Etude d'un traitement combiné bio-physico-chimique pour la ...

N° d’ordre 2004ISAL0045 Année 2004
Thèse
Etude d’un traitement combiné
bio-physico-chimique pour la
décontamination des eaux polluées en
atrazine
Présentée devant
L’institut national des sciences appliquées de Lyon
Pour obtenir
Le grade de docteur
Formation doctorale
Sciences et Techniques du Déchet
École doctorale
Chimie, Procédés et Environnement de Lyon
Par
Sophie GENDRAULT DERVEAUX
(Maître ès Sciences en Biochimie)
Soutenue le 22 septembre 2004 devant la Commission
d’examen
Jury MM.
Mr J. Bourgois, Professeur (Mines de Saint Etienne)
Mr A. Pauss, Professeur (UTC Compiègne)
Mr B. Fabre, Professeur (UHA Mulhouse – Colmar)
Mr R. Gourdon, Professeur (INSA de Lyon)
Mr J.M. Blanchard, Professeur (INSA de Lyon)
Mr R. Bayard, Maître de conférences (INSA de Lyon)
Président
Rapporteur
Rapporteur
Directeur de thèse

REMERCIEMENTS
Toute mon estime et mes premiers remerciements vont à mon directeur de thèse, Rémy Gourdon, un
homme exceptionnel qui a su me soutenir tout au long de cette épreuve qu’est celle du doctorat,
jusque dans les moments parfois désespérés. Merci pour ton amitié, ta sympathie et ta bonne humeur
quotidienne. Je ressors de ces années avec des cantiques plein la tête ! Merci pour ton efficacité,
c’est un véritable bonheur de travailler à tes côtés.
Je remercie Pierre Moszkowicz, directeur du LAEPSI qui m’a accueillie depuis mon année de DEA
dans son laboratoire.
Une pensée particulière va à mes collègues et amis de la FEUP de Porto, où une partie de ce travail
a été réalisé. Je pense particulièrement à Paulo, Nuno et Patricia, des amis pour la vie.
Ces années n’auraient pas été aussi gaies et festives sans notre « Pépito National ». Merci Rémy
pour tes conseils, ton soutient et ton amitié. Tu verras, un jour l’informatique te sourira !
Ces quelques années au LAEPSI ont été l’occasion de rencontres exceptionnelles. Merci à toi
Khalilou de nous sortir parfois de notre rationalité accablante. La philosophie peut alléger nos
pensées, elle peut aussi les troubler.
Merci à tous mes collègues et amis : Bada, sacrée partenaire de bureau et leader avec moi de
nombreuses festivités au laboratoire ! Vincent, Sonia, Daniela, Marion et tous les autres, partenaires
de franches rigolades, futurs Docteurs à qui je souhaite un grand succès. Merci à Christian pour tous
les coups de main et les bidouillages maison.
Spéciale dédicace à mes amis des quatre continents, qui se reconnaîtront ; leur présence est toujours
d’un grand réconfort.
A mes amis musiciens qui ont rythmé cette dernière année de thèse.
Un Merci tout particulier à mes parents et à toute ma famille qui ont cru longtemps que je serai
étudiante à vie. Cette fois j’arrête mes études, c’est promis !
MERCI mon Poussin, tout ton amour a rempli ces années de bonheur et notre séjour au Portugal m’a
laissé des souvenirs inoubliables.
« L’Odyssée suit son cours » …
avec l’arrivée de notre premier bébé à qui je dédie ce travail ainsi qu’à toute sa
génération.
1
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESUME
Ce travail concerne l’étude d’un procédé bio-physico-chimique pour le traitement d’eaux polluées par
de l’atrazine. Le procédé étudié consiste en une biofiltration, utilisant l’écorce de pin comme support
d’adsorption et comme agent de biodégradation la souche bactérienne Pseudomonas ADP sp.,
connue pour sa capacité à minéraliser l’atrazine en tant que source d’azote. Cette technique vise à
éliminer totalement le polluant par minéralisation, valorisant l’écorce de pin, un déchet de l’industrie
du bois, le tout à faible coût.
Dans un premier temps, les essais d’adsorption ont montré que l’atrazine était retenue en faible
quantité sur l’écorce de pin, comparé à la capacité d’adsorption d’un charbon actif, rendant le
pesticide disponible pour les micro-organismes engagés dans le traitement.
L’approche biologique en milieu liquide a montré que la biodégradation de l’atrazine pouvait avoir lieu
à pH acide (jusqu’à pH 4,4) imposé par la présence de l’écorce en solution aqueuse et à des
températures relativement basses (jusqu’à 12°C) permettant d’exploiter ce procédé de manière
rustique : pas de chauffage ni besoin de tamponner l’eau à traiter. Pseudomonas ADP sp. a prouvé
qu’elle était capable de survivre en présence des composés organiques de l’écorce de pin et de les
consommer en tant que source unique de carbone. D’autre part, aucune source d’azote
supplémentaire à l’atrazine ne doit être apportée au cours du traitement sous peine de voir la
minéralisation de celle-ci diminuer.
La microflore indigène de l’écorce de pin a montré une légère capacité à minéraliser l’atrazine pour
des concentrations en atrazine comprises entre 45 µg.L -1 et 20 mg.L -1 permettant, à forte
concentration uniquement, d’augmenter le rendement global du traitement. D’une manière générale,
la présence de cette microflore n’aurait qu’un très léger effet inhibiteur vis à vis de la croissance de
Pseudomonas ADP sp. et de sa capacité à minéraliser l’atrazine.
L’étude du traitement combinant adsorption et biodégradation a été réalisée en essais batch et en
colonnes. En batch, 50% de l’atrazine sont minéralisés en 4 jours ; 50% restent adsorbés
irréversiblement à l’écorce et donc non disponibles pour les bactéries. En colonne, l’apport de
Pseudomonas ADP sp. améliore l’efficacité du traitement de 50% à 100% par rapport au procédé
d’adsorption seul.
Le traitement étudié semble inexploitable pour traiter des eaux contenant une faible concentration en
atrazine (quelques µg.L -1 ). En revanche, ce procédé combiné pourrait être envisagé comme prétraitement
pour des eaux fortement polluées (quelques mg.L -1 ).
Thèse S.GENDRAULT 2004
2

ABSTRACT
This work concerns the study of a combinated process for the treatment of waters contaminated with
atrazine. The treatment consists in a biofiltration ; it uses pine bark as the support of adsorption and
the strain Pseudomonas sp. ADP, known for its capacity to mineralize atrazine, using the pesticide as
sole nitrogen source. This process aims at a total elimination of the pollutant, recycling pine bark, a
by-product of wood industry, at low cost.
In a first step, the adsorption assays showed that atrazine was relativelyslightly retained by pine bark,
as compared to the adsorption capacity of an activated carbon. This characteristic makes the pollutant
easily available for the micro-organisms involved in the treatment.
The biological approach in liquid medium showed that atrazine biodegradation could occur under
acidic conditions (down to pH 4.4) imposed by the presence of the bark in an aqueous solution and at
low temperatures (until 12°C), allowing the development of the process in rustic conditions: without
heating and without buffering.
Pseudomonas sp. ADP proved that it was able to survive in the presence of the pine bark organic
compounds and metabolize them as a carbon source. Moreover, no other nitrogen source in more of
atrazine has to be added during the treatment, otherwise considerably decreasing the mineralization
of atrazine.
The indigenous microflore of the bark showed a low capacity for the mineralization of atrazine for
concentrations ranging from 45 µg.L -1 to 20 mg.L -1 . At high atrazine concentration, this effect
increases the global capacity of the treatment. The presence of the pine bark microflora was shown to
inhibit very slightly the growth of Pseudomonas sp. ADP and its capacity to mineralize atrazine.
The study of the combinated process was done in batch and in column experiments. In batch assays,
50% of atrazine were mineralized in 4 days, as the other 50% stayed irreversibly adsorbed onto pine
bark and were not available for the micro-organisms. In column assays, the contribution of
Pseudomonas sp. ADP improves by 50 to 100% the efficiency of the treatment as compared to the
adsorption process.
The studied treatment appears be inexploitable for the treatment of waters contaminated with low
concentrations of atrazine. However, the combinated process could be considered as a pre-treatment
for the decontamination of water highly polluted.
Thèse S.GENDRAULT 2004
3

LISTE DES ABREVIATIONS
Nomenclature
Acronymes et symboles
µ Moment dipolaire ues A Atrazine
µ max Vitesse maximale de croissance bactérienne T -1 AFT Anodic Fenton Treatment
C 0 ou C i Concentration initiale en liquide mol.L -1 ATP Adénosine triphosphate
C e Concentration à l'équilibre mol.L -1 BM Bilan Matière
C L Concentration dans le liquide Mol.L -3 C Carbone
δ Diamètre L CA Charbon actif
∆H Charge hydraulique - CAF Charbon actif en fibres
ε Porosité totale ou Indice de vide - CAG Charbon actif en grains
H Consante de Henry P CAP Charbon actif en poudre
η Viscosité dynamique d'un fluide M.L -1 .T -1 Cd Cadmium
K Coefficient de perméabilité ou conductivité hydraulique L.T -1 CE50 Concentration à effet particulier chez 50% des individus
k Constante de vitesse T -1 CL Concentration létale
K d Coef. de partage sol/eau (M.M -1 )(L 3 .M -1 ) 1/n Cl Chlore
K F Constante de Freundlich (M.M -1 )(L 3 .M -1 ) 1/n CO Carbone organique
K i Coef. d'inhibition COD Carbone organique dissous
K L Constante d'équilibre adsorbat/adsorbant L 3 M -1 CODB Carbone organique dissous biodégradable
K oc Coef. de distrubution carbone organique/eau (M.M -1 )(L 3 .M -1 ) 1/n COT Carbone organique total
K ow Coef de partage octanol/eau - COV Composé organique volatil
K s Constante de Monod Mol.L -3 Cr Chrome
λ Longueur d'onde L Cu Cuivre
m Masse M DBO Demande biologique en oxygène
Ma Masse d'air M DE50 Dose à effet particulier chez 50% des individus
Me Masse d'eau M DEA Deséthyl-atrazine
Ms Masse de solide M DEDIA Deséthyl-desisopropyl-atrazine
Mt Masse totale M DGRAH Direcção Geral dos Recursos e Aproveitamentos Hidráulicos
ν vitesse de consommation d'un substrat M.T -1 ou mol.T -1 DIA Desisopropyl-atrazine
n F Constante de Freundlich - DL Dose létale
ν max vitesse maximale de consommation d'un substrat Mol.L -3 .T -1 DMSE Dose maximale sans effet
θ humidité volumique % DO Densité optique
q vitesse de Darcy L.T -1 DT50 ou t 1/2 Temps de demi-vie
Q ou D Débit d'écoulement L 3 .T DthO Demande biologique en oxygène théorique (OCDE-301)
q 0 Concentration initiale dans la phase solide M.M -1 ou mol.M -1 Fe Fer
q e Quantité de composé adsobé à léquilibre M.M -1 ou mol.M -1 GUS Groundwater Ubiquity Score
θ eff Teneur en eau effective - H Hydrogène
q m Concentration de soluté dans la phase solide - HA ou OHA Hydroxyatrazine
Q max Quantité maximale de composé adsobé M.M -1 ou mol.M -1 Hg Mercure
R Coefficient de retard HIA Hydroxy-isopropylamino-atrazine
ρ app Masse volumique apparente M.L 3 HMDS Hexaméthyldisilazane
ρ re Masse volumique réelle M.L 3 HPLC High Performance Liquid Chromatography
S Solubilité d'un composé M.L 3 IFEN Institut Français de l'Environnement
S Surface M 2 IR Infra Rouge
s Degré de saturation L/S Ratio Liquide/Solide
S Concentration en substrat mol.L -1 MEB Microscope Electronique à Balayage
S i Solubilité d'une molécule non ionisée M.L -1 MM Matière Minérale
τ Tortuosité L MM Milieu minéral
V Volume L 3 MM-Glc Milieu minéral glucosé
Va Volume d'air L 3 MO Matière organique
Ve Volume d'eau L 3 Mso Matière Organique soluble
Vo ou Ve Volume de pore L 3 Na Sodium
Vs Volume de solide L 3 Ni Nickel
Vt Volume total L 3 Ni Azote
Vv Volume de vide L 3 O Oxygène
w Humidité pondérale % OHDEA Hydoxy-deséthyl-atrazine
X Densité ou concentration de biomasse M.L -3 OMS Organisation mondiale de la santé
Y Coefficient de rendement cellulaire Mbio.Mol -1 de substrat P Phosphore
Thèse Sophie Gendrault 2004
Pb
PCA
PMPOA
RENQA
RNE
RUP
S
UV-Vis
Zn
Plomb
Plate Count Agar
Programme de maîtrise des pollutions d’origine agricole
Rede Nacional de Qualidade da Água
Résidus non extractible
Pesticide restreint d'utilisation
Soufre
Ultra violet - visible
Zinc
4

Cette étude a fait l’objet de :
COMMUNICATIONS ORALES :
Unicum Colloquium. Crop Portection. 33ème Congrès du Groupe Français des Pesticides ;
Aix en Provence, France, Mai 2003. Gendrault S., Bayard R., Nones O.P., and Gourdon R.
“Influence of pine bark on the growth and atrazine degradation activity of Pseudomonas sp.
strain ADP in the treatment of contaminated waters”.
POSTERS :
First European Bioremediation Conference ; Chania, Crete, Greece, Juillet 2001. Gendrault
S., Alves M. A., Manaia C. M., Gourdon R., Bayard R., Nunes O. C. “Remediation of
contaminated natural waters with low concentrations of pesticides: a combination of physical
and biological method”.
Le CODEGPRA (Comité de Développement du Génie d es Procédés Rhône-Alpes),
« Apports du Génie des procédés aux enjeux sociétaux, Saint Martin d’Hères, Octobre 2003.
Gendrault S., Bayard R., Gourdon R., Nunes O.P. «Remediation of contaminated natural
waters with low concentrations of pesticides: a combination of physical and biological
method”.
Second European Bioremediation Conference ; Chania, Crete, Greece, Juin 2003. Gendrault
S., Bayard R., Nones O.P., and Gourdon R. “Influence of pine bark micro-flora on the growth
and atrazine degradation activity of Pseudomonas sp. strain ADP in the treatment of
contaminated waters”.
PUBLICATION SOUMISE :
Gendrault S., Bayard R., Nones O.P., and Gourdon R. “Influence of pine bark on the growth
and atrazine degradation activity of Pseudomonas sp. strain ADP in the treatment of
contaminated waters”. Agronomie.
Thèse S.GENDRAULT 2004

SOMMAIRE
REMERCIEMENTS…………………………………………………………...1
RESUME………………………………………………………………………..2
LISTE DES ABREVIATIONS…………..…………………………………….4
INTRODUCTION GENERALE……………….………………………………5
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE………………………………………………..8
I. LES PESTICIDES : RÉGLEMENTATION, UTILISATION ET
DEVENIR DANS L’ENVIRONNEMENT...................................................9
I.1 Aspects réglementaires ............................................................................................................... 9
I.1.1 Normes européennes, françaises et portugaises sur les pesticides – cas de l’atrazine ....... 9
I.1.2 Programmes de maîtrise et de réduction des pollutions d’origine agricole ......................... 10
I.2 Caractéristiques de l’atrazine.................................................................................................... 12
I.2.1 Généralités........................................................................................................................... 12
I.2.2 Mode d’utilisation et mode d’action de l’atrazine ................................................................. 12
I.2.3 Aspects Toxicologiques ....................................................................................................... 14
I.3 Dispersion des herbicides dans l’environnement................................................................... 15
I.3.1 Introduction .......................................................................................................................... 15
I.3.2 Devenir dans le sol............................................................................................................... 16
I.3.2.1 Rétention des pesticides dans le sol........................................................................... 17
I.3.2.1.1 Facteurs de l’adsorption.......................................................................................... 18
I.3.2.1.2 Formation de résidus liés........................................................................................ 21
I.3.2.2 Dégradation des pesticides dans le sol....................................................................... 22
I.3.2.2.1 Dégradation abiotique............................................................................................. 23
Thèse Sophie Gendrault 2004

I.3.2.2.2 Dégradation biologique ........................................................................................... 24
I.3.2.2.3 Minéralisation .......................................................................................................... 26
I.3.3 Volatilisation ......................................................................................................................... 27
I.3.4 Contamination des milieux aquatiques ................................................................................ 28
I.3.4.1 Le Ruissellement : contamination des eaux de surface.............................................. 29
I.3.4.2 Le lessivage: contamination des eaux souterraines ................................................... 29
II.
PROCÉDÉS DE TRAITEMENT DE L’EAU POUR L’ÉLIMINATION
DES PESTICIDES..................................................................................31
II.1 Introduction............................................................................................................................. 31
II.2 Elimination de l’atrazine dans la filière classique de traitement des eaux usées ........... 31
II.3 Procédés physico-chimiques dégradatifs ........................................................................... 32
II.3.1 Oxydation à l’ozone.............................................................................................................. 32
II.3.2 Oxydation au peroxyde d’hydrogène ................................................................................... 34
II.3.3 Traitement au réactif de Fenton (AFT, Anodic Fenton Treatment)...................................... 34
II.3.4 Dégradation photochimique ................................................................................................. 35
II.4 Procédés non dégradatifs : adsorption sur matrice poreuse ou membrane................... 35
II.4.1 Procédés d’adsorption sur charbon actif en poudre ou en grains ....................................... 35
II.4.1.1 Généralités .................................................................................................................. 35
II.4.1.2 Application à l’adsorption de l’atrazine sur charbon actif (CA)s.................................. 36
II.4.2 Procédés membranaires : microfiltration, ultrafiltration et nanofiltation ............................... 38
II.4.3 Valorisation des déchets verts pour le traitement de l’eau .................................................. 39
II.4.3.1 Une solution économique............................................................................................ 39
II.4.3.2 Quelques exemples..................................................................................................... 39
II.4.3.3 Cas de l’écorce de pin................................................................................................. 40
II.5 Procédés de dégradation biologique ................................................................................... 43
II.5.1 Caractéristiques générales des bioréacteurs....................................................................... 43
II.5.2 Traitements biologiques appliqués aux eaux contaminées par l’atrazine ........................... 44
II.6 Procédés combinés................................................................................................................ 47
II.6.1 Généralités........................................................................................................................... 47
II.6.2 La biofiltration....................................................................................................................... 49
II.6.2.1 Introduction.................................................................................................................. 49
II.6.2.2 Principales propriétés des biofilms.............................................................................. 49
II.6.2.3 Comportement des micro-organismes en biofilm........................................................ 50
Thèse Sophie Gendrault 2004

II.6.2.4 Formation des biofilms ................................................................................................ 50
II.6.3 Facteurs influençant la formation et l’activité des biofilms................................................... 52
II.6.3.1 Caractéristiques des micro-organismes...................................................................... 52
II.6.3.2 Le support d’adsorption............................................................................................... 53
II.6.3.2.1 Caractéristiques physiques du support d’adsorption............................................. 55
II.6.3.2.2 Caractéristiques chimiques du support d’adsorption............................................. 57
II.6.3.2.3 Caractéristiques microbiologiques du support d’adsorption .................................. 57
II.6.3.3 Composition du fluide.................................................................................................. 58
II.6.3.4 Effet de la vitesse de circulation du fluide ................................................................... 59
II.6.3.5 Effet de la température................................................................................................ 60
II.6.4 Cinétique de biodégradation d’un substrat .......................................................................... 60
III. BIODÉGRADATION DE L’ATRAZINE PAR PSEUDOMONAS ADP
SP. ..…………………………………………………………………………...62
III.1 Introduction............................................................................................................................. 62
III.2 Isolement de Pseudomonas ADP sp.................................................................................... 64
III.3 Taxonomie et exigences métaboliques................................................................................ 65
III.4
Mécanisme de dégradation de l’atrazine et isolement des gènes de Pseudomonas ADP
sp. impliqués dans la minéralisation de l’atrazine........................................................................... 67
III.5 Différentes applications......................................................................................................... 68
III.5.1 Traitement des eaux résiduelles d’usine de fabrication de pesticides ............................ 68
III.5.2 Traitement des sols pollués............................................................................................. 69
III.5.3 Décontamination de sédiments et aquifères pollués....................................................... 69
IV. DESCRIPTION MATHÉMATIQUE DU PROCESSUS
D’ADSORPTION....................................................................................71
IV.1 Modélisation de l’équilibre d’adsorption ............................................................................. 71
IV.2 Ecoulement dans un milieu poreux...................................................................................... 74
IV.2.1 Organisation du milieu poreux......................................................................................... 74
IV.2.2 Hétérogénéité de l’écoulement........................................................................................ 76
IV.2.3 Loi de Darcy..................................................................................................................... 76
IV.2.4 Vitesse d’écoulement et tortuosité................................................................................... 77
Thèse Sophie Gendrault 2004

ETUDE EXPERIMENTALE…………………………………………………78
I. ETUDE DU SUPPORT D’ADSORPTION : L’ÉCORCE DE PIN
« PINUS PINASTER » ...........................................................................79
I.1 Origine et répartition .................................................................................................................. 79
I.2 Chimie générale des écorces .................................................................................................... 80
I.3 Caractéristiques physico- chimiques de l’écorce de pin ....................................................... 81
I.3.1 Caractéristiques physiques.................................................................................................. 82
I.3.1.1 Principe de la méthode BET........................................................................................ 82
I.3.1.2 Principales caractéristiques......................................................................................... 82
I.3.2 Caractéristiques chimiques.................................................................................................. 84
I.3.3 Analyse Infra Rouge des fonctions de surface .................................................................... 85
I.3.3.1 Principe de l’analyse Infra Rouge................................................................................ 86
I.3.3.2 Protocole expérimental................................................................................................ 86
I.3.3.3 Interprétation du spectre IR......................................................................................... 86
I.4 Observations de la structure l’écorce de pin au MEB ............................................................ 87
I.5 Préparation de l’écorce en vue des études d’adsorption....................................................... 87
I.6 Préparation d’un extrait aqueux d’écorce de pin .................................................................... 88
I.7 Méthode de stérilisation............................................................................................................. 88
II.
ADSORPTION DE L’ATRAZINE SUR L’ÉCORCE DE PIN............90
II.1. Matériel et Méthodes.............................................................................................................. 90
II.1.1 Etude de l’adsorption en batch ............................................................................................ 90
II.1.1.1 L’atrazine : caractéristiques générales et méthodes d’analyses................................. 90
II.1.1.1.1 Caractéristiques physico-chimiques ...................................................................... 90
II.1.1.1.2 Méthodes d’analyse ............................................................................................... 92
Thèse Sophie Gendrault 2004

(a) Chromatographie Liquide Haute Pression.............................................................. 92
(b) Dosage par Immuno-essai...................................................................................... 92
(c) Suivi des essais avec des molécules marquées au 14 C.............................................. 93
II.1.1.2 Cinétique d’adsorption................................................................................................. 93
II.1.1.3 Isothermes d’adsorption .............................................................................................. 94
II.1.1.4 Extraction de l’atrazine adsorbée sur l’écorce de pin.................................................. 94
II.1.2 Etude de l’adsorption en colonne......................................................................................... 95
II.1.2.1 Courbes d’élution d’un soluté ...................................................................................... 95
II.1.2.2 Caractérisation de l’écoulement à l’aide de traceurs .................................................. 97
II.1.2.2.1 Choix du traceur..................................................................................................... 97
II.1.2.2.2 Suivi du traceur en sortie de colonne..................................................................... 97
II.1.2.3 Méthodes expérimentales d’adsorption en colonne.................................................... 98
II.1.2.3.1 Préparation des colonnes ...................................................................................... 98
II.1.2.3.2 Suivi du COD, du pH et de la conductivité en sortie de colonne ......................... 100
II.1.2.3.3 Adsorption de l’atrazine en colonne..................................................................... 101
II.2 Résultats et discussion ....................................................................................................... 102
II.2.1 Etude de l’adsorption en batch .......................................................................................... 102
II.2.1.1 Cinétiques d’adsorption............................................................................................. 102
II.2.1.2 Isothermes d’adsorption ............................................................................................ 103
II.2.1.2.1 Influence de la granulométrie de l’écorce de pin sur l’adsorption de l’atrazine ... 103
II.2.1.2.2 Influence du pH sur l’adsorption de l’atrazine...................................................... 104
II.2.1.2.3 Isotherme d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin dans une large gamme de
concentrations ........................................................................................................................ 105
II.2.2 Etude de l’adsorption en colonnes abiotiques ................................................................... 107
II.2.2.1 Etude hydrodynamique des colonnes ....................................................................... 108
II.2.2.2 Suivi du COD, pH et conductivité en sortie de colonne ............................................ 109
II.2.2.3 Adsorption de l’atrazine en colonne d’écorce de pin en conditions abiotiques......... 111
II.2.3 Conclusion ......................................................................................................................... 113
III. BIODÉGRADATION DE L’ATRAZINE EN CULTURE PURE DE
PSEUDOMONAS ADP SP. .................................................................115
III.1 Matériel et méthodes............................................................................................................ 115
III.1.1 Milieux de culture........................................................................................................... 115
III.1.1.1 Les milieux liquides ................................................................................................... 115
III.1.1.1.1 Milieu minéral MM............................................................................................... 115
III.1.1.1.2 Milieu riche complexe LB .................................................................................... 116
III.1.1.1.3 Extrait aqueux d’écorce de pin............................................................................ 116
Thèse Sophie Gendrault 2004

III.1.1.2 Les milieux solides .................................................................................................... 117
III.1.2 Préparation et utilisation des cellules congelées........................................................... 117
III.1.2.1 Préparation de cellules congelées ............................................................................ 117
III.1.2.2 Utilisation de stocks congelés ou de précultures ...................................................... 118
III.1.3 Suivi de la croissance des micro-organismes et de l’activité respiratoire ..................... 120
III.1.3.1 Suivi de la croissance cellulaire ................................................................................ 120
III.1.3.1.1 Mesure de turbidité ............................................................................................. 120
III.1.3.1.2 Dénombrement sur boite de Pétri....................................................................... 121
III.1.3.1.3 Dosage des protéines par la méthode de Folin- Lowry : .................................... 121
III.1.3.1.4 Dosage des protéines par la méthode Bradford :............................................... 121
III.1.3.2 Suivi de l’activité respiratoire (ou Demande Biochimique en Oxygène DBO)........... 122
III.1.3.2.1 Principe de la mesure ......................................................................................... 122
III.1.3.2.2 Protocole expérimental ....................................................................................... 123
III.1.3.3 Détermination du taux de croissance maximal ......................................................... 123
III.1.4 Suivi de la biodégradation de l’atrazine......................................................................... 124
III.1.4.1 Biodégradation primaire de l’atrazine........................................................................ 124
III.1.4.2 Minéralisation de l’atrazine........................................................................................ 125
III.1.4.2.1 Préparation des solutions mères d’atrazine marquée ........................................ 126
III.1.4.2.2 Principe des essais de minéralisation................................................................. 126
III.1.4.2.3 Protocole expérimental ....................................................................................... 127
III.1.5 Influence de paramètres physico-chimiques ................................................................. 128
III.1.5.1 Influence des sources de carbone ............................................................................ 128
III.1.5.2 Influence de la température et du pH........................................................................ 128
III.1.5.3 Influence d’une source additionnelle d’azote ............................................................ 129
III.1.5.3.1 Croissance bactérienne et dégradation primaire de l’atrazine ........................... 129
III.1.5.3.2 Minéralisation de l’atrazine ................................................................................. 129
III.1.5.4 Influence des composés solubles de l’écorce de pin................................................ 130
III.1.5.4.1 Influence sur l’Activité Respiratoire de Pseudomonas ADP sp. ......................... 130
III.1.5.4.2 Influence sur la croissance de Pseudomonas ADP sp.et la biodégradation de
l’atrazine 131
III.2 Résultats et dissussion ....................................................................................................... 132
III.2.1 Introduction .................................................................................................................... 132
III.2.2 Influence de paramètres physico-chimiques ................................................................. 132
III.2.2.1 Croissance et biodégradation de l’atrazine à différentes températures.................... 132
III.2.2.2 Croissance et biodégradation de l’atrazine à différents pH ...................................... 134
III.2.2.3 Influence d’une source additionnelle d’azote ............................................................ 135
III.2.2.3.1 Influence sur la dégradation primaire de l’atrazine............................................. 136
III.2.2.3.2 Influence sur la minéralisation de l’atrazine........................................................ 137
III.2.3 Influence des composés solubles de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp......... 138
Thèse Sophie Gendrault 2004

III.2.3.1 Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin .. 139
III.2.3.2 Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en extrait
d’écocre de pin............................................................................................................................ 140
III.3 Conclusions .......................................................................................................................... 144
IV. CARACTÉRISATION ET RÔLE DE LA MICROFLORE INDIGÈNE
DE L’ÉCORCE DE PIN........................................................................146
IV.1 Matériel et méthodes............................................................................................................ 146
IV.1.1 Isolement et identification des micro-organismes de l’écorce de pin ............................ 146
IV.1.2 Capacité de la flore indigène à dégrader l’atrazine ....................................................... 147
IV.1.2.1 Biodégradation de l’atrazine en consortium ou en cultures pures ............................ 147
IV.1.2.2 Minéralisation de l’atrazine par la flore indigène de l’écorce de pin.......................... 147
IV.1.3 Influence de la microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp...................... 148
IV.1.3.1 Croissance de Pseudomonas ADP sp. ..................................................................... 148
IV.1.3.2 Biodégradation de l’atrazine...................................................................................... 148
IV.1.3.2.1 Suivi de la dégradation primaire de l’atrazine en extrait aqueux d’écorce de pin
148
IV.1.3.2.2 Suivi de la minéralisation de l’atrazine ............................................................... 149
IV.2 Résultats et discussion ....................................................................................................... 150
IV.2.1 Isolement de la microflore de l’écorce de pin ................................................................ 150
IV.2.2 Capacité de la flore indigène de l’écorce à biodégrader l’atrazine................................ 151
IV.2.2.1 Biodégradation primaire de l’atrazine........................................................................ 151
IV.2.2.2 Minéralisation de l’atrazine........................................................................................ 152
IV.2.3 Influence de la microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp...................... 154
IV.2.3.1 Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en présence de
la microflore de l’écorce de pin ................................................................................................... 154
IV.2.3.2 Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en présence de la microflore
de l’écorce................................................................................................................................... 156
IV.3 Conclusion ............................................................................................................................ 158
V. ETUDE DU TRAITEMENT COMBINÉ...........................................160
V.1 Matériel et méthodes............................................................................................................ 160
V.1.1 Essais en batch.................................................................................................................. 160
V.1.1.1 Protocole expérimental.............................................................................................. 160
V.1.1.2 Distribution de la radioactivité dans les essais en batch........................................... 162
Thèse Sophie Gendrault 2004

V.1.1.2.1 Radioactivité en solution...................................................................................... 163
V.1.1.2.2 Radioactivité associée à l’écorce ........................................................................ 164
V.1.1.3 Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du traitement combiné............................ 165
V.1.2 Essais en colonnes ............................................................................................................ 166
V.1.2.1 Choix des paramètres ............................................................................................... 166
V.1.2.2 Inoculation et caractérisation du biofilm et de l’hydrodynamique des colonnes ....... 167
V.1.2.2.1 Observation au MEB des micro-organismes sur l’écorce de pin ........................ 167
(a) Inoculation des colonnes....................................................................................... 168
(b) Traitement des échantillons pour observation au MEB ........................................ 168
V.1.2.2.2 Influence des micro-organismes sur le comportement hydrodynamique des
colonnes 169
V.1.2.3 Protocole expérimental des essais de biofiltration .................................................... 170
V.2 Résultats et discussion ....................................................................................................... 173
V.2.1 Etude du traitement combiné en batch .............................................................................. 173
V.2.1.1 Minéralisation de l’atrazine en présence d’écorce de pin ......................................... 173
V.2.1.2 Analyses des composés radioactifs en solution en cours d’incubation .................... 176
V.2.1.3 Répartition de la radioactivité résiduelle en fin de traitement ................................... 179
V.2.1.4 Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du traitement .......................................... 181
V.2.1.5 Conclusions ............................................................................................................... 184
V.2.2 Etude en colonne du traitement combiné .......................................................................... 186
V.2.2.1 Etude du développement de Pseudomonas ADP sp. en colonne d’écorce de pin... 186
V.2.2.2 Influence du biofilm sur l’hydrodynamique de la colonne.......................................... 187
V.2.2.3 Traitement combiné en colonne................................................................................ 188
V.2.2.4 Conclusions ............................................................................................................... 194
CONCLUSION GENERALE ET PERPECTIVES…...…………………196
ANNEXES………………………………………………………………..….199
ANNEXE 1 : Spectre IR de l’écorce de pin en poudre – Identification des fonctions de surface…….200
ANNEXE 2 : Observation au MEB d’écorce de pin et de charbon actif…………………………………201
ANNEXE 3 : Caractéristiques des colonnes – Etude hydrodynamique…………………………………203
ANNEXE 4 : Caractéristiques des colonnes – Adsorption de l’atrazine en conditions abiotiques…...204
ANNEXE 5 : Observation au MEB de Pseudomonas ADP sp. en colonne d’écorce de pin………….205
ANNEXXE 6 : Caractéristiques des colonnes – Influence d’un biofilm sur l’hydrodynamique……….211
Thèse Sophie Gendrault 2004

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES………………………………….212
LISTE DES FIGURES……………………………………………………..227
LISTE DES TABLEAUX…………………………………………………..234
Thèse Sophie Gendrault 2004

INTRODUCTION GENERALE
L’utilisation intensive de fertilisants et de produits phytosanitaires principalement par les exploitants
agricoles provoquent de nombreuses pollutions du milieu naturel. L’utilisation des pesticides entraîne
entre autre le passage de molécules indésirables dans les eaux de surface ou les eaux souterraines.
Le transfert de ces pesticides à travers le sol et jusque dans les eaux naturelles peut avoir pour
conséquence le dépassement de la concentration limite légale fixée par les autorités européennes
(0,1 µg.L -1 par pesticide ou 0,5 µg.L -1 de pesticides cumulés) jusqu’à parfois entraîner l’interdiction de
la consommation de l’eau par les habitants résidant aux alentours de la zone contaminée. D’autre
part, les rejets issus de la manipulation de ces substances polluantes (lavage de cuves, rejets de
production…) peuvent engendrer de fortes pollutions locales (de l’ordre de plusieurs dixaines de
mg.L -1 ).
Face à ces problèmes récurrents, de nombreuses recherches ont été mises en œuvre, d’une part afin
de diminuer le pouvoir polluant (toxicité ou rémanence) des pesticides utilisés, et d’autre part afin de
traiter les eaux polluées de façon efficace. Aujourd’hui, de nombreuses techniques existent pour
traiter ces eaux chargées en pesticides. Il s’agit le plus souvent de traitements physiques (adsortion
sur charbon actif (Martin-Gullon et Font, 2001)) ou chimiques (procédés d’oxydation variés (Acero et
al., 2000)). Ces procédés relativement coûteux, ne sont finalement que très peu mis en œuvre et des
alternatives moins onéreuses ont été imaginées. Les traitements biologiques, notamment, répondent
à cette contrainte ; ils sont souvent simples et bon marché et d’une bonne efficacité. Les traitements
biologiques entraînent la consommation par biodégradation ou minéralisation des substances
polluantes par une biomasse capable d’utiliser le pesticide comme source nutritive. Des traitements
combinant « filtration » et bioremédiation dits « procédés de biofiltration » ont également fait leurs
preuves dans ce domaine (Sénat, 2004 ; Cemagref, 2004).
L’utilisation de matériaux naturels tels que des déchets végétaux comme support de biofiltration a été
étudiée avec succès à plusieurs reprises. Ces techniques concernent le plus souvent l’élimination de
métaux lourds contenus dans des eaux naturelles ; la décontamination d’eaux polluées par les
pesticides n’ayant été que très rarement abordée. Parmi les matériaux naturels testés, on peut citer
l’utilisation de bagasse (Peternel et al. 1999), coton (Bailey et al. 1999), fibres de betterave (Rima et
al. 2004) ou encore rafles de maïs (Hawthorne-Costa et al. 1995) pour l’adsorption de métaux comme
le cadmium, le plomb, le cuivre, le mercure, le nickel ou le zinc.
L’écorce de pin, un sous-produit issu de l’industrie du bois, abondamment disponible, notamment au
Portugal et en France, présente une bonne affinité pour les polluants métalliques (Al-Asheh et al.
5
Thèse S.GENDRAULT 2004

2000 ; Vázquez et al. 2002 ; Farm 2003) et certains composés hydrophobes comme les pesticides
organochlorés (Bras et al. 1999 ; Ratola et al. 2003). Certains auteurs relatent également l’utilisation
de l’écorce de pin comme garnissage de biofiltre pour traiter des gaz chargés en méthane (Du Plessis
et al. 2003).
De nombreuses études (en laboratoire) réalisées sur l’écorce de pin ont ainsi été entreprises et de
nouveaux procédés ont été élaborés comme techniques alternatives aux traitements classiques.
Notre étude concerne particulièrement l’élimination de l’atrazine, un herbicide largement utilisé à
travers le monde, notamment dans les cultures de maïs, mais également épandu comme herbicide
total sur les routes, les voies publiques, les voies ferrées ou les terrains non cultivés. Désormais
interdite d’utilisation dans plusieurs pays européens, dont la France depuis juin 2003, la présence de
traces d’atrazine dans les eaux naturelles nécessite encore aujourd’hui la mise en place de
traitements spécifiques.
Cette étude concerne la faisabilité du traitement d’eaux polluées par une technique de biofiltration,
combinant l’adsorption sur un support naturel peu onéreux, l’écorce de pin Pinus pinaster, et la
biodégradation de l’atrazine par une espèce bactérienne déjà décrite dans la littérature pour ses
capacités à minéraliser l’atrazine, Pseudomonas ADP sp. (Mandelbaum et al. 1993). Depuis 1993,
Pseudomonas ADP sp. fait l’objet de nombreuses recherches et est testée pour ses capacités à
dégrader l’atrazine dans différents scénarii. Certains auteurs ont ainsi imaginé traiter les eaux
résiduelles d’usines de fabrication de pesticides (concentrations des eaux à traiter : 25 mg.L -1 ) avant
leur rejet dans les eaux résiduelles municipales (Shapir et al 1998). D’autres ont pensé utiliser
Pseudomonas ADP sp. pour traiter in situ des sols pollués par une technique de bio-augmentation
(Masaphy et Mandelbaum 1997 ; Newcombe et Crowley 1999)), étudiant notamment l’influence de la
présence de matière organique et du vieillissement (Kristensen et al. 2001) sur la biodisponibilité de
l’atrazine dans les sols vis à vis de Pseudomonas ADP sp. Des études relatant le traitement de
sédiments ou d’aquifères pollués à l’atrazine ont également été mises en œuvre utilisant
Pseudomonas ADP sp. (Clausen et al. 2002 ; Kristensen et al. 2001).
L’intérêt d’un traitement combiné est double:
- D’une part il permet de concentrer les polluants traces sur un support d’adsorption. Un
composé concentré (dans les limites de toxicité) sera plus facilement consommé par les
micro-organismes que lorsqu’il est présent dans un milieu sous forme de traces.
- D’autre part, l’utilisation d’un support solide permet également de concentrer une biomasse
fixée à sa surface et d’obtenir des densités cellulaires par unité de volume de réacteur
supérieures aux densités cellulaires obtenues en milieu dispersé (réacteurs à biomasse libre).
Ainsi, les vitesses de dégradation du polluant seront d’autant plus grandes que la
concentration en biomasse sera grande. La biofiltration est un procédé largement connu
aujourd’hui pour son efficacité et relativement répandu (Exemple de la société canadienne
Technologies St Laurent, www.dsp-psd.pwgsc.gc.ca, 2004).
6
Thèse S.GENDRAULT 2004

