur l’expression <strong>de</strong>s gènes pel.<br />
Si <strong>la</strong> caractérisation <strong>de</strong>s régu<strong>la</strong>teurs transcriptionnels s’avère insuffisante pour<br />
expliquer <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion phase <strong>de</strong> croissance-dépendante <strong>de</strong>s gènes pel, <strong>le</strong>s étu<strong>de</strong>s pourraient<br />
être étendues <strong>au</strong> contrô<strong>le</strong> post transcriptionnel en privilégiant <strong>le</strong>s mécanismes décrits chez <strong>de</strong>s<br />
bactéries taxonomiquement proches tel<strong>le</strong> qu’E. carotovora. En effet, chez cette <strong>de</strong>rnière,<br />
RsmA est impliqué <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion phase <strong>de</strong> croissance-dépendante <strong>de</strong>s enzymes<br />
extracellu<strong>la</strong>ires en favorisant en début <strong>de</strong> croissance à <strong>la</strong> fois <strong>la</strong> dégradation <strong>de</strong>s ARNs <strong>de</strong>s<br />
gènes codant <strong>le</strong>s enzymes extracellu<strong>la</strong>ires et <strong>le</strong> système <strong>de</strong> signalisation <strong>de</strong> type « quorumsensing<br />
» ExpI-ExpR (Liu et al., 1998).<br />
Enfin, ces étu<strong>de</strong>s ont révélé une discordance entre <strong>le</strong> profil d’expression <strong>de</strong>s gènes pel<br />
<strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis et celui <strong>de</strong> l’activité Pel obtenu <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s surnageants <strong>de</strong> culture <strong>de</strong> cette<br />
souche. Cette discordance serait due à un déf<strong>au</strong>t <strong>de</strong> <strong>la</strong> translocation <strong>de</strong>s Pels <strong>dans</strong> <strong>le</strong> milieu<br />
extracellu<strong>la</strong>ire <strong>dans</strong> <strong>le</strong> mutant fis. Les acteurs responsab<strong>le</strong>s <strong>de</strong> ce déf<strong>au</strong>t <strong>de</strong> translocation<br />
pourront être i<strong>de</strong>ntifiés en analysant l’expression <strong>de</strong>s systèmes impliqués (systèmes Sec et Out<br />
et <strong>le</strong>s constituants <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrane externe) <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s expériences <strong>de</strong> RT-PCR quantitative ou<br />
<strong>de</strong> protéomique précé<strong>de</strong>mment indiquées.<br />
Le contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> sur <strong>le</strong>s <strong>au</strong>tres facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce <strong>la</strong>isse éga<strong>le</strong>ment présager <strong>la</strong><br />
mise en œuvre <strong>de</strong> mécanismes indirects comme précé<strong>de</strong>mment indiqué. A plus long terme,<br />
ces circuits pourront être c<strong>la</strong>rifiés par une approche globa<strong>le</strong> <strong>de</strong> transcriptomique en adoptant<br />
une stratégie simi<strong>la</strong>ire à cel<strong>le</strong> mentionnée pour <strong>le</strong>s gènes pel. En effet, <strong>la</strong> comparaison à<br />
différents sta<strong>de</strong>s <strong>de</strong> croissance (début <strong>de</strong> phase exponentiel<strong>le</strong> et phase stationnaire) du profil<br />
d’expression <strong>de</strong> <strong>la</strong> souche parenta<strong>le</strong> et <strong>de</strong> sa dérivée fis <strong>dans</strong> <strong>de</strong>s conditions <strong>de</strong> culture standard<br />
ou favorisant une altération structura<strong>le</strong> du génome (par exemp<strong>le</strong> présence <strong>de</strong> substance<br />
agissant sur <strong>la</strong> gyrase ou <strong>le</strong>s topoisomérases) <strong>de</strong>vrait permettre d’i<strong>de</strong>ntifier <strong>le</strong>s cib<strong>le</strong>s <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> et<br />
<strong>de</strong> distinguer cel<strong>le</strong>s dont l’expression dépend fortement <strong>de</strong> l’organisation structura<strong>le</strong> <strong>de</strong><br />
l’ADN <strong>de</strong> cel<strong>le</strong>s dont l’expression n’en dépend que modérément. Une attention particulière<br />
179
Conclusion et perspectives<br />
sera portée sur <strong>le</strong>s gènes codant <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce avérés ou potentiels. Cette approche<br />
permettra éga<strong>le</strong>ment d’apprécier l’implication <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion dépendant <strong>de</strong><br />