Le traitement étudié a été mis en œuvre afin de répondre aux deux problématiques suivantes :
1- Le traitement d’eaux naturelles polluées par de faibles concentrations en atrazine (de l’ordre
du µg.L -1 )
2- Le traitement d’eaux polluées à plus fortes concentrations (quelques centaines de µg.L -1 ,
voire quelques mg.L -1 ), correspondant à une pollution ponctuelle locale due, par exemple, à
des lavages de cuves, ou concernant des effluents issus d’usines de production de
pesticides. Dans ce cas, le bio-procédé serait mis en place comme pré-traitement
(éventuellement sur site) avant rejet des eaux dans le réseau d’eaux résiduelles municipales
ou avant de subir un traitement spécifique.
Dans le premier cas (eau polluée par des traces de pesticide), l’utilisation du procédé combiné
(adsorption et biodégradation) permettrait de concentrer l’atrazine sur le support d’écorce de pin pour
faciliter et stimuler sa biodégradation.
Dans le second cas, l’application du traitement combiné à des eaux plus fortement polluées en
atrazine permettrait par rapport à un traitement biologique simple, d’obtenir une densité cellulaire plus
importante, comparé à un réacteur en milieu dispersé, et par conséquent d’obtenir des vitesses de
dégradation plus importantes.
Dans les deux cas, l’intervention de bactéries dans le procédé a pour but d’éliminer totalement le
polluant par minéralisation, débarrassant le support d’adsorption de sa charge polluante et permettant
dans le meilleur des cas de régénérer le support d’adsorption par libération des sites d’adsorption.
Dans le cas d’un procédé d’adsorption simple, le support d’adsorption lorsqu’il est saturé, est éliminé
par incinération ou mise en décharge avec sa charge polluante, ou régénéré par d’autres techniques
complémentaires.
L’étude s’est déroulée en trois étapes principales :
Dans un premier temps une étude concernant le support d’adsorption d’écorce de pin a été
entreprise afin de déterminer les principales caractéristiques physico-chimique de ce
matériau. Puis l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce a été étudiée en conditions abiotiques en
milieu dispersé et en colonnes.
L’approche biologique a été l’objet de la deuxième phase de cette étude. Elle a permis de
mettre en évidence les capacités de la souche bactérienne Pseudomonas ADP sp. choisie
pour ce traitement, à minéraliser l’atrazine dans différentes conditions expérimentales et
notamment dans les conditions imposées par la présence de l’écorce de pin. L’influence de la
microflore indigène de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp. a également fait l’objet
d’une étude particulière.
Enfin, le traitement combinant adsorption et biodégradation a été testé en milieu dispersé et
en colonne, faisant l’objet de la troisième partie de cette étude.
7
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
8
Thèse Sophie Gendrault 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
I. Les pesticides : réglementation, utilisation et devenir
dans l’environnement
La pollution des eaux de surface et des eaux souterraines par les fertilisants (engrais
chimiques, effluents d’élevages, effluents agroalimentaires et boues) ou les produits de traitement des
cultures (produits phytosanitaires) est principalement due à l’exploitation des sols pour l’agriculture.
Ces pollutions entraînent la dégradation des milieux aquatiques et ont conduit à plusieurs reprises à
l’interdiction de l’utilisation de l’eau destinée à la consommation humaine.
Pour maîtriser les pollutions d’origine agricole, les pouvoirs publiques s’appuient sur la combinaison
de différents outils : réglementaires, économiques ou basés sur le volontariat.
I.1 Aspects réglementaires
I.1.1
Normes européennes, françaises et portugaises sur les pesticides – cas de l’atrazine
La directive européenne 98/83/CE du 3 novembre 1998, relative à la qualité des eaux destinées à la
consommation humaine, et sa transposition en droit français, à travers le décret 2001 – 1220 du 20
décembre 2001, et en droit portugais à travers l’annexe IV de la loi D.L. 236/98, du 1 er août 1998,
fixent à 0,1 µg.L -1 la concentration maximale admissible pour chaque pesticide, avec une limite de
0,5 µg.L -1 pour la concentration totale en pesticides.
La protection des milieux aquatiques vis à vis des produits phytosanitaires s’organise et s’appuie sur
des lois telles qu’ en France, « la loi sur l’Eau » du 2 janvier 1992, qui oblige la création d’un périmètre
de protection autour des sites de captage d’eau brute destinée à la consommation. Cette mesure
préventive tend à limiter très nettement la présence de pesticides dans les eaux.
De plus, en France, depuis le 1 er janvier 2000, le principe de pollueur-payeur est appliqué aux
pollutions diffuses d’origine agricole par la création d’une « Pollutaxe » sur les produits
phytosanitaires, dans le cadre de la Taxe générale sur les activités polluantes. Cette taxe a pour but
d’inciter les industriels à développer des substances moins toxiques pour l’homme et l’environnement,
et inciter les agriculteurs à choisir les produits les moins nocifs.
Ces dernières années, les alertes à la pollution à l’atrazine se sont multipliées en France, dans de
nombreuses communes de l’Ouest, du Sud-Ouest et dans 4 départements bretons, conduisant
localement les maires à interdire la consommation d’eau pendant l’été 2000 et le mois d’avril 2001
(source AFP, 2001).
Thèse Sophie Gendrault 2004
9

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
En 2001, Jean Glavany, à l’époque ministre de l’Agriculture, saisissait la commission d’étude sur la
toxicité pour évaluer la pollution des eaux par les triazines. Le ministère soulignait alors la présence
de plus en plus fréquente d’atrazine dans les eaux de surface mais également dans les eaux
souterraines. Les bilans établis par l’Institut Français de l’Environnement (IFEN) sont inquiétants :
En 2003, l’Institut Français de l’Environnement (IFEN) a publié un rapport alarmant sur la qualité des
eaux en France. 90% des points surveillés en rivières et 58% des points en eaux souterraines
contiennent des pesticides (Noualhat, 2003). 5% de la population aurait été alimentée au robinet en
2001 par une eau ayant dépassée au moins une fois la limite légale de 0,1 µg.L -1 . Le premier rapport
de l’IFEN date de 1998. Déjà alarmant, il avait eu pour conséquence, le lancement en 2000 d’un plan
d’action pour la réduction des pollutions par les produits phytosanitaires, le Plan Phyto (voir aussi
II.1.2). Le Plan Phyto a ainsi entraîné le retrait total de certaines substances du marché. C’est le cas
de l’atrazine, herbicide du maïs retrouvé sur 5960 analyses, qui en septembre 2002, fut retiré du
marché et interdit à l’utilisation en juin 2003, malgré les résultats optimistes de la commission des
Toxiques du Ministère de l’Agriculture et de la Pêche, concluant le 3 mai 2003, à l’absence de danger
pour la santé humaine.
Au Portugal, en réponse aux nouvelles directives européennes (transposées en droit national à
travers le Decreto-lei 74/90 du 7 mars et revu par le décret 236/98 du 1 er août), une large étude est
engagée dans le cadre du programme portugais de protection de l’eau. Elle est menée par la
Direcção Geral dos Recursos e Aproveitamentos Hidráulicos (DGRAH) à travers le Réseau National
de la Qualité de l’Eau (Rede Nacional de Qualidade da Água (RENQA). Cette étude menée entre
1983 et 1999 montre la présence de nombreux pesticides et en particulier de l’atrazine aussi bien
dans les rivières (concentration maximale de 0,63 µg.L -1 dans le Rio Tejo) que dans les eaux
souterraines (concentration maximale de 29 µg.L -1 dans la région Ribatejo)(Cerejeira et al., 2003).
I.1.2
Programmes de maîtrise et de réduction des pollutions d’origine agricole
En France, le gouvernement mène une politique globale d’intervention, comprenant, outre les aspects
réglementaires et fiscaux, un programme national de réduction des pollutions par les produits
phytosanitaires, lancé en concertation avec l’ensemble des partenaires, tant professionnels
qu’associatifs. Le ministère chargé de l’environnement porte son effort sur une meilleure
connaissance de l’impact des pesticides sur les milieux aquatiques ainsi que sur le développement de
solutions préventives et curatives les plus adaptées.
A partir des études menées par l’Institut Français de l’Environnement (IFEN) et des études
toxicologiques, l’impact environnemental des résidus de pesticides est évalué et les autorisations de
mise sur le marché de certains produits sont remis en cause.
Des solutions préventives et curatives ont pour objectif d’améliorer les pratiques des utilisateurs de
produits agricoles :
Thèse Sophie Gendrault 2004
10

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
• En 1993 les ministères chargés de l’agriculture et l’environnement ont élaboré en accord avec
les organisations agricoles, un programme de maîtrise des pollutions d’origine agricole :
le PMPOA. (Ministère de l’écologie et du développement durable, 2003)
Les objectifs sont les suivants :
- protéger les milieux aquatiques
- conserver une agriculture dynamique
Les principales pollutions des eaux d’origine agricole sont visées et tous les systèmes de
production concernés (élevages et cultures).
Les volets de ce programme sont :
- les pollutions par les produits phytosanitaires,
- les pollutions par les nitrates.
• En août 2000, un programme de réduction des pollutions par les produits phytosanitaires (le
Plan Phyto) prévoit sur le plan national la mise en place d’une filière de récupération des
emballages de produits phytosanitaires, un renforcement des contrôles de l’utilisation de ces
produits et le développement de techniques de protection des cultures alternatives. Cinq
millions d’euros sont injectés chaque année par le ministère de l’Environnement dans ce
programme, surtout chargé d’inciter les changements de pratiques parmi les utilisateurs
(agriculteurs, particuliers ou services techniques). Parmi les mesures prises, la publication
d’un livret « Pesticides, Mode d’emploi » par le ministère de l’agriculture et de la pêche,
permet d’informer et d’orienter les utilisateurs. La lutte contre la pollution de l’eau par les
produits phytosanitaires se fait donc à deux niveaux :
- La prévention, qui vise à limiter l’émission abusive de ces micro-polluants
notamment en informant les utilisateurs sur les bonnes démarches à suivre.
- L’élimination de la pollution au niveau des unités de traitement de l’eau ; le
traitement de nappes phréatiques fortement polluées est également évoqué.
Un programme équivalent au Portugal, Programme de Protection intégrée ou de « Bonne pratique
phytosanitaire » (« Boa Prática Fitossanitaria »), s’organise depuis 1994, visant à aider les
agriculteurs à mettre en œuvre des pratiques agricoles plus respectueuses vis à vis de l’homme et de
l’environnement. Ce programme porte essentiellement sur l’utilisation rationnelle et correcte des
pesticides ; il tend à responsabiliser les utilisateurs de substances phytosanitaires.
La mise en œuvre de politiques de réduction de l’utilisation des pesticides permettra de limiter la
dégradation, non seulement de la qualité de l’eau, mais aussi, et plus généralement, de
l’environnement : la biodégradabilité lente de certains produits utilisés il y a une dizaine d’année, fait
Thèse Sophie Gendrault 2004
11

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
que l’on trouve encore dans l’environnement, des traces de DDT, pourtant interdit en France depuis
1972.
I.2 Caractéristiques de l’atrazine
I.2.1
Généralités
L’atrazine (2-chloro-4-ethylamino-6isopropylamino-1,3,5triazine) est un herbicide sélectif de la famille
des s-triazines, largement utilisé depuis la fin des années 50 par les agriculteurs pour lutter contre les
mauvaises herbes infestant les cultures de céréales, d’asperges, de cannes à sucre, d’ananas ainsi
que les vignes. L’atrazine est, en outre, épandue comme herbicide total sur les routes, les voies
publiques, les voies ferrées et les terrains non cultivés.
L’atrazine a été introduit sur le marché en 1962 par la société J.R.Geigy (actuellement Novartis Crop
Protection AG). C’est un herbicide de Classe III (légèrement toxique) (selon la classification de
l’OMS), classé comme pesticide restreint d’utilisation (RUP) dû à son fort potentiel de contamination
des eaux souterraines (les RUP ne pouvant être utilisés que par des applicateurs certifiés).
L’atrazine est une base faible (pKa de l’acide conjugué 1,64), peu soluble dans l’eau (30 mg.L -1 à
20°C) avec un coefficient de partage Kow de 398. Les caractéristiques physico-chimiques de
l’atrazine sont présentées au § II.1.1.1(1) du chapitre « Etude Expérimentale ».
Elle fut commercialisée sous une centaine de noms différents : Aatrex (USA - Novartis), Primextra
(Europe – Novartis), Mebazine (Rhône-Poulenc), Vectal (AgrEvo), Gesaprim (Europe – Novartis),
Atrazol (Sipcam),…
I.2.2
Mode d’utilisation et mode d’action de l’atrazine
La France utilisait ces dernières années environ 100000 tones de pesticide par an, ce qui la place au
deuxième rang des utilisateurs mondiaux, derrière les Etats Unis. En 2001 l’atrazine était autorisée en
France à une dose maximale de 600 à 650 g de substance active par hectare.
On la trouve sous différentes formes : poudre mouillable, en suspension, en granulés, en solution
avec des teneurs variables en matière active selon les formulations.
L’atrazine est principalement employée comme herbicide systémique, et le plus souvent, utilisée au
stade de pré-levée, c’est à dire peu après le semis, et avant le développement des adventices. Le
désherbage (lutte contre la flore adventice) d’une culture est possible grâce à la sélectivité de cette
culture vis à vis des molécules herbicides. Ainsi, certaines plantes comme le maïs sont capables de
métaboliser les molécules d’atrazine.
12
Thèse Sophie Gendrault 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
Parmi les mécanismes de métabolisation (Tissut et al., 1992), on peut retenir :
La formation de benzoxadine dans la sève au niveau racinaire.
La conjugaison au niveau des parties aériennes avec le glutathion pour donner un dérivé
inactif.
La N-déalkylation enzymatique.
Chez le maïs, la résistance à l’atrazine est attribuée à une rapide détoxification, par conjugaison au
glutathion, sous l’effet de transferases.
Dans la plante cible, l’atrazine inhibe rapidement le transport d’électrons lors de la photosynthèse,
stoppant totalement la croissance de celle-ci.
Le transfert de l’herbicide vers la plante se fait par l’eau du sol ; pour un traitement efficace, une
concentration minimale de 10 µg.L -1 dans l’eau du sol est requise, et doit être maintenue pendant les
deux premiers mois qui suivent le traitement (Tissut & Severin, 1984).
Il peut arriver que des plantes adventices parviennent à développer des résistances aux herbicides
par mutation génique. Il est alors nécessaire de changer de type d’herbicide.
Désormais totalement interdite d’utilisation dans plusieurs pays européens, dont la France, l’Italie, les
pays Bas ou l’Allemagne, l’atrazine n’a pas vu son autorisation renouvelée par l’Union européenne
(Décision de la commission 2004/248/CE) et les agriculteurs sont à l’affût de solutions alternatives.
« Aucune des nouvelles matières actives homologuées n'est aussi polyvalente que l'atrazine, mais de
nombreuses formules permettent, dans des situations données, de diminuer les doses d'atrazine,
voire de les supprimer, lorsque cela sera nécessaire », constate l'AGPM Technique (L’Association
Générale des Producteurs de Maïs).
En effet, la présence généralisée dans l’eau de traces d’atrazine et de ses produits dérivés
nécessitent, encore aujourd’hui, la mise en place de traitement spécifiques. D’autre part, l’observation
d’une efficacité de moins en moins avérée de l’atrazine, liée entre autre à l’apparition de phénomènes
de résistance de certaines mauvaises herbe explique l’interdiction de celle-ci sur le marché européen.
Le Portugal comme l’Espagne, le Royaume Uni ou l’Irlande bénéficient exceptionnellement d’une
autorisation pour un usage spécifique de produits phytosanitaires contenant de l’atrazine jusqu’au 30
juin 2007 (Décision de la Commission du 10 mars 2004 concernant la non-inscritpion de l’atrazine à
l’annexe I de la Directive 91/414/CEE du Conseil et le retrait des autorisations accordées aux produits
phytopharmaceutiques contenant cette substance active ; 2004/248/CE)
Thèse Sophie Gendrault 2004
13

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
I.2.3
Aspects Toxicologiques
C’est le manque de sélectivité des pesticides vis-à-vis de leur cible qui provoque la plupart des effets
nocifs pour l’environnement. Les animaux absorbent les pesticides via la nourriture ou l’eau, via l’air
respiré ou au travers de leur peau. Ayant franchi diverses barrières naturelles, le toxique peut
perturber certaines réactions métaboliques. On utilise habituellement pour estimer la toxicité d’une
substance chimique, la dose (ou concentration) qui provoque un effet particulier chez la moitié de la
population soumise au toxique (DE50 ou CE50). Si cet effet est la mort, on parle de dose (ou
concentration) létale (DL50 ou CL50). La dose maximale sans effet (DMSE) est la dose
immédiatement inférieure à celle qui provoque le moindre effet dans la même épreuve expérimentale
(Severn et Ballard, 1990).
Si le coefficient de partage octanol-eau d’un composé est élevé et la vitesse de dégradation faible, la
substance s’accumulera à des concentrations croissantes dans les organismes se succédant le long
de la chaîne trophique. C’est ce qu’on appelle la bioaccumulation (biomagnification, Cooper, 1991).
Pour les substances liposolubles comme certains pesticides, la bioaccumulation dépend donc du
coefficient de partage octanol-eau K ow (K ow = 398 pour l’atrazine).
La toxicité aiguë de l’atrazine chez les mammifères est très faible. En raison de sa faible solubilité, il
ne se produit pas de résorption cutanée. Elle est très facilement résorbée après injection orale et plus
de 50% des quantités ingérées sont éliminées par l’urine en l’espace de 24h. Dans les expériences
sur l’animal, aucun effet mutagène ou tératogène n’a été observé.
Pour l’atrazine comme pour d’autres pesticides, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a publié
en 1994 une liste qui donne les valeurs guides pour chacun des pesticides. La consommation
quotidienne pendant toute une vie d’une eau potable contenant cette concentration guide, serait sans
conséquence pour la santé humaine. Ainsi, l’OMS annonce une valeur guide de 2 µg.L -1 pour
l’atrazine dans les eaux de boisson.
A titre indicatif, le Tableau 1 donne quelques valeurs de DL50 de l’atrazine pour différents types
d’animaux vis à vis de l’atrazine.
Tableau 1 : Toxicité de l’atrazine ; DL50 par voie orale sur quelques animaux (Trotter et al., 1990)
Animal Rats Souris Lapins Hamsters Canards Oiseaux
DL 50 (mg/kg) 672-3000 850-1750 750 1000 >2000 >10000
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ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
I.3 Dispersion des herbicides dans l’environnement
I.3.1
Introduction
Dans les années 40, les premiers pesticides sont apparus sur le marché, avec des résultats très
positifs quant à l’augmentation des rendements agricoles. Vingt ans plus tard, les premières
accusations d’atteinte à la santé publique et à l’environnement commençaient à se faire entendre
(Carson, 1962).
On estime aujourd’hui que 2,5 millions de tonnes de pesticides sont appliqués chaque année sur les
cultures de la planète. La part qui entre en contact avec les organismes cibles – ou qui est intergrée –
est minime. La plupart des chercheurs l’évaluent à moins de 0,3%, ce qui veut dire que 99,7% des
substances déversées s’en vont « ailleurs » (Pimentel, 1995).
Depuis la fin des années 70, l’agriculture intégrée à permis de réduire les intrants comme les engrais
ou les produits phytosanitaires issus de la chimie (Holland, 1994). Aujourd’hui, on est en mesure
d’informer l’agriculteur sur l’impact environnemental d’un traitement. L’impact d’un pesticide dépend
du degré d’exposition, résultant de sa dispersion et de sa concentration dans l’environnement, et de
ses caractéristiques toxicologiques (Serven et Ballard 1990 ; Emans et al. 1992).
Depuis une dizaine d’années, les caractéristiques chimiques des pesticides ont radicalement évolué ;
de produits extrêmement peu solubles dans l’eau, fortement adsorbés (très hydrophobes, coefficient
de partage élevé), et non mobiles, nous sommes passés à une génération de pesticides plus solubles
et peu mobilisables (plus hydrophiles, coefficient de partage plus faible) et par conséquent plus
mobiles (Carsel & Smith ; 1987). Cette évolution a eu lieu suite à une prise de conscience des
problèmes environnementaux (bioaccumulation et magnification) causés par la présence de ces
produits phytosanitaires et de ce fait à l’apparition d’organismes résistants (insectes, microorganismes
ou plantes) vis à vis des pesticides chlorés.
Les propriétés des pesticides ainsi que la quantité appliquée déterminent leur devenir après
application au champ. La volatilité, l’hydrosolubilité et les phénomènes d’adsorption vont déterminer la
distribution relative du pesticide entre la phase vapeur (volatilisation et évapotranspiration), la phase
liquide (dissolution) et les surfaces solides (fixation sur particules de sol, racines, microorganismes…).
Ainsi la persistance d’un pesticide dans un sol va dépendre directement de ses
propriétés physico-chimiques et de celles du sol. Un composé persistant va être difficilement
hydrolysable, faiblement biodégradable, avec une constante de volatilisation (ou constante de Henry)
faible et un fort coefficient de partage. Il va ainsi limiter la contamination des eaux souterraines ou de
surface (Carsel & Smith ; 1987) mais augmenter les risques d’adaptation d’organismes résistants et
de bio-accumulation.
Thèse Sophie Gendrault 2004
15

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
I.3.2
Devenir dans le sol
Lors de l’application d’un produit phytosanitaire, la substance active va se répartir, dans des
proportions variant avec le stade de la culture, la formulation du produit, la cible, la technique
d’application (liquide pulvérisé, incorporation au sol, dépôt de granulés…)et les conditions
météorologiques, entre le sol, le feuillage de la plante ou les résidus de culture, et les pertes dues à la
« dérive » (entraînement par le vent).
Dès qu’ils atteignent le sol, les pesticides sont soit dégradés (chimiquement ou biologiquement), soit
dispersés, soit retenus. Les matières actives peuvent se volatiliser, ruisseler ou être lessivées et
atteindre les eaux de surfaces environnantes ou les eaux souterraines. Elles peuvent également être
adsorbées par les particules du sol, les plantes ou des organismes du sol.
Les processus suivants déterminent les différents comportements des pesticides dans les sols (Figure
1) :
• Dégradation par les micro-organismes
• Dégradation chimique (hydrolyse, oxydation, photodégradation…)
• Rétention par des composants organiques et minéraux du sol
• Adsorption par les racines des plantes
• Volatilisation
• Effet de dilution par les mouvements de l’eau
• Adsorption par certains végétaux
UV
Volatilisation
Photodégradation
Adsorption
Rétention
C 8 H 14
C H ON C ClN 5
H ON ...
5 → C 8 H 815 ON 15 5 → 5 C 6 H 116 ON 11 5 → … 5
Dégradation
biologique
Dégradation
chimique
Dilution
Ruissellement ou lixiviation
Figure 1 : Comportement des pesticides dans les sols
16
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ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
Le devenir des pesticides dans les sols est directement lié à la notion de persistance. La persistance
est définie par le temps de résidence d’un composé dans un compartiment défini (Greenhalgh, 1986).
La persistance d’un pesticide dépend des caractéristiques des cultures (morphologie, phase de
croissance au moment du traitement, taux de croissance, caractéristiques des cuticules), des
propriétés du pesticide (constante de Henry, solubilité, potentialité à subir des transformations
chimiques, physiques ou biologiques), des conditions environnementales (intensité des pluies, durée
et fréquence ; vitesse du vent ; humidité ; température ; intensité de la lumière ; nébulosité) et des
conditions d’applications (Himel et al., 1990).
Sirons et al. (1982) expriment la persistance de certains pesticides dans les plantes par la relation
suivante :
C= k(a * b * log t)
où :
- k : taux de disparition
- t : le temps après application
- a et b des coefficients.
Pour un herbicide, on peut en réalité distinguer trois formes de persistance (Heydel, 1998) :
- La persistance agronomique : temps durant lequel un effet phytotoxique est
observable sur les plantes sensibles.
- La persistance biologique : temps au cours duquel un effet est observable sur les
organismes vivants du sol.
- La persistance chimique : temps qui s’écoule entre le traitement et celui où
l’herbicide ne peut plus être détecté dans le sol, sans préjugé des voies de
disparition.
I.3.2.1
Rétention des pesticides dans le sol
La rétention englobe les processus d’adsorption sur le sol lui-même, sur les micro-organismes du sol
ainsi que sur les plantes. La rétention contrôle, et est contrôlée par des procédés de transformation
chimique ou biologique ; elle influence les transports du pesticide vers l’atmosphère, les eaux de
surface ou les eaux souterraines (Himel et al., 1990).
Elle est l’un des principaux facteurs responsables de l’efficacité d’un pesticide et a été largement
étudiée au cours de ces trente dernières années (Hamaker & Thompson, 1972 ; Yamane et Green ,
1972 ; Weber et al., 1974 ; Calvet, 1989).
Thèse Sophie Gendrault 2004
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ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
L’adsorption correspond à la rétention d’un composé à l’interface sol-eau ou sol-air (Calvet, 1989).
L’adsorption/désorption est un processus dynamique au cours duquel les molécules sont
continuellement en équilibre entre la phase solide et la phase liquide (ou gazeuse).
Le phénomène d’adsorption est directement lié aux caractéristiques de la molécule et à celles de
l’adsorbant. Différentes interactions ou liaisons peuvent s’établir entre une molécule organique et un
support d’adsorption ; il peut s’agir de forces de van der Waals, de liaisons hydrogène, d’interactions
dipôle-dipôle, de liaisons ioniques, liaisons covalentes ou d’effet de protonation (Himel et al., 1990).
On peut également rencontrer des interactions hydrophobes (Chiou et al., 1979).
I.3.2.1.1
Facteurs de l’adsorption
(a) Propriétés des molécules de pesticide
Les propriétés moléculaires du pesticide jouent un rôle important dans les phénomènes
d’adsorption. Quatre propriétés sont déterminantes (Calvet et al., 1980) :
• le structure électronique de la molécule
• l’aptitude à être ionisée
• le volume moléculaire
• la solvatation des molécules par l’eau ou les solvants organiques
Dans le cas de structures covalentes comme l’atrazine, il faut tenir compte de la répartition et de la
mobilité des charges (polarité). L’atrazine possède un moment dipolaire de 4,63.10 -18 ues. (plus polaire
que l’eau (µ=1,85.10 -18 ues))
L’atrazine est une base faible (pKa de l’acide conjugué 1,68) (Calvet et al., 1980). Dans un sol
agricole (pH 4-8,5) l’atrazine n’est pas ionisée, ce qui exclut les phénomènes d’adsorption ionique. La
solubilité des bases faibles augmente quand l’acidité du milieu s’accroît ; dans le cas des triazines,
Yamane et Green (1972) ont décrit cet effet par une relation simple :
S= Si [1 + 10 (pKa – pH) ]
où Si est la solubilité de la molécule non ionisée (30 mg.L -1 à 20°C pour l’atrazine).
(b) Propriétés des matériaux adsorbants du sol
Les propriétés des matériaux adsorbants sont complémentaires des propriétés moléculaires et
contribuent en partie à déterminer la nature des liaisons entre les molécules de pesticides et la
surface de l’adsorbant.
Thèse Sophie Gendrault 2004
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ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
L’adsorption va dépendre de la composition du sol et de sa teneur en minéraux (argile, oxydes,
hydroxydes et allophanes (aluminosilicates hydratés)) et de sa composition en constituants
organiques. Elle dépendra également des paramètres physicochimiques du sol en question.
Les argiles présentent des propriétés d’échange d’ions importantes, dues à la présence de charges
positives à leur surface. Des travaux ont montré que les propriétés d’adsorption des argiles
provenaient très souvent de la présence d’hydroxydes amorphes sur ces surfaces (Calvet et al.,
1980). Tercé et Calvet (1978) ont déterminé pour l’atrazine, les constantes de l’isotherme d’adsorption
de Freundlich sur une montmorillonite (n f = 0,78 et Kf = 65) et une illite (n f = 0,35 et Kf = 7,2).
Tandis que la présence d’oxydes et d’hydroxydes cristallisés dans les sols joue un rôle minime
dans les phénomènes d’adsorption des bases faibles comme l’atrazine (Tercé et Calvet, 1975), les
hydroxydes libres présentent quant à eux une grande capacité d’adsorption en raison de leur aire de
surface élevée (400-800 m 2 /g) et de la présence de nombreux groupes hydroxyles (sites potentiel de
liaison hydrogène) (Calvet et al., 1980).
Les allophanes (aluminosilicates hydratés) possèdent une aire de surface élevée (environ 500 m 2 /g)
et des charges positives ou négatives leur confèrent des propriétés d’échange d’ions.
La teneur en matière organique (MO) est un indice essentiel dans l’adsorption des pesticides dans le
sol. De manière générale, l’adsorption des pesticides est significativement plus importante pour les
sols dont la teneur en carbone organique est la plus forte (Calvet et al., 1980). Celle-ci est
essentiellement responsable de la rétention des matières actives non ioniques.
Dans le cas d’un sol, il est parfois difficile d’établir une relation étroite entre les coefficients K d et le
teneur en MO. La constante normalisée K oc (coefficient de distribution carbone organique/eau, en
dm 3 .kg -1 ) est définie par la relation suivante
K = oc
K d
.100
%CO
où K d (le coefficient de partage sol-eau) exprime le degré d’adsorption du pesticide dans le sol et
%CO est le pourcentage de carbone organique du sol considéré (Leonard 1990) ; K oc rend compte de
la mobilité du pesticide.
Par rapport au K d , le K oc ainsi déterminé, permet une meilleure appréciation pour différents types de
sol. Si la matière organique est le principal adsorbant qui intervient dans les sols, le K oc devient un
indice caractéristique de la molécule de pesticide pour ce type de sol.
Les différentes études d’adsorption de l’atrazine, ont montré une grande variabilité du K oc en fonction
des sols, pouvant aller d’environ 100 l/kg (Gustafson, 1989 ; Wauchope et al. (1992)) à 1680 l/kg pour
Roy et Krapac (1994). La constante K oc varie également en fonction de la profondeur du sol. De la
19
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ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
même façon les études de Barriuso et al. (1994) montrent qu’il existe une variation du coefficient
d’adsorption K d de l’atrazine en fonction de la profondeur du sol.
(c) Influence des paramètres physicochimiques du sol
D’une façon générale, la protonation d’un composé, imposée par ou contrôlant le pH environnant, va
favoriser son adsorption dans un sol (Wang et al., 1991 ; Delage, 1995 ; Clay et al., 1988).
L’adsorption des formes protonées se fait au niveau des sites chargés négativement (argiles ou MO
tels que les substances humiques). La Figure 2 montre l’évolution de la capacité d’adsorption de
l’atrazine en présence d’acides humique (0,4 g.L -1 ) en fonction du pH.
Binding capac ity of At. (x 10 3 M/ g
Atrazine adsorbée (x 10 3 M.g -1 AH)
HA)
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0 2 4 6 8
pH
Figure 2 : Evolution de la capacité d’adsorption de l’atrazine sur les acides humiques (AH) (0,4 g/L) en
fonction du pH, d’après Wang et al. (1991)
Weber (1966) en étudiant l’adsorption des triazines par la Montmorillonite, a montré que la rétention
était maximale pour des pH voisins du pKa des molécules en question.
Pour les triazines, qui sont des bases faibles, la protonation a lieu a des pH très acides (pKa = 1,6
pour l’acide conjugué de l’atrazine). Les valeurs de pH rencontrées pour les sols (4,5 à 8,5 (Calvet et
al. 1980)) sont en général supérieures à celle du pKa des triazines ; ainsi, le pourcentage de la forme
protonée pour l’atrazine est très faible. On peut donc penser que les variations de pH n’auront qu’une
faible influence sur l’adsorption de l’atrazine dans les sols.
La solubilité d’un composé est fonction de la température du milieu, de la pression de vapeur mais
aussi de l’excitation moléculaire. La solubilité augmente souvent avec la température, et l’adsorption
chimique étant un phénomène exothermique, elle doit théoriquement diminuer lorsque la température
augmente. Ainsi Schiavon (1980) et Montiel (1990) confirment cette hypothèse. Balayannis (1988)
constate que l’augmentation de température de 3°C à 27°C, entraîne une diminution des coefficients
d’adsorption de l’atrazine (respectivement 26,2 et 12,4 g.kg -1 ) dans un sol limoneux. Cependant,
20
Thèse Sophie Gendrault 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
Calvet et al. (1980) ont observé après de nombreuses études, que l’élévation de température
conduisait à une promotion de l’adsorption sur le sol en présence de matière organique (acides
humiques) et à une diminution ou à un effet nul dans le cas d’une adsorption sur les argiles. Avant
eux, Dunigan et Mc Intosh (1971) avaient également constaté que l’affinité des acides humiques pour
l’atrazine augmentait en même temps que la température. Ceci peut s’expliquer par le fait que
l’agitation moléculaire augmentant avec la température, la probabilité de choc est multipliée et
l’adsorption favorisée.
La force ionique peut influencer l’adsorption de certains pesticides sur les sols. Calvet (1980) et
Schiavon (1980) mentionnent ainsi que l’adsorption des triazines augmente en même temps que la
force ionique.
Une variation de l’état d’hydratation peut modifier l’agrégation de l’adsorbant et augmenter ou
diminuer les surfaces accessibles aux molécules de soluté (Calvet et al., 1980). Ainsi, Calvet et Tercé
(1975) ont observé que la quantité d’atrazine adsorbée par la Montmorillonite calcique augmente
quand la teneur en eau diminue. Cette augmentation est attribuée à l’effet de l’acidité de la surface de
l’argile qui est moins neutralisée dans les échantillons à faibles teneurs en eau.
I.3.2.1.2
Formation de résidus liés
On appelle résidus liés (ou « non extractibles ») les résidus adsorbés de façon irréversible par les
constituants du sol et qui ne peuvent par conséquent pas être extraits par les méthodes classiques
d’extraction (solvants organiques ou solutions aqueuses, extractions à chaud, agitation…). Ces
résidus comprennent aussi bien les molécules mères que leurs produits de dégradation. D’une
manière générale, la quantité de résidus liés augmente avec le temps de contact entre la molécule
active et le milieu adsorbant, diminuant ainsi la biodisponibilité de ces molécules vis à vis des microorganismes
et par là même, la dégradation biologique du pesticide.
La formation de résidus non extractibles (RNE) peut également être la conséquence d’une
incorporation biologique : rétention du pesticide par les plantes ou les micro-organismes du sol (Calvet
et Barriuso, 1994).
Les taux de RNE pour l’atrazine varient entre 23 et 47% de la dose appliquée sur un sol limoneux ou
argileux en conditions naturelles, avec un maximum de RNE observé après 180 jours d’incubation
(Schiavon et al. 1990).
Les études de Stolpe et Schea (1995) montent qu’un sol traité à l’atrazine et incubé à 22°C présente
après 120 jours 46% de résidus liés dans les 15 cm supérieurs du sol, et seulement 3% de RNE au
niveau des couches plus profondes (150 à 240 cm).
Thèse Sophie Gendrault 2004
21

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
I.3.2.2
Dégradation des pesticides dans le sol
Les pertes de pesticides dans le sol, du fait de la présence de micro-organismes ou de réactions
chimiques, sont confondues sous le vocable de dégradation.
La dégradation est un processus essentiel entraînant la disparition du produit par sa transformation et
influant sur la persistance et les possibilités de contamination. Ce processus peut entraîner la
dégradation totale du pesticide ou simplement former des produits de dégradation intermédiaires.
La cinétique de dégradation est souvent bien décrite par une loi exponentielle, traduisant le fait que la
quantité dégradée par unité de temps est proportionnelle à la quantité restante (cinétique de 1 er
ordre) ; cette hypothèse est admise quel que soit le processus de dégradation, biotique ou abiotique.
La vitesse de dégradation est indiquée par le temps de demi-vie de la substance (DT50 ou t 1/2 ) (van
der Werf, 1997). Le temps de demi-vie rend compte de la persistance d’un pesticide dans le sol et
exprime le temps au bout duquel 50% du produit appliqué au le sol a été dégradé. Elle varie en
fonction de la substance active elle-même (propriété chimique, persistance, solubilité…), du sol dans
lequel elle se trouve (paramètres physico-chimiques, composition,…) et des interactions entre eux ; la
vitesse de dégradation influe donc sur la persistance et la disponibilité du produit en question dans le
sol.
Le processus de dégradation d’un pesticide dans un sol, qu’il soit chimique ou biologique est
indissociable des notions de persistance et de disponibilité (ou biodisponibilité).
La constante de vitesse de dégradation k, et le temps de demi-vie sont les deux paramètres qui
permettent de caractériser une cinétique de dégradation.
Dans le cas de l’atrazine, l’augmentation du pH du sol entraîne une augmentation du temps de demivie
(Walker et al., 1983).
Ainsi comme montre le Tableau 2, les temps de demi-vie de l’atrazine peuvent varier de 14 à 248
jours suivant les conditions et le type de sol.
Thèse Sophie Gendrault 2004
22

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
Tableau 2 : Exemples de temps de demi-vie de l’atrazine dans différents sols
Temps demi-vie (j) Type de sol, pH, T Références
55 Limoneux Weed et al. 1995
46 Sable limoneux Lafrance et Banton 1995
57 et 131 Sableux pH 4,7 et 6,5 Walker et Blacklow 1994
30, 32 et 16 Sable, limoneux, lim-argileux Topp et al. 1994
36 ± 6 Sable limoneux Gish et al. 1994
50 à 120 25 sols différents Reinhardt et Nel 1993
11-27
22°C (0-15 cm)
Stolpe et Shea 1995
107-248
81-160
(45-120 cm)
(150-240 cm)
14, 28 35°C, 25°C Walker et Zimdahl 1981
59 - Lafrance et al. 1992
60 à 73 Helling et al. 1988
64 - Jury et al. 1987
35 - Rao et Davidson 1982
I.3.2.2.1
Dégradation abiotique
Des phénomènes chimiques peuvent conduire à une transformation dans le sol des substances
actives.
La photo-décomposition sous l’effet de rayonnements ultra-violets est l’une des voies de dégradation
abiotique (Pelizzetti et al., 1990). La photo-décomposition de l’atrazine conduit à la formation
d’hydroxyatrazine et de dérivés déalkylés (Pelizzetti et al., 1990).
Ce processus de dégradation, qui peut avoir lieu à la surface du sol, dans l’air ou dans les eaux de
surface, est d’intensité relativement faible pour l’atrazine par rapport aux autres voies de dégradation,
surtout sous un climat tempéré (Heydel, 1998).
L’hydrolyse de l’atrazine en son dérivé hydroxylé est la principale voie de dégradation chimique de cet
herbicide (Armstrong et al. 1967 ; Li et Felbeck, 1972 ; Nearpas, 1972 ; Plust et al., 1981) ; celle-ci a
lieu essentiellement dans les premiers centimètres du sol et aboutit principalement à la formation
d’hydroxyatrazine.
Une étude de Plust et al. (1981) montre que la réaction d’hydrolyse est d’ordre 1 (réaction de
protonation) et a permis d’élucider les paramètres catalytiques et énergétiques de cette réaction. En
milieu acide, le mécanisme proposé se compose des étapes suivantes :
Thèse Sophie Gendrault 2004
23

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
1° Protonation du cycle (réaction d’ordre 1) :
Cl
Cl
N
N
K a1
N
N
C H 3
NH
N
NH
CH 3
CH 3
+ H+ N
CH 3
CH 3
C H 3
NH
H
+
NH
2° Réaction de l’entité protonée avec une molécule d’eau :
Cl
OH
C H 3
NH
N
+
N
H
N
NH
CH 3
CH 3 + H 2
O
k 1
C H 3
NH
N
N
N
NH
CH 3
+ 2 H + Cl
+
-
CH 3
Dans le sol, la matière organique constitue la principale source de protons : en particulier les acides
humiques et les acides fulviques (Li et Felbeck, 1972 ; Gamble et Kahn, 1985)
I.3.2.2.2
Dégradation biologique
La dégradation biologique est la conséquence de la présence de certains micro-organismes (bactéries
et champignons essentiellement) dans les sols (Skipper et al. 1967 ; Migrain et al., 1993). Elle est
considérée comme la voie principale de dissipation des pesticides dans les sols (Bollag and Liu, 1990)
et dépend de nombreux facteurs (structure chimique, type de sol, texture, teneur en MO, pH,
température, humidité…).
La densité de la population des micro-organismes diminuant avec la profondeur du sol, on observe
une diminution de la biodégradation dans les couches profondes, la dégradation abiotique devenant
alors prépondérante.
La matière organique du sol a une influence capitale sur les phénomènes de biodégradation : sa
présence dans le sol va favoriser la rétention des pesticides, diminuant la biodisponibilité de ces
derniers vis à vis de la micro-flore. Pen revanche, la présence de matière organique dans le sol va
être synonyme de forte activité microbienne.
Le pH du sol joue également un rôle important puisqu’il va favoriser une dégradation biologique pour
des pH allant de 5,5 à 8, ou plutôt influencer la dégradation vers une voie chimique (hydrolyse par
exemple) dans un sol acide (

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
En règle générale, la voie biologique de dégradation s’accentue avec l’augmentation de la
température et de l’humidité du sol (jusqu’à une certaine limite). Ainsi certains auteurs ont remarqué
que l’augmentation de 25 à 35°C de la température d’incubation d’un sol (25% d’humidité) divise par
deux le temps de demi-vie de l’atrazine (Walker et Zindahl, 1981).
La biodégradation peut entraîner la minéralisation complète d’une substance, ou plus souvent, la
formation d’intermédiaires de dégradation, pouvant parfois être plus toxiques que le produit original.
La dégradation biologique peut être assurée par un seul organisme ou par les effets combinés de
plusieurs organismes consommant les pesticides comme sources d’azote ou de carbone (Kaufman et
Kearney, 1970). Grâce à leur forte capacité d’adaptation et de mutation, les micro-organismes sont
capables d’exprimer des enzymes de dégradation lorsqu’ils sont exposés régulièrement à des
substances étrangères indésirables. Ainsi, le traitement pluriannuel d’une parcelle avec le même
herbicide, va favoriser la présence d’une population spécifique de micro-organismes capables de
métaboliser la substance active. Ainsi, Barriuso et Houot (1996) ont montré que le taux de
minéralisation de l’atrazine augmente dans le sol avec la fréquence des applications de cet herbicide.
Ce résultat a également été confirmé par Vanderheyden et al. (1997) et Pussemier et al. (1997).
La dégradation biologique de l’atrazine aboutit principalement à la formation de résidus déalkylés
(Deséthyl-atrazine DEA, Desisopropyl-atrazine DIA, Deséthyl-desisopropyl-atrazine DEDIA) et
également à la formation de résidus déhalogénés (Hydroxyatrazine HA) (Kaufman et Kearrney, 1970 ;
Behki et Khan, 1986 ; Mougin et al., 1994), déaminés ou à noyau clivé (Gschwing, 1992 ;
Mandelbaum et al., 1993a et 1995).
Une réaction de dégradation de l’atrazine a été proposée pour les s-triazines ; celle-ci conduit à la
formation de l’acide cyanurique (dernier intermédiaire) avant une série d’hydrolyse (clivage du noyau),
entraînant la formation de CO 2 et NH + 4 , dans le cas d’une dégradation totale dite minéralisation (Cook
et al., 1981 et 1987).
Le clivage du noyau triazine ne pourrait se faire que suite à une hydroxylation (Kaufman et Kearrney,
1970).
A titre d’exemple, Giardina et al. (1985) proposent un schéma de dégradation de l’atrazine par
Niocardia en précisant les voies possibles de dégradation chimique pouvant intervenir simultanément
dans les sols (Figure 3).
Thèse Sophie Gendrault 2004
25

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
Cl
N
N
CH 3
CH 3
C H 3
NH
N
NH
Cl
OH
N
N
N
N
CH 3
CH 3
CH 3
CH 3
N H 2
N
NH
N H 2
N
NH
Cl
Cl
O
N
N
N
N
N
NH
N H 2
N
NH 2
N H 2
N
H 2 N
N
O
HN NH 2
H N NH
2
Dégradation Biologique
Dégradation Chimique
Figure 3 : Exemple de mécanisme de dégradation biologique et chimique de l’atrazine, d’après Giardini et
al., 1985
En 1993 (a et b), Mandelbaum et al. montrent que certaines bactéries isolées d’un sol pollué utilisent
l’atrazine comme seule source d’énergie. La dégradation est négligeable à des températures
inférieures à 7°C, mais significative entre 15 et 25°C, à un pH de 5,5 à 7,3. Ils observent une
conversion supérieure à 80% d’atrazine entre 4 et 8 jours, à une concentration initiale de 100 mg.L -1 ,
tandis que le même taux de conversion peut être atteint entre 0,5 et 2 jours en milieu enrichi en citrate
et sucrose.
I.3.2.2.3
Minéralisation
La minéralisation consiste en la dégradation totale d’un composé sous l’action d’une activité chimique
ou biologique. Dans les sols, la minéralisation des pesticides, comme leur biodégradation, peuvent
26
Thèse Sophie Gendrault 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
être le résultat d’une activité individuelle d’un micro-organisme particulier mais plus souvent d’un effet
combiné de diverses souches microbiennes.
La minéralisation représente l’aspect le plus intéressant d’un point de vue environnemental, puisqu’il
entraîne la décomposition totale d’un produit indésirable de manière naturelle. Certains microorganismes
présents dans le sol sont capables d’utiliser un pesticide comme nutriment et source
d’énergie ; dans le cas d’une minéralisation, les produits de dégradation sont le CO 2 et autres
composés inorganiques (NH + 4 , H 2 O,..).
De la même façon que précédemment, des applications répétées d’atrazine peuvent entraîner
l’apparition de souches aptes à minéraliser l’atrazine. Ainsi, Ostrofsky et al. (1997) ont montré que la
minéralisation de l’atrazine atteignait 80% dans un sol traité annuellement depuis 25 ans, alors qu’elle
était inférieure à 30% dans un sol traité une année sur quatre depuis 25 ans, et inférieure à 7% pour
un sol non traité auparavant.
Plusieurs souches bactériennes provenant de sols contaminés ont ainsi été isolées pour leur capacité
à minéraliser l’atrazine (Yanze-Kontchou et al., 1994 ; Mandelbaum et al., 1995 ; Struthers et al.,
1998 ; de Souza et al., 1998). (voir aussi liste complète p.63)
I.3.3
Volatilisation
La volatilisation est l’une des causes principales de fuites de pesticides hors de la zone cible,
notamment lorsque les traitements visent la surface du sol ou celle des végétaux. Ces pertes
dépassent en général les pertes dues à la dégradation chimique, au ruissellement et au lessivage (
Taylor et Spencer, 1990). La volatilisation est maximale lorsque l’application est faite par dépôt
aérien ; elle est considérablement réduite par l’incorporation du pesticide directement dans les sols
(sous forme de granulés ou par aspersion). Lors des traitements par aéronef, jusqu’à 50% du produit
peut être entraîné par le vent en dehors des zones à traiter (Pimentel et Levitan, 1986). L’utilisation de
rampes de pulvérisation réduit ces pertes qui peuvent atteindre toutefois entre 1% et 30% selon
Emans et al. (1992) et Pimentel et Levitan (1986). En 1992, Schiavon et al. considéraient que les
pertes par volatilisation de l’atrazine étaient de l’ordre de 3% maximum de la dose appliquée sur une
période de un an. Quelques années plus tard, une étude de Rice et al. (2002) montrait que le taux de
volatilisation de l’atrazine pouvait atteindre 59%, 4 jours après l’application du pesticide sur un sol
agricole.
Le taux d’évaporation dépend d’une part, des propriétés physico-chimiques de la molécule en
question et des conditions climatiques et environnementales (humidité et température de l’air,
humidité et température du sol ; intensité du vent).
La constante de Henry H (rapport de la pression de vapeur à la solubilité dans l’eau), rend compte du
taux de volatilisation d’une substance (Jury et al., 1984). Les produits ayant un H dépassant
largement 2,5 sont considérés comme très volatils (Jury et al 1984).
27
Thèse Sophie Gendrault 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
D’autre part, le mode de travail du sol influe sur la volatilisation. Pour un sol non travaillé, la teneur en
matières organiques est importante : l’adsorption augmente et la volatilisation diminue.
Les molécules volatilisées sont véhiculées rapidement par les courants aériens et très rapidement
diluées dans l’atmosphère ; à cette dilution s’ajoute également les effets photochimiques et les
oxydations destructrices, limitant ainsi leur impact sur l’environnement. Cependant, des risques
existent : la volatilisation est la principale voie de transfert vers les plantes et donc vers les hommes et
les animaux. Glotfelty (1987) rapporte également que les vapeurs peuvent se concentrer dans les
gouttelettes de brouillard puis être redéposées sur les végétaux.
I.3.4
Contamination des milieux aquatiques
Tous les ans, des consommateurs sont privés d’eau courante dans les régions de cultures intensives,
et les exemples ne manquent pas : la Basse Normandie, le Pays de Loire ou la Bretagne, ont
fréquemment connu ces périodes de « crise ».
Les fortes pollutions des eaux de surface sont en général de courte durée, on parle de pic de
pollution. La contamination des eaux souterraines est plus discrète mais aussi plus permanente
(Schiavon et al, 1995 ; Heydel, 1998).
La contamination des eaux souterraines ou des eaux de surface par les pesticides est essentiellement
due aux phénomènes de ruissellement et de lessivage engendrés par les eaux de pluie. Le
ruissellement contribue à la pollution des eaux de surface tandis que le lessivage contribue surtout à
celle des eaux profondes. Bien qu’on considère souvent séparément les eaux de surface et les eaux
souterraines, elles sont liées presque partout par le cycle hydrologique. En fonction des gradients
hydrauliques, c’est l’eau de surface qui alimente les aquifères ou l’inverse (Leonard 1990). En
conséquence, les taux de pesticides dans les eaux superficielles peuvent affecter les eaux
souterraines ou dépendre d’elles.
La pollution des eaux est liée aux interactions pesticides-sol et est fortement influencée par les
conditions climatiques. Le caractère polluant d’un produit est en pratique associé à l’incapacité du sol
à le retenir ou à le dégrader, avant que, sous l’effet de l’eau, il ne soit dispersé dans l’environnement.
On peut donc estimer que les possibilités de pollution de l’eau par un produit phytosanitaire sont
corrélées à son état de disponibilité dans le sol au cours du temps (Barriuso et al., 1994).
La stabilité des pesticides et leur potentiel d’entraînement sont responsables de leur transfert des
zones d’applications vers les milieux aquatiques via les eaux de pluie.
Les risques de pollution sont également induits par la présence des métabolites de dégradation des
pesticides eux-mêmes. Souvent négligés, ils constituent parfois des risques similaires voire supérieurs
au pesticide lui-même. Dans le cas de l’utilisation de l’atrazine, Liu et al. (1996) montrent que la DIA et
28
Thèse Sophie Gendrault 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
la DEA sont, elles aussi, systématiquement présentes dans le milieu, les fréquences de détection de
l’atrazine et de la DEA étant similaires, et supérieures à celle de la DIA, en raison des stabilités
respectives des composés. De plus, Bottoni et al. (1996) rapportent que, du fait de temps de demi-vie
dans le sol supérieurs à celui du composé initial (40 jours pour la DIA, 72 jours pour la DEA, 37 jours
pour l’atrazine), le potentiel de lessivage des métabolites est supérieur à celui de l’atrazine. Ainsi,
considérer uniquement l’atrazine comme polluant revient à sous-estimer l’état de pollution du milieu et
donc sous-estimer le risque encouru.
I.3.4.1
Le Ruissellement : contamination des eaux de surface
Le ruissellement peut être défini comme le mouvement latéral de l’eau à la surface du sol et des
matières dissoutes et suspendues qu’elle contient (Leonard, 1990). Ce phénomène a lieu chaque fois
que l’intensité des pluies dépasse la capacité d’infiltration du sol. Cet écoulement peut entraîner les
pesticides dissous, en suspension ou adsorbés sur les sédiments. Ce phénomène dépend donc de la
solubilité des produits dans l’eau et de la stabilité de leurs liaisons avec les constituants du sol
(Schiavon et al., 1995), mais aussi du mode d’application du pesticide et du mode de travail du sol. Le
ruissellement emporte – pendant la saison d’épandage – en moyenne 2% d’un pesticide appliqué à un
sol, rarement plus de 5 à 10% (Leonard, 1990 ; Schiavon et al., 1995).
Leonard et al. (1979), à partir de données de nombreux bassins versants, ont trouvé que la
concentration en pesticides dans les écoulements de surface était fortement corrélée aux
concentrations mesurées dans les 10 mm supérieurs du sol à ces endroits. Les substances peu
volatiles qui sont fortement adsorbées et résistent à la dégradation restent longtemps à la surface du
sol et sont de ce fait plus sensibles à l’entraînement particulaire ou colloïdal par l’eau. Leur
incorporation dans le sol réduira les risques de ruissellement. Les pesticides solubles seront plutôt
entraînés dans le sol par lessivage.
I.3.4.2
Le lessivage: contamination des eaux souterraines
Le transfert par lessivage ou lixiviation, peut causer la pollution des eaux souterraines par mouvement
vertical. Le lessivage est favorisé par les chemins préférentiels du sol ; ainsi, dans certaines
conditions, même les molécules de pesticides de faible solubilité peuvent être entraînées vers les
couches profondes du sol et les eaux de drainage à travers les failles naturelles du sol. L’importance
de ce phénomène dépend de la nature du pesticide, des propriétés du sol, de la vitesse d’infiltration et
de l’épaisseur de la zone non saturée. La mobilité et la persistance des pesticides doivent être
simultanément considérées lorsqu’on parle de risque de pollution des eaux souterraines. Gustafson
(1989) a proposé l’utilisation d’un indice simple et unique du risque de contamination par les
substances actives des eaux souterraines : le GUS, ou Groundwater Ubiquity Score.
Thèse Sophie Gendrault 2004
29

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Les Pesticides
Le GUS est donné par la formule :
GUS = log(t 1/2 )[4-log(K oc )]
où t 1/2 est le temps de demi-vie et
K = oc
K d
.100
%CO
Les molécules pour lesquelles GUS > 2,8 sont considérées comme très mobiles ; celles dont GUS <
1,8 sont peu mobiles.
On retrouve en général dans les eaux souterraines des pesticides ayant un GUS supérieur à 2,8 ;
ceux dont l’indice est inférieur à 1,8 n’ont jamais été mis en évidence.
Concernant l’atrazine, les valeurs de lessivage d’un sol de Lorraine, obtenues pour l’année 1981-1982
avec un sol limoneux ont montré un entraînement par les eaux de percolation de 0,56% de la
radioactivité, initialement appliquée sous forme de 14C-atrazine ; l’atrazine ne représentant à la fin,
que 10%, le reste étant constitué des produits issus de sa dégradation (Schiavon 1988). Albanis et al.
(1988) ont travaillé en lysimètres avec différents types de sol ; leurs résultats indiquent que les
quantités d’atrazine drainées représentaient seulement 0,54% (sol argileux), 0,66% (sol limoneux) et
0,47% (sol limoneux-sableux) de la dose initiale appliquée. Pour Gaynor et al. (1992), la quantité
d’atrazine et de DEA lessivés dans un sol argileux représente 1,2 à 1,4% de la quantité initiale de
substance active épandue. Le mode de travail du sol peut également être un paramètre déterminant ;
une étude de Weed et al. (1995) montre que selon le mode d’exploitation du sol (36 parcelles
travaillées différemment ont été testées) la quantité d’atrazine drainée par lessivage variait entre 0,2
et 0,35% de la dose initiale appliquée.
Thèse Sophie Gendrault 2004
30

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
II. Procédés de traitement de l’eau pour l’élimination des
pesticides
II.1 Introduction
L’élimination des pesticides représente aujourd’hui un enjeu important pour préserver la qualité de
l’eau. La panoplie des procédés existants permet de bien adapter le traitement en fonction de la
nature de la pollution (accidentelle ou chronique) et des caractéristiques de l’eau à traiter. De
nombreuses techniques de traitement sont aujourd’hui à la disposition des industriels. Les principaux
procédés utilisés, énumérés ci-dessous (ozonation, dégradation photochimique, adsorption sur
charbon actif, procédés membranaires), ont déjà fait leur preuve. D’autres procédés, encore à l’état de
recherche (Oxydation au réactif de Fenton, traitement biologiques…), sont très prometteurs pour
l’élimination des pesticides.
Ce chapitre donne une liste non exhaustive des procédés actuellement existants et pouvant être mis
en œuvre pour le traitement des eaux polluées par l’atrazine. Il présente également quelques voies de
dégradation de l’atrazine (chimiques ou biologiques) mettant en évidence les métabolismes
préférentiels de l’atrazine (métabolismes qui pourront être comparés aux métabolismes de l’atrazine
par la souche bactérienne utilisée dans le cadre de notre étude).
II.2 Elimination de l’atrazine dans la filière classique de traitement
des eaux usées
Lors de l’étape de clarification, trois procédés physico-chimiques peuvent se succèder en cascade :
La coagulation-floculation, la décantation et la filtration, permettent d’éliminer les matières en
suspension. Au cours de cette étape, seuls les pesticides aptes à s’adsorber sur les particules
formées lors de la coagulation-floculation pourront être éliminés.
Les contrôles effectués sur plusieurs installations industrielles montrent que le pourcentage
d’élimination de l’atrazine au cours de ces étapes ne dépasse pas 12% (Degrémont, 1994).
Randke et al. (1994) observent que les procédés de coagualtion, filtration sur sable et chloration, sont
inefficaces pour l’élimination de l’atrazine. Cependant, un apport de 5 mg.L -1 de charbon actif en
poudre, à ce stade du traitement, permet un abattement de 40% de l’atrazine (Welte et al., 1996).
L’utilisation du chlore n’aurait quant à elle, aucune efficacité pour l’élimination des s-triazines (Guerra-
Sanchez, 2000).
Thèse S.GENDRAULT 2004
31

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
Paillard et al. (1990) montrent que l’atrazine (11,4 µg.L -1 ) présente dans les eaux brutes, n’est pas
bien éliminée par une filière classique de production d’eau potable. L’abattement obtenu au cours de
la floculation –décantation est de 5% en moyenne. En revanche l’addition de 30 mg.L -1 de charbon
actif en poudre pendant la coagulation permet d’éliminer l’atrazine à 80%.
II.3 Procédés physico-chimiques dégradatifs
Différents procédés d’oxydation avancée existent actuellement dans les filières de production d’eau
potable. Les procédés d'oxydation avancée sont particulièrement appropriés pour le traitement des
effluents contenant des composés récalcitrants, toxiques ou non-biodégradables.
II.3.1
Oxydation à l’ozone
L’ozone est un oxydant puissant couramment utilisé pour le traitement des eaux potables. L’ozone
peut agir par une réaction directe (réactions très sélectives) ou de façon indirecte par l’intermédiaire
d’espèces secondaires comme les radicaux OH°, formés par décomposition de la molécule d’ozone.
Cette action indirecte est peu sélective, mais les cinétiques de réaction sont très variables selon les
matières à oxyder (Degrémont, 1989). Ainsi l’ozone dégrade les molécules avec plus ou moins
d’efficacité. Par exemple, il est totalement inefficace envers le lindane, à des doses compatibles avec
des applications à grande échelle (GLS, 2003)
Lors d’un traitement à l’ozone, il faut prendre en compte les contraintes induites par la mise en œuvre
d’une ozonation, à savoir la nécessité de mettre en place une filtration sur charbon actif en grains en
aval afin de retenir d’une part, les sous produits d’oxydation pouvant être nocifs, et d’autre part, les
bromates (composés cancérigènes) qui peuvent se former si l’eau brute contient des bromures.
L’action de l’ozone sur les pesticides peut parfois amener à la production de produits toxiques ; en cas
de forte dose d’oxydant, certains composés haloformes sont susceptibles de se former en présence
de matière organique (Dore, 1989, Ch6).
Dans le cas de l’atrazine, l’utilisation de l’ozone à des teneurs d’environ 3mg.L -1 ne permet pas
l’ouverture du cycle triazinique (Nelieu, 1994). Cependant Husley et al. (1993) constatent une
réduction de 80% de l’atrazine présente initialement à une concentration de 5 µg/.L -1 . Welte et al.
(1996) montrent que sous l’effet de l’ozone, l’atrazine subit une déalkylation pour former la deséthyleatrazine
(DEA).
A titre d’exemple, Acero et al. (2000) ont étudié les voies de dégradation de l’atrazine par ozonation
(Figure 4).
Thèse S.GENDRAULT 2004
32

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
Figure 4 : Différentes voies de dégradation de l’atrazine par ozonation selon Acero et al. (2000)
L’ozonation est souvent couplée avec un autre procédé. Beltran et al.(1994) ont étudié la possibilité
de couplage avec l’irradiation UV.
Utilisé en couplage avec une méthode biologique, l’ozonation est intéressante, car dans certains cas,
elle facilite la biodégradabilité des composés. Ainsi, Lai et al. (1995) observent que le niveau de
biodégradabilité de la simazine (herbicide de la famille des s-triazines) est considérablement
augmenté lorsqu’un pré-traitement à l’ozone/UV est appliqué.
Thèse S.GENDRAULT 2004
33

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
II.3.2
Oxydation au peroxyde d’hydrogène
L’utilisation du peroxyde d’hydrogène permet d’augmenter la quantité de radicaux OH • disponibles
pour l’oxydation radicalaire. Les radicaux OH • , extrêmement réactifs, sont consommés rapidement par
la matière organique, les bicarbonates, les carbonates, l’ammonium et les alcools tertiaires.
Le couplage de ces deux dernières techniques (O 3 / H 2 O 2 ) permet d’éliminer 90% de l’atrazine avec
des taux d’ozonation de l’ordre de 3 mg.L -1 d’O 3 . L’efficacité de ce traitement dépend de la dose de
H 2 O 2 utilisée ; l’élimination de l’atrazine serait optimale à partir d’un rapport massique O 3 /H 2 O 2 de 2,5.
Selon Gaid et Ravarini (1996) et Degrémont (1994), la combinaison O 3 / H 2 O 2 à des rapports
massiques de l’ordre de 4, avec une dose initiale d’ozone d’environ 2 mg.L -1 permettrait un
abattement de l’atrazine de 80%.
Pour une dose d’ozone de 2 mg.L -1 , l’élimination de l’atrazine peut atteindre 46% pour une
concentration initiale de 370 µg.L -1 ; elle s’élève à 75% en présence de peroxyde d’hydrogène, ajouté
dans un rapport H 2 O 2 /O 3 de 0,4 g.g -1 (Richard et al., 1991).
II.3.3
Traitement au réactif de Fenton (AFT, Anodic Fenton Treatment)
Ce procédé consiste en une oxydation par les radicaux OH • formés à partir de la réaction de Fenton :
Fe 2+ +H 2 O 2 → Fe 3+ +OH - +HO •
Cette méthode utilise une cellule électrochimique composée d’électrode de fer (anode et cathode).
L’anode délivre du Fe 2+ à la solution tandis que la cathode fonctionne comme une électrode inerte.
Les demi-réactions suivantes illustrent les phénomènes mis en jeu lors de la réduction de l’eau pour
former les radicaux OH • réactifs.
Fe → Fe 2+ +2e -
2H 2 O+2e - → H 2(g) +2OH - .
Appliquées à des eaux contenant de l’atrazine, les études ont permis de mettre en évidence 7
produits de dégradation. L’AFT permet la dégradation de l’atrazine en 3 minutes (70% d’abattement)
(Saltmiras et al., 2002). Cependant le cycle triazine n’est pas clivé par cette technique.
La dégradation primaire de l’atrazine par réaction de Fenton augmentant sa biodégradabilité
(déalkylation, déchlorination), cette technique pourrait être envisagée en couplage avec un traitement
biologique.
Thèse S.GENDRAULT 2004
34

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
II.3.4
Dégradation photochimique
La dégradation photochimique de l’atrazine a été étudiée sous irradiation UV-Vis, en présence ou non
d’un catalyseur (dioxyde de titane, TiO 2 ).
En présence de 500 mg.L -1 de TiO 2 , la demi-vie de l’atrazine dans une solution à pH 6 est de l’ordre
de 20 minutes. La desisopropyl-atrazine (DIA) et la deséthy-latrazine (DEA) sont les sous-produits
principaux, formés au cours de ce traitement. La deséthyl-desisopropyl-atrazine (DEDIA) ainsi que
l’hydroxy-deséthyl-atrazine (OHDEA) sont également retrouvées en quantité non négligeable (Héquet
et al., 2001).
Dans tous les cas, le noyau triazine n’est pas clivé mais, comme précédemment, le traitement
photochimique fragilisant la structure mère de l’atrazine pourrait être envisagé comme pré-traitement
à un procédé de dégradation biologique.
II.4 Procédés non dégradatifs : adsorption sur matrice poreuse ou
membrane
II.4.1
Procédés d’adsorption sur charbon actif en poudre ou en grains
II.4.1.1
Généralités
L'adsorption est un traitement efficace pour retenir les polluants, particulièrement quand la charge est
importante et la polarité faible. Le charbon actif est utilisé pour éliminer des molécules peu solubles,
du type phénols ou hydrocarbures saturés, les pesticides, les métaux lourds, certains agents tensioactifs,
etc...difficilement dégradés par l'ozone.
Les performances des filtres à charbon actif dépendent de la température, ainsi que du composé à
adsorber.
La mise en place d’une ozonation en amont permet d’améliorer le rendement d’adsorption du charbon
et de le protéger contre toute prolifération bactérienne.
Les différents facteurs qui vont influencer l'adsorption des polluants sur les charbons actifs sont :
• La température : L'adsorption est un phénomène généralement exothermique, toute
élévation de la température diminue l'efficacité de l'adsorption.
• La solubilité : Les composants les moins solubles sont adsorbés plus facilement
• La structure moléculaire : Les chaînes à ramifications (encombrement moléculaire
important) sont plus facilement adsorbées que les chaînes non ramifiées.
• La taille moléculaire :Les grosses molécules sont généralement mieux adsorbées que les
plus petites.
Thèse S.GENDRAULT 2004
35

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
• La polarité : Les molécules apolaires sont plus facilement adsorbées que les molécules
polaires (dans le cas des charbons actifs, la surface est apolaire).
• La saturation de la chaîne carbonée : Les molécules contenant des liaisons insaturées sont
plus facilement adsorbés que molécules à liaisons saturées (échanges électroniques).
Il existe deux principaux procédés distincts d’adsorption par charbon actif : l’un utilise le charbon actif
en poudre (CAP), l’autre le charbon actif en grains (CAG). Tous deux reposent sur l’accumulation à la
surface ou à l’intérieur des particules de charbon, des polluants contenus dans l’eau par interactions
physico-chimiques. Chacun est utilisé dans des conditions bien spécifiques.
Le CAP est utilisé par injection de barbotine (mélange eau-charbon en suspension). Cette injection
s’effectue idéalement le plus en amont possible de la filière de traitement afin d’obtenir des temps de
contact le plus long possible. Il faut également prendre en compte les taux de matières organiques
contenues dans l’eau, matières qui peuvent entrer en compétition avec les pesticides et en limiter
l’adsorption. La chaîne de traitement doit comprendre une étape de décantation – filtration située
après l’injection de charbon, de façon à retenir les particules de charbon. L’utilisation de CAP est
particulièrement adaptée aux usines possédant une filière complète de clarification. Elle permet
notamment de traiter des pollutions accidentelles.
Le CAG est utilisé dans le cas de pollutions chroniques, mais pour des concentrations relativement
faibles. Le CAG s’utilise en lit filtrant généralement placé en fin de chaîne de traitement, lits dans
lesquels l’eau percole avec un temps de séjour de 10 à 15 minutes.
Lorsque le filtre est saturé, il est alors régénéré en usine via un traitement thermique qui lui permet de
recouvrer ses propriétés adsorbantes.
II.4.1.2
Application à l’adsorption de l’atrazine sur charbon actif (CA)s
L’adsorption sur charbon actif est actuellement l’un des procédés les plus utilisé pour éliminer les
composés organiques et notamment les micro-polluants du type pesticide des eaux destinées à la
consommation humaine.
De nombreuses études ont été réalisées sur la capacité des charbons actifs à retenir l’atrazine.
Différents types d’essais ont été réalisés : en réacteurs agités ou en colonne, avec des charbons
actifs de différentes natures : en grain, en poudre, sous forme de fibres…
La durée d’utilisation des CA dépend du type de CA utilisé, de la durée de temps de contact et de la
concentration en pesticide et autres matières organiques présentes dans l’eau.
Les quelques exemples cités ci-dessous donnent une idée de l’efficacité du charbon actif sous ces
diverses formes à retenir l’atrazine.
• Lors des premières études sur la capacité du charbon actif à fixer l’atrazine, Holiday et Hardin
(1981) ont montré que 99,9% de l’atrazine présente dans une eau de rivière (concentrations
36
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
initiales 0,5 à 430 mg.L -1 ) pouvaient être éliminés par filtration sur charbon actif (pH de la
solution circulante = 9).
• Bouillot et al. (1991) observent une capacité d’adsorption de l’ordre de 38 mg.g -1 de CAG,
tandis que l’utilisation du même CAG en filtre entraîne une diminution de la capacité
d’adsorption d’un coefficient 1000 (concentration initiale en atrazine = 1 µg.L -1 ).
• Brunet et al. (1996) ont testé les performances de plusieurs types de charbon actif en filtrant
des eaux de forage dopées en atrazine (concentration initiale = 104 µg.L -1 ). En appliquant une
masse de 10 mg.L -1 de CAP, ils trouvent des capacités d’adsorption de l’ordre de 10 µg.g -1 de
CAP (temps de contact 72h). Lorsque la concentration initiale en atrazine est plus faible
(46 µg.L -1 ), la capacité de rétention de l’atrazine passe à 30 µg. g -1 .
• Des expériences en colonne CAG menées par Croll et al. (1992) indiquent que pour de faibles
concentrations entrantes en atrazine (

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
II.4.2
Procédés membranaires : microfiltration, ultrafiltration et nanofiltation
La nanofiltration est utilisée dans les procédés de purification d’eau, tels que l’adoucissement, la
décolorisation et l’élimination de micro-polluants. Elle permet d’éliminer des molécules de petite taille
sous une pression élevée. La nano-filtration permet ainsi de retenir une partie importante de la
matière organique ainsi que les ions divalents et les bactéries. Les résultats des essais de nanofiltration
réalisés par Gaid et Ravarini (1996) sont présentés dans leTableau 3.
Tableau 3 : Elimination d’atrazine par nano-filtration (d’après Gaid et Ravarini, 1996)
Atrazine à l’entrée Atrazine en sortie Taux d’abattement
0,42 µg .L -1

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
II.4.3
Valorisation des déchets verts pour le traitement de l’eau
II.4.3.1
Une solution économique
Le traitement des eaux contaminées par les métaux ou les micro-polluants du type pesticide,
colorants ou autres, fait en général intervenir des techniques onéreuses telles que la précipitation, la
filtration sur membrane, l’échange d’ions, l’adsorption sur charbon actif, etc.
Dans un souci économique, social et environnemental et dans le cadre des projets de Développement
Durable défini lors du Sommet de la Terre (Rio de Janeiro, 1992), des techniques alternatives sont
aujourd’hui étudiées afin d’une part, de réduire les coûts de traitement et d’autre part utiliser au
maximum des ressources renouvelables et valoriser les sous-produits de l’agriculture ou les déchets
issus d’activités industrielles ou agricoles.
Ainsi, les produits naturels, disponibles en large quantité ou certains déchets industriels ou agricoles
peuvent présenter un potentiel adsorbant intéressant pour le traitement des eaux contaminées. Afin
que le coût de traitement soit intéressant par rapport aux techniques classiques, le choix de ce
matériau doit se faire en fonction de sa capacité adsorbante, de la quantité disponible mais aussi de
sa disponibilité géographique (le transport de matière entraînant un coup et une pollution non
négligeable).
En général, un matériau adsorbant est économique s’il est utilisable dans un procédé simple, s’il est
abondant naturellement (au moins localement) ou s’il constitue un sous-produit ou un déchet d’une
activité industrielle ou agricole.
Ainsi de nombreuses recherches ont été menées sur une grande variété de matériaux tels que les
écorces, les lignines, les chitines, les algues, la biomasse microbienne morte, la canne à sucre, les
fibres de betteraves, les cotons, la laine, certaines cendres, la tourbe…
Dans notre étude, l’idée d’utiliser des matériaux naturels comme support pour le traitement d’eaux
contaminées par l’atrazine a vu le jour dans un souci économique et environnemental. Ainsi, nous
nous sommes intéressés aux études déjà réalisées pour l’élaboration de procédés de dépollution des
eaux par filtration sur des matériaux naturels, qui dans la plupart des cas, constituent une masse
importante de déchets largement disponibles et valorisables.
II.4.3.2
Quelques exemples
C’est dans le domaine de l’adsorption des métaux lourds que l’on retrouve aujourd’hui les plus
nombreux exemples d’utilisation de produits naturels adsorbants pour le traitement d’eaux usées. De
nombreux matériaux ligno-cellulosiques ont notamment été étudiés ces dernières années. Le Tableau
4, présente une liste non exhaustive des différents matériaux naturels utilisés pour l’adsorption des
métaux lourds.
Thèse S.GENDRAULT 2004
39

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
Tableau 4 : Exemple de matériaux naturels utilisés pour l’adsorption de métaux lourds dans des procédés
de traitement des eaux usées ou effluents
Matériau Polluant Référence
Bagasse Cd(II) et Pb(II) Peternel et al. (1999)
Peau d’oignons Cd(II), Pb(II), Cu(II) et Hg(II) Kumar et Dara (1980) ; Asai et al. (1986)
Brou d’amande Pb(II) et Zn(II) Omgbu et Iweanya. (1990)
Peau de cacahuète Cu(II) Randall et al. (1975)
Matériau cellulosique Cd(II), Cu(II) et Pb(II) Okeimen et al. (1985)
Shukla et Sakhardande (1990)
Ecorce de pin U Freer et al. (1989)
Ecorce de pin
Cd(II), Pb(II), Cu(II) et Hg(II), Vasconcelos (1989)
Cr(III), Fe
Epi de maïs Cu(II) Hawthorne-Costa et al. (1995)
Cotton Hg(II) Bailey et al. (1999)
Tourbe Cr(III) Bailey et al. (1999)
Fibres de betterave Ni(II), Pb(II), Cu(II) et Zn(II) Rima et al. (2004)
La capacité d’adsorption des matériaux naturels, tout comme celle de n’importe quel adsorbant, varie
essentiellement en fonction du pH et de la force ionique du milieu environnant et dans une moindre
mesure de la température. Ainsi, les études de Peternele et al. (1999) montrent, par exemple, que
l’adsorption du plomb (Pb(II)) et du cadmium (Cd(II)) sur des fibres de bagasse augmentait lorsque la
force ionique diminuait et le pH augmentait.
Rima et al. (2004) observent un pH optimal de 6 à 6,6 pour l’adsorption des métaux lourds sur des
fibres de betteraves et parviennent à éliminer 98% des métaux présents à des concentrations initiales
de quelques centaines de mg.L -1 (soit une adsorption de environ 100 mg.g -1 de matériau ).
II.4.3.3
Cas de l’écorce de pin
Parmi les matériaux naturels potentiellement exploitables dans le domaine de l’adsorption et du
traitement de l’eau, l’écorce de pin a fait l’objet ces dernières années de quelques études.
En tant que procédé alternatif aux traitements classiques, l’écorce de pin (matériau ligno-cellulosique)
est particulièrement intéressante puisque étant un sous-produit de l’industrie du bois, elle est
abondamment disponible et présente une affinité importante pour les composés, entre autres,
hydrophobes.
La littérature révèle deux sortes d’utilisation pour l’écorce de pin. Dans certaines études l’écorce est
utilisée comme adsorbant tel quel ; différentes granulométries sont évoquées et parfois une activation
chimique permet d’augmenter l’efficacité de cet adsorbant. D’autres études montrent une efficacité
40
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
particulièrement attractive de l’écorce de pin utilisée comme garnissage de biofiltres pour le
traitement des gaz ou traitement de l’eau. Dans ce dernier cas, l’écorce joue le rôle de support
d’adsorption des polluants et de croissance pour les micro-organismes, eux-mêmes responsables de
la transformation ou de la dégradation des polluants.
La plupart des études sur l’écorce de pin relatent de la capacité d’adsorption de ce support vis à vis
des métaux lourds (Farm, 2003 ; Blais et al., 2003 ; Al-Asheh et al., 2000 et 1997 ; Meunier et al.,
2002 ; Orlando et al., 2002 ). Composée, entre autre, de molécules polyphénoliques tels que les
tanins, l’écorce de pin, à un pH et une température appropriés, présente une certaine capacité à
retenir les cations métalliques en solution (Vazquez et al., 1994). Ces tanins font office d’échangeurs
d’ions (Laks, 1991) chélatants le di-cations comme présentée Figure 5.
Figure 5 : Echange d’ions entre la procyanidine (tanin de l’écorce) et un ion métalique divalent (Vazquez
et al. 2002)
L’écorce de pin s’est ainsi révélée efficace pour le traitement d’eaux chargées en ions tels que Pb 2+ ,
Cu 2+ , Cd 2+ , Cr 2+ pour ne citer que quelques exemples. Les capacités maximales d’adsorption de
l’écorce vis à vis de Pb 2+ peuvent atteindre jusqu’à 10,3 mg.g -1 d’écorce, 7,5 mg.g -1 pour Cd 2+ ou
encore 6,4 mg.L -1 pour le Cr 2+ (Al-Asheh et al., 1997). Al-Asheh et al. (1997) ont également étudié
l’influence de certains paramètres sur l’adsorption des métaux lourds ; ainsi, leurs résultats montrent
logiquement qu’une écorce de faible granulométrie (

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
être un indicateur aussi efficace que les mousses ou les lichens quant au suivi de la concentration des
métaux lourds présents dans l’atmosphère (Lippo et al., 1995).
L’écorce de pin en poudre a également prouvé sa capacité d’adsorbant vis à vis de pesticides
organochlorés comme le lindane ou l’heptachlore. Brás et al (1999) prétendent ainsi obtenir des taux
d’abattement équivalents à ceux obtenus avec des filtres à charbon actif, pour certains organochlorés
présents en solution aqueuse (concentrations initiales 1 à 10 µg.L -1 ). Ils notent également que plus le
composé est hydrophobe, meilleure sera l’adsorption sur l’écorce de pin.
L’écorce de pin préalablement activée par l’épichloridine et la diméthylformamide (méthode EDM)
pourrait également présenter des capacités d’échange d’anions et être utilisée pour l’élimination d’ions
nitrate (Qmax = 1,06 mmol.g -1 ) aussi bien qu’une résine amberliteIRA-900 (Orlando et al., 2002).
Enfin, certains auteurs ont montré que l’écorce de pin pouvait être utilisée comme garnissage de
biofiltre. Ainsi, Du Plessis et al. (2003) utilisent un compost d’écorce de pin comme support de
biofiltration pour traiter des gaz chargés en méthane et parviennent à des taux d’abattement de
méthane (oxydation) de 70% (temps de rétention 30 minutes, concentration initiale en
méthane > 0,5%, v/v).
A des conditions optimales d’humidité (65%), l’écorce disposée en lit de 0,9 m de hauteur (charge de
65 m 3 .m -2 .h -1 ) peut également servir de support de biofiltration pour le traitement d’air malodorant
chargé en sulfure d’hydrogène (Van Langenhove et al., 1986).
Un biofiltre à garnissage d’écorce de pin a également été utilisé par Ramirez-Lopez (2001) pour
l’élimination de composés organiques volatils (COV) présent dans l’air, tels que le dichlorométhane,
l’éthanol, le toluène ou encore la méthyl-éthyl-cétone. Ces études montrent notamment l’importance
de la teneur en eau de l’écorce et concluent que l’écorce sèche doit être privilégiée dans un tel
procédé par rapport à l’écorce humide.
Compte tenu de la quantité d’écorce de pin disponible au Portugal et dans le sud de la France, dans
l’idée de trouver des solutions alternatives aux traitements classiques souvent onéreux et à la vue des
résultats cités précédemment, nous avons choisi d’utiliser l’écorce de pin comme support d’adsorption
pour l’élimination de l’atrazine présente dans les eaux par biofiltration.
Thèse S.GENDRAULT 2004
42

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
II.5 Procédés de dégradation biologique
Parmi les procédés retenus pour la décontamination, les traitements biologiques sont susceptibles
d’offrir un avantage économique important comparés aux procédés physico-chimiques classiques,
souvent plus complexes dans leur réalisation et souvent onéreux.
Les procédés biodégradatifs sont souvent simples à mettre en œuvre et applicables à d’importantes
surfaces ou volumes ; ils peuvent être envisagés in situ ou sur site, ce qui limite considérablement les
frais (excavation, pompage ou transport) et réduit l’impact environnemental.
Les procédés biologiques font appel à des micro-organismes tels que les bactéries, les levures ou les
moisissures pour la réduction de la charge organique des eaux résiduelles ou l’élimination de micropolluants
toxiques spécifiques, récalcitrants aux techniques de la filière classique de traitement de
l’eau.
Les techniques biologiques présentent l’avantage (dans les plus favorables des cas), d’éliminer
totalement les polluants, contrairement aux techniques d’adsorption (le polluant est immobilisé mais
non dégradé) ou aux techniques physico-chimiques (dégradation souvent partielle).
II.5.1
Caractéristiques générales des bioréacteurs
La mise en œuvre des cultures bactériennes peut revêtir de très nombreuses formes. Il est classique
de distinguer les procédés dits à culture libres et les procédés dits à cultures fixées.
Dans les procédés à cultures libres, utilisés uniquement en traitement des effluents liquides, on
provoque le développement d’une culture bactérienne dispersée au sein du liquide à traiter. On utilise
pour cela un bassin brassé pour conserver en suspension la culture, et dans lequel on maintient :
soit, une certaine concentration en oxygène : ce sont les procédés aérobies tels que les boues
activées, le lagunage aéré ou naturel
soit, au contraire, l’absence d’oxygène : ce sont les procédés anaérobies tels que les procédés à lit de
boue ou le lagunage anaérobie.
Dans les techniques à cultures fixées, on utilise la capacité qu’ont la plupart des micro-organismes à
produire des exo-polymères permettant leur fixation sur divers supports, pour former un biofilm.
Les cultures fixées comme les cultures libres, peuvent s’utiliser en traitement aérobie ou anaérobie.
Les cultures libres ont comme avantage essentiel une relative simplicité de mise en œuvre. Elles sont
limitées cependant par les concentrations en micro-organismes accessibles et conduisent ainsi à des
volumes d’ouvrages importants.
Les cultures fixées en revanche, permettent d’obtenir dans les réacteurs des concentrations en
biomasse plus importantes, ce qui permet de réduire leur taille.
Thèse S.GENDRAULT 2004
43

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
Dans le milieu particulièrement complexe que représente la plupart des eaux résiduaires, les éléments
traces, les vitamines et autres facteurs de croissances sont généralement en concentrations
suffisantes pour assurer le renouvellement des micro-organismes et donc une épuration correcte. Il
peut arriver cependant, que l’effluent à traiter ne contienne pas assez de phosphore, ni même
d’azote ; il faut alors en ajouter pour stimuler l’activité microbienne. Pour qu’un effluent puisse être
traité par voie biologique, il doit en outre présenter des caractéristiques compatibles avec la
croissance bactérienne : pH, température, salinité, absence de produits inhibiteurs ou toxiques.
Les substances contenant du carbone organique sont consommées par les micro-organismes. En
effet, le carbone représente le constituant essentiel du matériel cellulaire et les molécules organiques
sont sources de carbone pour les hétérotrophes et d’énergie pour les chimioorganotrophes. Les
sources d’azote susceptibles d’être consommées par les micro-organismes incluent pratiquement
toutes les formes d’azote organique ou minéral. L’azote est métabolisé pour fournir essentiellement
les protéines, les acides nucléiques et les polymères des parois cellulaires.
Le phosphore est également consommé et incorporé dans les acides nucléiques, les phospholipides
et les polymères des parois bactériennes. Il est aussi un élément capital de l’ATP intervenant dans les
échanges énergétiques cellulaires.
Ainsi les matières organiques comme les pesticides peuvent être éliminées par voie biologique ; ils
sont utilisés comme source d’azote ou de carbone selon le pesticide et les micro-organismes. Le
traitement biologique spécifique pour l’élimination d’un polluant particulier utilise un consortium ou une
souche isolée connue pour ces capacités à métaboliser celui-ci.
Dans le cas le plus favorable, le polluant est minéralisé sous forme de CO 2 et H 2 O (minéralisation),
mais dans certains des cas, il est partiellement dégradé et des métabolites intermédiaires de
dégradation sont formés.
II.5.2
Traitements biologiques appliqués aux eaux contaminées par l’atrazine
Au cours des dix dernières années, et suite à l’utilisation intensive de l’atrazine dans les cultures
agricoles, des chercheurs ont imaginé divers procédés d’élimination de cette pollution. De nombreux
micro-organismes (bactéries ou moisissures), utilisés en cultures pures ou en consortium, ont été
isolés à partir de milieux pollués, et testés pour leur capacité à métaboliser l’atrazine, aussi bien dans
les sols que dans l’eau. Pour certains d’entre eux, l’atrazine est métabolisée en tant que seule source
de carbone (Behki et Khan, 1986 ; Yanze-Kontchou et Gschwind, 1994) ; pour d’autres, l’atrazine est
une source d’azote (Mandelbaum et al., 1995 ; Radosevich et al., 1995). Différents métabolismes de
dégradation de l’atrazine ont été décrits dont un mécanisme général pour les s-triazines proposé par
Cook (1987). Dans ce mécanisme général, la dégradation des triazines conduit à l’acide cyanurique,
dernier intermédiaire triazinique ; puis, la dégradation complète des triazines conduit à la formation de
CO 2 et NH + 4 via les composés intermédiaires non cycliques comme le biuret et l’urée. Dans le cas de
l’atrazine, la première étape consiste en une N-déalkylation (Mougin et al., 1994 ; Nagy et al.,1995) ou
une hydroxylation (Mandelbaum et al, 1993a et b).
44
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
Un exemple de dégradation biologique de l’atrazine est proposé par Ostrofsky et al. (2001)
Figure 6 : Exemple de dégradation de l’atrazine par une communauté bactérienne, selon Orstrofsky et al.
(2002)
Yanze-Kontchou et Gschwind (1999) ont montré qu’une communauté bactérienne capable de
minéraliser l’atrazine dans les eaux usées pourrait être utilisée dans le cadre d’un procédé de
traitement des eaux, au sein d’une station d’épuration.
Certains auteurs proposent de pré-traiter l’eau à l’ozone avant de la faire percoler à travers un sol
biologiquement actif (Somich et al., 1990) ou circuler dans un bioréacteur contenant des bactéries
disposées en biofilm à la surface d’un support solide (Lesson et al., 1993 ; Hapeman et al., 1995).
Dans ce procédé, l’ozone utilisé en pré-traitement, transforme l’atrazine par oxydation en des
composés cycliques plus facilement biodégradables.
Hapeman et al. (1995) parvenaient ainsi, à l’aide d’un pré-traitement à l’ozone et l’utilisation de
Klebsiella terragena, à éliminer 80% environ de l’atrazine présente initialement dans l’eau à une
concentration de 110 mg.L -1 , sous forme de CO 2 et NH + 4 , en 1 jour.
Yanze-Kontchou et Gschwind (1994) ont étudiés l’utilisation de Pseudomonas YAYA6 pour traiter
aussi bien une eau polluée qu’un sol contaminé par l’atrazine, sans pré-traitement à l’ozone.
Thèse S.GENDRAULT 2004
45