l’organisation structura<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’ADN <strong>de</strong>s gènes d’intérêt. De plus, <strong>la</strong> caractérisation <strong>de</strong>s<br />
régu<strong>la</strong>teurs différentiel<strong>le</strong>ments exprimés non encore étudiés pourrait permettre l’i<strong>de</strong>ntification<br />
<strong>de</strong> <strong>protéine</strong>s additionnel<strong>le</strong>s servant <strong>de</strong> re<strong>la</strong>is à <strong>Fis</strong> pour <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> l’expression <strong>de</strong> certains<br />
gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce. Une approche simi<strong>la</strong>ire a été récemment utilisée pour i<strong>de</strong>ntifier, chez E.<br />
coli, <strong>le</strong>s gènes régulés par <strong>Fis</strong> et l’état d’enrou<strong>le</strong>ment <strong>de</strong> l’ADN (Blot et al., 2006).<br />
Ces différentes investigations <strong>de</strong>vraient permettre <strong>de</strong> satisfaire tota<strong>le</strong>ment l’objectif <strong>de</strong><br />
cette thèse qui était d’éluci<strong>de</strong>r <strong>le</strong>s mécanismes <strong>de</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong><br />
viru<strong>le</strong>nce par <strong>la</strong> phase <strong>de</strong> croissance. L’intégration <strong>de</strong> l’action <strong>de</strong>s différents acteurs impliqués<br />
<strong>dans</strong> ce contrô<strong>le</strong> <strong>au</strong> rése<strong>au</strong> <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>tion précé<strong>de</strong>mment caractérisé <strong>de</strong>vrait permettre <strong>de</strong><br />
comprendre comment <strong>la</strong> bactérie perçoit <strong>le</strong>s sign<strong>au</strong>x provenant <strong>de</strong> l’environnement et<br />
comment, en retour, el<strong>le</strong> adapte <strong>la</strong> synthèse <strong>de</strong> ses facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce. De tel<strong>le</strong>s<br />
connaissances pourraient favoriser l’i<strong>de</strong>ntification <strong>de</strong> nouve<strong>au</strong>x agents interférant avec <strong>le</strong><br />
pouvoir pathogène d’E. chrysanthemi. Enfin, comme présenté <strong>dans</strong> <strong>la</strong> partie bibliographique et<br />
conforté par <strong>le</strong>s résultats <strong>de</strong>s trav<strong>au</strong>x <strong>de</strong> ma thèse, <strong>le</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce ainsi que <strong>le</strong>s<br />
mécanismes utilisés pour régu<strong>le</strong>r <strong>le</strong>ur synthèse sont simi<strong>la</strong>ires chez <strong>le</strong>s pathogènes <strong>de</strong>s anim<strong>au</strong>x<br />
et <strong>de</strong>s végét<strong>au</strong>x. Les résultats obtenus sur E. chrysanthemi pourraient donc être étendus à un<br />
grand nombre <strong>de</strong> bactéries pathogènes.<br />
180
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199
THESE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON<br />
NOM : LAUTIER DATE <strong>de</strong> SOUTENANCE :<br />
Prénoms : Thomas 20 décembre 2007<br />
TITRE : <strong>Rô<strong>le</strong></strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> <strong>associée</strong> <strong>au</strong> nucléoï<strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce chez <strong>la</strong><br />
bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi.<br />
NATURE : Doctorat<br />
Numéro d'ordre : 2007-ISAL-0116<br />
Eco<strong>le</strong> doctora<strong>le</strong> : Evolution, Ecosystème, Microbiologie, Modélisation<br />
Spécialité : Microbiologie<br />
Cote B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 ---- CLASSE :----<br />
RESUME :<br />
Erwinia chrysanthemi est une entérobactérie phytopathogène responsab<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> pourriture mol<strong>le</strong> et<br />
qui engendre <strong>de</strong>s pertes économiques importantes sur différentes p<strong>la</strong>ntes. Une colonisation efficace <strong>de</strong><br />
l’hôte requiert l’action séquentiel<strong>le</strong> <strong>de</strong> plusieurs facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce. Certains <strong>de</strong> ces facteurs sont<br />
essentiel<strong>le</strong>ment requis <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s étapes précoces du processus infectieux tels que <strong>la</strong> harpine HrpN, <strong>le</strong><br />
système <strong>de</strong> détoxification Sap ou <strong>le</strong>s f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s assurant <strong>la</strong> mobilité bactérienne. D’<strong>au</strong>tres agissent par<br />
contre <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s étapes tardives du processus tels que <strong>le</strong>s enzymes dégradatives. Parmi ces enzymes, <strong>le</strong>s<br />
pectate lyases (Pels) jouent un rô<strong>le</strong> déterminant <strong>dans</strong> <strong>le</strong> pouvoir pathogène, en raison <strong>de</strong> <strong>le</strong>ur capacité à<br />
reproduire <strong>le</strong> symptôme <strong>de</strong> pourriture mol<strong>le</strong>. La synthèse <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce est finement<br />
régulée pour conduire une infection efficace.<br />
L’essentiel <strong>de</strong>s trav<strong>au</strong>x <strong>de</strong> cette thèse a consisté à caractériser <strong>le</strong> rô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>protéine</strong> <strong>associée</strong> <strong>au</strong><br />
nucléoï<strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>le</strong> contrô<strong>le</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> viru<strong>le</strong>nce chez E. chrysanthemi.<br />
Un mutant fis présente une synthèse diminuée <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce impliqués <strong>dans</strong> <strong>le</strong>s étapes<br />
précoces <strong>de</strong> l’infection (f<strong>la</strong>gel<strong>le</strong>s, harpine et système <strong>de</strong> détoxification). De plus, l’induction <strong>de</strong><br />
l’activité pectate lyase est retardée et <strong>au</strong>gmente durant <strong>la</strong> phase stationnaire <strong>de</strong> croissance <strong>dans</strong> <strong>le</strong><br />
mutant fis. Le contrô<strong>le</strong> exercé par <strong>Fis</strong> sur l’expression <strong>de</strong>s gènes codant ces facteurs se fait par un<br />
mécanisme direct. In p<strong>la</strong>nta, <strong>le</strong> mutant fis présente une viru<strong>le</strong>nce atténuée qui serait <strong>le</strong> résultat <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
modification du profil <strong>de</strong> synthèse <strong>de</strong>s facteurs <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce.<br />
Le mécanisme molécu<strong>la</strong>ire <strong>de</strong> <strong>la</strong> régu<strong>la</strong>tion exercée par <strong>Fis</strong> a été étudié plus en détail sur <strong>le</strong>s gènes<br />
pel dont l’expression est modulée par un grand nombre <strong>de</strong> régu<strong>la</strong>teurs (8 sont déjà caractérisés). Une<br />
étu<strong>de</strong> intégrative réalisée en adoptant une doub<strong>le</strong> approche in vivo et in vitro a montré que <strong>Fis</strong> réprime<br />
directement l’expression <strong>de</strong>s gènes pel <strong>au</strong> nive<strong>au</strong> <strong>de</strong> l’initiation <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription. Dans certaines<br />
conditions, <strong>Fis</strong> agit <strong>de</strong> concert avec KdgR, un <strong>au</strong>tre répresseur essentiel, pour verrouil<strong>le</strong>r l’expression<br />
<strong>de</strong>s gènes pel.<br />
L’ensemb<strong>le</strong> <strong>de</strong> ces données met en évi<strong>de</strong>nce un rô<strong>le</strong> pivot <strong>de</strong> <strong>Fis</strong> <strong>dans</strong> <strong>la</strong> coordination <strong>de</strong> l’expression<br />
<strong>de</strong>s princip<strong>au</strong>x gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce d’E. chrysanthemi <strong>au</strong> cours du processus infectieux.<br />
MOTS-CLES : Bactérie phytopathogène / <strong>Fis</strong> / gènes <strong>de</strong> viru<strong>le</strong>nce / régu<strong>la</strong>tion <strong>de</strong> <strong>la</strong> transcription /<br />
Erwinia chrysanthemi.<br />
Laboratoire <strong>de</strong> recherche :<br />
Microbiologie, Adaptation et Pathogénie, UMR 5240 CNRS-UCBL-INSA-BayerCropScience,<br />
Domaine Scientifique <strong>de</strong> <strong>la</strong> Doua, Université Lyon 1, Bat. André Lwoff, 10 rue Raphaël Dubois,<br />
69622 Vil<strong>le</strong>urbanne Ce<strong>de</strong>x France<br />
Composition du jury :<br />
Mr Carlos BLANCO, Professeur à l’Université <strong>de</strong> Rennes I, Rapporteur<br />
Mr C<strong>la</strong>u<strong>de</strong> GUTIERREZ, Professeur à l’Université Toulouse III, Rapporteur<br />
Mr Hafid ABAIBOU, Responsab<strong>le</strong> Senior R&D, Biomérieux, Examinateur<br />
Mr Philippe LEJEUNE, Professeur à l’INSA <strong>de</strong> Lyon, Examinateur<br />
Mme Marie-Andrée MANDRAND-BERTHELOT, Directeur <strong>de</strong> Recherche CNRS, Examinateur<br />
Mr William NASSER, Directeur <strong>de</strong> Recherche CNRS, Directeur <strong>de</strong> thèse<br />
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