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
En 1994, alors que Stucki et al. (1995) se penchaient sur un traitement biologique pour les eaux
souterraines, Feakin et al. (1995) intéressés par un procédé couplé d’adsorption/biodégradation,
proposaient de développer un biofilm dans des colonnes de charbon actif, avec une bactérie reconnue
pour sa capacité à dégrader l’atrazine.
McKinlay et Kasperek (1999) quant à eux, ont étudié la possibilité de décontaminer des eaux polluées
à l’atrazine provenant de sites agricoles, à l’aide de macrophytes issus de marais (jonc, iris jaune et
roseau), déjà utilisés dans des procédés de traitement de l’eau (Figure 7).
Figure 7 : Schéma du procédé de traitement imaginé par McKinlay et Kasperek (1997)
Dans ce procédé, la microflore responsable de la biodégradation de l’atrazine est localisée dans la
rhizosphère des plantes macrophytes, qui joue le rôle de « tampon environnemental » pour les microorganismes.
Quelques résultats de ce procédé sont présentés à la Figure 8.
Le système de McKinlay et Kasperek (1999) présente des résultats intéressants puisque l’atrazine (à
concentration initiale de 6-7 mg.L -1 ) est totalement éliminée de l’eau circulante, au bout d’un mois
(pour la première application d’atrazine avec le jonc) et en 4 jours au bout de la quatrième application
d’atrazine.
Thèse S.GENDRAULT 2004
46

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
Figure 8 : Dégradation de l’atrazine au cours du temps avec 4 additions successives d’atrazine (6 mg/l)
dans le système de McKinlay et Kasperek (1999) pour les 4 macrophytes étudiés.
Les divers procédés de traitement présentés ci-dessus ne sont encore envisagés qu’au stade de la
recherche, à l’échelle du laboratoire.
II.6 Procédés combinés
II.6.1
Généralités
Actuellement, il est admis que les procédés biologiques représentent un faible impact
environnemental et rentrent donc bien dans la liste des technologies utilisables pour le traitement de
l’eau. L’épuration biologique de l’eau, du sol et de l’air a lieu selon un schéma semblable. Dans tous
les cas, il s’agit de profiter de la capacité des micro-organismes à biodégrader une substance
indésirable. Ainsi, la biofiltration est devenue un procédé d’épuration particulièrement attractif.
L’efficacité de la biodégradation est parfois limitée dans les cas de contamination à faibles
concentrations. Le polluant étant une source d’alimentation pour les micro-organismes, celui-ci doit
être présent dans le milieu à une concentration suffisante pour permettre la croissance microbienne
ou une cinétique de biodégradation significative. Dans le cas de faibles concentrations (de l’ordre du
µg.L -1 ), le polluant ne peut assurer un apport énergétique suffisant et/ou la cinétique de
biodégradation est trop faible. L’idée des procédés combinés est donc de concentrer le polluant sur un
support d’adsorption afin que celui-ci puisse être consommé par les micro-organismes présents à la
surface du support solide.
47
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
D’autre part, les bactéries fixées sur un support présentent généralement des activités spécifiques
supérieures à celles observées en culture libre (Olstead and Weber, 1991).
Le matériau solide utilisé joue donc deux rôles essentiels :
• Adsorption du polluant
• Support de croissance pour les micro-organismes
Ce procédé de traitement est économique puisqu’il permet la régénération des « filtres » par
consommation du polluant par les micro-organismes ; il a un impact environnemental très limité si le
polluant est minéralisé, c’est à dire totalement dégradé sous forme de CO 2 et H 2 O.
Ainsi, l’efficacité d’un tel traitement (adsorption + biodégradation) à été prouvée pour l’élimination de
phénol (5 µg.L -1 ) et de dichlorophénol (10 µg.L -1 ) en colonne de charbon actif en grain (CAG) inoculée
par des bactéries (Speitel et al., 1989) connues pour dégrader ces deux polluants organiques.
Feakin et al. (1995) ont expérimenté un traitement combiné sur colonne de CAG pour le traitement
d’eau polluée par de faibles concentrations en atrazine (10 µg.L -1 ).
Des colonnes inoculées et non inoculées, contenant 10 g de CAG et alimentées par un débit de
0,5 ml.min -1 (temps de contact 40 minutes) ont été suivies pendant 20 jours. Les résultats montraient
que la biodégradation à l’intérieur des colonnes inoculées participait à 53% à l’élimination de l’atrazine
(contre 0% dans les colonnes non inoculées). Les mêmes expériences réalisées sur 302 jours avec
de l’eau de rivière préalablement clarifiée puis ozonée ([atrazine]i = 5µg.L -1 environ) ont montré que la
présence d’un biofilm dans la colonne réduisait notablement la concentration en atrazine de l’eau
traitée en sortie de colonne. Cependant, la présence du biofilm dans les colonnes de CAG ne retardait
pas pour autant le passage au-dessus de la limite fixée de 0,1 µg.L -1 par rapport à l’utilisation d’une
colonne de CAG non inoculée. La présence de bactéries au sein du CAG participait donc à éliminer
l’atrazine par biodégradation, limitant l’adsorption de celle-ci sur le support mais cette biodégradation
n’était pas assez rapide pour empêcher l’accumulation du polluant sur le CAG et rendre le procédé
efficace.
Nous nous sommes inspirés de cette approche pour étudier et tester un traitement combiné utilisant
de l’écorce de pin en tant que support de biofiltration et Pseudomonas ADP sp. comme bactérie
capable de minéraliser l’atrazine. Pour cette étude, une connaissance en générale des procédés de
biofiltration a été nécessaire et est abordée dans le chapitre qui suit.
Thèse S.GENDRAULT 2004
48

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
II.6.2
La biofiltration
II.6.2.1
Introduction
Le biofiltre est constitué d’un matériau granulaire à la surface ou au sein duquel les micro-organismes
sont immobilisés, empilés dans un réacteur généralement cylindrique : l’eau à traiter circule de
manière ascendante ou descendante à travers un lit généralement fixe ainsi constitué. Le polluant
contenu dans l’eau à traiter est adsorbé sur le biofilm ou les particules de support (« garnissage ») où
la dégradation microbienne à lieu.
Le garnissage utilisé peut contenir de la matière organique (compost, tourbe…) qui assure une grande
surface d’accrochage et l’apport de nutriments pour les micro-organismes.
Les biofiltres sont des unités qui utilisent des combinaisons de processus fondamentaux : adsorption,
absorption, biodégradation et désorption (Devinny et al., 1999).
La connaissance et le contrôle des différents mécanismes de formation d’un biofilm permettent
d’optimiser l’efficacité de celui-ci.
II.6.2.2
Principales propriétés des biofilms
Un biofilm est une structure complexe et dynamique dont les caractéristiques peuvent varier en
fonction du temps, du support d’adhésion, des micro-organismes mis en jeu, et des paramètres
physico-chimiques environnants.
Un biofilm est une matrice d’aspect gélatineuse constituée par une agglutination de micro-organismes,
adhérents à une surface solide et la plupart du temps immergée dans un milieu liquide aqueux (Melo,
et al. 1994). L’adhésion au support solide se fait grâce à la présence de polymères extracellulaires
(polysaccharides chez les bactéries gram-négatif ou peptidoglycanes chez les bactéries gram-positif)
présents à la surface des micro-organismes. Cette structure extracellulaire permettant l’adhésion des
bactéries à un support est aussi appelée glicocalix (Costerton et al., 1995).
Les biofilms sont le plus souvent hydrophiles ; cette propriété est attribuée à la présence de nombreux
sucres hydrophiles au niveau de la pellicule extracellulaire de polysaccharides. L’adhésion sera donc
facilitée à la surface d’un support hydrophile.
Un biofilm peut être organisé en différentes couches entre la base et la superficie du biofilm. Par
exemple, on peut au sein d’un même biofilm, trouver des zones anaérobies au niveau de la base et
des zones aérobies en contact avec le liquide circulant.
La couleur d’un biofilm peut être variée, allant du blanc translucide au noir, variant selon les microorganismes
présents. Une même souche microbienne va présenter des caractéristiques structurales
différentes lorsqu’elle est libre en solution ou lorsqu’elle est adsorbée à la surface d’un support solide.
L’épaisseur et la densité du biofilm varient en fonction des propriétés physico-chimiques et
biologiques du milieu environnant (conditions hydrodynamiques, composition du milieu circulant,
49
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
vitesse de circulation…). Les densités de biofilms peuvent varier entre 10 kg/m 3 jusqu’à 105 kg/m 3
(Vieira,1995).
La diffusion d’un soluté à l’intérieur du biofilm dépend des caractéristiques du biofilm (densité,
rugosité, etc…) et des conditions de circulation de la solution (vitesse de circulation du fluide…) ainsi
que des propriétés du soluté en question.
II.6.2.3
Comportement des micro-organismes en biofilm
Les micro-organismes se comportent de manière très différente lorsqu’ils sont libres en suspension et
lorsqu’ils sont organisés en biofilm à la surface d’un support solide (Fletcher, 1992). Il apparaît dans la
nature que la bactérie « préfère » résider sur une surface dans un milieu aqueux plutôt que « flotter
librement » (Melo, 1997). Les changements fondamentaux au niveau physiologique et cellulaire qui
apparaissent lors de la formation d’un biofilm, peuvent se traduire par une augmentation de la
résistance des micro-organismes vis à vis des agressions extérieures (O’Toole et al., 2000).
La principale différence est la distance entre les micro-organismes : à l’intérieur d’un biofilm la
proximité des micro-organismes entre eux est bien supérieure à celle observée en solution. D’autre
part, la présence d’une matrice extracellulaire va modifier les propriétés physico-chimiques du milieu
(forces d’interactions superficielles). La formation d’un biofilm va engendrer la création de gradient de
concentration, de pH, de champs électriques, de zones d’aérobiose et anaérobiose qui vont induire
nombre de variations dans le comportement des micro-organismes (Melo et al. ,1994).
Parmi les micro-organismes, les bactéries semblent être les plus adaptées à la formation de biofilm ;
ceci est dû à leur petite taille, à leur taux de croissance élevé, à leur capacité d’adaptation au milieu
ainsi qu’à leur forte capacité à synthétiser des polymères extracellulaires (Vieira, 1995).
Au sein des biofilms formés de communautés bactériennes, on peut trouver de nombreux genres et
espèces différentes. Dans ces communautés, le transfert de gènes est favorisé et les bactéries
échangent leur matériel génétique à des fréquences très élevées (Filloux et Vallet, 2003).
II.6.2.4
Formation des biofilms
L’épaississement du biofilm est en général représenté par une sigmoïde (Figure 9). Après une courte
période de conditionnement, le biofilm se développe rapidement puis se stabilise. Durant le
conditionnement, les (macro)molécules présentes dans le milieu circulant s’accumulent à la surface
du support. Ces (macro)molécules peuvent être des nutriments qui vont attirer les bactéries à la
surface du support et ainsi initialiser le développement et l’épaississement en biofilm (Melo, 1997). Au
niveau du plateau, le biofilm a atteint son épaisseur optimale et un équilibre s’établit entre la
croissance cellulaire (biodisponibilité des nutriments en fonction de l’épaisseur du biofilm) et l’érosion
du biofilm due aux forces appliquées par la circulation du liquide.
Thèse S.GENDRAULT 2004
50

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
Conditionnement
Plateau
Epaisseur du biofilm
Developpement rapide
Temps
Figure 9 : Developpement idéal d’un biofilm (Melo, 1997)
La Figure 10 illustre les différentes étapes de formation d’un biofilm . Ces étapes sont les suivantes :
1. Transfert de masse de (macro)molécules vers la surface du support et adsorption de cellesci
: formation d’un film de conditionnement.
2. Transport des micro-organismes vers la surface adsorbante et adhésion (réversible)
3. Adsorption irréversible des micro-organismes à la surface du support.
4. Transport de nutriments (transfert de masse externe et interne) à l’interface liquide/biofilm et à
l’intérieur du biofilm.
5. Métabolisme cellulaire et transformation du biofilm : production de nouvelles cellules et de
polymères extracellulaires (EPS).
6. Transport des métabolites produits par le biofilm vers l’extérieur.
7. Processus de détachement du biofilm : érosion superficielle ou décollement engendré par les
forces hydrodynamiques ou effets internes.
Thèse S.GENDRAULT 2004
51

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
Nutriments
FLUX
Métabolites
7
Micro -organismes
4
6
1 2
SUPPORT D’ADSORPTION
3
5
BIOFILM
Film de conditionnement
Figure 10 : Les différentes étapes de formation d’un biofilm (adapté de Melo, 1994)
La vitesse de formation du biofilm dépend de la vitesse du processus le plus lent. Par exemple, la
vitesse de transfert des nutriments à l’intérieur du biofilm limite le taux de consommation du substrat
par le biofilm et limite donc sa croissance.
II.6.3
Facteurs influençant la formation et l’activité des biofilms
De nombreux facteurs influencent la formation du biofilm. Les principaux paramètres à prendre en
compte sont : les caractéristiques des micro-organismes, la composition du support d’adsorption et
ses propriétés physico-chimiques, la composition du fluide le traversant, ainsi que de nombreux
paramètres physico-chimiques tels que la température, le pH, la force ionique…On devra également
tenir compte de la vitesse du fluide et de sa turbulence ainsi que de la présence de particules
organiques ou minérales.
II.6.3.1
Caractéristiques des micro-organismes
La formation de pellicule biologique va dépendre de la nature des micro-organismes présents ; d’autre
part, l’état physiologique des micro-organismes, associé à l’excrétion des polymères, sera déterminant
pour l’adhésion à un support.
O’Toole et Kolter (1998) ont développé une méthode de criblage génétique qui a permis de
caractériser un certain nombre de déterminants importants dans la formation de biofilm, dont la
présence d’appendice extracellulaire tels que les flagelles (qui permet à la bactérie de se déplacer en
milieu liquide ou semi-solide) les pili de type IV (structures fibrillaires présentes au pôle de certaines
bactéries à gram négatif ; Wall et Kaiser 1999) ou encore les appendices extracellulaires comme les
fimbriae ou les curli.
52
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
Les flagelles, les pili de type IV ou encore les Cup (fimbrae ou curli), sont des appendices de surface,
essentiels à la formation du biofilm, plus particulièrement dans sa phase initiale (approche et la
colonisation de la surface). Dans l’étape suivante, ces structures ne sont probablement plus
nécessaires et laissent la place à d’autres déterminants qui vont permettre la structuration et la
différenciation du biofilm (Filloux et Vallet, 2003). L’adhésion aux supports solides sera ensuite
facilitée pour des micro-organismes ayant une forte capacité à produire les polymères extracellulaires
(type alginate, par exemple chez P. aeruginosa, lipopolysaccharides…). Ainsi une souche dite
« muqueuse » pourra donner un biofilm d’une épaisseur moyenne de 40 µm, alors qu’une souche
« non muqueuse » ne pourra former qu’un biofilm de 6µm d’épaisseur (Filloux et Vallet, 2003).
II.6.3.2
Le support d’adsorption
La nature du support utilisé joue un rôle essentiel sur la capacité d’adsorption des polluants ainsi que
sur la fixation des micro-organismes. Ce support peut être constitué de particules homogènes ou
hétérogènes, il peut être rugueux ou lisse. Quel que soit le matériau choisi, la connaissance de ses
caractéristiques physico-chimiques et biologiques est fondamentale ; l’influence du microflore indigène
pouvant influencer notablement la formation d’un biofilm à sa surface (possibilité de compétition entre
les micro-organismes indigènes et exogènes).
Le support est un matériau solide qui peut être de nature organique, tels que : tourbe, compost
végétal, écorce de pin, fumier, gousse de cacahuètes (Chou et al. 1997 ; Ramirez et al. 1997) ou
charbon actif (Feakin et al. 1995, Servais et al. 1991, Scott et al. 1995, Jones et al. 1998). On trouve
également des matériaux inorganiques comme les matériaux argileux, le verre (Jucker et al. 1996), ou
des matériaux synthétiques comme la mousse, les billes de polystyrène (Devinny et al. 1999), des
structures Teflon (Jucker et al. 1996) ou encore des résines de type Ambérlite (Grosser et al. 2000),
etc…
Le Tableau 5 présente quelques exemples de matériaux utilisés pour la biofiltration lors de récentes
études expérimentales.
Thèse S.GENDRAULT 2004
53

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
Tableau 5 : Supports utilisés dans les systèmes de biofiltration (selon Métivier, 2001)
Support d’adsorption
Références
Compost Cardenas-Gonzales et al. 1999
Compost / perles de polystyrène Jan et al. 1998
Compost / charbon actif / lime / perles polystyrène Campbell et Connor 1997
Compost / charbon actif Hwang et Tang 1997
Compost / celite R-635 Sanchez-Pena et al. 2000
Compost / perlite Morgenroth et al. 1996
Compost de fumier de porc Chou et Cheng 1997
Compost / tourbe / bois Hsu et al. 2000
Compost / perlite / charbon actif Lee at al. 1999
Bioton® / charbon actif Deshusses et al. 1996
Sol / compost / écorce de pin Marran et Lausten 2000
Tourbe Wang et al. 1996
Tourbe / perle en verre Zilli et al. 2000
Tourbe / perlite Budwill et Coleman 2000
Tourbe / matériaux minéraux Wu et al. 1999
Ecorce de pin Douglas Lewis et al. 2000
Déchets des écorces / perlite Lee et al. 1996
Ecorce de pin / compost d’ordure de poulet Lackey et al. 1998
Charbon actif
Feakin et al.1999
Support d’adsorption
Références
Coquilles de cacahuètes Ramirez-L 1997
Billes d’alginate Chung et al. 1997
Boues granulées Gracian et al. 1998
Particules de biomasse Jorio et al. 2000
Mousse de polyuréthane Moe et Irvine 2000
Céramique / diatomée Lim et al. 2001
Les principales caractéristiques physiques du support à prendre en compte sont la
granulométrie, la porosité, la surface spécifique, la taille des pores, la perméabilité du lit constitué et la
capacité de rétention en eau ; ces paramètres permettront d’approcher le comportement
hydrodynamique du biofilm. Les caractéristiques chimiques essentielles d’un support sont le pH de
surface, la teneur en carbone, en azote, la nature des fonctions de surface et la charge, ainsi que la
composition ; celles-ci seront représentatives de la qualité du garnissage pour le développement et la
croissance du biofilm.
Thèse S.GENDRAULT 2004
54

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
En règle générale, le support solide est un milieu poreux ; il doit donc présenter une grande surface
d’adsorption et une faible résistance au passage du fluide afin de réduire les pertes de charge. La
présence de micro-pores peut favoriser l’adsorption en créant une grande surface spécifique (Durham
et al. 1994 ). Parfois, le mélange de différents matériaux permet d’optimiser l’efficacité du biofiltre et
confère au filtre des propriétés mécaniques favorables, permettant par exemple d’éviter des
phénomènes de colmatage.
Pour une bonne adhésion des micro-organismes, le support doit de préférence être hydrophile, avoir
une surface rugueuse et ne doit pas être toxique (Durham et al. 1994).
D’autre part, la connaissance de sa biodégradabilité renseignera sur la stabilité du support. La
présence d’une activité microbienne à l’intérieur même du milieu filtrant aura également un rôle
essentiel sur le développement du biofilm, puisque celle-ci pourra engendrer des phénomènes de
compétition parfois non négligeables.
II.6.3.2.1
Caractéristiques physiques du support d’adsorption
Les principales caractéristiques physiques déterminantes pour le choix d’un support sont les
suivantes :
Surface spécifique et taille des pores :
Plus la surface spécifique du support sera élevée, meilleur sera le développement des microorganismes
à sa surface. La surface spécifique est de l’ordre de 380.10 3 m 2 .m -3 pour le compost, de
29.10 3 m 2 .m -3 pour l’écorce de pin (Smet et al. 1996), et de 500.10 6 m 2 .m -3 pour le charbon actif
(Barbulea, 2000). Les micropores sont peu occupés par les micro-organismes ; Tang et al. (1996)
estiment par exemple, que le biofilm formé sur un support de compost occupe une surface de
185 m 2 .m -3 seulement. Vieira (1995) a constaté que les supports d’adsorption dont les pores étaient
de dimensions 4 à 5 fois supérieures à la taille des micro-organismes, constituaient un support idéal
pour l’adhésion et le développement de biofilm.
Masse volumique :
Les matériaux de faible masse volumique sont recommandés ; un matériau léger et qui comporte de
bonnes propriétés mécaniques évitera ainsi des problèmes de tassement. Les problèmes de
colmatage sont également à prendre en compte. Le compost est un bon exemple de matériau de
faible masse volumique (300 à 500 kg.m -3 , humide) mais pose souvent des problèmes de colmatage à
cause notamment de sa faible granulométrie. Les sols (1000 à 5000 kg.m -3 pour un sol en place) sont
des matériaux beaucoup plus denses.
Thèse S.GENDRAULT 2004
55

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
Indice de vide ou porosité intergranulaire :
C’est l’espace disponible entre les particules d’un support ou garnissage, pour le passage d’un fluide
volume de " vide"
liquide ou gazeux à travers un lit. Un indice de vide élevé (ε ≥ 0,7 avec ε =
) peut
volume total
éviter de fortes pertes de charge et des problèmes de colmatage (Kennes et Thalasso 1998 ; Le
Cloirec 1998). Une distribution homogène des diamètres de particules, induit un écoulement du fluide
plus uniforme à travers le lit garni. Un indice de vide compris entre 0,3 et 0,7 est conseillé pour un
biofiltre ( Martin et al. 1993 ; Baltzis et al. 1994 ; Bohn 1996 ; Kennes and Thalasso 1998).
Capacité de rétention en eau :
Le support doit de préférence posséder une capacité de rétention en eau élevée pour fournir aux
micro-organismes l’eau nécessaire à leur croissance. L’eau retenue par le support favorise
l’accrochage des cellules à celui-ci. La capacité de rétention en eau est fondamentale car elle permet
le maintient des propriétés structurales du support. L’eau permet le transfert des polluants vers le
biofilm. Une capacité de rétention en eau comprise entre 40 et 80% (massique) est convenable quand
le support est saturé (Ottengraf 1986 ; Devinny 1999).
Granulométrie et caractéristiques de surface
La taille des particules d’adsorbant ainsi que leur composition peuvent stimuler ou non l’adhésion du
biofilm. De manière générale, les études réalisées sur le développement des biofilms montrent que :
• L’adhésion des micro-organismes sur des particules est facilitée par la présence de charges
positives à la surface de celles-ci.
• Des inhibiteurs métaboliques ou la présence de métaux à la surface des particules peuvent
influencer la formation du biofilm.
La rugosité du support affecte particulièrement la rétention mécanique des (macro)molécules et des
micro-organismes et donc leur adhésion au support. De manière générale, l’augmentation de la
rugosité d’un support augmente la rétention des micro-organismes à sa surface. Après avoir étudié la
formation des biofilms sur différentes surfaces, Mott (1991) observe que sur une surface lisse (tube
d’acier inoxydable électropoli), le développement d’un film bactérien de Pseudomonas fluorescens est
35% moins dense que sur un même tube d’acier non poli.
Ce sont les irrégularités du support qui vont conditionner la formation des premières pellicules
biologiques.
Il est donc nécessaire de trouver un bon équilibre entre tous ces paramètres physiques afin d’assurer
une bonne stabilité du garnissage, d’éviter les colmatages et la formation d’agrégats de particules de
support.
Thèse S.GENDRAULT 2004
56

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
II.6.3.2.2
Caractéristiques chimiques du support d’adsorption
Les principales caractéristiques chimiques du support d’adsorption à prendre en compte pour le bon
développement d’un biofilm sont les suivantes :
Le pH :
D’une manière générale, les micro-organismes requièrent pour leur bon développement, un pH
proche de la neutralité ; le matériau utilisé devra de préférence posséder un pouvoir tampon. Les
supports organiques utilisés possèdent en général des pH compris entre 6 et 8. L’addition de
carbonate de calcium, carbonate de sodium, de soude ou autre composé tampon est préconisée lors
de l’utilisation de garnissage à faible pouvoir tampon. Dans certains cas particuliers, on pourra
observer le développement d’un biofilm à la surface de support possédant de faible pH (5-6) ; c’est le
cas pour un garnissage d’écorce de pin (Ramirez-Lopez, 2001).
Nutriments inorganiques et matière organique :
La présence de nutriments dans le garnissage favorise le développement des micro-organismes à sa
surface. Le matériau considéré peut être une source de carbone, d’azote, d’hydrogène ou d’oxygène,
ou source de minéraux, ou encore de vitamines. Pour un support de compost, on trouve des
concentrations en azote, phosphore et potassium aux alentours de 0,4%, 0,15% et 0,15% (w/w sur
produit sec) respectivement, ce qui représente des concentrations satisfaisantes pour une bonne
activité microbienne. Dans le cas de garnissage pauvre en nutriments, il sera nécessaire d’apporter
ces nutriments par circulation d’une solution nutritive.
Les fonctions de surface :
Les fonctions chimiques présentes à la surface du support peuvent être acides ou basiques et
influencent l’adhésion des micro-organismes et l’adsorption des polluants à sa surface.
II.6.3.2.3
Caractéristiques microbiologiques du support d’adsorption
L’utilisation d’un biofilm pour l’épuration d’un fluide peut se faire de différentes manières :
- dans un premier cas, le biofilm peut être constitué de micro-organismes endogènes au
support, c’est à dire naturellement présents (dans un compost, une tourbe ou autre). A titre
d’exemple, les supports comme l’écorce de pin ou la tourbe contiennent des populations
bactériennes spécifiques répondant facilement à de nouvelles conditions d’alimentation en air
ou en eau polluée et sont connues pour éliminer certains polluants (Bohn 1996).
- Dans d’autres cas, pour un polluant particulier, ou pour un garnissage pauvre en microorganismes
(matériau synthétique par exemple), une inoculation est nécessaire avec des
boues activées, du sol, du compost ou des cultures bactériennes pures ou en consortium, afin
d’obtenir le biofilm désiré.
Thèse S.GENDRAULT 2004
57

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
Dans le cas d’une inoculation de micro-organismes étrangers au support d’adsorption, il est
nécessaire de s’assurer de la survie et de l’adhésion de ces micro-organismes sur le garnissage, qui
peut être perturbée par compétition entre la microflore endogène et la ou les souches inoculées.
L’inoculation de micro-organismes exogènes en grande quantité permet d’avantager la flore exogène
dans sa compétition avec les différentes souches bactériennes présentes au sein du support.
Dans certains cas, une stérilisation préalable du support peut être recommandée.
II.6.3.3
Composition du fluide
Le pH de la solution circulante est également l’un des paramètres principaux influençant la formation
du biofilm. Le pH de la solution va conditionner la physiologie des micro-organismes ainsi que les
propriétés électriques des cellules et du support d’adsorption. En fonction du pH, les fonctions
chimiques présentes à la surface des cellules, des macro-molécules et du support vont être plus ou
moins répulsives ou attractives (Melo, 1994).
La composition de la solution va également affecter la production de bio-polymères responsables de
l’adhésion des cellules ; cette production est stimulée par un rapport carbone/azote élevé (Wimpenny
et al. 1977, Robinson et al. 1984).
D’autre part, la disponibilité des nutriments est également un facteur influençant l’épaisseur de biofilm
(Bott et Miller 1983). Des expériences menées par Trulear et Characklis (1982) ou Characklis (1990)
démontrent qu’à une vitesse constante, le biofilm sera d’autant plus épais que la charge organique du
fluide sera importante (Figure 11).
300
Epaisseur de biofilm (µm)
250
200
150
100
50
0
-▲- 1 g.m- 2 .h -1
-■ - 0,4 g.m- 2 .h -1
-♦ - 0,2 g.m- 2 .h -1
0 50 100 150 200
Temps (h)
Figure 11 : Influence de la charge organique sur l’épaisseur du biofilm (inspiré de Characklis 1990)
58
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
La présence de nutriments en grande concentration aurait tendance à former des structures de biofilm
« ouvert » ; avec de plus faibles concentrations, on observe des structures plus compactes (Melo
1997). Une structure ouverte facilite la diffusion des nutriments vers les cellules du biofilm. Pour les
bactéries aérobies, le biofilm « ouvert » facilite également le transfert d’oxygène.
L’apport répété de fortes charges organiques ainsi que les carences en nutriments peuvent provoquer
le décollement du biofilm (Characklis et al. 1990).
II.6.3.4
Effet de la vitesse de circulation du fluide
D’une manière générale, l’augmentation de la vitesse de circulation du fluide peut avoir 2 effets
principaux :
L’augmentation du transfert de masse (nutriments pour les micro-organismes), qui pourra être
bénéfique pour la croissance du biofilm
L’augmentation de l’érosion, pouvant entraîner le décollement du biofilm.
L’augmentation de la vitesse de circulation entraîne la formation de biofilm plus fins mais plus denses.
Ainsi, la diffusion des nutriments est plus difficile dans ceux-ci que dans les biofilms formés à faibles
flux. Cependant, un biofilm dense sera plus stable et aura une meilleure résistance à l’érosion,
imposée par les forces hydrodynamiques extérieures.
La Figure 12, tirée des travaux de Pinheiro et al. (1988), représente l’effet de la vitesse du fluide
circulant sur la formation du biofilm. Cette figure montre qu’à faible vitesse (0,25 m.s -1 ), la période
d’induction est beaucoup plus longue qu’à des vitesses supérieures ; à faible vitesse, le transfert de
masse est l’étape limitante.
0,004
v = 0,25m/s
0,003
Rf (m 2 .Kg -
Rf (m2.K/W)
0,002
0,001
v = 0,44m/s
v = 0,72m/s
v = 0,80m/s
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Temps (j)
v = 1,24m/s
Figure 12 : Effet de la vitesse de circulation sur la formation du biofilm (inspiré de Pinheiro et al., 1988)
Thèse S.GENDRAULT 2004
59

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
II.6.3.5
Effet de la température
Les changements de température affectent particulièrement l’état physiologique des microorganismes.
Pour la plupart des bactéries, des températures allant de 30 à 35 °C représentent des
températures idéales de développement et de croissance.
Les micro-organismes sont très sensibles aux changements de températures. Bott et al. (1977) ont
montré que l’épaisseur d’un biofilm de Escherichia coli augmentait de 80% lorsque la température
passait de 30 à 35°C.
II.6.4
Cinétique de biodégradation d’un substrat
dC
La plupart du temps, la cinétique de dégradation d’un substrat ( − L
dt
dX
de croissance des micro-organismes ( ), comme suit :
dt
) peut être reliée à la vitesse
dX
dt
= µ . X
= −Y
dC
dt
L
où µ est la vitesse spécifique ou taux de croissance des micro-organismes (T -1 ) et Y le coefficient de
rendement cellulaire (M cell .mol -1 ).
Le taux de croissance (µ) dépend de la concentration en substrat (C L ) disponible pour les microorganismes,
et est décrite par l’équation de Monod :
µ
µ
K
s
C
L
+ C
L
= max ( )
Dans le cas particulier où de fortes concentrations de substrat inhibent la croissance, l’équation de
Haldane est utilisée :
où K i est la constante d’inhibition.
µ
C
max L
µ =
2
K
s
+ CL
+ CL
K
i
Dans un domaine de concentrations non inhibitrices, la cinétique de biodégradation d’un substrat peut
alors globalement être décrite par modèle de suivant :
60
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Procédés de traitement
dC
ν = −
dt
L
=
µ max
Y
CL
K + C
s
L
X
où
ν C
ν = max
K + C
s
L
L
X
avec:
X : Densité ou concentration de biomasse (M.L -3 )
µ max : Vitesse maximale de croissance (T -1 )
Y : Coefficient de rendement cellulaire (M bio .mol -1 de substrat)
C L : Concentration de polluant dans le liquide (Mol.L -3 )
v max : Vitesse maximale spécifique de dégradation (Mol.L -3 .T -1 )
K s : Constante de Monod (Mol.L -3 )
v : Vitesse de consommation de substrat (Mol.L -3 .T -1 )
Lorsque les concentrations en substrat sont très fortes par rapport à K s , le substrat n’est pas limitant et
la vitesse de dégradation tend vers
ν
max
. X =
µ
K
max
. s
Y
X
et la cinétique de dégradation sera d’ordre zéro par rapport au substrat. Quand les concentrations en
substrat sont bien inférieures à K s , la vitesse de dégradation est quasi proportionnelle à la
concentration en substrat et la cinétique de dégradation sera du premier ordre par rapport au substrat.
On a donc souvent une réaction d’ordre zéro par rapport au substrat près de l’entrée du biofiltre, où
les concentrations sont fortes et de premier ordre par rapport au substrat en s’éloignant de l’entrée à
travers le biofiltre, où les concentrations décroissent.
Thèse S.GENDRAULT 2004
61

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas
III. Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
III.1 Introduction
Les nombreuses pollutions à l’atrazine rencontrées un peu partout dans le monde, dues à l’utilisation
intensive de cet herbicide depuis les années 60, ont motivé de nombreux travaux de recherche sur les
modes de dépollution. Parmi les procédés retenus, pour la décontamination de sols et des eaux
pollués par les pesticides, les traitements biologiques offrent un avantage économique important
comparé aux procédés physico-chimiques classiques, beaucoup plus complexes dans leur réalisation
et souvent très onéreux.
La recherche de micro-organismes capables de dégrader les pesticides date d’une vingtaine
d’années. De nombreux chercheurs ont isolé, à partir de sols pollués, différents micro-organismes
pour leur capacité à dégrader l’atrazine et donc potentiellement utilisables lors d’un traitement
biologique. Parmi les nombreuses souches isolées, la plupart d’entre elles n’offraient qu’une
dégradation partielle du pesticide (Rhodococcus sp. B30 (Behki et Khan , 1994), Nocardioides sp.
(Topp, 2000), Clavibacter michiganese ATZ1 (de Souza, 1998)…), tandis que d’autres parvenaient à
mineraliser l’atrazine (Pseudomonas sp. YAYA6 (Yanze-Kontchou, 1994), Pseudomonas sp. ADP
(Mandelbaum, 1995), Agrobacterium radiobacter J14A (Struthers, 1998), Pseudomonas sp. CN1 (de
Souza, 1998)...) .
Le Tableau 5 donne une liste (non exhaustive) des micro-organismes isolés pour leur capacité à
métaboliser l’atrazine.
Thèse S.GENDRAULT 2004
62

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas
Tableau 6 : Liste non exhaustive des micro-organismes isolés capables de dégrader l’atrazine
Souche
Produits de
dégradation
Minéralisation
Références
Acinetobacter calcoaceticus DEA, DIA _ Migrain et al. (1993)
Agrobacterium radiobacter
J14A
CO 2 + Struthers et al. (1998)
Arthrobacter aurescens strain alkylamines + acide
TC1
cyanurique
_ Strong et al (2002)
Arthrobacter sp. AD1 _ Cai et al. (2003)
Chelatobacter heintzii Cit1 Rousseaux et al (2003)
Clavibacter michiganese ATZ1 HA + N-ethylammelide _ De Souza et al. (1998a)
Hymenoscyphus ericae _ Donnelly et al. (1993)
Klebsiella pneumoniae CO 2 + NH 4 + Ernst & Rhem (1995)
Mycelia sterilia INBI 2-26 Vasil’chenko et al. (2002)
Nocardioides sp. C190 HA + N-ethylammelide _ Topp et al. (2000a)
Nocardioides sp. SP12 Acide cyanurique _ Piutti et al. (2003)
Phaneochaete chrysosporium DEA + DIA _ Mougin et al (1994)
Pleurotus pulmonarius HIA - Masaphy et al. (1993)
Pseudomonas sp. DEA, DIA _ Bekhi & Khan (1986)
Pseudomonas sp. YAYA6 CO 2 +
Yanze-Kontchou & Gschwind
(1994)
Pseudomonas sp. ADP CO 2 + NH 4 + Mandelbaum et al. (1995)
Pseudomonas sp. CN1 Acide cyanurique + CO 2 + De Souza et al. (1998a)
Pseudomonas alcaligenes
+ Agrobacterium sp.
DEA, DIA _ Migrain et al. (1993)
Pseudomonas putida
+ Xanthomonas maltophilia
DEA, DIA _ Migrain et al. (1993)
Pseudoaminobacter sp. CO 2 + Topp et al. (2000b)
Streptomyces sp. PS1/5 DEA + DIA _ Fadullon et al. (1998)
Ralstonia M91-3 Biuret + CO 2 + NH 4 + Radosevich et al. (1995)
Rhizobium sp. HA - Bouquard et al. (1997)
Rhodococcus sp. B30 _ Bekhi & Khan (1994)
Rhodococcus sp. N186/21 HIA _ Nagy et al. (1995)
Rhodococcus TE1 DEA, DIA _ Behki et al. (1993)
HIA = hydroxy-isopropylamino-atrazine
DEA = deséthylamino-atrazine
DIA = desisopropylamino-atrazine
HA = hydroxyatrazine
Thèse S.GENDRAULT 2004
63

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas
Pseudomonas sp. ADP, connue pour ses capacités à minéraliser rapidement l’atrazine, a été et est
encore l’une des souches les plus étudiées depuis son isolement en 1995 par Mandelbaum et al.
(1995). De nombreuses équipes se sont penchées sur le métabolisme de dégradation de l’atrazine
par Pseudomonas ADP sp. et sont parvenues à isoler les gènes codant pour la synthèse des
enzymes impliquées. D’autres ont cherché à utiliser Pseudomonas ADP sp. pour des traitements
biologiques de dépollution et ont étudié ses limites d’adaptation à différents environnements.
Pseudomonas ADP sp. est également la souche que nous avons choisi d’utiliser dans notre procédé
de traitement combiné.
Ce chapitre a pour but de présenter l’historique de cette souche depuis son isolement en 1995 jusqu’à
l’identification des gènes responsables de la dégradation de l’atrazine, ainsi que les différentes
applications de dépollution mettant en jeu Pseudomonas ADP sp.
III.2 Isolement de Pseudomonas ADP sp.
En 1993, l’équipe de Mandelbaum isole d’un sol agricole pollué du Minnesota, le consortium LFB6,
reconnu capable de dégrader l’atrazine dans les sols (Mandelbaum et al. , 1993b). Les expériences
menées avec du 14 C montrent la capacité du consortium à minéraliser l’atrazine. La dégradation
observée est très rapide (24 h pour une concentration initiale en atrazine de 100 mg.L -1 ) dans un sol
argileux ou dans du sable (Mandelbaum et al. , 1993b) ; elle a lieu aussi bien en présence des cellules
entières qu’avec des extraits protéiques du consortium. L’hydroxyatrazine est la première molécule
identifiée comme métabolite intermédiaire de dégradation (Mandelbaum et al. , 1993b).
Rapidement, les capacités du consortium sont testées ; on étudie notamment l’influence de
paramètres classiques tels que la température, le pH, l’effet de la salinité… La biodégradation de
l’atrazine par le consortium LFB6 est observée à partir de 15°C à des pH allant de 5,5 à 8,5
(Mandelbaum et al, 1993a).
C’est en 1995, à partir du consortium LFB6, que l’équipe parvient finalement à isoler et caractériser la
souche bactérienne responsable de la minéralisation de l’atrazine. Sa séquence ARN16S, comparée
aux bases de données de Genbank, révèle qu’il s’agit d’une Pseudomonas sp. (Mandelbaum et al,
1995). Pseudomonas ADP sp. révèle sa capacité à minéraliser l’atrazine présente à des
concentrations particulièrement élevées (>1000 mg/l) utilisant l’herbicide comme seule source d’azote.
D’autre part, Pseudomonas ADP métabolise plus d’atrazine que ce dont elle a besoin pour son propre
métabolisme. En milieu liquide, 100 mg.L -1 d’atrazine sont dégradés en 90 minutes par 9.10 9 cell/ml
(Mandelbaum et al.,1995).
Thèse S.GENDRAULT 2004
64

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas
III.3 Taxonomie et exigences métaboliques
Le tableau suivant réalisé à partir des travaux de Mandelbaum et al., résume les principales
caractéristiques taxonomiques de Pseudomonas ADP sp.
Tableau 7 : Principales caractéristiques taxonomiques de Pseudomonas sp.ADP
Gram Mobilité Flagelle Forme
Couleur
des
colonies*
Aspect sur
boite*
Contours des
colonies*
Croissance King’s
B
négatif +
1
polaire
bâtonnet
beige
Opaque
Centre foncé
irréguliers

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas
rapport aux études précédentes. Ces études montrent que d’une manière générale, les temps de
demi-vie de l’atrazine dans un sol biologiquement actif est de l’ordre de quelques mois ; dans les
cultures pures ou cultures « enrichies » le temps de demi-vie de l’atrazine est en général de quelques
semaines, contre quelques jours pour les cultures de Pseudomonas ADP sp.
Tableau 9 : Demi-vie de l’atrazine dans différentes conditions (cité dans Mandelbaum et al. 1993a)
Milieu pH Température (°C) Demi-vie (jours) Références
Sol 4,8-6,5 22 53-113 Burkart et al. 1988
Sol 5,6-6,6 Cond. Champs 37-168 Erickson et al. 1989
Sol-Eau boueuses 4,5 65-113 Armstrong et al. 1968
Eau filtrée stérile 5-9 25 64-200 Burkart et al. 1988
Bactéries issues de
déchets industriels
>7 Geller et al. 1980
Pseudomonas spp. 6,8-7,0 28 >35 Behiki et al. 1986
Aspergillus fumigatus 24 Helgesen et al. 1975
Culture enrichie >42 DeLuca 1992
Culture Pseudomonas
ADP sp. (12
Mandelbaum et al.
7,3 25 0,5-2
précultures à
1993a
100 mg. L -1 )
Culture Pseudomonas
ADP sp. . (6
Mandelbaum et al.
7,3 25 4-8
précultures à
1993a
100 mg. L -1 )
(références dans Mandelbaum 1993)
Mandelbaum et al. (1995) ont montré que la croissance de Pseudomonas ADP sp. et son activité de
biodégradation de l’atrazine n’étaient pas directement corrélées. Ainsi, Pseudomonas ADP sp. est
capable de minéraliser l’atrazine dans des conditions non favorables à sa croissance.
Pseudomonas ADP sp. continuerait de métaboliser l’atrazine au delà de ses besoins en azote. Ceci
serait lié au fait que quelques enzymes responsables du métabolisme de l’atrazine seraient présentes
dans le cytoplasme ou le periplasme des bactéries.
Thèse S.GENDRAULT 2004
66

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas
III.4 Mécanisme de dégradation de l’atrazine et isolement des gènes
de Pseudomonas ADP sp. impliqués dans la minéralisation de
l’atrazine
Parmi les différentes bactéries isolées, capables de dégrader l’atrazine, on peut remarquer que la
première étape de dégradation biologique de l’atrazine a lieu soit par N-dealkylation soit par
dechloration (Struthers et al. 1998).
La Figure 12 représente la voie catabolique de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Figure 13 : Mécanisme de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.selon Martinez et al.
(2001)
67
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas
Le métabolisme de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. a été largement exploré au cours de ces
dernières années et la séquence complète des gènes codant pour les enzymes impliquées dans le
catabolisme de l’atrazine a été déterminée (gènes AtzA à Atz F). Elle contient 108,845 nucléotides
situés sur le plasmide pADP-1 et répartis sur 3 régions différentes.
Des gènes similaires, codants pour ces mêmes enzymes ont été retrouvés chez une grande variété
de bactéries, gram-négatif ou gram-positif (Bouquard et al, 1997 ; de Souza et al., 1998 ; Radosevich
et al., 1995 ; Rousseaux et al., 2001 ; Topp et al., 2000).
Le métabolisme de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. comporte une première étape de
déchloration catalysée par une atrazine chlorohydrolase (AtzA) et conduisant à la formation
d’hydroxyatrazine (HA) (de Souza et al. 1995 et 1996). AtzB catalyse ensuite l’hydrolyse de
l’hydroxyatrazine (HA) formée à la première étape pour donner du N-isopropylammelide (Boundy-Mills
et al. 1997). La troisième étape implique une N-isopropylammelide isopropylaminohydrolase (AtzC)
qui par hydrolyse du substrat forme l’acide cyanurique (Sadowsky et al. 1998). S’en suit un clivage du
cycle triazine et la formation de Biuret (AtzD), Allophanate (AtzE) pour finalement donner de
l’ammonium et du dioxyde de carbone par une ultime réaction (AtzF) (Martinez et al. 2001).
Les produits issus des premières et deuxièmes étapes de dégradations de l’atrazine par
Pseudomonas ADP sp. sont des métabolites non phytotoxiques, et moins mobiles que l’atrazine
(Boundy-Mills et al., 1997).
III.5 Différentes applications
III.5.1
Traitement des eaux résiduelles d’usine de fabrication de pesticides
Certains auteurs ont imaginé utiliser Pseudomonas sp. ADP pour traiter les eaux résiduelles d’usine
de fabrication de pesticide, avant qu’elles ne soient rejetées dans les eaux usées municipales. La
présence de forte concentration en sels (> 4%) dans ces eaux résiduelles représente un obstacle pour
tout traitement biologique. Pour survivre dans un milieu dont la salinité est élevée les cellules doivent
lutter contre la pression osmotique par accumulation dans le cytosol de solutés dits osmolytes. Shapir
et al. (1998) ont montré que Pseudomonas ADP sp. était capable de survivre dans un milieu riche en
sel (jusqu’à 4% de NaCl) par synthèse de thréalose comme principal osmolyte. De plus, prouvant que
Pseudomonas ADP sp. était capable de minéraliser l’atrazine dans des eaux résiduelles réelles à 3%
de NaCl (réduction de la concentration en atrazine de 25 à 3 mg.L -1 en 48h), ils concluent à la
possibilité d’utiliser cette souche dans le traitement des effluents liquides d’usines de synthèse
d’atrazine.
Thèse S.GENDRAULT 2004
68

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas
Auparavant, Kauffmann et Mandelbaum (1996) avaient pensé, afin de s’affranchir des problèmes de
survie bactérienne dans les effluents industriels, utiliser les enzymes de Pseudomonas ADP sp.
impliquées dans la dégradation de l’atrazine, en les isolant et en les fixant dans une matrice
(tetraméthyl orthosilicate sol-gel). Les performances de cette technique se sont avérées limitées car la
production de méthanol lors de la formation du gel entraînait une réduction de l’activité des enzymes ;
jusqu’à présent aucune autre étude n’a été publiée à ce sujet.
III.5.2
Traitement des sols pollués
D’autres auteurs, comme Masaphy et Mandelbaum (1997), ont proposé d’utiliser Pseudomonas ADP
sp. pour le traitement in situ de sols contaminés à l’atrazine. Ils ont montré l’efficacité d’un procédé de
bioaugmentation (addition de micro-organismes au sol) et étudié l’effet du vieillissement (et donc de la
biodisponibilité) de l’atrazine dans le sol, sur la capacité des bactéries à consommer l’herbicide. Ainsi,
dans un sol contenant initialement environ 20 µg d’atrazine par gramme de sol sec, jusqu’à 80% sont
minéralisés par bioaugmentation avec Pseudomonas ADP sp.
Newcombe et Crowley (1999) ont également suggéré l’utilisation de Pseudomonas ADP sp. pour
traiter des sols pollués par bioaugmentation. Ils ont noté que l’application répétée de Pseudomonas
ADP sp. sur un sol pollué, augmentait significativement le taux de minéralisation de l’atrazine. Ainsi,
dans leurs expériences en mesocosmes (atrazine initialement présente à 100 mg.kg -1 de sol), 90% de
l’atrazine sont minéralisés en 35 jours dans le sol inoculé tous les 3 jours avec Pseudomonas ADP sp.
contre 17% seulement lorsque le sol est inoculé une fois seulement.
Kristensen et al. (2001) remarquent que le temps de résidence de l’atrazine dans le sol à traiter influe
particulièrement sur la biodisponibilité de celle-ci vis à vis des micro-organismes et donc sur sa
minéralisation : plus l’atrazine aura été en contact longtemps avec le sol, plus elle aura formé des
liaisons avec le matériau, moins la minéralisation sera efficace. Chung et Alexander (1998) notent
également que plus le sol contient de la matière organique, plus l’effet de biodisponibilité en fonction
du temps de séjour de l’atrazine est important.
III.5.3
Décontamination de sédiments et aquifères pollués
Clausen et al. (2002) ont quant à eux étudié la capacité de Pseudomonas ADP sp. a survivre et
minéraliser l’atrazine dans des sédiments en conditions aérobies et en conditions de dénitrification.
Leurs expériences montrent qu’à 10°C, Pseudomonas ADP sp. est capable de minéraliser 50% de
l’atrazine présente initialement 0,6 mg.L -1 en 14 jours aussi bien en conditions aérobies qu’en
conditions d’anoxie en présence de nitrates comme accepteurs final d’électrons. Ils notent cependant,
qu’à fortes concentrations en nitrate (100 mM) la minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP
69
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas
sp est inhibée. Quelques années auparavant, Bichat et al. (1999) et Katz et al. (2000) avaient déjà
montré la capacité de Pseudomonas ADP sp. à minéraliser l’atrazine en conditions d’anoxie, en
présence d’une source exogène en azote (NH 4 , NO 3 , Urée ou Glycine) et concluaient que la
dégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. n’était pas affectée par la présence d’azote
exogène.
L’existance de telles souches microbiennes capables de dégrader un polluant dans des conditions
d’anoxie en présence de nitrate comme accepteur d’électrons présente un avantage économique
important pour le traitement de sols ou de sédiments comparé aux traitement biologiques aérobie où
l’aération forcée à travers le matériau pollué représente un coût non négligeable.
Au Danemark, Kristensen et al. (2001) ont également étudié en laboratoire le traitement biologique
d’aquifères crayeux. Les résultats de minéralisation montrent que le temps de résidence de l’atrazine
dans le milieu crayeux avait une légère influence sur sa minéralisation par Pseudomonas ADP sp. 50
% de l’atrazine sont minéralisés lorsque celle-ci est incorporée 1 jour avant bioaugmentation, contre
40% lorsque l’atrazine est incorporé 3 mois plus tôt.
Thèse S.GENDRAULT 2004
70

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Etude de d’adsorption
IV. Description mathématique du processus d’adsorption
Ce chapitre a pour but de rappeler les bases scientifiques nécessaires à l’exploitation de nos résultats
concernant les phénomènes d’adsorption et d’hydrodynamique pour les études en colonne. Il décrit
globalement les modèles classiques utilisés pour décrire l’adsorption d’un substrat sur une phase
solide et l’écoulement d’une solution à travers un milieu poreux.
IV.1 Modélisation de l’équilibre d’adsorption
L’adsorption s’effectue par formation de liaisons entre les molécules de solutés (adsorbat) et les
groupes fonctionnels ou sites d’adsorption à la surface des particules solides (adsorbant). Lors d’un
processus d’adsorption sur un milieu poreux, les molécules sont transférées par diffusion vers la
surface externe de la particule d’adsorbant et sont ensuite éventuellement transférées vers les cavités
constituées par les pores internes du matériau (surfaces internes).
L’adsorption est un phénomène chimique ou physique ; il est souvent difficile de faire la distinction
entre ces deux types de mécanismes. D’une manière générale, on peut dire que les chaleurs
d’adsorption pour les interactions de type physique sont de l’ordre de quelques kJ par mole, tandis
qu’une adsorption chimique entraînera des chaleurs plus importantes, en général supérieures à 2-3
kJ.mol -1 . On peut également différencier ces deux phénomènes en comparant leur spécificité :
l’adsorption chimique est hautement spécifique alors l’adsorption physique est non spécifique. D’autre
part, l’adsorption physique est favorisée par la diminution de la température alors que le phénomène
chimique est souvent favorisé par une augmentation de température (Ruthven, 1938).
L’adsorption physique met en jeu des forces d’attraction faibles dont : des interactions
électrostatiques, forces de van der Waals, dipôle-dipôles,…
Le transfert d’électrons impliqué dans l’adsorption de type chimique entraîne la formation de liaisons
covalentes entre le soluté et la surface de l’adsorbant.
Pour décrire l’équilibre d’adsorption à l’interface liquide/solide, on exprime la quantité de soluté
adsorbée à l’équilibre par unité de masse d’adsorbant (q e ), en fonction de la concentration restante
dans la solution à l’équilibre (C e ). Une fonction de ce type représente une isotherme d’adsorption et
définit l’équilibre thermodynamique à une température constante.
Thèse S.GENDRAULT 2004
71

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Etude de d’adsorption
Le bilan matière utilisé pour représenter l’équilibre d’adsorption à un seul composé en milieu dispersé
parfaitement agité est donné par l’équation suivante :
V ( C0 − Ce
) = m ( qe
− q0
)
où :
V : volume de la suspension (L 3 )
C 0 : concentration initiale dans la phase liquide (M.L -3 )
C e : concentration dans la phase liquide à l’équilibre (M.L -3 )
q 0 : concentration initiale dans la phase solide (M soluté.M -1 d’adsorbant)
q e : concentration dans la phase solide à l’équilibre (M soluté.M -1 d’adsorbant)
m : masse d’adsorbant (M)
Différents modèles mathématiques ont été établis pour représenter l’équilibre d’adsorption d’un seul
composé. Parmi les modèles les plus souvent utilisés on peut citer :
Le modèle de Langmuir :
C’est un modèle d’adsorption en monocouche développé à la base pour modéliser l’adsorption
chimique des gaz sur des surfaces solides homogènes (Langmuir, 1918).
Ce modèle est basé sur les hypothèses suivantes :
• La molécule adsorbée est située sur un site bien défini de l’adsorbant (adsorption localisée)
• Chaque site ne peut fixer qu’une molécule
• L’énergie d’adsorption est identique pour chaque site et indépendante de la présence de
molécules adsorbées sur les sites voisins (pas d’interaction entre les molécules)
L’équation de Langmuir s’écrit comme suit :
1
q
e
=
1
q
m
+
q
m
1
K
L
C
e
q m : concentration max de soluté dans la phase solide (M soluté.M -1 adsorbant)
K L : constante d’équilibre qui dépend de la température et du type d’interaction adsorbat –
adsorbant (L 3 .M -1 )
C e : concentration du soluté à l’équilibre dans la phase liquide (M.L -3 )
L’équation de Langmuir présente deux cas limites. Pour une solution à faible concentration
(K L. C e

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Etude de d’adsorption
D’autre part si la concentration dans la phase liquide est élevée (K L C e >>1), l’équation est une droite
horizontale de la forme :
q
e
= q m
Le modèle de Freundlich :
La relation empirique de Freundlich a été largement utilisée pour les systèmes hétérogènes et en
particulier pour décrire les phénomènes d’adsorption de composés organiques sur le charbon actif
(Freudlich, 1906). La forme de l’équation est la suivante :
ln q = ln K + n ln C
e
F
e
K F et n sont les constantes de Freundlich et sont uniques pour un composé donné.
Le modèle de Freundlich est plus représentatif des surfaces hétérogènes. Toutefois il est uniquement
adapté sur une intervalle réduite de concentration. Généralement lorsque le modèle s’adapte bien
avec des données à forte concentration, ce n’est pas le cas pour les très faibles concentrations.
On peut également citer Modèle Brunauer, Emmett et Teller (BET) (Brunauer et al., 1938) qui est
une extension du modèle de Langmuir vers l’adsorption multi-couche et qui répond aux hypothèses
suivantes :
• Chaque molécule adsorbée dans la première couche forme un site d’adsorption pour la
seconde et ainsi de suite pour les couches supérieures.
• Les molécules des couches supérieures se conduisent essentiellement comme le liquide
saturé sous une réaction de condensation.
• Les couches supérieures peuvent se former sans que la couche antérieure ait rempli
complètement la surface d’adsorbant.
• La constante d’équilibre des premières molécules adsorbées est différente de celle des
couches moléculaires supérieures.
Cette équation est particulièrement adaptée pour la détermination de la capacité maximale
d’adsorption de la plupart des adsorbants.
La Théorie du Potentiel proposée par Polany (1916) suppose que l’adsorption est due aux forces
d’attraction qui s’étendent au-delà de la surface d’adsorbant. La théorie considère un espace
d’adsorption proche de la surface d’adsorbant et un potentiel d’adsorption ε, qui représente la
différence d’énergie potentielle entre les molécules du soluté adsorbées et le soluté dans la solution.
73
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Etude de d’adsorption
D’autres modèles existent aujourd’hui qui permettent de modéliser l’adsorption d’un composé sur un
support solide (isotherme d’Elovich, de Temkin…) ; nous ne les aborderons pas ici.
IV.2 Ecoulement dans un milieu poreux
Dans le cadre de nos études en colonne, nous avons été amenés à étudier l’écoulement à travers
notre support poreux d’écorce de pin et à utiliser quelques notions de base présentées ci-dessous
concernant les vitesses d’écoulement.
L’écoulement en milieu poreux est décrit par une loi principale, la loi de Darcy, et fait intervenir un
certain nombre de paramètres comme la tortuosité ou la vitesse de pore, énumérés ci-dessous.
IV.2.1 Organisation du milieu poreux
Les milieux poreux contiennent un certain pourcentage de vides qui peuvent être occupés par de
l’eau ou d’autres fluides. D’un point de vue macroscopique, le milieu poreux peut être divisé en trois
composantes principales : une composante solide, une composante aqueuse et une composante
gazeuse. La Figure 14 définit les principales relations qui existent entre les volumes V et masses M
des différentes entités.
Relations Volumiques
Relations Massiques
Va
AIR
Ma
Vt
Ve
EAU
Me
Mt
Vs
SOLIDE
Ms
Figure 14 : Représentation des différentes phases d’un milieu poreux
Les principales caractéristiques permettant de définir un milieu poreux sont :
• La masse volumique apparente à l’état sec :
m
ρ s
b
=
Vt
74
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Etude de d’adsorption
• La masse volumique apparente totale :
m
ρ
t
app
=
Vt
• La Porosité totale :
Avec le volume de vide : Vv = Va + Ve
ε =
volume de " vide"
Va + Ve
=
volume total Vt
La porosité se subdivise en trois catégories, selon la classification adoptée par l’IUPAC (International
Union of Pure and Applied Chemistry) :
Macroporosité : diamètre de pore > 50 nm
Mesoporosité : diamètre de pore de 2 à 50 nm
Microporosité : diamètre de pore < 2 nm
Certains auteurs distinguent également deux catégories de micropores : les micropores primaires
(ultramicropores) dont le diamètre est inférieure à 0,8 nm, et les micropores secondaires dont le
diamètre est compris entre 0,8 et 2 nm (Lastokie et al., 1993).
• Le Degré de saturation :
Ve
s =
Ve + Va
• L’indice de vide :
Va + Ve
e =
Vs
• La Teneur en eau est caractérisée par deux paramètres essentiels :
- l’humidité pondérale w
masse d'
eau
w =
=
masse de sol sec
m
m
a
s
- l’humidité volumique θ
volume d'
eau
θ =
volume total
=
Ve
Vt
D’autre part, on peut définir la structure du milieu poreux comme l’arrangement réciproque et
l’orientation des particules entre elles. Il existe notamment des structures à particules isolées, des
structures massives et des structures en agrégats. Dans le cadre de notre étude, nous nous
restreindrons au cas des milieux poreux granulaires, formés de particules poreuses isolées.
En outre, dans nos conditions, nous considérerons le milieu comme étant saturé en eau (Va=0).
Thèse S.GENDRAULT 2004
75

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Etude de d’adsorption
IV.2.2 Hétérogénéité de l’écoulement
Les caractéristiques hydrodynamiques peuvent être différentes au sein même de la matrice du fait de
son hétérogénéité. Dans certaines régions du volume poreux, l’écoulement est plus ou moins lent,
parfois même nul. Les paramètres responsables de cette hétérogénéité de l’écoulement sont :
La structure du milieu
La teneur en eau au moment de l’infiltration
De fortes vitesses d’écoulement qui ont tendance à favoriser les écoulements préférentiels
La présence d’une lame d’eau à la surface qui favorise également les écoulements
préférentiels.
Les phénomènes principaux qui participent à l’écoulement sont :
• La convection, qui désigne l’écoulement massique de la solution dans la porosité
percolante (pores ouverts ou connectés). Le soluté se déplace avec la phase mobile.
• La dispersion hydrodynamique, différenciée en :
Dispersion cinématique, provoquée par l’hétérogénéité de la distribution des
vitesses d’écoulement dans un milieu poreux (fonction de la structure et de la
texture du milieu)
Diffusion moléculaire, due aux gradients de concentrations entre les zones
mobiles (porosité percolante) et les zones stagnantes (porosité intraparticulaire
ou pores semi-ouverts ou mal connectés ou zones stagnantes par
écoulement non homogène de la porosité percolante).
IV.2.3 Loi de Darcy
La loi de Darcy permet de décrire simplement l’écoulement, qui dans la configuration réelle d’une
matrice poreuse est trop compliquée pour être considérée dans ses détails microscopiques, car les
vitesses de fluide varient considérablement d’un point à un autre et même le long d’un même
parcours.
Dans le cas des milieux saturés continus, le débit d’un liquide incompressible s’écoulant à travers un
milieu poreux peut se calculer grâce à la relation suivante :
Q = −K
. S . ∆H
(m 3 /s)
où
S : surface de la section d’écoulement (m 2 )
76
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Etude de d’adsorption
∆H : charge hydraulique (-)
K : coefficient de perméabilité ou conductivité hydraulique (m/s)
(K est le rapport entre la perméabilité k et la viscosité dynamique η du fluide)
La vitesse de Darcy, q, est une vitesse fictive du fluide à la sortie du massif, comme si toute la section
du massif était soumise à l’écoulement.
q =
Q
(m/s)
S
Limite de la Loi de Darcy
La relation entre le flux et le gradient hydraulique n’est plus linéaire aux grandes vitesses
d’écoulement pour lesquelles les forces d’inertie ne sont plus négligeables par rapport aux forces de
viscosité. On peut aussi obtenir des phénomènes qui s’écartent de la loi de Darcy à l’autre extrémité
de la gamme de vitesses d’écoulement, notamment aux faibles gradients et dans les petits pores.
IV.2.4 Vitesse d’écoulement et tortuosité
D’une manière générale, on considère que l’écoulement ne se fait pas à travers toute la section S, car
seule la fraction correspondant à la porosité est ouverte à l’écoulement. De plus, le chemin réel
d’écoulement δ est plus grand que la longueur L de la colonne à cause de la tortuosité τ:
δ
τ = (-)
L
D’autre part, l’eau ne s’écoule qu’à travers les pores du milieu. Une définition correcte de la vitesse
d’écoulement implique donc une redéfinition de la section à travers laquelle s’effectue l’écoulement.
On définit donc la vitesse de pore comme le rapport entre la vitesse de Darcy et la teneur en eau
effective :
q
v = (m/s)
θ
eff
où θ eff
prend tient compte uniquement de la fraction d’eau qui participe à l’écoulement.
77
Thèse S.GENDRAULT 2004

Thèse S.GENDRAULT 2004
227

Thèse S.GENDRAULT 2004
234

ETUDE EXPERIMENTALE
ETUDE EXPERIMENTALE
78
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE EXPERIMENTALE
Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin
I. Etude du support d’adsorption : l’écorce de pin « Pinus
pinaster »
I.1 Origine et répartition
Le pin maritime (Pinus pinaster) se rencontre près des côtes atlantiques et méditerranéennes, en
Espagne, en Italie, au Maroc mais plus particulièrement au Portugal dans les régions du centre et du
nord, et sur côtes atlantiques du sud ouest de la France. La Figure 1 représente l’occupation de Pinus
pinaster en Europe et Afrique du Nord.
Figure 1 : Distribution de Pinus pinaster en Europe et en Afrique du Nord (Ratola, 2002)
Au Portugal, le pin maritime représente 31% des espèces rencontrées en forêt ; mais aujourd’hui le
nombre de pins maritime décroît régulièrement en faveur de l’eucalyptus. La Figure 2 représente la
répartition des espèces peuplant les forêts portugaises.
Autres feuillus
3%
Chêne vert
14%
Chataigner
1%
Eucalyptus
21%
Chêne faginé
ou rouvre
4%
Autres
résineux
1%
Pinus pinaster
(maritime)
31%
Pinus pinea
(parasol)
2%
Chêne liège
23%
Figure 2: Répartition des espèces forestière du Portugal (Inventaire National des forets – 3 ème édition,
1998)
Thèse S.GENDRAULT 2004
79

ETUDE EXPERIMENTALE
Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin
En France, le pin maritime également appelé pin des Landes, est implanté dans la région du sudouest
depuis l’antiquité ; il fut cultivé de manière intensive à partir du XIX ème siècle afin d’enrayer le
phénomène d’ensablement de la côte landaise et d’assainir les zones marécageuses. Aujourd’hui, il
recouvre près d’un million d’hectares et constitue l’une des essences forestières les plus importantes
de France.
Pinus pinaster est un résineux de 20 à 30 mètres de haut, au tronc flexueux, à la cime peu compacte
et à l’écorce brun-rouge (figure 3).
Figure 3 : Ecorce de pin Pinus pinaster
Au Portugal le pin maritime, dit « pinheiro bravo », représente la principale source de matière
première pour les scieries, qui représente près de 70% de la production totale de bois. (Ratola, 2002).
Le Portugal produirait chaque année 6 millions de mètres cube de bois de pin (Ratola,2002). En
considérant que 1 m 3 de bois sec produit 100 kilos d’écorce, 600 000 tonnes d’écorce pourraient être
disponibles annuellement (Fradinho et al., 2002). Ainsi, l’écorce en tant que matériau abondant et
gratuit (déchet de l’industrie du bois) représenterait une source valorisable intéressante.
I.2 Chimie générale des écorces
Les écorces sont, en général, constituées d’une fine couche intérieure (phloem) et d’une couche
externe (rytidom) séparées par une couche intermédiaire (periderm). L’épaisseur de l’écorce varie en
fonction de l’espèce de l’arbre et de son âge. Les parois cellulaires qui constituent le phloem sont
principalement riches en amidon, en acides gras et en tanins. Les résines circulent quant à elles, à
l’intérieur de minuscules canaux. Le periderm est composé de trois couches dont l’épaisseur varie
avec l’espèce.
La liste des composés rencontrés dans l’écorce est très longue ; on peut cependant citer les
principales familles de composés qui sont : les hydrates de carbone (cellulose, hemicellulose), les
80
Thèse S.GENDRAULT 2004

ETUDE EXPERIMENTALE
Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin
pectines, les lignines, la subérine, les terpènes (flavonoïdes, salicines, tanins, stilbènes et autres), et
des poly-flavonoïdes.
La composition des lignines des écorces de conifères reste mal connu à cause de la difficulté qu’il
existe à isoler celles-ci sans contamination par des impuretés phénoliques. Cependant quelques
études suggèrent des structures particulières et indiquent que les lignines de l’écorce sont bien
différentes des lignines du bois ; elles contiennent notamment plus d’acides dicarboxyliques et moins
d’acide 3-4-dimetoxibenzoïque, éther diaril et dimères biphényl.
D’autre part, des acides dicarboxyliques ainsi que des acides gras libres (acide béenique, acide
lignocérique, et phérulique) ont été identifiés comme constituants des cires d’écorce, ainsi que de
petites quantités d’acides gras insaturés et des résines acides.
La subérine de l’écorce serait un complexe formé principalement par des hydroxyacides gras. Des
acides phénoliques sont également présents dans cette composition. Certains hydroxyacides gras
seraient unis entre eux par une liaison ester.
D’après ce qu’on connaît sur la chimie de l’écorce, on peut considérer que l’écorce pourrait être
utilisée comme matrice « échangeur d’ions ». Le contenu important de groupes fonctionnels,
principalement la présence de groupes hydroxyles, carboxyliques et phénoliques, rend l’écorce
intéressante pour des fixations ioniques.
I.3 Caractéristiques physico- chimiques de l’écorce de pin
Différentes études menées dans divers domaines (Ramirez Lopez, 2001 ; Vazquez et al 1994 ; …)sur
l’écorce de pin ont permis de mettre en évidence les caractéristiques physico-chimiques générales de
l’écorce de pin Pinus pinaster. Des analyses supplémentaires ont été réalisées dans le cadre de notre
étude.
L’écorce de pin utilisée dans cette étude provient d’une scierie du nord du Portugal. Elle nous a été
livrée sous forme brute, n’ayant subi aucun traitement préalable (morceaux d’environ 10 cm de long
sur 4 cm de large).
Thèse S.GENDRAULT 2004
81

ETUDE EXPERIMENTALE
Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin
I.3.1 Caractéristiques physiques
La surface spécifique de notre matériau, le volume de pore et la taille des pores ont été déterminés à
l’Institut de Recherche en Catalyse (CNRS, Villeurbanne) selon les méthodes BET, Single Point, t.Plot
et BJH.
I.3.1.1
Principe de la méthode BET
Les surfaces spécifiques du matériau ont principalement été obtenues par application de la théorie de
Brunauer, Emmett et Teller (BET) aux isothermes d’adsorption d’azote à 77°K. La théorie repose sur
l’hypothèes d’une adsorption multimoléculaire due à des liaisons faibles du type Van der Waals.
L’énergie d’adsorption d’une molécule sur la surface est différente de celle d’une molécule située sur
la deuxième couche. Le calcul permet d’établir l’équation BET de l’isotherme d’adsorption :
P
P0
1 C −1
P
= +
V ( 1−
P ) Vm.
C Vm.
C P0
P
0
où :
V : volume de gaz adsorbé à la pression relative P/P 0
V m : volume de gaz nécessaire pour couvrir la surface d’une monocouche
C : facteur proportionnel à la différence entre l’énergie d’adsorption de la première couche et
l’énergie de liquéfaction
P
P0
Pour obtenir la surface spécifique, on porte
en fonction de P/P 0 . La courbe théorique est
V (1 − P )
P
C −1
1
une droite de pente et d’ordonnée à l’origine .
Vm.
C
V m
. C
En pratique la courbe est linéaire que pour l’intervalle de pression relative P/P 0 compris entre 0,05 et
0,35. La surface spécifique est calculée à partir de la valeur V m déduite de la transformée linéaire
BET.
0
I.3.1.2
Principales caractéristiques
La masse volumique apparente (ρ app ), la masse volumique réelle (ρ re ) ainsi que l’indice de vide (ε 0 ) ont
été déterminés sur la poudre d’écorce de pin de diamètre d inférieur à 200 µm.
Thèse S.GENDRAULT 2004
82

ETUDE EXPERIMENTALE
Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin
La masse volumique apparente (ρ app ) de la poudre d’écorce a été déterminée par remplissage d’un
récipient de volume connu (Vt) avec le matériau en question, tassé de la même manière que pour les
expériences en colonnes.
La masse volumique réelle (ρ re ) a été déterminée après remplissage d’eau des lits d’écorce de pin
ainsi formés. Le volume d’eau utilisé était le volume de vide (V v ) accessible à l’eau, on a :
m
ρ
re
=
et
V −V
t
v
ρ
app
=
m
V
t
Avec :
m : masse de l’échantillon dans le récipient (kg)
V t : volume total du récipient (m 3 )
V v : volume de vide (m 3 )
ρ re : masse volumique réelle (kg/m 3 )
ρ app : masse volumique apparente (kg/m 3 )
La porosité totale (ε) adimensionnelle est donnée par l’équation :
ε =
V
V
v
t
Les principales caractéristiques physiques de notre écorce sont présentées dans le Tableau 1.
Tableau 1 : Caractéristiques physiques de l’écorce de pin (d

ETUDE EXPERIMENTALE
Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin
Une analyse BET a également été réalisée en parallèle sur l’écorce en poudre stérilisée (voir
procédure de stérilisation I.7) et non stérilisée. Les résultats présentés au Tableau 2, montrent que la
stérilisation ne modifie pas significativement la surface spécifique du matériau.
Tableau 2 : Analyse de la surface spécifique de l’écorce de pin (BET sur écorce broyée à d

ETUDE EXPERIMENTALE
Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin
La caractérisation de la matière organique (MO) de l’écorce de pin (Tableau 4) montre que le
constituant majeur est d’origine ligneuse (environ 50% de la MO). L’écorce possède ainsi une grande
stabilité biologique. Celle-ci peut être exprimée par le paramètre Tr (sadef.fr 2003) défini comme suit :
MO Hemicellulose fraction de Van der Soest Lignine
Tr = a − b
+ c
+ d +
MSo MSo
MSo
MSo
MM
MSo
avec :
MO : % matière organique
MSo : %matière organique soluble
MM : % matière minérale
(a, b, c et d sont des coefficients)
On note également que la matière organique soluble représente environ 15% de la matière organique.
Si cette matière organique soluble n’est pas toxique pour les micro-organismes et si elle est
suffisamment biodégradable, on peut imaginer qu’elle pourra être utilisée comme source de carbone
par les bactéries utilisées dans notre procédé combiné de biofiltration.
Tableau 4 : Caractérisation de la matière organique
% de la matière organique
Matière organique soluble 14,9
Matière Hémicellulosiqiue 1,1
Matière ligneuse 54,8
Matière cellulosique 29,2
Stabilité biologique (Tr) 126 (Sadef.fr 2003)
I.3.3 Analyse Infra Rouge des fonctions de surface
Une analyse par spectrométrie IR a été réalisée à l’Unité de Recherche en Génie Civil (URGC, INSA
de Lyon) afin d’identifier les principales fonctions chimiques présentes à la surface du matériau
« Ecorce de pin ». La connaissance des fonctions de surface a permis d’émettre des hypothèses
quant aux types de liaisons susceptibles de s’établir lors des phénomènes d’adsorption ou absorption
de l’atrazine sur le support d’écorce de pin.
Thèse S.GENDRAULT 2004
85

ETUDE EXPERIMENTALE
Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin
I.3.3.1
Principe de l’analyse Infra Rouge
La spectrométrie infra-rouge est une méthode d’analyse non destructive, basée sur l’étude de
l’absorption par l’échantillon des radiations électromagnétiques de longueurs d’ondes λ comprises
entre 1 et 1000 µm, soit un nombre d’onde ν=1/λ compris entre 1 et 10 -3 m -1 . La partie la plus riche en
informations et la plus accessible d’un point de vue expérimental est celle du moyen infra-rouge
(λ compris entre 2,5 et 25 µm soit ν compris entre 0,04 et 0,4 µm -1 ). Les absorptions dans ce
domaine forment une sorte d’empreinte spectrale des composés caractéristiques des liaisons
interatomiques qui les composent.
I.3.3.2
Protocole expérimental
L’analyse IR s’effectue sur des pastilles de KBr fabriquées en respectant les proportions suivantes :
300 mg de KBr et 5 mg de matériau broyé finement. La masse de mélange prélevée pour faire la
pastille est de 30 mg. L’analyse est répétée 5 fois pour un nombre d’onde variant entre 400 et
4000 cm -1 . Le spectre obtenu résulte de la moyenne de ces 5 balayages.
L’appareil utilisé est un Perkin Elmer de type dispersif (Spectrum One, FTIR Spectrometer) Les
spectres ont été traités avec le logiciel Spectrum.
Le spectre d’adsorption Infra Rouge obtenu pour l’analyse de l’écorce de pin en poudre (fraction
d

ETUDE EXPERIMENTALE
Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin
I.4 Observations de la structure l’écorce de pin au MEB
La microstructure de l’écorce de pin en poudre a été caractérisée par observation au Microscope
Electronique à Balayage Jeol 840 LGS au Centre d’Etudes et de Caractérisations Micro-structurales
de l’INSA de Lyon. Ces observations ont permis de comparer les structures des particules d’écorce
selon leur granulométrire et de les comparer à celle du charbon actif en poudre.
La préparation des échantillons a été réalisée par séchage (chauffage à 80°C) des matériaux à
étudier, puis métallisation à l’or dans un pulvérisateur cathodique BLAZERS SCD 040.
Les clichés obtenus (ANNEXE 2) par observation au MEB des particules d’écorce de pin et de
charbon actif montrent que la structure de surface de ces deux matériaux est ressemblante,
présentant une structure en nid d’abeille (Figure 1). Cependant, le charbon actif semble présenter une
surface plus régulière que l’écorce de pin. L’observation des structures longitudinales des particules
d’écorce et de charbon actif montre également que le charbon actif présente un réseau de canaux
profonds et organisés (le diamètre des pores est d’environ 15 µm) alors que l’écorce est beaucoup
moins organisée et présente de plus gros pores, d’environ 50 µm de diamètre (Figures 2 et 3).
Lorsque l’écorce est broyée à 200 µm, la structure longitudinale des particules est détruite et les
canaux internes ne sont plus visibles ; seule une structure en feuillets superposés est encore
observable.
Le charbon semble ainsi présenter une structure poreuse beaucoup plus importante que l’écorce de
pin.
I.5 Préparation de l’écorce en vue des études d’adsorption
Les morceaux d’écorce brute ont été broyés dans un broyeur à lame (Retsch SM 2000/1430 UPM) sur
une grille de 2 mm. La poudre d’écorce a ensuite été séparée en différentes fractions
granulométriques sur des tamis de 200 µm, 400 µm, 700 µm et 2 mm. L’écorce en poudre a été
séchée dans une étuve à 80°C pendant 24 h avant chaque utilisation puis conservée si nécessaire
dans un récipient hermétique.
Thèse S.GENDRAULT 2004
87

ETUDE EXPERIMENTALE
Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin
Figure 4 : Ecorce brute de pin Pinus Pinaster
I.6 Préparation d’un extrait aqueux d’écorce de pin
L’utilisation d’extrait d’écorce de pin nous a permis de réaliser des expériences en milieu liquide, tout
en gardant des conditions chimiques similaires aux conditions imposées par la présence de l’écorce
elle-même (pH acide et présence des composés hydrosolubles de l’écorce). L’utilisation d’extrait a
ainsi permis d’étudier la croissance de Pseudomonas ADP sp. ainsi que sa capacité à dégrader
l’atrazine dans ces conditions tout en s’affranchissant des autres processus liés à la présence de
particules dans le milieu tels que les phénomènes d’adsorption.
L’extrait d’écorce de pin a été obtenu en mettant au contact de la poudre d’écorce (d

ETUDE EXPERIMENTALE
Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin
méthode a été inspirée d’une étude réalisée sur les méthodes de stérilisation des sols (Wolf et al.
1989).
L’extrait aqueux d’écorce de pin a, quant à lui, été stérilisé par filtration à 0,2 µm sur des membranes
de nitrate de cellulose.
Thèse S.GENDRAULT 2004
89

MATERIEL ET METHODES
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
II. Adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
II.1. Matériel et Méthodes
II.1.1 Etude de l’adsorption en batch
II.1.1.1
L’atrazine : caractéristiques générales et méthodes d’analyses
II.1.1.1.1
Caractéristiques physico-chimiques
La formule développée (Figure 5) ainsi que les principales caractéristiques physico-chimiques de
l’atrazine sont présentées dans le Tableau 5.
Cl
N
N
N
N
N
H
H
(2-chloro-4-ethylamino-6isopropylamino-1,3,5triazine)
Figure 5 : Formule développée de l’atrazine
Tableau 5 : Propriétés physico-chimiques de l’atrazine (source : Dialogweb.com)
Formule brute C 8 H 14 ClN 5
Aspect
Cristallin solide, incolore
Masse molaire 215,69 g.mol -1
Masse volumique 1,2 g/cm 3 à 20°C
pKa* 1,64
Solubilité dans eau 30 mg.L -1 à 20°C ; 70 mg.L -1 à 25°C
Solubilité dans méthanol 15000 mg/l à 20°C
Pression de vapeur 3.85 x 10 -5 Pa à 25°C
Point de fusion 175,8 °C
Point d’ébullition
205,0 °C / 101 kPa
Stabilité
Relativement stable à pH neutre, légèrement acide ou basique.
Rapidement hydrolysé à pH très acide ou très basique et à 70°C à pH
7.
DT50 9,5 j. (pH 1), 86 j. (pH 5), 5,0 j. (pH 13)
Kow 398
Coefficient de partition log P : 2,5 log Kow : 2,6
Moment dipolaire 4,63 Debye (Weber 1967)
* pKa de la forme protonée
90
Thèse S.GENDRAULT 2004

MATERIEL ET METHODES
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
On retiendra essentiellement de ces caractéristiques que l’atrazine est une base faible (pKa de la
forme protonée 1,64), et qu’elle n’est donc pas ionisée à des pH aux alentours de 4-5 souvent
imposés par la présence de l’écorce de pin dans un milieu liquide aqueux.
On note également la faible hydrosolubilité de l’atrazine qui nous a conduits à utiliser des solutions
mères à 2000 mg.L -1 préparées dans le méthanol et diluées dans l’eau au moment des essais pour
obtenir les concentrations initiales souhaitées. La présence résiduelle de méthanol agissant comme
cosolvant dans les solutions aqueuses ainsi préparées a permis de travailler à des concentrations en
atrazine allant jusque 50 mg.L -1 .
L’effet du méthanol résiduel sur l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin a été testé (Figure 6).
q (mg/g)
0,14
0,12
A- Sol. mère / MeOH
B- Atrazine dans Eau
y = 0,3036x + 0,0038
0,10
0,08
y = 0,1845x + 0,0031
0,06
0,04
0,02
0,00
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Ceq (mg/l)
Figure 6 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en présence de MeOH (A) ou sans
MeOH (B) ; diamètre des particules d’écorce :d

MATERIEL ET METHODES
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
II.1.1.1.2
Méthodes d’analyse
(a) Chromatographie Liquide Haute Pression
L’atrazine a été dosée par chromatographie liquide en mode isocratique grâce à une HPLC Waters
Module I Plus équipée d’une colonne RP-18 Supelcosil (prévue pour la séparation des pesticides
organochlorés) et d’un détecteur UV réglé à 220 nm. La phase mobile, constituée d’un mélange
d’acétonitrile / Eau ultra Pure (50 :50, vol :vol), a été utilisée à un débit de 1 mL.min -1 .
L’eau Ultra Pure est préparée grâce à un appareil Millipore MilliQ Gradient. Les phases mobiles ont
été dégazées à l’hélium pendant toute la durée des analyses (20 mL.min -1 ).
Dans ces conditions opératoires, le temps de rétention de l’atrazine est d’environ 7,3 minutes et la
limite de détection de 0,03 mg.L -1 .
Les chromatogrammes ont été traités à l’aide du logiciel d’integration APEX.
(b) Dosage par Immuno-essai
Le dosage de l’atrazine à de faibles concentrations, de l’ordre de quelques µg.L -1 , a été réalisé avec le
kit Atrazine Hach (Atrazine Reagent Set, ref. 27627-10) commercialisé par Hach C ie et utilisé comme
méthode semi-quantitative. La gamme de concentrations à utiliser pour ce kit est de 0,1 µg.L -1 à
3 µg.L -1 . Cette méthode a été utilisée dans les expériences en colonnes (V.1.2). L’emploi de ce kit a
permis de travailler à des concentrations correspondant à une pollution réelle (de quelques µg.L -1
d’atrazine).
Le principe du dosage en kit consiste en une réaction antigène-anticorps ; le dosage est réalisé dans
des cuves de 1 mL recouvertes d’anticorps spécifiques à l’atrazine. La concentration en atrazine est
déterminée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 450 nm. La concentration en atrazine
est inversement proportionnelle à l’intensité de la couleur développée.
Protocole de dosage immuno-essai :
La solution à doser (0,5 mL) est introduite dans une cuve, contenant les anticorps « anti-atrazine »
fixés sur ses parois. Une solution d’enzyme conjuguée (0,5 mL) est additionnée et le tout est
vigoureusement agité pendant 30 secondes. La réaction s’effectue pendant 20 minutes puis le
contenu de la cuve est jeté et la cuve est rincée 4 fois à l’eau déminéralisée.
Une solution permettant le développement de la couleur est placée dans la cuve (0,5 mL), agitée puis
la réaction se fait pendant 10 minutes. Enfin, 0,5 mL de solution d’arrêt permettant de bloquer la
réaction colorimétrique sont additionnés avant lecture au spectrophotomètre à 450 nm.
Des étalons fournis avec le kit (concentrations 0,1 µg.L -1 ; 0,5 µg.L -1 ; 3 µg.L -1 ) ont été utilisés afin de
tracer la courbe de calibration.
Thèse S.GENDRAULT 2004
92

MATERIEL ET METHODES
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
(c) Suivi des essais avec des molécules marquées au 14 C
Des études d’adsorption à faibles concentrations en atrazine ont pu être réalisées grâce à l’utilisation
d’atrazine marquée [U-ring- 14 C]-atrazine commercialisée par Sigma Aldrich (pureté 98,6% ; activité
26,4 mCi.mmol -1 ).
Suivie de la radioactivité en solution
Le suivi de la radioactivité dans la phase liquide des essais d’adsorption a été réalisé par prélèvement
de 0,1 à 1 mL de solution contenant initialement une quantité connue de [U-ring- 14C ]-atrazine. 7 mL de
liquide à scintillation sont additionnés au prélèvement puis le mélange est analysé au compteur à
scintillation.
II.1.1.2
Cinétique d’adsorption
L’étude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin a, dans un premier temps, été réalisée en
batch. Les cinétiques d’adsorption ont ainsi été déterminées à 20°C en milieu dispersé en mettant en
contact l’atrazine en solution aqueuse avec une quantité connue d’écorce de pin en poudre dans des
tubes en verre de contenance 20 mL (ratio liquide/solide = 10 mL.g -1 ; 1g d’écorce stérile (d

MATERIEL ET METHODES
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
triplicats et des blancs sans écorce et/ou sans atrazine ont permis d’identifier les éventuelles pertes
ou transformations de l’atrazine, et d’identifier les pics provenant du relargage des composés solubles
de l’écorce dans l’eau.
II.1.1.3
Isothermes d’adsorption
Des isothermes d’adsorption ont été réalisées dans les mêmes conditions de température et
d’agitation que celles citées ci-dessus (II.1.1.2). Un temps d’agitation de 24h, correspondant à
l’équilibre apparent déterminé grâce aux études cinétiques, a été respecté. Les essais d’adsorption de
l’atrazine ont ensuite été réalisés avec différentes granulométries d’écorce de pin : d< 200µm,
200

MATERIEL ET METHODES
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
II.1.2 Etude de l’adsorption en colonne
II.1.2.1
Courbes d’élution d’un soluté
La courbe obtenue par l’analyse de la solution en sortie de colonne est appelée « courbe d’élution ».
Lorsque l’injection de la solution contenant le traceur (ou tout autre soluté) est effectuée en créneau,
la caractéristique de la courbe d’élution peut se présenter de différentes manières (Figure 8).
C(t)
Co
Injection
C/Co
1
V
V/Vo
C/Co
2
C/Co
3
Co
V/Vo
V/Vo
Figure 8 : Différentes courbes d’élution rencontrées suite à une injection en créneau (1 à 3). C et V
expriment respectivement la concentration en soluté et le volume de solution cumulé récolté en sortie de
colonne ; Vo représente le volume d’eau total contenu dans la colonne, C 0 est la concentration entrante
de soluté
- 1 : Courbe d’élution symétrique ; son sommet correspond au temps de séjour moyen.
Elle représente une fonction de distribution de type gaussien, qui signifie que
l’écoulement se déroule dans une structure homogène sans zone morte ni chemin
préférentiel. L’élargissement de la courbe par rapport au créneau résulte de la
dispersion axiale et radiale du soluté.
- 2 : Courbe asymétrique dans laquelle le front compressif (montée) est plus rapide que
le front diffusif (descente). Cet effet est lié à la présence de zones mortes ou
stagnantes, où l’échange entre les molécules entrantes et les molécules sortantes est
très lent.
- 3 : la présence de deux pics résulte de l’existence de chemins préférentiels.
Thèse S.GENDRAULT 2004
95

MATERIEL ET METHODES
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
L’expression de ces courbes en concentration relative (C/Co) par rapport au volume relatif (V/Vo) ou
au temps t permet de s’affranchir de certaines variations dans les conditions opératoires (variation de
la concentration en entrée, de la vitesse d’écoulement, etc.) et permet de comparer les différentes
courbes d’élution entre elles. La représentation d’une courbe d’élution exprimée en concentration
relative en fonction du temps ou du volume relatif est appelée « courbe de distribution des temps de
séjour » (DTS).
L’analyse de la courbe d’élution fournit un certain nombre de paramètres caractéristiques, comme le
bilan de masse BM et le facteur de retard R.
Le bilan de masse s’exprime comme suit :
µ
BM = 0
∆t
où ∆t est le temps d’injection du soluté (correspondant à 1 V 0 dans le cas du traceur).
µ 0 exprime l’aire sous la courbe d’élution et est calculée par :
µ
0
∞
C(
t)
= ∫
C
0 0
dt
La valeur de BM permet de décrire le comportement du soluté:
• Si BM = 1, toute la masse de soluté injectée en entrée est récupérée en sortie. Les
interactions pouvant se produire au cours de l’écoulement sont entièrement réversibles et le
soluté est dit « conservatif ».
• Si BM

MATERIEL ET METHODES
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
où ,
- L : Longueur de la colonne (m)
- ε : Teneur en eau dans la colonne (-)
- q : Vitesse de Darcy en entrée de colonne (m.s -1 )
Le facteur de retard R est un indicateur des interactions éventuelles existantes :
o Si R = 1, il n’existe aucune interaction entre le soluté et la matrice.
o Si R < 1, l’avancement du soluté est plus rapide que celui des molécules
d’eau. Ceci peut être dû à l’exclusion anionique.
o Si R > 1, le soluté est soumis à des interactions avec la matrice au cours de
son transfert, et est donc élué en retard par rapport aux molécules non
réactives de la solution.
II.1.2.2
Caractérisation de l’écoulement à l’aide de traceurs
Le traçage est une procédure expérimentale qui permet de rendre observable le déplacement réel de
l’eau, dans un milieu poreux, suivant une ou des trajectoires définies, entre un point d’origine et un ou
plusieurs points de détection, au moyen de traceurs artificiels.
II.1.2.2.1
Choix du traceur
Un traceur idéal a, en tout point, un comportement identique à celui de l’eau ou du liquide qui s’écoule
à travers du milieu poreux. C’est donc une substance non réactive. En pratique, on utilise souvent des
traceurs anioniques. Parmi ceux-ci on peut citer les sels de bromure, les chlorures ou certains
colorants.
II.1.2.2.2
Suivi du traceur en sortie de colonne
Après saturation de la colonne en eau, un volume de 1V 0 de la solution de KCl (1g.L -1 ) est injecté en
créneau grâce à une vanne d’entrée, à l’intérieur de la colonne. La concentration en KCl est suivie en
sortie de colonne par conductimétrie. Une cellule de conductivité (XE100 Radiometer) reliée à un
analyseur CONSORT C832 permet de suivre la conductivité en continu par intégration sur ordinateur
des données toutes les 45 secondes. La solution circulante est envoyée avec un débit de 1 mL.min -1 .
La courbe d’élution est exprimée en C/Co en fonction de V/Vo.
Thèse S.GENDRAULT 2004
97

MATERIEL ET METHODES
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
II.1.2.3
Méthodes expérimentales d’adsorption en colonne
II.1.2.3.1
Préparation des colonnes
Les colonnes utilisées sont des colonnes en verre de chromatographie (fournisseur Amersham
Biosciences) de dimensions L = 400 mm de hauteur et 25 mm de diamètre interne. Les colonnes sont
équipées de deux pistons dont l’extrémité qui est mise en contact avec le milieu poreux est protégée
par une grille plastique (maille de 1 mm 2 ) recouvert d’une membrane en nylon (diamètre des pores
10 µm). L’étanchéité est assurée grâce à des joints caoutchouc. Les tubulures utilisées sont en
polyéthylène. La Figure 9 représente le détail des colonnes utilisées.
Tube PTFE
Colonne de verre(D int 26mm, L 400 mm)
Joint caoutchouc
Grille protectrice
Membrane nylon
Figure 9 : Schéma d’une colonne
Les colonnes sont remplies avec environ 10 g de milieu poreux (écorce de pin en poudre ou charbon
actif dans certains cas). Le remplissage est fractionné, c’est à dire que tous les 2 g, une pression est
appliquée sur le matériau afin d’homogénéiser le tassement. Le milieu est ensuite pressé entre les
deux pistons (la hauteur de la colonne contenant le support d’adsorption représente environ 7 cm).
Thèse S.GENDRAULT 2004
98

MATERIEL ET METHODES
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
Les colonnes sont dans un premier temps saturées en eau par circulation en flux ascendant d’eau
déminéralisée stérile pendant 12 h environ jusqu’à obtenir un poids constant des colonnes.
Un traçage au KCl est ensuite effectué (comme décrit ci-dessus II.1.2.2.2) ; il permet de rendre
compte du comportement hydrodynamique des colonnes. Lorsque aucune irrégularité ne survient (le
pic d’élution est symétrique), les essais d’adsorption peuvent commencer. Si la courbe d’élution du
traceur présente une asymétrie, la colonne est vidée, remplie de nouveau et testée de nouveau.
Chaque colonne mise en place est caractérisée par un certain nombre de paramètres cités dans le
tableau ci-dessous (Tableau 6)
Tableau 6 : Caractéristiques d’une colonne
Paramètres colonne Symbole Unité
Diamètre interne d cm
Section S cm 2
Hauteur du lit L cm
Masse de milieu poreux m g
Volume du lit V t cm 3
Volume de pore V e ou V 0 cm 3
Indice de vide e (V e /V s ) -
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) -
Flux D cm 3 .h -1
Vitesse de Darcy q (D/S) cm.h -1
Vitesse de pore V (q/ ε) cm.h -1
Le volume d’air V a est considéré comme nul, et le degré de saturation s=1.
L’écorce de pin utilisée en colonne est constituée de particules de diamètre inférieur à 200 µm.
Pour certains essais l’écorce de pin stérilisée a été utilisée afin de tester l’influence de la stérilisation
sur l’adsorption de l’atrazine. La stérilisation de l’écorce de pin a été réalisée comme précisé au § I.7.
L’hydrodynamique de l’écorce de pin et du charbon actif a également été comparée.
Les particules de charbon actif utilisé (Darco G-60 fourni par Aldrich) possèdent un diamètre inférieur
à 200 µm.
Thèse S.GENDRAULT 2004
99

MATERIEL ET METHODES
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
II.1.2.3.2
Suivi du COD, du pH et de la conductivité en sortie de colonne
Lors de la circulation de l’eau à travers la colonne, certains composés organiques de l’écorce de pin
sont solubilisés dans la solution circulante ; une analyse du carbone organique dissous (COD) en
sortie de colonne permet d’évaluer la quantité de carbone relarguée au cours du temps. D’autre part,
lors de la solubilisation des composés de l’écorce en solution, le pH de l’eau ainsi que la conductivité
varient avec le volume de solution filtrée. Un système d’électrodes, positionné en sortie de colonne,
permet de suivre en ligne l’évolution du pH et de la conductivité en fonction du volume passé à travers
la colonne.
Le pH et la conductivité sont suivis simultanément par un appareil CONSORT C832 relié à une
électrode pHC3001 et une cellule de conductivité XE100 Radiometer. Chaque électrode est plongée
dans une cellule à débordement de 1mL, traversée par la solution en sortie de colonne. L’installation
est représentée Figure 10. Le Multianalyser CONSORT C832 est relié à un ordinateur à partir duquel
sont enregistrées les données toutes les 45 secondes.
Pour l’analyse du COD, les échantillons collectés ont été filtrés sur une membrane filtrante de
0,45 µm ; le carbone inorganique a été éliminé par acidification à l’acide phosphorique puis purgé par
barbotage à l’hélium. Les échantillons collectés ont été analysés au COT mètre O.I. Analytical 1020A
selon la norme européenne EN 1484.
Thèse S.GENDRAULT 2004
100

MATERIEL ET METHODES
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
Cond.
pH
10 g écorce de pin
Multianalyser CONSORT C832
- pH
- Conductivité
Collecteur de
fractions
Aquisition
informatique
COTMètre
HPLC
Flux : 1 ml/min
Eau déminéralisée
ou
Solution d’atrazine
Pompe
Peristaltique
Conditions stériles
Figure 10 : Dispositif expérimental pour l’étude de l’adsorption en colonne
II.1.2.3.3
Adsorption de l’atrazine en colonne
Les essais d’adsorption de l’atrazine en colonne d’écorce de pin ont été réalisés à une concentration
entrante d’environ 0,2 mg.L -1 , dans un premier temps. La capacité d’adsorption de l’atrazine a été
testée avec l’écorce préalablement stérilisée (Cf. I.7) ou non stérilisée ; une colonne de charbon actif
a également été préparée.
Les colonnes sont préparées et remplies comme décrit ci-dessus (II.1.2.3.1) ; après saturation en eau,
le comportement hydrodynamique des colonnes est contrôlé par un traçage au KCl (II.1.2.2.2). Un
biocide (NaN 3 200 mg.L -1 ) est additionné à la solution entrante d’atrazine afin d’assurer des conditions
abiotiques et ainsi s’affranchir de tout phénomène biologique pouvant entraîner une dégradation
partielle du pesticide. L’installation est représentée Figure 10.
La solution est injectée dans les colonnes en flux ascendant à des débits de 1 mL.min -1 ou
0,3 mL.min -1 . Les échantillons sont prélevés à intervalle de temps régulier par un collecteur de
fractions directement placé en sortie de colonne. Les échantillons sont ensuite analysés par HPLC
permettant de détecter une concentration minimale en atrazine de 0,03 mg.L -l .
Thèse S.GENDRAULT 2004
101

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
II.2 Résultats et discussion
II.2.1 Etude de l’adsorption en batch
II.2.1.1
Cinétiques d’adsorption
Les études de cinétique d’adsorption ont été réalisées pour des concentrations initiales en atrazine
(C i ) comprises entre 0,5 mg.L -1 et 15 mg.L -1 , dans des tubes en verre soumis à une agitation par
retournement pendant environ 50 heures, selon le protocole (II.1.1.2).
Les cinétiques ont permis de fixer le temps d’équilibre apparent d’adsorption de l’atrazine sur le
support d’écorce de pin. Les résultats sont présentés ci-dessous.
Atrazine adsorbée (mg.l
-1 )
0,6
0,4
0,2
Ci=0,5 mg/l
0,0
0 10 20 30 40
Temps (h)
Atrazine adsorbée (mg.l
-1 )
1,6
1,2
0,8
0,4
Ci=1,4 ppm
0,0
0 10 20 30 40
Temps (h)
Atrazine adsorbée (mg.l
-1 )
2,8
2,1
1,4
0,7
Ci=2,7 mg/l
0,0
0 10 20 30 40
Temps (h)
Atrazine adsorbée (mg.
l-1 )
6,0
4,0
2,0
Ci=5 mg/l
0,0
0 10 20 30 40
Temps (h)
Atrazine adsorbée (mg.l
-1 )
15,0
10,0
5,0
Ci=15 ppm
0,0
0 10 20 30 40
Temps (h)
Atrazine adsorbée (mg.l
-1 )
12,0
8,0
4,0
Ci=10,7 ppm
0,0
0 10 20 30 40
Temps (h)
Figure 11 : Cinétique de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin (d

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
avons choisi d’utiliser pour réaliser tous les essais ultérieurs d’adsorption en batch de l’atrazine sur
l’écorce.
II.2.1.2
Isothermes d’adsorption
Les isothermes d’adsorption ont été tracées afin de comparer la capacité de l’écorce à adsorber le
polluant atrazine dans différentes conditions expérimentales. Ainsi, les essais d’adsorption ont été
réalisés pour différents ratios liquide/solide, différentes granulométries de particules d’écorce, à
différents pH et dans une gamme de concentrations en atrazine relativement étendue : de quelques
µg.L -1 à plusieurs dizaines de mg.L 1 .
II.2.1.2.1
Influence de la granulométrie de l’écorce de pin sur l’adsorption de l’atrazine
Afin de sélectionner les meilleures conditions d’adsorption de l’atrazine pour notre procédé de
traitement, des études sur l’influence de la granulométrie de l’écorce sur sa capacité d’adsorption ont
été menées selon le protocole décrit au § II.1.1.3, pour 3 diamètres différents de particules d’écorce :
d

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
Campos et al. (2000) obtiennent à titre d’exemple, pour l’adsorption d’atrazine sur un charbon actif en
poudre des constantes de Freundlich de l’ordre de 50 (mg. g -1 )(L.mg -1 ) 1/n (n=0,44).
Tableau 7 : Coefficients du modèle de Freundlich caractérisant les isothermes d’adsorption de l’atrazine
sur des particules d’écorce de pin autoclavée de différentes granulométries
(µm) K f n
d

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
0,25
0,2
pH 4
pH 7
y = 0,233x + 0,0103
y = 0,1677x + 0,0034
q (mg.g -1 )
0,15
0,1
0,05
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Ceq (mg.L -1 )
Figure 13 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoclavée (d

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
Les Figure 14 et Figure 15 représentent les isothermes d’adsorption pour deux gammes de
concentrations différentes. Dans les deux cas, la diminution du ratio L/S entraîne la réduction de
l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce. Ce résultat indique que la dispersion des particules d’écorce en
suspension est modifiée en fonction du ratio liquide/solide utilisé ; l’agrégation des particules d’écorce
à faible ratio L/S pourrait entraîner la réduction de l’accessibilité des molécules d’atrazine aux sites
d’adsorption de l’écorce.
80
70
L/S=1000
y = 0,2087x + 1,8534
60
L/S=100
y = 0,1214x + 1,4086
q (µg/g)
50
40
30
L/S=10
y = 0,0227x + 0,2525
20
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Ceq (µg/l)
Figure 14 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine ([atrazine] i = 2,6 à 749 µg.L -1 ) sur l’écorce de pin en
poudre (d

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
L’adsorption à ratio L/S=10 à faible concentration est réduite comparée à l’adsorption observée à plus
forte concentration. Cette observation peut être expliquée par un phénomène d’agrégation des
particules d’écorce entre elles, ce qui diminuerait la surface totale d’adsorption pour les molécules
d’atrazine.
Si l’on compare l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en poudre (d

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
matière organique libérée par l’écorce de pin ; le pH et la conductivité ont également été suivis en
sortie de colonne.
II.2.2.1
Etude hydrodynamique des colonnes
Le comportement hydrodynamique des colonnes d’écorce de pin stérile et des colonnes d’écorce non
stérile a été étudié en parallèle.
La Figure 17 présente les courbes d’élution pour ces deux types de colonnes après injection de 1V 0
d’une solution de KCl (1g.L -1 ). Les caractéristiques des colonnes sont présentées ANNEXE 3.
1,0
Ecorce non stérile
Ecorce non stérile
1,0
Ecorce stérile stérile
0,8
0,8
C/Co
0,6
0,4
C/Co
0,6
0,4
0,2
0,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
V/Vo
0,2
0,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
V/Vo
Figure 17 : Comportement hydrodynamique : Transfert de KCl dans les colonne d’écorce de pin stérile
(droite) ou non stérile (gauche) ; Débit de colonne = 1 mL.min -1 ; 22°C
Les comportements hydrodynamiques des colonnes d’écorce de pin stérile ou non stérile sont très
semblables. Dans les deux cas, le point d’inflexion de la courbe ascendante est obtenu après 1V 0,
(R=1,002 et 0,96 pour l’écorce stérile et non stérile respectivement) indiquant l’absence de retard
dans l’élution du KCl. Cependant un délai de restitution du KCl est observé (phase descendante)
suggérant la présence de phénomènes de dispersion. Ce retard peut être expliqué par la présence de
zones stagnantes à l’intérieur de la colonne ou la dilution de la solution en sortie de colonne dans les
cellules contenant l’électrode de conductivité (dilution dans 1-2 mL). L’apparition d’un léger plateau
dans le cas de l’écorce non stérile peut s’expliquer par l’existence de chemins préférentiels dans la
colonne.
Dans les deux cas, le KCl injecté est récupéré en sortie à 100% (Bilan massique BM = 0,98) ; le KCl
n’est donc pas retenu sur l’écorce et constitue un bon traceur pour les colonnes d’écorce de pin. Ce
traçage au KCl avant chaque utilisation d’une nouvelle colonne, a permis de mettre en évidence
certains défauts de préparation (zones stagnantes, chemins préférentiels) par la présence
d’irrégularité sur les courbes d’élution. Dans ce cas les colonnes ont été préparées à nouveau.
Thèse S.GENDRAULT 2004
108

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
II.2.2.2
Suivi du COD, pH et conductivité en sortie de colonne
Le passage de la solution aqueuse polluée à travers la colonne entraîne la solubilisation de certains
composés organiques solubles de l’écorce de pin, ainsi qu’une acidification de la solution. L’évaluation
en sortie de colonne de la concentration en Carbone Organique Dissous (COD) ainsi que des
paramètres pH et conductivité a été mise en œuvre selon le schéma présenté Figure 10 (§ II.1.2.3.2)
pour des colonnes d’écorce de pin stérile et non stérile. Les caractéristiques des colonnes utilisées
pour cette expérience sont présentées en ANNEXE 3.
La Figure 18 montre que la libération de matière organique issue de la solubilisation de composés de
l’écorce de pin est relativement identique pour les colonnes d’écorce stérile et non stérile. La
concentration de carbone organique est très élevée dans les premiers échantillons collectés (2500
mg.L -1 pour l’écorce non stérile et 2300 mg.L -1 pour l’écorce stérile). Rapidement, le COD en sortie de
colonne diminue et atteint 70 mg.L -1 entre 10 et 30 V 0 (correspondant à un volume de 200 à 600 mL) ;
puis le COD devient inférieur à 20 mg.L -1 après 35 V 0 . Cette concentration est assez élevée puisque
proche des limites de rejet d’eaux brutes dans dans le milieu naturel (DCO max 125 mg.L -1 , soit une
concentration en carbone d’environ 30-50 mg.L -1 ).
La masse de carbone solubilisée représente 3,64% de la masse totale d’écorce stérile et 3,40 %
lorsque l’écorce n’a pas été autoclavée. Ces valeurs sont 3 fois supérieures à celles obtenues lors de
tests de lixiviations en batch à un ratio Liquide/solide de 20 mg.L -1 (COD = 1,16% de la masse totale
de l’écorce 2). Dans les colonnes le ratio L/S est environ de 2 mg.L -1 , soit une écorce dix fois plus
concentrée en solution que dans les tests de lixiviation en batch ; ceci explique sans doute la
différence entre COD en colonne et COD en essais batch.
3000
COD (mg/l)
2500
2000
1500
1000
Ecorce stérile
Ecorce non stérile
500
0
0 10 20 30 40 50
V/Vo
Figure 18 : Suivi du COD en sortie de colonne d’écorce de pin stérile et non stérile traversée par une
solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min -1 ; 22°C ; Temps de séjour ≅ 20 min
Cette libération de carbone organique dissous est importante puisque dans le cadre du traitement
biologique il sera important de connaître d’une part la toxicité de ces composés organiques solubles
de l’écorce de pin sur les micro-organismes utilisés, et d’autre part, la capacité des micro-organismes
109
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
à utiliser ces composés comme source de carbone. La consommation des composés solubles de
l’écorce de pin par les micro-organismes pourrait alors éviter l’addition lors du traitement d’une source
de carbone additionnelle.
Il est également important de connaître le pH et la conductivité de l’eau en sortie de colonne (Figure
19 et Figure 20).
pH
5,5
5,3
5,1
4,9
4,7
4,5
4,3
Ecorce stérile
4,1
Ecorce non stérile
3,9
3,7
3,5
0 5 10 15 20 25
V/V0
Figure 19 : Suivi du pH en sortie de colonne (10 g écorce stérile ou d’écorce non stérile) traversée par une
solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min -1 ; 22°C ; temps de séjour ≅ 20 min
900
800
700
C (µS/cm)
600
500
400
300
200
100
0
Ecorce stérile
Ecorce non stérile
0 10 20 30 40
V/V0
Figure 20 : Suivi de la conductivité en sortie de colonne (10 g d’écorce stérile ou d’écorce non stérile)
traversée par une solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min -1 ; 22°C ; temps de séjour ≅ 20 min
Le pH de la solution d’eau en sortie de colonne est relativement acide pour les premiers mL élués
(environ 3,9) pour les colonnes d’écorce stérile comme pour l’écorce non stérile. Après circulation
d’environ 5V 0 , le pH se stabilise à 4,8 et 4,6 pour les colonnes d’écorce non stérile et d’écorce stérile
110
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
respectivement. De la même façon, la conductivité très élevée en début de circulation 350 à
840 µS.cm -1 ), traduisant la lixiviation de composés ioniques de l’écorce de pin, décroît rapidement et
se stabilise après 30 V 0 à une valeur de 20 µS.cm -1 dans les deux colonnes. Une quantité plus
importante de composés ioniques est relarguée par l’écorce de pin non stérilisée (840 µS.cm -1 pour le
premier échantillon prélevé) comparé à l’écorce stérilisée (350 µS.cm -1 ), indiquant que la stérilisation
stabilise certains composés de l’écorce de pin.
Des essais ultérieurs permettront de dire si Pseudomonas ADP sp. utilisée dans le cadre de notre
procédé combiné, sera capable de survivre et de croître dans ces conditions de pH, et de
conductivité.
II.2.2.3
Adsorption de l’atrazine en colonne d’écorce de pin en conditions abiotiques
L’adsorption de l’atrazine a été testée sur les colonnes d’écorce de pin préalablement stérilisée et non
stérilisée selon le protocole décrit au § II.1.2.3.3. Dans les deux cas la solution d’atrazine circulante
contenait un biocide (azoture de sodium 200 mg.L -1 ) afin d’assurer des conditions totalement
abiotiques, évitant ainsi l’intervention de phénomènes biologiques indésirables ici. Le schéma du
montage pour ces essais est représenté Figure 10 (p.101). Un essai sur colonne de charbon actif a
également été réalisé en parallèle.
Les caractéristiques des colonnes utilisées pour ces essais sont présentées en ANNEXE 4.
On observe que la saturation en atrazine des colonnes d’écorce non stérile est atteinte pour l’injection
d’un volume de 50 V 0 environ, contre 100 V 0 dans le cas des colonnes d’écorce préalablement
stérilisée (Figure 21). Dans la colonne de charbon actif, l’atrazine n’est pas détectée en sortie de
colonne après injection d’un volume correspondant à 170 V 0 ; encore une fois, ce résultat montre la
bien meilleure capacité d’adsorption du charbon actif par rapport à celle de l’écorce de pin.
Thèse S.GENDRAULT 2004
111

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
C/Co
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
Ecorce non stérile
Ecorce stérile
Charbon Actif
0,0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
V/Vo
Figure 21 : Adsorption de l’atrazine sur écorce de pin (stérile ou non stérile) et sur charbon actif en
colonne (masse d’adsorbant 10g), circulation en circuit ouvert ; [atrazine] i =0,2 mg.L -1 ; débit = 1 mL.min -1 ;
22°C ; temps de séjour ≅ 20 min
Le calcul de l’aire supérieure de la courbe (méthode des trapèzes) permet d’accéder à la quantité
d’atrazine adsorbée sur l’écorce de pin. Après l’injection de 164 V 0 , l’équilibre apparent est atteint et
0,031 ou 0,032 mg d’atrazine sont adsorbés par gramme d’écorce non stérile ou stérile
respectivement. Les deux courbes sont à première vue très différentes ; elles laissent penser que les
concentrations en atrazine adsorbée seraient significativement différentes entre l’écorce stérile et
l’écorce non stérile. Pourtant les résultats obtenus sont très similaires (0,031 et 0,032 mg.g -1 ) ; ceci est
expliqué par le fait que les concentrations C 0 et les volumes de pores V 0 de chaque colonne ne sont
pas les mêmes (C 0 =0,23 mg.L -1 et V 0 =25 ml pour la colonne d’écorce non autoclavée contre
C 0 =0,20 mg.L -1 et V 0 =18 ml pour la colonne d’écorce autoclavée). Ainsi, ces résultats montrent que
les capacités d’adsorption de l’écorce stérilisée et l’écorce non stérilisée sont tout à fait similaires.
Si l’on compare l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en colonne et en essais batch (Figure 22),
on remarque que pour une concentration à l’équilibre de 0,2 mg.L -1 les quantités d’atrazine adsorbées
sur l’écorce (stérile ou non stérile) sont similaires : 0,040 mg par gramme d’écorce stérilisée et
0,037 mg par gramme d’écorce non stérilisée, en batch. En colonne comme en milieu dispersé,
l’adsorption de l’atrazine est très légèrement supérieure sur l’écorce stérilisée que sur l’écorce non
traitée.
Thèse S.GENDRAULT 2004
112

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
0,25
0,2
q (mg/g)
0,15
0,1
0,05
Ecorce autoclavée
Ecorce non autoclavée
y = 0,2052x + 0,0023
y = 0,1449x + 0,0077
0
0 0,5 1 1,5
Ceq (mg/l)
Figure 22 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoclavée et non autoclavée
(d

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin
Les études en colonnes ont montré que la solution en sortie de colonne était acide (pH 4,6 et
conductivité 40 µS.cm -1 après 5V 0 ) ; le pH n’évoluant plus après 5 V 0 . La question se pose alors quant
à la survie des micro-organismes choisis pour le traitement combiné, dans les colonnes d’écorce de
pin, dans ces conditions de pH.
Les résultats d’adsorption obtenus en colonne montrent que la saturation en atrazine de l’écorce est
atteinte beaucoup plus rapidement dans les colonnes d’écorce non stérilisée que dans les colonnes
d’écorce stérilisée. En revanche, dans les deux cas la quantité d’atrazine adsorbée par gramme
d’écorce est équivalente (environ 0,03 mg.g -1 pour une solution entrante à 0,2 mg.L -1 ). Ce résultat
concorde avec les résultats obtenus en batch (0,04 mg.g-1 d’écorce stérilisée et 0,037 mg.g -1 d’écorce
non stérilisée). L’écorce préalablement stérilisée présenterait un léger avantage par rapport à l’écorce
brute.
D’autre part, les essais ont permis de mettre en évidence des concentrations en carbone organique
non négligeables en sortie de colonne. Un traitement sur écorce de pin serait donc difficilement
envisageable dans le cadre d’une filière classique mais en revanche exploitable en tant que prétraitement
ou traitement individuel pour de fortes concentrations en atrazine avant que l’eau polluée
ne subisse une filtration sur charbon actif ou soit envoyée en station d’épuration.
Les essais comparatifs réalisés avec le charbon actif montrent que ce dernier est nettement plus
efficace que l’écorce de pin pour adsorber l’atrazine. Cependant, dans un procédé de
décontamination par biofiltration combinant adsorption et biodégradtion, la faible capacité d’adsorption
de l’écorce peut devenir un avantage, puisque le polluant restera plus facilement disponible pour les
micro-organismes mis en jeu.
Thèse S.GENDRAULT 2004
114

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
III. Biodégradation de l’atrazine en culture pure de
Pseudomonas ADP sp.
III.1 Matériel et méthodes
III.1.1 Milieux de culture
Les milieux de culture doivent contenir les nutriments nécessaires au développement et au
métabolisme des micro-organismes choisis. Ils doivent ainsi contenir au moins une source azotée,
une source carbonée, une source de phosphore, ainsi que des micro et macro-nutriments (sels
minéraux dont métalliques), éventuellement des facteurs de croissance. Les milieux de culture
peuvent être solides ou liquides, synthétiques ou complexes, riches ou pauvres.
III.1.1.1
Les milieux liquides
III.1.1.1.1 Milieu minéral MM
La plupart de nos essais ont été réalisés en milieu liquide minéral glucosé (source de carbone et
d’énérgie pour les bactéries), l’atrazine jouant le rôle d’unique source d’azote.
La composition du milieu minéral utilisé était la suivante (Barreiros et al., 2003) :
- Tampon Phosphate 27 mM, pH 7,2
- MnCl 2
,4H 2
O 0,51 µM
- CaCl 2
,2H 2
O 0,2 mM
- H 3
BO 3
0,01 mM
- NaCl 7,56 mM
- CoCl , 6H2 2
O 0,8 µM
- MgCl 2
,6H 2
O 0,81mM
- CuCl , 2H2 2
O 0,1 µM
- FeCl 2 ,4H 2
O 5,19 µM
- HCl 1,3 µl.L -1 - NiCl , 6H2
, 25%
2
O 1 µM
- ZnCl 2
0,51 µM
- NaMoO 4
,2H 2
O 0,16 µM
Les solutions suivantes ont été préparées autoclavées 20 minutes à 120°C et conservées
séparément :
- Eau déminéralisée
- Solution de CaCl 2 (0,2 M)
- Solution de nutriments
- Tampon Phosphate (1,35 M)
Chacune des solutions a été conservée à 4°C, à l’exception du tampon phosphate (1,35 M), conservé
à température ambiante.
115
Thèse S.GENDRAULT 2004

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Composition du tampon Phosphate:
KH 2 PO 4
Na 2 HPO 4 ,2H 2 O
0,37 M
0,98 M
Le tampon est ajusté à pH 7,2 par addition d’une solution de soude 0,1 M.
III.1.1.1.2 Milieu riche complexe LB
Le milieu LB est constitué de :
Extrait de levure
5g
Tryptone
10g
NaCl
10g
L’ensemble est additionné à 1 L d’eau déminéralisée, agité puis autoclavé à 120°C pendant 20
minutes, puis conservé à température ambiante.
III.1.1.1.3 Extrait aqueux d’écorce de pin
L’extrait aqueux d’écorce de pin a été utilisé dans l’idée de nous fournir des informations sur la
capacité de Pseudomonas sp. ADP à croître et à dégrader l’atrazine dans un milieu contenant les
composés organiques solubles de l’écorce de pin. L’utilisation de ce milieu a permis d’une part de
tester la toxicité éventuelle de ces composés sur Pseudomonas sp. ADP et d’autre part de
déterminer si ces composés pouvaient ou non constituer une source de nutriments pour les microorganismes.
L’utilisation de l’extrait d’écorce de pin a ainsi permis de s’affranchir des phénomènes d’adsorption
de l’atrazine à la surface des particules d’écorce qui aurait modifié sa biodisponibilité si les essais
avaient été réalisés en présence d’écorce solide.
La préparation de l’extrait aqueux d’écorce de pin est décrite au paragraphe I.6. Cet extrait
constitue un milieu complexe pauvre car les teneurs en carbone et en azote notamment sont
faibles.
Le Tableau ci-dessous présente la composition des extraits réalisés à partir des deux écorces de
pin utilisées au cours de cette étude.
Thèse S.GENDRAULT 2004
116

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Tableau 9 : Teneurs en COT et azote total des extraits aqueux d’écorce de pin utilisés pour différentes
expériences
Ecorce 1 Ecorce 2
Carbone Organique Total 100 ± 10 mg.L -1 580 ± 10 mg.L -1
Azote Total (Kejdhal) 4 ± 0,2 mg.L -1 4 ± 0,2 mg.L -1
Les deux écorces ont été utilisées l’une après l’autre. Toutes les deux provenaient d’une scierie
du nord du Portugal utilisant Pinus pinaster comme matière première.
Lors de son utilisation en culture pure, l’extrait a été stérilisé par filtration sur une membrane de
nitrate de cellulose à 0,2 µm.
III.1.1.2
Les milieux solides
Le milieu solide riche complexe PCA (Plate Count Agar, Merck réf. 1.05463) a été utilisé pour la
croissance des micro-organismes, aussi bien Pseudomonas ADP sp. que pour les microorganismes
indigènes de l’écorce de pin.
Les étalements sur boite de Pétri contenant un milieu riche ont également permis de vérifier la
contamination ou non de certaines cultures réalisées lors des nombreuses expériences de
croissance bactérienne et de dégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Préparation du milieu solide PCA :
A 1 L d’eau déminéralisée sont additionnés,
PCA en poudre
22,5 g
Après dissolution, le milieu est autoclavé à 120°C pendant 20 minutes.
Les boites sont coulées à 80°C en conditions stériles, solidifiées puis séchées pendant 2h à 60°C. Les
boites sont ensuite conservées à 4°C.
III.1.2 Préparation et utilisation des cellules congelées
III.1.2.1
Préparation de cellules congelées
La souche Pseudomonas sp. ADP connue pour ces capacités à minéraliser l’atrazine et décrite dans
la littérature pour la première fois par Mandelbaum et al. (1995) (voir Etude Bibliographique § III), est
commercialisée par l’entreprise allemande DSMZ sous le numéro de référence 11735.
Des cultures de Pseudomonas ADP sp. ont été dans un premier temps réalisées par étalement sur
boite de Pétri PCA incubées à 30°C pendant 48h. Les colonies ont ensuite été transférées en milieu
117
Thèse S.GENDRAULT 2004

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
liquide MM contenant 20 mg.L -1 d’atrazine, comme seule source d’azote et 1 g.L -1 de glucose comme
source de carbone. Les cultures ont été incubées à 30°C sous agitation orbitale à 150 rpm pendant
20 h.
Les cultures ont ensuite été centrifugées à 7000 rpm pendant 20 minutes à 8°C et le culot de cellules
resuspendu dans un tampon phosphate (54 mM, pH 7,2) ; cette opération a été répétée afin
d’effectuer un deuxième lavage. Le culot obtenu après deux lavages a été resuspendu dans un
volume (V/V) de quelques mL d’un mélange de glycérol (40%) et de milieu LB (2 x concentré).
La solution concentrée en cellules a été aliquotée (500 µl) dans des tubes cryogéniques et congelée à
–20°C.
Les stocks de cellules directement utilisés pour les expériences (inoculation à partir de cellules
congelées) ont été préparés de la même manière mais les cellules ont été ressuspendues dans un
milieu constitué de 50% de milieu minéral (MM) et 50% de glycérol (40%).
Avant chaque utilisation d’un stock de cellules congelées, un comptage est réalisé juste après
décongélation pour quantifier le nombre d’unités cellulaires présentes dans un stock. Ces comptages
sont réalisés par dilution du stock de 10 -4 à 10 -9 et étalement sur boite de gélose PCA.
Ainsi, la concentration en cellules étant connue dans les stocks congelés, l’inoculation de
Pseudomonas sp. ADP dans les essais a pu être relativement maîtrisée (nombre de CFU/mL connu)
et contrôlée par mesure de densité optique des cultures liquides autour d’une valeur initiale d’environ
0,05.
III.1.2.2
Utilisation de stocks congelés ou de précultures
• Essais menés à partir de précultures
Les essais en cultures pures ont été, en général, réalisés à partir de précultures cellulaires, ellesmême
obtenues à partir des stocks de cellules congelées.
Les précultures de Pseudomonas sp. ADP ont été réalisées par inoculation d’environ 10 8 CFU/mL
(provenant d’un stock congelé) dans un milieu MM contenant une source de carbone (glucose, 1 g.L -1
et une source d’azote (atrazine 20 mg.L -1 , ou sulfate d’ammonium, 1 g.L -1 )). Les stocks de cellules
congelées contenaient dans des proportions 50/50, un mélange de milieu MM (milieu minéral) et du
glycérol (40%). Du glycérol résiduel est donc présent dans les culture (environ à 8%). Cependant,
cette source de carbone est mal utilisée par Pseudomonas ADP sp. comme le montre la Figure 23 cidessous,
réalisée par mesure de l’activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. Le glucose est quant
à lui facilement biodégradé par Pseudomonas ADP sp.
Thèse S.GENDRAULT 2004
118

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
DBO (mg.L -1 )
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0 10 20 30 40 50
Temps (h)
Glucose (1g/L)
Glycérol (1g/L)
Figure 23 : Utilisation du glycérol ou du glucose comme source de carbone par Pseudomonas ADP sp.
Suivi de la respiration de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) en présence d’atrazine (30 mg.L -
1 ) comme source d’azote et 1g.L -1 de glucose ou glycérol comme source de carbone ; 30°C ; agiation 150
rpm
Les cultures de 50 mL ont été agitées (150 rpm) en Erlenmeyers de 250 mL dans une chambre
thermostatée à 30°C pendant 20h. Les essais ont été inoculés à partir de ces précultures lorsque les
micro-organismes étaient en phase exponentielle de croissance (environ 20 h pour Pseudomonas
ADP sp. en milieu MM-Glucose). La DO initiale dans chaque essai était d’environ 0,05.
• Essais menés directement à partir de cellules congelées
La densité de cellules dans les précultures réalisées en présence d’atrazine (20 mg.L -1 ) étant très
limitée (DO en fin de croissance aux alentours de 0,18 dans les conditions optimales de croissance),
l’inoculation des essais impliquait l’introduction d’importants volumes de préculture (environ 10% du
volume initial), introduisant par là même une quantité de nutriments (notamment azotés) non
négligeable et non souhaités dans beaucoup d’essais. Une autre solution envisagée était de
centrifuger les précultures, puis d’effectuer un lavage des cellules au tampon phosphate pour les
débarrasser de leurs nutriments avant de les inoculer dans chaque essai, ce qui nécessitait la
préparation d’importants volumes de préculture à centrifuger avec parfois des moyens non adaptés à
ces quantités (volume maximum des tubes à centrifugation disponibles : 30mL).
Le choix d’utiliser directement les stocks de cellules congelées pour inoculer les essais, bien que non
« conventionnel », a permis dans tous les cas de réaliser des études comparatives. L’utilisation de
cellules congelées nous permettait ainsi de connaître parfaitement le nombre de cellules inoculées
tout en nous affranchissant des problèmes posés par la présence non souhaitée de traces d’atrazine
ou autre source de nutriments dans le cas de l’utilisation de préculture.
L’incertitude liée à l’effet de la congélation et de la conservation des cellules congelées sur leur survie
et leur physiologie demeure en l’absence de précultures permettant de contrôler la revitalisation des
cellules. Cependant, la comparaison d’essais de minéralisation de l’atrazine effectués à partir de
119
Thèse S.GENDRAULT 2004

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
précultures ou de stocks de cellules congelées a montré que cet effet pouvait être négligé (Figure 24).
Une phase de latence d’une dizaine d’heures environ par rapport à l’utilisation de précultures est
observée, correspondant à la phase de revitalisation des cellules congelées.
90
80
70
% Atrazine minéralisée
60
50
40
30
20
10
Préculture
Cellules congelées
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Temps (h)
Figure 24 : Comparaison de la minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. inoculé à environ
10 6 cfu/mL à partir d’une préculture ou de cellules congelées, en milieu minéral MM (glucose 1g.L -1 ; 14 C-
atrazine 20 mg.L -1 ), 20°C.
III.1.3 Suivi de la croissance des micro-organismes et de l’activité
respiratoire
III.1.3.1
Suivi de la croissance cellulaire
Selon les expérimentations menées, la croissance cellulaire à été suivie soit :
- par lecture de la densité optique à 600 nm.
- par comptage sur boite de Pétri
- par dosage des protéines
III.1.3.1.1 Mesure de turbidité
La croissance cellulaire a été suivie dans certains essais par mesure de la turbidité des cultures à
600 nm sur un spectrophotomètre UV-Visible Milton Roy Spectronic 401 multi-cuvettes.
Des aliquotes de 1 mL de culture ont été utilisés.
Thèse S.GENDRAULT 2004
120

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
III.1.3.1.2 Dénombrement sur boite de Pétri
Le suivi de croissance bactérienne pour les essais contenant de l’écorce de pin en poudre a été
réalisé par étalement sur boite de Pétri PCA (Cf. III.1.1.2) des suspensions décantées (non
centrifugées) et diluées entre 10 -4 et 10 -9 . Les boites ont été incubées à 30°C pendant plusieurs jours.
Le dénombrement est effectué par comptage à l’œil nu des colonies formées.
III.1.3.1.3 Dosage des protéines par la méthode de Folin- Lowry :
La culture à doser (1 mL contenant 0 à 100 µg de protéines) est chauffée à 90°C en présence d’une
solution de NaOH (0,2 N) pendant 2 h. La solution traitée est centrifugée à 10000 rpm pendant
15 minutes afin d’éliminer les fractions cellulaires non hydrolysées.
La réaction colorimétrique se fait par mélange de :
- 1 mL de réactif cuprique (EDTA cuivré 0,25 g.L -1 , NaCO 3 20 g.L -1 , NaOH 0,1 N)
- 0,1 mL de réactif de Folin
- 0,2 mL de surnageant
Le réactif de Folin (solution phénolique contenant des composés de tungstène et de molybdène) est
réduit, passant de la couleur du jaune au bleu, par les ions Cu + (réactif cuprique).
La coloration se développe pendant 30 minutes à l’obscurité à température ambiante.
L’absorbance est mesurée à 660 nm contre un blanc sans protéine réalisé de la même manière que
l’échantillon à doser.
Une courbe de calibration est effectuée à partir de l’albumine sérique de bœuf entre 0 et 100 µg.
III.1.3.1.4 Dosage des protéines par la méthode Bradford :
L’échantillon à doser (100 µl) contenant 0 à 20 µg de protéines est mélangé à 2 mL de réactif de
Bradford. La coloration se développe en 2 minutes. L’absorbance à 595 nm est lue contre un blanc
sans protéines. La teneur en protéines de l’échantillon est déterminée grâce à une courbe
d’étalonnage réalisée avec de l’albumine sérique de bœuf.
Le réactif de Bradford est composé de :
- Bleu de Coomassie 100 mg
- Ethanol 95% 50 mL
- Acide O-phosphorique 100 mL
- Eau distillée q.s.p. 1000mL
Le réactif est stable pendant 15 jours à température ambiante.
Thèse S.GENDRAULT 2004
121

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
III.1.3.2
Suivi de l’activité respiratoire (ou Demande Biochimique en Oxygène DBO)
La respiration des micro-organismes, témoignant d’une activité biologique aérobie, a été mesurée
dans des flacons de 500 mL équipés de têtes Oxitop® (commercialisés par WTW) permettant la
mesure directe de la pression à l’intérieur des flacons.
III.1.3.2.1 Principe de la mesure
Dans des flacons hermétiques (Figure 25), le CO 2 expiré par les micro-organismes résultant de la
consommation d’oxygène pour l’oxydation de la matière organique du milieu est dissous dans la
soude, placée sous forme de pastilles solides dans un piège en caoutchouc au-dessus de la solution.
La quantité de soude placée dans la trappe doit être suffisante par rapport à la quantité de matière
organique présente dans les flacons et potentiellement biodégradable.
Dans ces conditions, la consommation d’oxygène et la dissolution du CO 2 expiré crée une dépression
dans le flacon mesuré par des détecteurs de pression présents dans les têtes Oxitop® ; cette
dépression est ensuite exprimée en consommation de O 2 en mg.L -1 ou mg.g -1 de carbone organique.
La réaction de dissolution du CO 2 dans la soude (NaOH) est la suivante :
CO2 + 2 NaOH → Na2CO3
+ H
2O
La mesure de variation de pression et la consommation d’oxygène sont reliées par la loi des gaz
parfaits.
Ce système nécessite une approximation préalable de la DBO, calculée à partir de la DBO théorique
dite DthO normalisée (OCDE-301-AnnexeIV) dont la formule suit :
16
DthO =
[ 2C
+ 0,5( H − Cl − 3N)
+ 3S
+ (5/ 2) P + (1/ 2) Na − O]
Mr
Pour une molécule considérée, chaque lettre représente le nombre d’atomes (correspondant au
symbole chimique) contenu dans celle-ci, et Mr son poids moléculaire.
Pour le glucose (C 6 H 12 O 6 ), on trouve par exemple une DthO de 1,07 g de O 2 .g -1 de glucose.
La connaissance de la DthO, de la température d’incubation et de la pression atmosphérique permet
d’évaluer le volume d’échantillon à introduire dans les flacons pour avoir un volume d’air suffisant à la
respiration des micro-organismes pour un intervalle de temps déterminé.
Thèse S.GENDRAULT 2004
122

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
III.1.3.2.2 Protocole expérimental
Les essais de respirométrie ont été réalisés dans des flacons stériles de 500 mL contenant 20 ou
50 mL de milieu de culture selon les cas. Les flacons ont été agités à 150 rpm sur une table orbitale
placée à 30 °C à l’obscurité pendant toute la durée de l’incubation. Les essais ont été inoculés à partir
de stock de cellules congelées (environ 10 6 cfu.mL -1 ).
Les essais ont été réalisés en triplicats. Des témoins abiotiques ont été traités de la même manière
mais sans inoculation. Des témoins « vides » (flacons vides) ont permis d’enregistrer les variations
éventuelles de pression ou de température au cours du temps.
Grâce au boîtier Oxitop®, les données ont été récupérées soit à la fin des essais soit au fur et à
mesure de la mesure grâce au logiciel OC Achat (commercialisé avec le matériel Oxitop par WTW).
Les données ont ensuite été traitées sur Excel. La Figure 25 représente le matériel Oxitop® utilisé lors
de ces essais de respirométrie.
Figure 25 : Flacon de DBO équipé de tête Oxitop® utilisé lors des études de respirométrie
III.1.3.3
Détermination du taux de croissance maximal
Le taux de croissance des bactéries µ max est calculé dans la phase exponentielle de croissance.
Ainsi, µ max est exprimé selon la relation suivante, lorsque S supporte la croissance (source de
carbone) :
linéarisé en
X = X
0 .
e
µ max . t
ln X = ln X µ . t
0 +
max
avec X, la concentration cellulaire au temps t et X 0 la concentration cellulaire au temps t=0.
La vitesse de consommation du substrat S est exprimée selon l’équation :
123
Thèse S.GENDRAULT 2004

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
−
dS
dt
1
= ⋅
Y
dX
dt
où : S : Concentration en substrat (atrazine) au temps t (n S .V -1 )
µ m : Taux de croissance maximale (T -1 )
Y : Taux de conversion biomasse/substrat (Nbre Cell. M -1 )
X 0 : Concentration cellulaire à t=0 (n Cell .V -1 )
L’intégration de cette équation entre t 0 et t donne :
soit
S − S
S = S
1
= ( X
Y
0 0
− X
X
( e
0 µ
0
−
m t
−
Y
)
1)
avec
X
=
X
0 .
e
µ max . t
Ainsi, seulement si l’atrazine est support de croissance de Pseudomonas ADP sp. nous pourrons
déterminer des vitesses de croissance en fonction du taux de conversion Y.
III.1.4 Suivi de la biodégradation de l’atrazine
III.1.4.1
Biodégradation primaire de l’atrazine
La biodégradation primaire de l’atrazine a été suivie par analyse HPLC des échantillons liquides,
après filtration à 0,45 µm sur membranes de nitrate de cellulose.
Le protocole pour l’analyse HPLC de l’atrazine est décrit au § (a). Les analyses HPLC en détection
UV nous ont permis de quantifier l’atrazine à des concentrations supérieures à 0,03 mg.L -1 .
Au-dessous de cette concentration, l’utilisation d’atrazine uniformément marquée [U-ring- 14 C]-atrazine
a été requise.
Les composés intermédiaires de dégradation de l’atrazine n’ayant pas été pas détectés grâce à cette
méthode, l’analyse HPLC (dans le cas de l’utilisation d’atrazine froide) a simplement permis d’étudier
la disparition de l’atrazine du milieu ; ainsi, l’information donnée par ces analyses ne renseigne pas
sur la minéralisation mais seulement sur la dégradation primaire de l’atrazine.
124
Thèse S.GENDRAULT 2004

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
L’atrazine a été ajoutée au milieu de culture à partir d’une solution mère concentrée (2000 mg.L -1 )
préparée dans le méthanol, en suivant une procédure inspirée des protocoles utilisés par
Mandelbaum et al. (1993, 1995). Dans les essais, le méthanol est ainsi présent entre 1 et 2,5 % dans
le milieu de culture.
La Figure 26 montre que dans ces conditions (semblables à celles des futurs essais en milieu minéral,
glucose 1g.L -1 et atrazine quelques dizaines de mg.L -1 ), l’addition d’atrazine à partir d’une solution
mère concentrée préparée dans le méthanol n’a pas d’effet sur la croissance de Pseudomonas ADP
sp.
0,18
0,16
0,14
0,12
DO 600nm
0,1
0,08
0,06
0,04
Atrazine sans MeOH
Atrazine dans MeOH
0,02
0 10 20 30 40 50 60
Temps (h)
Figure 26 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM-glucosé à 1 g.L -1 ) avec atrazine
(30 mg.L -1 ) additionnée au milieu à partir d’une solution mère concentrée dans le méthanol ou dissoute
directement en poudre dans le milieu MM ; 30°C ; agitation 150 rpm
En revanche, nous n’avons pas identifié si le méthanol était utilisé par Pseudomonas ADP sp. en tant
que source de carbone (aucune référence trouvée dans la littérature).
D’autre part, les résultats présentés au § III.1.2.2 montrent que le glycérol est très mal assimilé par
Pseudomonas ADP sp. et que par conséquent l’utilisation de cellules congelées contenant 20% de
glycérol ne contribue pas à alimenter les cultures en source de carbone utilisable par Pseudomonas
ADP sp.
III.1.4.2
Minéralisation de l’atrazine
L’étude de la minéralisation de l’atrazine a été réalisée grâce à l’utilisation d’atrazine radioactive par
suivi du 14 CO 2 formé.
La [U-ring- 14 C]-atrazine commercialisée par Sigma, d’activité spécifique de 24,6 mCi.mmol - 1 a été
utilisée pour réaliser plusieurs séries d’expériences à des concentrations initiales de 20 mg.L -1 et
44,2 µg.L -1 .
Thèse S.GENDRAULT 2004
125

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
III.1.4.2.1 Préparation des solutions mères d’atrazine marquée
Pour les séries à 20 mg.L -1 , une solution mère à 2 g.L -1 a été préparée dans le méthanol à partir d’un
mélange d’atrazine froide et d’atrazine radioactive. L’activité spécifique de la solution mère était de
2 µCi.mL -1 . L’activité initiale dans chaque essai à 20 mg.L -1 était de 1 µCi par fiole (biomètre).
Pour les séries à 44,2 µg.L -1 , une solution mère à 4,4 mg.L -1 a été préparée dans le méthanol à partir
d’atrazine radioactive uniquement. L’activité spécifique de la solution mère était de 0,5 µCi.mL -1 .
L’activité initiale dans chaque essai à 44,2 µg.L -1 était de 0,25 µCi par fiole (biomètre).
III.1.4.2.2 Principe des essais de minéralisation
Le dispositif expérimental des essais de minéralisation en biomètres est présenté sur la photo cidessous
(Figure 27).
Figure 27 : Photo d’un biomètre pour l’étude de la minéralisation de l’atrazine
Le CO 2 résultant de la respiration des micro-organismes est dissous dans la soude (1M) présente
dans un piège placée au-dessous des bouchons de chaque biomètre.
Suivi de la minéralisation. Quantification du 14 CO 2
La minéralisation de l’atrazine a été suivie par quantification du 14 CO 2 dissous dans la soude placée
dans les biomètres utilisés pour les expériences de minéralisation en milieu dispersé aussi appelé
« Essai en Batch » (Figure 28).
Thèse S.GENDRAULT 2004
126

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Trappe Piège à NaOH C0 2 – NaOH (1 M) (10,5 M) ml 0,5 mL
Milieu liquide
Barreau aimenté
Figure 28 : Représentation schématique d’un biomètre utilisé dans les essais de minéralisation en
« Batch »
La soude (1 M) contenue dans les pièges à CO 2 (0,5 mL) a été prélevée régulièrement au cours du
temps et remplacée par de la soude fraîche (deux fois par jour en début d’expériences puis tous les 2
ou 3 jours ensuite). Les 0,5 mL de soude sont placés dans une fiole à scintillation dans laquelle 7 mL
de liquide scintillant sont ensuite ajoutés ; après une heure, le mélange est analysé au compteur à
scintillation TRI-CARB 2100TR Packard Liquid Scintillation Analyser (le délai de 1 heure permet
d’éviter la scintillation de la soude (environ 120 dpm)).
Les résultats donnés en dpm (désintégration par minute) sont finalement traduits en % de
minéralisation par rapport à la radioactivité initialement présente dans les biomètres.
Suivie de la radioactivité en solution
Le suivi de la radioactivité dans la phase liquide des essais de minéralisation a été réalisé par
prélèvement de 1 mL de solution contenant initialement une quantité connue de [U-ring- 14C ]-atrazine.
7 mL de liquide à scintillation sont additionnés au prélèvement puis le mélange est analysé au
compteur de la même façon que précédemment.
III.1.4.2.3 Protocole expérimental
Les essais ont été réalisés en biomètre en milieu minéral stérile MM (50 mL/biomètre). Pseudomonas
ADP sp. a été inoculé au milieu à partir de précultures réalisées comme expliqué au chapitre III.1.2.2
pour obtenir une DO initiale d’environ 0,05. Les biomètres ont été incubés à 20 ± 2 °C sous une
agitation douce (barreau magnétique). Deux concentrations initiales en atrazine ont été testées
(20 mg.L -1 et 44,2 µg.L -1 ). L’atrazine était la seule source d’azote. Le glucose additionné au milieu à
une concentration de 1 g.L -1 était la source de carbone.
La minéralisation de l’atrazine a été suivie pendant environ 300 heures (avec renouvellement de l’air à
chaque prélèvement des pièges à soude, soit tous les 2-3 jours au maximum).
Des témoins abiotiques non inoculés avec Pseudomonas ADP sp. ont permis de suivre la
minéralisation de l’atrazine en milieu abiotique et de vérifier la non contamination des milieux utilisés.
127
Thèse S.GENDRAULT 2004

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Les essais et les blancs ont été réalisés en triplicats.
III.1.5 Influence de paramètres physico-chimiques
L’étude de l’influence de certains paramètres sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. et sur sa
capacité à dégrader l’atrazine a permis de fixer certaines limites expérimentales. Les paramètres
comme la température, le pH ainsi que l’apport de nutriments ont été testés en culture pure de
Pseudomonas ADP sp.
III.1.5.1
Influence des sources de carbone
Pseudomonas ADP sp. est décrite dans la littérature comme une souche capable de minéraliser
l’atrazine en tant que source d’azote (Mandelbaum et al., 1995) ; l’atrazine n’est donc pas utilisée
comme source de carbone. L’addition d’une source de carbone a donc été requise dans les différents
essais afin de subvenir au besoin des bactéries. Le glucose a été choisi comme source de carbone
facilement biodégradable. Mandelbaum et al. (1995) montre que le citrate constitue également une
source facilement assimilée par Pseudomonas ADP sp.
III.1.5.2
Influence de la température et du pH
Des essais de croissance bactérienne et de dégradation de l’atrazine ont été menés à des
températures allant de 12°C, qui pourrait correspondre à la température d’une eau naturelle à traiter, à
30°C correspondant à la température optimale de croissance des bactéries mésophiles.
L’influence du pH sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. et sa capacité à dégrader l’atrazine a
été étudié en parallèle.
Protocole expérimental pour les essais à différentes températures
La croissance de Pseudomonas ADP sp. a été suivie en milieu minéral MM (§ III.1.1.1.1) en présence
de 50 mg.L -1 d’atrazine (addition d’atrazine dans le milieu à partir d’une solution mère d’atrazine à
2000 mg.L -1 ) en tant que seule source d’azote. La source de carbone était le glucose à 1 g.L -1 .
Les essais de 50 mL ont été inoculés à une DO 600 de 0,05 à partir d’une préculture réalisée à 30°C en
milieu MM pendant 20 h (III.1.2.2) et incubés à 30°C, 20°C ou 12°C, sous une agitation de 150 rpm.
La croissance a été évaluée par lecture de DO 600 et les protéines du milieu ont été quantifiées par la
méthode de Bradford (III.1.3.1).
Les essais ont été réalisés en triplicats.
Thèse S.GENDRAULT 2004
128

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Protocole expérimental pour les essais à différents pH
De la même manière que les essais précédents, des essais à différents pH ont été réalisés dans un
milieu MM (50 mL) contenant 20 mg.L -1 d’atrazine comme seule source d’azote et 1 g.L -1 de glucose
comme seule source de carbone. Ces essais ont été inoculés à partir de cellules congelées de
Pseudomonas ADP sp. (environ 10 6 cfu.mL -1 , DO initiale environ 0,05) et incubés à 30°C sous
agitation orbitale (150 rpm).
Les 4 pH suivants ont été testés : 3,5 ; 4,4 ; 5,2 ; 7,0.
Les essais ont été réalisés en triplicats.
Le milieu MM non tamponéa été ajusté au pH désiré à l’aide d’une solution de KH 2 PO 4 (50 g.L -1 ).
Après stérilisation du milieu MM par autoclavage, le pH a été vérifié avant d’utiliser le milieu dans les
essais. Le pH a également été contrôlé en fin d’expérience.
La dégradation primaire de l’atrazine a été suivie par prélèvements entre le temps 0 et 60 heures et
analyse des échantillons par HPLC (§ II.1.1.1.2(a)).
III.1.5.3
Influence d’une source additionnelle d’azote
III.1.5.3.1 Croissance bactérienne et dégradation primaire de l’atrazine
La croissance de Pseudomonas ADP sp. a été suivie en milieu minéral MM (§ III.1.1.1.1) contenant
environ 50 mg.L -1 d’atrazine en présence ou non d’une source additionnelle d’azote ((NH 4 ) 2 SO 4 ,
1 g.L -1 ). La source de carbone était le glucose à 1g.L -1 .
Les essais de 20 mL ont été inoculés à une DO 600 de 0,05 à partir de cellules congelées de
Pseudomonas ADP sp. (environ 10 6 cfu.mL -1 ).
Les essais ont été réalisés en triplicats, incubés à 30°C sous agitation (150 rpm).
La coissance a été suivie par mesure de densité optique à 600 nm, pendant 60 heures.
La biodégradation primaire de l’atrazine a été quantifiée par analyse HPLC des échantillons prélevés
entre t 0 et 60 heures.
III.1.5.3.2 Minéralisation de l’atrazine
Ces expériences à l’atrazine marquée ont été réalisées au CEA (Commissariat à l’Energie Atomique)
de Grenoble, au laboratoire DBMS/BBSI.
Le suivi de la production du 14 CO 2 a permis de quantifier la minéralisation de l’atrazine selon le
protocole décrit en III.1.4.2.2
Thèse S.GENDRAULT 2004
129

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
La minéralisation de l’atrazine a été suivie en MM (Glucose 1 g.L -1 comme source de carbone) en
présence ou non d’une source additionnelle d’azote (Sulfate d’ammonium, 1 g.L -1 ).
Les essais de 50 mL ont été inoculés à une DO 600 de 0,05 correspondant environ à 10 6 cfu/mL.
III.1.5.4
Influence des composés solubles de l’écorce de pin
Le traitement combiné envisagé est principalement dépendant de la capacité de Pseudomonas ADP
sp. à survivre et à se développer en présence de l’écorce de pin choisie comme support de biofiltre.
L’écorce de pin contenant une grande variété de composés organiques, la toxicité de ces derniers vis
à vis de la souche bactérienne choisie pour ce traitement a dû être testée. Ainsi, l’activité respiratoire
de Pseudomonas ADP sp., sa capacité à croître et à dégrader l’atrazine en présence des composés
solubles de l’écorce de pin ont été étudiées dans les essais décrits ci-dessous.
Ces essais ont été réalisés en extrait aqueux d’écorce de pin, préparé comme décrit au § I.6 et
stérilisé selon le protocole présenté au § I.7.
Tous les essais réalisés en triplicats, ont été inoculés à partir de cellules congelées de Pseudomonas
ADP sp.
III.1.5.4.1 Influence sur l’Activité Respiratoire de Pseudomonas ADP sp.
Dans une première série d’essais, la respiration de Pseudomonas ADP sp. a été suivie en extrait
aqueux d’écorce de pin (20 mL) en présence ou non de sels minéraux additionnels contenus dans le
milieu MM utilisé dans les essais précédents. Aucune source de carbone additionnelle n’a été ajouté à
l’extrait d’écorce, les composés organiques solubles de l’écorce de pin représentant la seule source
de carbone pour Pseudomonas ADP sp. (COT extrait = 100 mg.L -1 ).
En parallèle à ces essais, des témoins réalisés en MM, ont servi de référence. Dans les témoins en
MM, le glucose a été additionné à 0,25 ou 1 g.L -1 comme seule source de carbone, correspondant
respectivement à 100 mg.L -1 et 400 mg.L -1 de carbone.
Dans tous les essais (MM et extrait), (NH 4 ) 2 SO 4 1 g.L -1 est ajouté comme source d’azote.
Le protocole opératoire pour ces essais de respirométrie est décrit au § III.1.3.2.2.
Dans une seconde série d’essais, l’influence de l’addition d’une source de carbone à l’extrait aqueux
d’écorce de pin a été testée selon le même protocole (§ III.1.3.2.2). Les flacons DBO ont été préparés
avec 50 mL de milieu. La source d’azote était l’atrazine (30 mg.L -1 ). Le glucose a été apporté à l’extrait
comme source additionnelle de carbone à différentes concentrations : 0 mg.L -1 ; 0,25 mg.L -1 ;
0,5 mg.L -1 et 1 mg.L -1 .
Des blancs non inoculés ont également été suivis. Tous les essais ont été incubés en chambre
thermostatée à 30°C.
Thèse S.GENDRAULT 2004
130

MATERIEL ET METHODES
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
III.1.5.4.2 Influence sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. et la biodégradation de
l’atrazine
La croissance de Pseudomonas ADP sp. a été suivie à 30°C (agitation 150 rpm) dans des
Erlenmeyers de 100 mL, dans les milieux suivants (20 mL de milieu):
- Extrait d’écorce de pin seul
- Extrait d’écorce de pin ± une source additionnelle d’azote ((NH 4 ) 2 SO 4 1 g.L -1 ± glucose
(1 g.L -1 ) ± atrazine (50 mg.L -1 ).
Des témoins ont été menés en parallèle en milieu minéral (MM). Des blancs non inoculés ont
également été suivis. La croissance a été suivie par mesure de la DO à 600 nm selon le protocole
décrit au § III.1.3.1.1.
La biodégradation primaire de l’atrazine a été suivie par HPLC selon le protocole décrit au § III.1.4.1.
Thèse S.GENDRAULT 2004
131

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
III.2 Résultats et dissussion
III.2.1 Introduction
Pseudomonas ADP sp. a été retenue pour ses capacités à minéraliser l’atrazine grâce à la présence
de gènes localisés sur le plasmide pADP-1 (Martinez et al., 2001) et choisie pour participer à
l’élimination de ce polluant dans le cadre de notre procédé de traitement combiné.
Dans un premier temps, quelques paramètres physico-chimiques ont été testés sur cette souche afin
de mieux connaître son comportement dans différents environnements et notamment de répondre aux
questions suivantes : Jusqu’à quelle température peut-on observer la croissance de cette bactérie et
l’activité de minéralisation de l’atrazine ? Pseudomonas ADP sp. est-elle capable de survivre dans un
milieu acide (pH 4-5) imposé par la présence d’écorce de pin en poudre en solution ? Quelle est
l’influence de la présence d’une source d’azote dans le milieu, autre que celle de l’atrazine ?
D’autre part, une partie de ce chapitre a été consacrée à l’étude de l’influence des composés
organiques solubles de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp. La toxicité de ces composés ainsi
que la capacité de Pseudomonas ADP sp. à les consommer en tant que source nutritive d’azote ou de
carbone ont été étudiées.
III.2.2 Influence de paramètres physico-chimiques
III.2.2.1
Croissance et biodégradation de l’atrazine à différentes températures
Dans un souci de réduction des coûts de traitement, l’utilisation de l’eau à décontaminer à
température ambiante présenterait un avantage certain. Les micro-organismes étant sensibles à la
température et leur genre Pseudomonas étant, dans leur grande majorité, connu pour posséder une
activité optimale entre 20 et 42°C (bactéries mésophiles) (voir § III.1.5.2), l’étude qui suit a eu pour but
de répondre à la question suivante : A basses températures (10°-15°C), pouvant correspondre aux
températures de l’eau à traiter, Pseudomonas ADP sp. peut-elle croître et conserver sa capacité à
consommer l’atrazine ?
Trois températures ont été testées : 12°C, 20°C et 30°C. Le protocole de ces expériences a été décrit
au § III.1.5.2. La croissance et la biodégradation primaire de l’atrazine ont été suivies en milieu
minéral MM avec l’atrazine (environ 50 mg.L -1 ) comme seule source d’azote.
Figure 29 présente le suivi de la croissance bactérienne et la dégradation primaire de l’atrazine par
Pseudomonas ADP sp. aux trois températures étudiées.
132
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Les résultats montrent que croissance et biodégradation évoluent en fonction de la température. On
note bien que l’activité de Pseudomonas ADP sp. est optimale à 30°C. A 20°C, la croissance est
légèrement ralentie et la biodégradation de l’atrazine est très légèrement affectée (Tableau 11).
A une température de 12°C Pseudomonas ADP sp. est capable de survivre, de croître et dégrader
l’atrazine, mais de manière plus lente qu’aux hautes températures.
L’expression des taux de croissance µ m . (Cf. § III.1.3.3) en fonction de la température (Tableau 10)
traduit l’effet de la température sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. Entre 12 et 30°C, le taux
de croissance µ m évolue linéairement avec la température selon l’équation suivante (µ est estimé sur
les 20 premières heures de croissance) :
µ m = 0,0015 θ + 0,0302
où θ est la température en °C et µ m le taux de croissance en h -1 (Tableau 10).
La vitesse de dégradation de l’atrazine, quant à elle, n’évolue pas linéairement avec la température et
donc pas non plus avec le taux de croissance de Pseudomonas ADP sp. : croissance et biodéradation
de l’atrazine en tant que source d’azote ne seraient pas corrélées chez Pseudomonas ADP sp.
On remarque ainsi (Tableau 11) que les quantités d’atrazine dégradées en fonction du temps sont
similaires à 20 ou à 30°C ; à t=12h, 91 à 98% de l’atrazine initialement présente dans le milieu ont été
dégradés contre 70% seulement à 12°C. L’activité de biodégradation de l’atrazine est clairement
ralentie à cette température.
0,35
0,30
A
70
60
B
0,25
50
0,20
0,15
0,10
12 °C
20°C
0,05
30°C
0,00
0 20 40 60 80 100 120
Temps (h)
40
30
12 °C
20°C
20
30°C
10
0
0 20 40 60 80 100 120
Temps (h)
Figure 29 : Influence de la température sur la croissance (A) de Pseudomonas ADP sp. et sa capacité à
dégrader l’atrazine (B) en milieu minéral (MM), avec atrazine (environ 50 mg.L - 1) comme seule source
d’azote et glucose (1 g.L -1 ) comme source de carbone ; agitation orbitale (150 rpm) ; pH 7
Thèse S.GENDRAULT 2004
133

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Tableau 10 : Taux de croissance µ m de Pseudomonas ADP sp. calculés sur les 20 premières heures en
fonction de la température
T 12°C 20°C 30°C
µ m (h -1 ) 0,0482 0,0602 0,0752
Tableau 11 : Pourcentage d’atrazine dégradée en 12 heures en fonction de la température
T 12°C 20°C 30°C
Atz dégradée
t=12h
70% 93% 98%
Ces résultats montrent que le procédé pourrait être appliqué sans réchauffement de l’eau à traiter.
Cependant, l’augmentation de la température accélérant le taux de biodégradation, une analyse du
rapport Energie/Efficacité/Coût serait nécessaire pour déterminer la température optimale pour ce
traitement.
III.2.2.2
Croissance et biodégradation de l’atrazine à différents pH
La croissance de Pseudomonas ADP sp. ainsi que sa capacité à dégrader l’atrazine ont été testées à
différents pH, en particulier dans la gamme de pH 4-5 correspondant aux pH imposés par l’écorce de
pin en poudre en suspension dans l’eau. La survie des bactéries dans ces conditions de pH est
essentielle dans le cadre du traitement combiné. En effet, de ces résultats dépendent la faisabilité du
procédé.
Le protocole expérimental est décrit au § III.1.5.2 et la Figure 30 présente les résultats obtenus pour
les 4 pH testés.
0,20
0,15
pH 3,5
pH 4,4
0,10
pH 5,2
pH 7
0,05
0,00
0 10 20 30 40 50 60
Temps (h)
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 10 20 30 40 50 60
Temps (h)
pH 3,5
pH 4,4
pH 5,2
pH 7
Figure 30 : Influence du pH sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. (A) et sa capacité à dégrader
l’atrazine (B) en milie minéral (MM) ; atrazine comme seule source d’azote (environ 15 mg.L -1 ) ; glucose
(1g mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation orbitale (150 rpm)
134
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Le Tableau 12 présente les taux de croissance µ m de Pseudomonas ADP sp aux différents pH
étudiés (calculé sur les 20 premières heures). Tandis que la meilleure croissance est logiquement
obtenue à pH 7, on observe une croissance intéressante entre pH 5,2 et 4,4 avec des taux de
croissance 0,0381 h -1 à ces deux pH. A pH 3,5 le taux de croissance est très faible ; Pseudomonas
ADP sp. semble ne pas survivre dans ces conditions et par conséquent aucune dégradation de
l’atrazine n’est observée. De plus, on remarque que µ n’est pas proportionnel au pH comme c’était le
cas pour les températures. Malheureusement, aucune valeurs de µ n’a pu être trouvée pour
Pseudomonas ADP sp. dans la littérature.
La biodégradation primaire de l’atrazine à lieu majoritairement au cours des dix premières heures
d’incubation. Si l’activité de consommation de l’atrazine est maximale à pH 7 et 5,2 (Tableau 13, 96 à
99 % d’atrazine initialement présente sont dégradés en 10 heures), elle est également observée, de
manière légèrement retardée à pH 4,4 (82% de l’atrazine initialement apportée est dégradée en 10h).
Tableau 12 : Taux de croissance de Pseudomonas ADP sp. calculés sur les 20 premières heures et
vitesse de biodégradation de l’atrazine calculée s sur les 10 premières heures en fonction du pH
pH 3,5 pH 4,4 pH 5,2 pH 7
µ (h -1 ) 0,0199 0,0381 0,0381 0,0387
Tableau 13 : Pourcentage d’atrazine dégradée en 10h en fonction du pH
Atrazine
dégradée
T=10h
pH 3,5 pH 4,4 pH 5,2 pH 7
1% 82% 99% 96%
Dans l’hypothèse où l’écorce ne serait pas toxique pour Pseudomonas ADP sp., ces résultats
indiquent que ces bactéries seraient en mesure de survivre dans les conditions de pH imposées par
l’écorce de pin et qu’un traitement visant à tamponner le milieu pourrait ainsi être évité.
III.2.2.3
Influence d’une source additionnelle d’azote
Lors d’une pollution d’eaux de surface ou d’eaux souterraines par l’atrazine, la concentration en
pesticide ne représentant souvent que quelques micro-grammes par litre, le problème se pose quant à
la survie de Pseudomonas ADP sp. lorsque l’atrazine est la seule source d’azote. L’activité
métabolique des bactéries étant essentiellement liée à leur croissance, des expériences ont été
menées afin de tester l’influence qu’aurait l’addition d’une source d’azote (en plus de l’atrazine) sur la
135
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
capacité de Pseudomonas ADP sp. à dégrader le pesticide. Ces expériences ont été réalisées à des
concentrations en atrazine d’environ 50 mg.L -1 (bien supérieures aux taux de pollution observés dans
la nature et obtenues avec du méthanol comme cosolvant) afin d’obtenir des taux significatifs de
croissance et de permettre le suivi de la concentration en atrazine par analyse HPLC.
III.2.2.3.1 Influence sur la dégradation primaire de l’atrazine
La dégradation primaire de l’atrazine a été suivie par analyse HPLC. Il s’agit en réalité du suivi de la
disparition de l’atrazine du milieu, les métabolites intermédiaires n’étant pas mis en évidence. La
croissance de Pseudomonas ADP sp. a également été suivie en parallèle à la biodégradation de
l’atrazine. Le protocole expérimental pour ces essais est présenté au § III.1.5.3.
La Figure 31 montre très clairement que l’apport d’une source supplémentaire d’azote (sulfate
d’ammonium 1 g.L -1 ) a un effet positif sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral.
Les taux de croissance estimés dans les différents milieux varient entre 0,0119 h -1 dans le milieu ne
contenant que l’atrazine comme source d’azote (50 mg.L -1 environ, équivalent à 16 mg.L -1 d’azote) et
0,0665 h -1 pour un milieu contenant ou non de l’atrazine dans lequel le sulfate d’ammonium est
apporté à 1g.L -1 (équivalent à 200 mg.L -1 d’azote).
mg Prot.L -1
35
30
25
20
15
10
5
0 10 20 30 40 50 60
Temps ( h)
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Atrazinez (mg.L -1 )
MM + Sulf . Am.
MM + Atrazine + Sulf. Am.
MM + Atrazine
Figure 31 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et dégradation primaire de l’atrazine présente ou non
(50 mg.L -1 ) en milieu minéral (MM) en présence ou non d’une source additionelle d’azote (sulfate
d’ammonium 1 g.L -1 ) ; Glucose (1 g.L -1 ) ; 30°C ; agitation orbitale 150 rpm
La Figure 31 montre également que lorsque du sulfate d’ammonium est apporté (1g.L -1 ), la croissance
est identique en milieu minéral glucosé en présence ou non d’atrazine (µ=0,0665 h -1 et 0,0624 h -1
Thèse S.GENDRAULT 2004
136

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
respectivement) traduisant la non toxicité de l’atrazine, à une concentration de 50 mg.L -1 environ, vis à
vis de Pseudomonas ADP sp.
La croissance est très réduite lorsque l’atrazine est la seule source d’azote présente dans le milieu ; la
vitesse de dégradation ne semble pas en être pour autant affectée ce qui voudrait dire que croissance
et dégradation du substrat atrazine ne seraient pas directement corrélés. C’est également ce
qu’observent Mandelbaum et al. (1995) (voir étude Bibliographique § III.4).
En effet, les vitesses de dégradation de l’atrazine sont tout à fait comparables que ce soit en présence
ou non d’une source additionnelle d’azote comme le sulfate d’ammonium (3,73 et 3,84 mg.h -1
respectivement). Au bout de 13 heures d’incubation, plus de 95% de l’atrazine présente initialement
dans le milieu sont dégradés dans les deux cas.
Ces résultats montrent que la dégradation primaire de l’atrazine n’est pas affectée par la présence
d’une source additionnelle d’azote dans le milieu mais ne permettent en aucun cas de conclure sur sa
minéralisation.
Pour cette raison, des études de minéralisation ont été menées avec de l’atrazine radioactive.
III.2.2.3.2 Influence sur la minéralisation de l’atrazine
Les expériences de minéralisation ont été conduites selon le protocole décrit au § III.1.5.3.2 en milieu
minéral (MM) enrichi au glucose ou en milieu complexe riche LB en présence d’atrazine marquée
(concentration initiale 20 mg.L -1 ) . La minéralisation a été suivie par mesure de la production de 14 CO 2
selon le protocole détaillé au § III.1.4.2.3.
Le sulfate d’ammonium (1g.L -1 ) a été utilisé comme source additionnelle d’azote dans le milieu MM.
Les résultats présentés à la Figure 32 montrent qu’aucune minéralisation de l’atrazine n’a lieu en
milieu riche (LB) ; le milieu LB contient une quantité importante de nutriments azotés et carbonés
facilement disponibles pour les bactéries ; l’atrazine est « laissée » de côté en faveur des autres
substrats du milieu nutritif.
80% de l’atrazine sont minéralisés en milieu minéral glucosé (MM-Glc), en l’espace de 25h, lorsque
aucune source d’azote est ajoutée au milieu, contre 20% seulement lorsque le sulfate d’ammonium
est présent dans le milieu à 1g L -1 .
Thèse S.GENDRAULT 2004
137

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
% Atrazine mineralisée
100
80
60
40
20
MM
MM + Sulf . Am.
LB
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temps ( h)
Figure 32 : Minéralisation de l’atrazine (concentration initiale environ 20 mg.L -1 ) par Pseudomonas ADP
sp. en milieu riche (LB) ou en milieu minéral (MM ; glucose 1 g.L -1 ) contenant ou non une source
additionnelle d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 ) ; 30°C ; Agitation 150 rpm ; 14 C-atrazine à 1 µCi/fiole
Si la dégradation primaire de l’atrazine n’est pas affectée par la présence d’une source additionnelle
d’azote dans le milieu, la minéralisation est quant à elle largement réduite, laissant penser que des
métabolites intermédiaires doivent être accumulés. Ce résultat montre également que croissance et
minéralisation ne sont pas couplées puisque l’apport d’azote augmente la croissance mais diminue la
minéralisation. Ce résultat est en accord avec les observations faites par Mandelbaum et al. (1995) :
Biodégradation et croissance ne seraient pas directement corrélées, Pseudomonas ADP sp. étant
capable de minéraliser l’atrazine dans des conditions non favorables à sa croissance.
Ceci implique que le traitement devra se faire sans addition d’azote. Les expériences menées en
extrait aqueux d’écorce de pin décrites ci-après ont pour objectif d’évaluer l’influence des composés
azotés libérés par l’écorce de pin (environ 4 mg.L -1 pour un ratio L/S=20) sur la minéralisation de
l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
III.2.3 Influence des composés solubles de l’écorce de pin sur
Pseudomonas ADP sp.
Cette étude a permis de déterminer si les composés organiques solubles de l’écorce de pin,
solubilisés lorsque la poudre est en suspension dans l’eau, étaient ou non toxiques pour la souche
Pseudomonas ADP sp. choisie. De ce résultat dépendait la faisabilité du traitement ; c’est donc un
point essentiel de cette étude que nous abordons dans ce chapitre. Les essais concernant l’influence
des composés solubles de l’écorce sur Pseudomonas ADP sp. ont été réalisés en extrait aqueux
d’écorce de pin (Cf. §I.6), nous permettant ainsi de suivre des croissances bactérienne par densité
optique et de suivre la dégradation de l’atrazine, en s’affranchissant des phénomènes d’adsorption qui
seraient intervenus si nous avions utilisé un milieu contenant l’écorce elle-même.
138
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Différents tests ont été mis en oeuvre : des essais de respirométrie ont permis d’étudier dans un
premier temps la toxicité des composés de l’écorce vis à vis de Pseudomonas ADP sp.; d’autre part la
croissance (par mesure de DO) et la biodégradation de l’atrazine (analyse HPLC) ont été suivis en
extrait d’écorce de pin ; l’influence de l’addition d’une source supplémentaire de carbone à l’extrait
d’écorce de pin a également fait l’objet d’une étude particulière.
III.2.3.1
Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin
L’extrait aqueux d’écorce de pin utilisé dans ces essais contenait une quantité d’environ 100 mg.L -1 de
carbone organique dissous (COD) et environ 4 mg.L -1 d’azote, potentiellement utilisables pour les
bactéries (Cf. § Tableau 9, p.117).
Le suivi en parallèle de l’activité respiratoire en milieu minéral (MM-Glc) glucosé à 1 ou 0,25 g.L -1 et
sulfate d’ammonium 1 g.L -1 et en extrait d’écorce de pin, a permis d’étudier la toxicité des composés
de l’écorce vis à vis de Pseudomonas ADP sp. (Cf. protocole expérimental au § III.1.5.4.2). D’autre
part, aucune source de carbone n’ayant été ici additionnée à l’extrait d’écorce, ces essais ont permis
de tester la capacité de Pseudomonas ADP sp. à utiliser les composés organiques solubles de
l’écorce de pin comme source de carbone.
La Figure 33 montre que pour une même concentration initiale en carbone organique dissous dans
l’extrait et en milieu minéral (COD 100 mg.L -1 en MM-Glucosé à 0,25 g.L -1 ou en extrait) l’activité
respiratoire de Pseudomonas ADP sp. est relativement équivalente en milieu minéral (MM) et en
extrait aqueux d’écorce de pin ; on note cependant une croissance très légèrement meilleure en MM.
Cette différence peut être expliquée soit par une faible toxicité des composés solubles de l’écorce de
pin vis à vis de Pseudomonas ADP sp., soit plus probablement par une plus faible biodégradabilité de
ces composés.
1400
1200
1000
DBO (mg.L-1)
800
600
400
200
0
0 10 20 30 40 50
temps (h)
MM + Glc (1 g/l) + N (1 g/l)
MM + Glc (0.25g/l) + N (1g/l)
Extrait + N (1g/l)
Extrait + N (1g/l) + sels
Figure 33 : Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) en présence de 1 ou
0,25 g.L -1 de glucose comme source de carbone, 1 g.L -1 de sulfate d’ammonium ; en extrait aqueux
d’écorce de pin (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 comme source d’azote) en présence ou non de sels
minéraux ; 30°C ; agitation 150 rpm
139
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Lorsque le glucose est apporté à 1 g.L -1 (correspondant à une concentration en COD de 400 mg.L -1 )
la respiration est logiquement supérieure à celle observée avec une concentration plus faible en
glucose. L’apport de nutriments minéraux à l’extrait n’améliore pas l’activité bactérienne par rapport à
l’extrait seul, ce qui permet de conclure que les nutriments minéraux essentiels doivent être présents
en quantité suffisante dans l’extrait pour les bactéries.
Ainsi, les composés solubles de l’écorce de pin ne semblent pas présenter de toxicité vis à vis de
Pseudomonas ADP sp. De plus, ces composés peuvent être utilisés par Pseudomonas ADP sp.
comme source de carbone, permettant ainsi d’éviter l’addition d’une source additionnelle de carbone
lors du traitement combiné.
Ces résultats encouragent ainsi l’idée de faisabilité du traitement combiné sur écorce de pin.
III.2.3.2
Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en extrait
d’écocre de pin
La croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin a été suivie en présence
ou non de sources additionnelles de carbone (glucose 1 g.L -1 ) et/ou d’azote (sulfate d’ammonium
1 g.L -1 ) et comparée à la croissance en milieu minéral (MM) enrichi en glucose (1 g.L -1 ) et en sulfate
d’ammonium (1 g.L -1 ).
Le protocole de ces essais est détaillé au § III.1.5.4.2.
La Figure 34 montre tout d’abord que la croissance de Pseudomonas ADP sp. est faible
lorsqu’aucune source complémentaire de carbone ou d’azote n’est ajoutée à l’extrait aqueux d’écorce
de pin. La présence d’une source additionnelle d’azote stimule considérablement la croissance
indiquant d’une part que la quantité d’azote contenue dans l’extrait (environ 4mg.L -1 , avec C/N = 50/1)
est insuffisante pour permettre un bon développement des bactéries, et confirmant d’autre part, que
Pseudomonas ADP sp. utilise les composés organiques solubles de l’écorce de pin comme source de
carbone.
Thèse S.GENDRAULT 2004
140

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
1,0
DO 600 nm
0,8
0,6
0,4
0,2
MM + N + Glc
Extract + N
Extract
Extract + Glc + N
Extract + Glc
0,0
0 50 100 150 200
Temps (h)
Figure 34 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait stérile d’écorce de pin ou en milieu minéral
(MM) contenant ou non une source additionnelle de carbone (glucose 1g.L -1 noté Glc) et/ou une source
d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm
L’addition de glucose (1 g.L -1 ) à l’extrait induit une inhibition de la croissance de Pseudomonas ADP
sp., en présence ou non d’une source complémentaire d’azote (respectivement C/N=100/200 avec
une source additionnelle d’azote et C/N=100/0,8 sans source additionnelle d’azote) Dans les essais
contenant du glucose, des agrégats sont formés laissant penser que les cellules se regroupent pour
constituer une forme défensive, ce qui pourrait indiquer que la présence de glucose additionnel n’est
pas favorable à leur croissance. Cette hypothèse est confirmée par les essais menés en extrait
aqueux d’écorce de pin contenant différentes concentration de glucose (Figure 35).
D’autre part, la Figure 34 montre également que la croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait
est retardée par rapport à la croissance observée en milieu minéral (MM glucosé et azoté)
correspondant à une phase d’adaptation des micro-organismes d’environ 40h au milieu contenant les
composés organiques solubles de l’écorce de pin.
L’activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. a été suivie pour des concentrations en glucose
comprises entre 0 et 1 g.L -1 (Figure 35).
Thèse S.GENDRAULT 2004
141

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
1200
DBO (mg.L -1 )
1000
800
600
400
200
Sans glucose
Glucose 0,25 g/l
Glucose 0,5 g/l
Glucose 1g/l
Blanc stérile
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Temps (h)
Figure 35 : Activité respiratoire (exprimée en mg de O 2 .L -1 ) de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux
d’écorce de pin contenant (0,25 mg.L -1 ; 0,5 mg.L -1 ou 1 mg.L -1 ) ou non du glucose ; 30°C ; agitation 150
rpm.
La présence d’une source additionnelle de carbone (glucose) dans l’extrait d’écorce de pin a un effet
inhibiteur sur la respiration de Pseudomonas ADP sp. La Figure 35 montre que la respiration est
meilleure lorsque aucune source de carbone n’est ajoutée à l’extrait. Dans ces conditions, le rapport
C/N est de 100/4 et correspond aux exigences nutritives classiques pour les bactéries. Pour des
concentrations en glucose supérieures à 0,25 mg.L -1 (C/N>250/4), la formation d’agrégats bruns
(1 mm de diamètre environ) a été observée comme précédemment, laissant penser à une forme
défensive des cellules.
Des essais de croissance ont également été menés en présence d’atrazine (50 mg.L -1 ) en tant que
source d’azote. La Figure 36 présente les résultats de ces essais et montre à nouveau que la
croissance en extrait (comme en MM) est très limitée lorsque aucune source d’azote supplémentaire
n’est apportée au milieu. L’apport d’atrazine dans l’extrait (50 mg.L -1 ) comme seule source
additionnelle d’azote stimule légèrement la croissance de Pseudomonas ADP sp. par rapport aux
conditions en extrait seul. Lorsque du sulfate d’ammonium est additionné à l’extrait (1g.L -1 ), le
développement de Pseudomonas ADP sp. se trouve très nettement stimulé que ce soit en présence
d’atrazine ou non, indiquant que l’atrazine en extrait aqueux d’écorce de pin ne présente pas de
toxicité vis à vis de Pseudomonas ADP sp.
Thèse S.GENDRAULT 2004
142

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
0,6
Croissance
DO 600nm
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
Extrait + N
Extrait + Atrazine + N
Extrait + Atrazine
Extrait
MM-Glc + Atrazine
0,0
0 10 20 30 40 50 60
Temps (h)
Atrazine en solution (mg.L -1 )
60
50
40
30
20
10
Biodégradation
Extrait
Extract + N
Témoin Stérile Extrait
0
0 10 20 30 40 50 60
Temps (h)
Figure 36 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en extrait aqueux
d’écorce de pin stérile ou en milieu minéral MM (glucose 1 g.L -1 ) en présence d’atrazine (50 mg.L -1 ) avec
ou sans sulfate d’ammonium (1 g.L -1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm
La Figure 36 montre également que la dégradation primaire de l’atrazine en extrait seul et en extrait
contenant une source additionnelle d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 ) est équivalente : environ
40 % de l’atrazine initialement apportée au milieu est dégradée en 12 heures) alors que la croissance
est meilleure lorsqu’une source d’azote est ajoutée à l’extrait (µ max =0,0547 h -1 en extrait azoté contre
0,0296 h -1 en extrait seul). Cette observation confirme à nouveau que croissance et activité de
biodégradation de l’atrazine ne seraient pas directement corrélées comme cela a déjà été discuté au
§ III.2.2.3.2 p.137. D’autres auteurs (Mandelbaum et al., 1995) ont également montré que
Pseudomonas ADP sp. est capable de minéraliser l’atrazine dans des conditions non favorables à sa
croissance. Pseudomonas ADP sp. continue de métaboliser l’atrazine au delà de ses besoins en
azote. Ceci serait lié au fait que les enzymes responsables du métabolisme de l’atrazine sont
présentes dans le cytoplasme ou le periplasme des cellules bactériennes.
143
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
L’addition d’une source d’azote au milieu, bien que profitable à la croissance des bactéries, ne stimule
donc pas pour autant la biodégradation de l’atrazine. D’autre part, les essais précédents réalisés en
milieu minéral glucosé (MM-Glc) ont montré que l’addition d’une source d’azote diminuait
considérablement le taux de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Ainsi, nous avons écarté l’idée d’ajouter une source additionnelle d’azote pour les essais suivants, ne
conservant comme seule source d’azote que l’atrazine et les quelques traces d’azote contenu dans
l’extrait aqueux d’écorce de pin ou les particules d’écorce de pin elles-mêmes.
Concernant les essais de minéralisation, la Figure 37 montre les résultats obtenus en extrait stérile
d’écorce de pin et en milieu minéral MM glucosé (protocole expérimental décrit au § V.1.1.1).
80
70
% Atrazine minéralisée
60
50
40
30
20
10
MM-Glc + Atrazine
Extrait + Atrazine
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Temps (h)
Figure 37 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp en extrait aqueux d’écorce de pin stérile
ou en milieu minéral MM (glucose 0,25 g.L -1 ) ; concentration initiale en atrazine 20 mg.L -1 ; 22°C ;
agitation lente
La minéralisation est similaire en extrait et en milieu minéral glucosé, pour une quantité de carbone
équivalente dans les deux milieux (100 mg.L -1 ), à une concentration initiale en atrazine de 20 mg.L -1
(correspondant à un rapport C/N de l’ordre de 100/5-9). Une nouvelle fois ces résultats montrent que
la présence des composés organiques de l’écorce de pin ne sont pas néfastes pour Pseudomonas
ADP sp. vis à vis de la minéralisation de l’atrazine.
III.3 Conclusions
Les principales conclusions concernant la biodégradation de l’atrazine en culture pure de
Pseudomonas ADP sp. sont les suivantes :
- Pseudomonas ADP sp. est capable de croître et dégrader l’atrazine de façon
significative à une température de 12°C et à des pH acides compris entre 4,4 et 7.
144
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
- L’addition d’une source d’azote au milieu, en plus de l’atrazine, stimule la croissance
des bactéries mais diminue considérablement le taux de minéralisation de l’atrazine,
elle-même consommée en tant que source d’azote par Pseudomonas ADP sp., sans
pour autant affecter le taux de dégradation primaire de l’atrazine.
- Pseudomonas ADP sp. est capable de croître et de dégrader l’atrazine en extrait
aqueux d’écorce de pin contenant les composés organiques solubles de l’écorce de
pin. Les taux de minéralisation observés en extrait aqueux d’écorce de pin et en
milieu minéral glucosé (MM-Glc 0,25 g.L -1 ) sont similaires. Les composés organiques
de l’écorce de pin peuvent être consommés par Pseudomonas ADP sp. en tant que
source de carbone (concentration en carbone dans l’extrait 100 mg.L -1 ). Ils sont par
conséquent biodégradables et non toxiques vis à vis de Pseudomonas ADP sp.
- L’addition de glucose à l’extrait aqueux d’écorce de pin provoque une inhibition de la
croissance de Pseudomonas ADP sp.
En terme d’application, ces résultats suggèrent que :
- La biodégradation de l’atrazine pourrait être efficace sans l’ajout d’une source
supplémentaire de carbone comme le glucose. Pseudomonas ADP sp. pourrait ainsi
dégrader en parallèle l’atrazine (source d’azote) et les composés organiques solubles
issus de l’écorce de pin (source de carbone).
- La faible concentration en azote contenue dans l’écorce de pin pourrait stimuler
l’utilisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en tant que source d’azote.
L’addition d’une source d’azote supplémentaire induirait une réduction du taux de
minéralisation de l’atrazine.
- La biodégradation de l’atrazine pouvant avoir lieu à des pH acides imposés par la
présence des composés organiques de l’écorce (pH 4,4), le traitement pourrait être
conduit sans addition de tampon. D’autre part, la biodégration ayant été observée à
12°C, le réchauffement de l’eau à traiter ne serait pas indispensable. Ainsi, des
conditions de traitement relativement « rustiques » pourraient être envisagées.
Cependant, le contrôle du pH et de la température dans les zones optimales
permettrait bien évidemment d’optimiser l’efficacité du procédé.
Thèse S.GENDRAULT 2004
145

MATERIEL ET METHODES
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
IV. Caractérisation et rôle de la microflore Indigène de
l’écorce de pin
La capacité de Pseudomonas ADP sp. à coexister, à croître et à dégrader l’atrazine en présence de la
microflore indigène de l’écorce de pin est un aspect important de la faisabilité du procédé combiné
envisagé.
Quelle influence cette microflore indigène a-t-elle sur la souche bactérienne Pseudomonas ADP sp. ?
Sont-elles en compétition ?
D’autre part, la microflore de l’écorce de pin peut-elle également intervenir dans le processus de
dégradation de l’atrazine ? Les expériences décrites ci-dessous ont été conduites pour répondre à ces
questions.
IV.1 Matériel et méthodes
IV.1.1 Isolement et identification des micro-organismes de l’écorce de pin
L’isolement des principaux micro-organismes extraits de l’écorce de pin a permis d’identifier
qualitativement les espèces revivifiables prédominantes et de tester, en cultures pures ou en
consortium, leur capacité à croître dans un milieu contenant de l’atrazine et à la dégrader.
L’isolement de la flore indigène de l’écorce de pin a été réalisé à partir de la poudre d’écorce
(particules d’écorce d

MATERIEL ET METHODES
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
Il ne fait pas de doute que la totalité des micro-organismes présents dans l’écorce n’a pas été isolée
par cette technique de revitalisation. Il est connu que dans les sols, cette approche ne touche que
quelques % des cellules (Giacomazzi, 2002). Cependant, on peut penser que les micro-organismes
mis en évidence selon l’isolement effectué ci-dessus représentent les espèces indigènes majoritaires
de l’écorce de pin.
IV.1.2 Capacité de la flore indigène à dégrader l’atrazine
Les quatre isolats obtenus à partir de l’isolement des micro-organismes de l’écorce de pin sont notés
CP1 à CP4.
IV.1.2.1
Biodégradation de l’atrazine en consortium ou en cultures pures
La biodégradation de l’atrazine par le consortium, contenant les 4 souches isolées (CP1, CP2, CP3,
CP4) de l’écorce de pin, ou par des cultures pures de chacune des souches, a été testée en milieu
liquide LB et en extrait aqueux d’écorce de pin. Le milieu riche LB a été utilisé afin d’obtenir une
bonne croissance des micro-organismes présents, et donc une forte activité métabolique ; l’extrait
aqueux d’écorce de pin a quant à lui permis de simuler les conditions du milieu d’origine des différents
micro-organismes isolés.
Comme précédemment, la croissance des micro-organismes a été suivie par mesure de DO 600
(III.1.3.1.1); la dégradation de l’atrazine du milieu a été analysée par HPLC (II.1.1.1.2(a)) sur les
prélèvements effectués entre le temps 0 à 200 heures environ.
Les essais ont été réalisés en Erlenmeyers dans 20 mL de milieu (LB ou extrait aqueux d’écorce de
pin) à 30°C sous agitation (150 rpm). Les fioles ont été inoculées à partir des stocks de cellules
congelées avec environ 10 6 cfu.mL -1 de chacune des 4 souches isolées.
L’atrazine a été ajoutée aux essais à environ 50 mg.L -1 .
Les essais ont été réalisés en triplicats.
IV.1.2.2
Minéralisation de l’atrazine par la flore indigène de l’écorce de pin
L’utilisation d’atrazine marquée uniformément au 14 C a permis d’étudier la minéralisation de l’atrazine
par la flore indigène de l’écorce de pin en présence même d’écorce de pin en poudre dans un milieu
minéral (MM).
Les expériences ont été réalisées en biomètre en présence de 50 mL de MM stérile contenant 2,5 g
(ratio L/S =20 mL.g -1 ) d’écorce de pin en poudre non stérile (d>200nm). C’est donc l’écorce de pin qui
ici, apporte les micro-organismes indigènes au milieu. Deux concentrations initiales en atrazine ont
147
Thèse S.GENDRAULT 2004

MATERIEL ET METHODES
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
été testées : 44 µg.L -1 et 20 mg.L -1 . Les biomètres ont été placés à 20 ± 2°C et agités doucement avec
un barreau magnétique.
Les témoins abiotiques ont été préparés à partir de 2,5 g d’écorce préalablement stérilisée (§ I.7) et
50 ml de milieu MM stérile.
La minéralisation a été suivie par quantification du 14 CO 2 formé selon le protocole décrit au
§ III.1.4.2.3.
IV.1.3 Influence de la microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas
ADP sp.
Le travail qui suit a consisté à étudier la croissance de Pseudomonas ADP sp. ainsi que sa capacité à
biodégrader et à minéraliser l’atrazine en présence de la microflore de l’écorce de pin. Les essais ont
été réalisés en extrait aqueux d’écorce de pin dans un premier temps puis en présence d’écorce en
poudre.
IV.1.3.1
Croissance de Pseudomonas ADP sp.
Pseudomonas ADP sp. a été cultivé dans des Erlenmeyers de 250 mL contenant 50 mL d’extrait
aqueux d’écorce de pin stérile, ou non stérile, ou 50 mL de milieu minéral stérile (MM) contenant de
l’écorce de pin en poudre (diamètre

MATERIEL ET METHODES
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
d’écorce de pin puisqu’en présence de particules d’écorce l’adsorption ne peut pas être distinguée de
la biodégradation.
IV.1.3.2.2 Suivi de la minéralisation de l’atrazine
La minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en présence de la microflore indigène de
l’écorce de pin a été étudiée en milieu minéral (MM) en présence d’écorce de pin en poudre (non
stérile, ratio L/S=20 mL.g -1 ). Pour ces expériences, l’atrazine était la seule source additionnelle
d’azote. Deux concentrations initiales en atrazine ont été testées : 44,2 µg.L -1 (correspondant à une
pollution probable) et 20 mg.L -1 (concentration en azote permettant un développement microbien
important). Les composés solubles de l’écorce de pin étaient la seule source de carbone (COT
initial = 580 mg.L -1 ) (Tableau 9, p.117). Les composés solubles de l’écorce de pin apportaient au
milieu une concentration en azote d’environ 4 mg.L -1 . Pseudomonas ADP sp. a été inoculé à partir de
précultures à une DO initiale de 0,05. Les essais ont été réalisés à 20 ± 2°C dans des biomètres et
agités doucement à l’aide de barreaux magnétiques.
Les témoins contenant l’écorce stérilisée (débarrassée de sa microflore) ont été inoculés de la même
façon que précédemment (préculture de Pseudomonas ADP sp.) et incubés dans les mêmes
conditions.
La minéralisation a également été suivie dans des témoins non inoculés par Pseudomonas ADP sp.
Thèse S.GENDRAULT 2004
149

RESULTATS ET DISCUSSION
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
IV.2 Résultats et discussion
IV.2.1 Isolement de la microflore de l’écorce de pin
L’isolement de colonies issues de l’écorce de pin réalisé selon le protocole présenté au § IV.1.1 a
permis de mettre en évidence 4 isolats majoritaires nommés CP1, CP2, CP3 et CP4.
Les caractéristiques morphologiques et physiologiques de ces isolats sont résumées dans le Tableau
14.
Tableau 14 : Description des colonies de micro-organismes isolés de l’écorce de pin sur boite de Pétri
Colonie Taille Forme Contour Epaisseur Aspect Couleur Gram Filament
CP1 2-3 mm circulaire régulier plat opaque blanc + oui
incrusté
dans l’agar
CP2 7 mm circulaire régulier plat lisse beige Coque - non
ou ovale
muqueux
translucide
CP3 2-3 circulaire régulier plat translucide beige Bacile - non
brillant
lisse
CP4 2-3 circulaire régulier plat translucide
brillant
lisse
jaune Coque + non
Chacun des 4 isolats mis en évidence par cette méthode présente une morphologie particulière
(couleur, forme, taille, présence de filament…) ce qui a permis de les identifier assez facilement sur
boite de Pétri et de les distinguer de Pseudomonas ADP sp.
Si CP1, CP3 et CP4 présentent l’aspect de bactéries, l’observation de CP2 au microscope optique se
rapproche d’une structure de levure de part sa taille et sa forme (Coque 10 à 20 µm). Suite à cet
isolement, des stocks de cellules congelées de chacun des isolats ont été préparés et conservés pour
être utilisés, de la même façon que Pseudomonas ADP sp., lors des études qui suivent.
Thèse S.GENDRAULT 2004
150

RESULTATS ET DISCUSSION
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
IV.2.2 Capacité de la flore indigène de l’écorce à biodégrader l’atrazine
L’objectif de cette étude est de déterminer si la flore indigène de l’écorce de pin joue ou non un rôle
significatif dans la biodégradation de l’atrazine. Chaque isolat (CP1 à CP4) a donc été testé pour ses
capacités à dégrader l’atrazine en culture pure et en consortium, en milieu complexe riche (LB) et en
extrait aqueux d’écorce de pin.
IV.2.2.1
Biodégradation primaire de l’atrazine
Les essais de biodégradation de l’atrazine ont été conduits en milieu riche LB et en extrait aqueux
d’écorce de pin selon le protocole décrit au § IV.1.2.1., en présence d’atrazine (concentration initiale
d’environ 50 mg.L -1 ) comme source d’azote ; aucune source de carbone n’a été ajoutée à l’extrait
d’écorce de pin.
La Figure 38 montre que, l’atrazine est biodégradée par le consortium (CP1, CP2, CP3 et CP4 à
environ 10 6 cfu.mL -1 chacun) en milieu complexe riche LB. Aucune biodégradation de l’atrazine n’est
en revanche observée dans l’extrait aqueux d’écocre de pin. De plus, la croissance du consortium en
milieu LB est nettement supérieure à celle observée en extrait d’écorce de pin où elle est quasiment
nulle. Ce phénomène peut être lié à une carence en azote dans l’extrait aqueux d’écorce de pin
(l’atrazine, 50 mg.L -1 environ, représente la seule source d’azote pour les bactéries, équivalent à
environ 17 mg.L -1 d’azote). Les micro-organismes de l’écorce peuvent également être inaptes à
consommer les composés organiques dissous de l’écorce de pin ou incapables de cométaboliser
l’atrazine en présence de ces composés organiques.
Croissance
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
Extrait + Atrazine
LB + Atrazine
0,6
0,4
0,2
0
0 100 200 300
Temps (h)
70
60
50
40
30
20
10
0
Biodégradation
0 100 200 300
Temps (h)
Témoin stérile
Extrait + Atrazine
LB + Atrazine
Figure 38 : Croissance du consortium isolé à partir de l’écorce de pin et biodégradation de l’atrazine en
milieu LB ou en extrait aqueux d’écorce de pin inoculé avec environ 10 6 cfu.mL -1 de chaque isolat (CP1 à
CP4) ; atrazine comme source d’azote (55 mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation 150 rpm
Thèse S.GENDRAULT 2004
151

RESULTATS ET DISCUSSION
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
Afin d’identifier les micro-organismes de la flore indigène de l’écorce de pin responsables de la
dégradation de l’atrazine en milieu LB, les mêmes expériences ont été répétées en culture pure de
chaque isolat.
La Figure 39 présente les résultats de biodégradation de l’atrazine obtenus en cultures pures.
70
60
Atrazine (mg.L -1 )
50
40
30
20
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350
Temps (h)
CP4
CP3
CP1
CP2
Figure 39 : Biodégradation de l’atrazine en milieu LB par les micro-organismes isolés de l’écorce de pin
(inoculé avec environ 10 6 cfu.mL -1 de CP1, CP2, CP3 ou CP4) ; atrazine comme source d’azote (environ 55
mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation 150 rpm
Alors que les isolats CP3 et CP4 ne semblent pas présenter d’activité de dégradation significative de
l’atrazine, les isolats CP1 et surtout CP2, quant à eux, présentent une activité significative. En
présence de l’isolat CP1, environ 50% de l’atrazine présente initialement dans le milieu sont dégradés
en 310 heures, contre 83% dans ce même intervalle de temps en présence de l’isolat CP2,
correspondant à la dégradation observée avec le consortium. L’isolat CP2, et dans une moindre
mesure CP1, seraient donc responsables de la biodégradation de l’atrazine observée en présence du
consortium en milieu LB.
Ces résultats sont à analyser avec précaution puisqu’il s’agit ici de biodégradation primaire de
l’atrazine et non pas de minéralisation.
IV.2.2.2
Minéralisation de l’atrazine
La capacité de la microflore indigène de l’écorce de pin à minéraliser l’atrazine a été étudiée grâce à
l’utilisation d’atrazine marquée au 14 C par suivi du dégagement de 14 CO 2 dans des biomètres, selon le
protocole présenté au § IV.1.2.2.
Ces expériences ont été réalisées en présence même de particules d’écorce (d

RESULTATS ET DISCUSSION
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
Deux concentrations initiales d’atrazine ont été testées : la première, 20 mg.L -1 a permis d’apporter
une source d’azote significative pour la croissance des micro-organismes (aucune autre source
d’azote n’a été additionnée au milieu). La seconde concentration en atrazine testée de 44,2 µg.L -1
pourrait correspondre à une probable pollution des milieux naturels à l’atrazine.
Les résultats de ces essais pour les deux concentrations en atrazine testées sont présentés Figure
40.
% Atrazine minéralisée
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0 100 200 300 400
Temps (h)
Ecorce non stérile + Atz 44 µg/L
Ecorce non stérile + Atz 20 mg/L
Témoin stérile (Atz 44 µg/L)
Témoin stérile (Atz 20 mg/L)
Figure 40 : Minéralisation de l’atrazine en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de pin
stériles ou non stériles (d

RESULTATS ET DISCUSSION
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
IV.2.3 Influence de la microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas
ADP sp
Quelle est l’influence de la microflore de l’écorce de pin sur le développement de Pseudomonas ADP
sp. utilisée dans le cadre du traitement combiné et sur sa capacité à dégrader l’atrazine ? Des essais
ont été réalisés afin de quantifier cet effet, afin de déterminer si une stérilisation de l’écorce serait
nécessaire avant son utilisation en tant que support de la biofiltration, lors du traitement combiné
étudié ici.
IV.2.3.1
Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en présence
de la microflore de l’écorce de pin
L’influence de la microflore de l’écorce de pin sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. a été
étudiée en extrait aqueux d’écorce de pin non stérile, contenant naturellement une partie de la flore
indigène de l’écorce, et en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce non stériles
(d

RESULTATS ET DISCUSSION
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
Cependant, nous avons considéré que les cellules présentes en milieu aqueux et celle adsorbées
étaient proportionnellement réparties dans les deux phases et que par conséquent, l’évolution de la
densité de cellules dans le liquide était représentative de la croissance globale de Pseudomonas ADP
sp.
En extrait aqueux d’écorce de pin (Figure 42), la présence de la micro-flore de l’écorce n’affecte pas la
croissance de Pseudomonas ADP sp. La croissance est en effet équivalente en extrait stérile et en
extrait non stérilisé contenant la microflore de l’écorce de pin.
0,25
DO 600nm
0,20
0,15
0,10
0,05
Pseudo en Extrait stérile
Pseudo en Extrait non stérile
Témoin - Extrait stérile
Témoin - Extrait non stérile
0,00
0 20 40 60 80 100 120
Temps (h)
Figure 42 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin stérile ou non stérile
en présence d’atrazine (environ 50 mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation 150 rpm
Concernant l’influence de la flore de l’écorce sur la biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas
ADP sp., la Figure 43 montre que la dégradation de l’atrazine semble être légèrement réduite en
extrait non stérile d’écorce de pin mais seulement après 40 heures d’incubation, par comparaison à la
dégradation en extrait stérile. Après 120 heures d’incubation, environ 66% de l’atrazine initialement
présente sont dégradés dans l’extrait d’écorce de pin non stérile contre environ 80% dans l’extrait
stérile, alors qu’après 45h la biodégradation est similaire (65% environ).
Ce phénomène pourrait suggérer l’existence d’une compétition pour les nutriments du milieu
(carbone, azote ou minéraux) entre Pseudomonas ADP sp. et les micro-organismes indigènes de
l’écorce de pin présents dans l’extrait. Cependant, ce résultat est incertain car il ne repose que sur un
point de la courbe.
Thèse S.GENDRAULT 2004
155

RESULTATS ET DISCUSSION
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
100
% Atrazine dégradée
80
60
40
20
Pseudo en Extrait stérile
Pseudo en Extrait non stérile
0
0 20 40 60 80 100 120
Temps (j)
Figure 43 : Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux stérile et non stérile
d’écorce de pin ; [atrazine ]i= 30 mg.L -1 ; 30°C ; agitation 150 rpm
La microflore indigène de l’écorce de pin aurait globalement un effet légèrement négatif à la fois sur la
croissance de Pseudomonas ADP sp., en présence de particules d’écorce de pin, et sur sa capacité à
biodégrader l’atrazine. Cette observation suggère l’existence d’une légère compétition entre les microorganismes
de l’écorce et Pseudomonas ADP sp. pour la consommation des nutriments du milieu,
mais l’incidence en est très faible.
IV.2.3.2
Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en présence de la microflore
de l’écorce
Les essais ont été réalisés en biomètres par suivi du 14 CO 2 en milieu minéral (MM) contenant des
particules d’écorce stériles et non stériles, selon le protocole décrit au § IV.1.3.2.2 à deux
concentrations initiales en atrazine (20 mg.L -1 et 44,2 µg.L -1 ).
Pour les deux concentrations initiales en atrazine testées, la Figure 44 montre que la microflore de
l’écorce seule (MM + écorce non stérile non inoculée par Pseudomonas ADP sp.) est capable de
minéraliser jusqu’à 16% de l’atrazine. Le témoin stérile (MM + Ecorce stérile) ne présente aucune
activité de minéralisation.
Thèse S.GENDRAULT 2004
156

RESULTATS ET DISCUSSION
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
A
60
% Atrazine minéralisée
50
40
30
20
10
Ecorce non stérile + Pseudo
Ecorce stérile + Pseudo
Témoin Ecorce non stérile
Témoin Ecorce stérile
0
0 50 100 150 200 250 300 350
Temps (h)
B
60
% Atrazine minéralisée
50
40
30
20
10
Ecorce stérile + Pseudo
Ecorce non stérile + Pseudo
Témoin Ecorce non stérile
Témoin Ecorce stérile
0
0 50 100 150 200 250 300 350
Temps (h)
Figure 44 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. présente à une concentration initiale de
20 mg.L -1 (A) ou 44,2 µg.L -1 (B) en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de pin stériles ou
non stériles (L/S=20) ; 20 ± 2 °C ; agitation lente
Lorsque l’atrazine est présente dans le milieu à forte concentration (20 mg.L -1 , Figure 44-A), le taux de
minéralisation atteint 52% en présence des particules d’écorce non stériles contre 35% seulement
avec l’écorce stérile, indiquant que la présence de la flore indigène de l’écorce aurait un effet positif
sur la minéralisation de l’atrazine.
A faible concentration en atrazine (44,2 µg.L -1 , Figure 44-B) le phénomène inverse est observé : la
microflore de l’écorce de pin induit une légère inhibition de la minéralisation de l’atrazine par
Pseudomonas ADP sp. : 45% de l’atrazine sont minéralisés en présence d’écorce non stérile contre
50% environ en présence d’écorce stérile. Ce résultat indique que la microflore de l’écorce de pin et
Pseudomonas ADP sp. sont en compétition pour l’utilisation des nutriments et/ou des sources de
157
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
carbone du milieu ; cette compétition induit un effet de réduction du taux d’atrazine dégradée par
Pseudomonas ADP sp.
A faible concentration, on peut penser que l’adsorption sur les particules d’écorce doit probablement
avoir lieu principalement en surface des particules, laissant ainsi l’atrazine facilement disponible pour
Pseudomonas ADP sp. A forte concentration, l’atrazine pourrait diffuser plus profondément dans les
particules d’écorce, le gradient de concentration étant plus élevé, diminuant la disponibilité de
l’atrazine vis à vis de Pseudomonas ADP sp. La présence de la microflore à l’intérieur de la structure
même des particules d’écorce pourrait justifier du fort taux de minéralisation observé dans ces
conditions.
En présence de la flore indigène de l’écorce de pin, les vitesses initiales de minéralisation de l’atrazine
sur les 48 premières heures, atteignent 0,218 mg.L -1 .h -1 et 4,02.10 -4 mg.L -1 .h -1 respectivement pour
des concentrations initiales en atrazine de 20 mg.L -1 et 44,2 µg.L -1 . Les résultats sont résumés dans le
Tableau 15. Ces données suggèrent une cinétique initiale d’ordre 1 par rapport à l’atrazine avec une
constante de vitesse k de l’ordre de 1.10 -2 h -1 .
Tableau 15 : Vitesse initiale de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. calculée sur les 48
premières heures, en présence d’écorce de pin stérile ou non (en mg.L -1 .h -1 )
[Atrazine] i Pseudo. + écorce stérile Pseudo. + écorce non stérile
20 mg.L -1 0,133 0,218
44,2 µg.L -1 4,54. 10 -4 4,02.10 -4
IV.3 Conclusion
• Quatre isolats appartenant à la flore indigène de l’écorce de pin ont été obtenus. Ces isolats
représentent les micro-organismes probablement majoritaires de l’écorce de pin et cultivables
dans les conditions utilisées mais ne sont pas pour autant les seuls micro-organismes
constituants cette microflore de l’écorce. Les essais réalisés ont montré une certaine capacité
de la flore indigène de l’écorce à dégrader l’atrazine en consortium. Les isolats CP2 et dans
une moindre mesure CP1 semblent être responsables de cette activité de dégradation de
l’atrazine.
D’autre part, la flore indigène de l’écorce de pin a été caractérisée comme ayant une activité
non négligeable de minéralisation de l’atrazine (entre 9% et 16% de minéralisation) présente
dans le milieu à forte (20 mg.L -1 ) ou faible (44,2 µg.L -1 ) concentration initiale.
• La présence de la microflore de l’écorce aurait un effet légèrement inhibiteur sur la croissance
de Pseudomonas ADP sp. Cependant les essais de biodégradation montrent qu’en présence
158
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce
de cette microflore, le taux de minéralisation de l’atrazine (essais inoculés avec Pseudomonas
ADP sp.) est augmenté par rapport au taux de minéralisation observé en milieu contenant des
particules d’écorce stériles lorsque l’atrazine était présente initialement dans le milieu à une
forte concentration ([atrazine]i= 20 mg.L -1 ).
A faible concentration ([atrazine]i= 44,2 µg.L -1 ), la présence de la microflore de l’écorce n’a
qu’un effet très limité sur la minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. Le taux de
minéralisation est très légèrement réduit par la présence de la microflore de l’écorce
suggérant que les micro-organismes présents dans le milieu (Pseudomonas ADP sp. et la
microflore de l’écorce) sont en compétition pour les nutriments et/ou source de carbone du
milieu. Cette compétition induirait un très léger effet négatif sur l’efficacité de l’élimination de
l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Thèse S.GENDRAULT 2004
159

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
V. Etude du traitement combiné
L’étude de faisabilité du traitement combiné (adsorption/biodégradation) a été abordée sous deux
angles différents :
- Des essais en batch ont permis un suivi précis du devenir de l’atrazine au cours du
traitement grâce à l’utilisation d’atrazine radioactive.
- Des essais en colonne ont permis de comparer l’intérêt d’utiliser Pseudomonas ADP
sp. par rapport à un traitement physique simple d’adsorption.
En accord avec les résultats obtenus aussi bien dans les études d’adsorption que lors de l’approche
biologique, des choix ont été faits quant à l’orientation du traitement et la nécessité d’apporter ou non
certains éléments pouvant améliorer l’efficacité du traitement.
V.1 Matériel et méthodes
V.1.1 Essais en batch
Dans les essais en milieu dispersé, dits « Essais en Batch », le devenir de l’atrazine a pu être suivi
grâce à l’utilisation de [U-ring- 14C ]-atrazine.
Ces expériences ont été menées à l’Unité de Microbiologie et de Génétique de l’INSA de Lyon (UMR
5122 CNRS) et à l’Unité Environnement et Grandes Cultures de l’INRA de Versailles-Grignon.
V.1.1.1
Protocole expérimental
Les essais ont été réalisés dans des biomètres (voir schéma Figure 28 p.127) contenant 50 mL de
milieu minéral liquide (MM) et 2,5 g d’écorce de pin stérile ou non stérile (ratio L/S=20 mg.g -1 ), incubés
à 20 ± 2°C sous agitation lente à l’aide d’un barreau magnétique, pendant environ 350 heures (15
jours).
Des essais sans écorce, réalisés en parallèle en extrait aqueux d’écorce de pin et en milieu minéral
glucosé (MM + glucose 1,25 g.L -1 , 50 ml), ont permis de mettre en évidence l’influence de la présence
de l’écorce de pin dans le milieu, sur la capacité de Pseudomonas ADP sp. à minéraliser l’atrazine.
La [U-ring- 14 C]-atrazine commercialisée par Sigma, d’activité spécifique de 24,6 mCi.mmol - 1 a été
utilisée pour réaliser plusieurs séries d’expériences à des concentrations initiales de 20 mg.L -1 et
44,2 µg.L -1 . La préparation des solutions mères d’atrazine est détaillée au § III.1.4.2.1 (p.126).
Thèse S.GENDRAULT 2004
160

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
Pseudomonas ADP sp. a été inoculé a partir de cellules provenant de précultures et réalisées selon le
protocole décrit au § III.1.2.2 (p.118) ; la DO initiale dans chaque biomètre atteignant une valeur
d’environ 0,05.
Les essais ont été réalisés en triplicats.
La minéralisation a été suivie par comptage de la radioactivité dans les pièges à soude selon la
méthode décrite en III.1.4.2.2.
Les essais ont été réalisés en 2 phases :
- Dans un premier temps, la minéralisation de l’atrazine a été suivie sur 15 jours (1 ère
Phase) par dosage du 14 CO 2 .
- Dans une deuxième phase, des extractions et combustions ont permis d’établir un
bilan carbone. Puis, l’évolution à long terme de l’atrazine résiduelle a été suivie sur
7 mois dans 2 conditions différentes : 1) en milieu dispersé et 2) en microcosmes.
Lors de cette deuxième phase, les 3 replicats ont été utilisés à des fins différentes :
o Les réplicats A ont subi extractions et combustions pour établir un bilan
carbone en quantifiant la radioactivité résiduelle dans chacun des
compartiments au terme des 15 premiers jours.
o Les réplicats B sont restés incubés en milieu dispersé (L/S=20 mg.L -1 )
pendant 7 mois. Le devenir à long terme de l’atrazine résiduelle a pu être
suivi par dosage régulier du 14 CO 2 . Au terme des 7 mois un bilan carbone a
été établi grace à des extractions et combustions permettant de quantifier la
radioactivité dans les différents compartiments.
o Les réplicats C ont subi le même sort que les réplicats B pendant 7 mois ,
mais cette fois en microcosmes.
La Figure 45 résume l’utilisation des différents réplicats lors de l’étude en batch du traitement
combiné.
Thèse S.GENDRAULT 2004
161

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
A
B
C
Essais en triplicat
- Suivi de la minéralisation sur 15 jours ( 14 CO 2 )
- Radioactivité en solution au bout de 15 jours
1 ère Phase
Si essais reproductibles
A B C
Collecte de l’écorce
Poursuite de l’incubation
et collecte de l’écorce à 7 mois
2 ème Phase
Extractions
et
Combustion
Suivi minéralisation
sur 7 mois en
Milieu dispersé
L/S=20
Extraction à 7 mois
Combustions à 7
mois
Suivi minéralisation
sur 7 mois en
Microcosmes
Extraction à 7 mois
Combustions à 7
mois
Suivi du devenir à long terme de l’écorce de
pin issue du traitement
Figure 45 : Utilisation des différents réplicats pour l’étude en batch du traitement combiné
V.1.1.2
Distribution de la radioactivité dans les essais en batch
Un bilan complet de la distribution de la radioactivité été réalisé par mesure de celle-ci en fin
d’expérimentation dans les différents compartiments du biomètre :
- Atrazine ou métabolites en solution aqueuse (Phase liquide)
-
14 CO 2 piégé dans la soude, issu de la minéralisation de l’atrazine (Phase gazeuse)
- Atrazine ou résidus adsorbés sur l’écorce de pin ou les cellules (extractibles et non
extractibles) (Phase solide).
Thèse S.GENDRAULT 2004
162

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
La Figure 46 représente la distribution possible de la radioactivité dans les différents compartiments
du milieu lors des essais en batch, ainsi que les méthodes de suivi de celle-ci pour chacun des
compartiments.
A*
Devenir de l'atrazine*
Localisation
En phase gazeuse
CO 2
En solution
Atrazine
Métabolites de dégradation
En phase solide
Atrazine ou métabolites adsorbés
Autres résidus et cellule
Résidus extractibles
Résidus liés
Méthode
Analyse du 14 CO2
dissous dans
NaOH
Prélèvement
de 1 ml de
solution
Extractions
CaCl 2
MeOH
Combustion de
l’écorce
Oxidizer
Matériel
Compteur à
scintillation
Figure 46 : Distribution de la radioactivité dans les essais batch – Méthodes de suivi de la radioactivité
dans les différents compartiments
V.1.1.2.1
Radioactivité en solution
Au bout de 350 heures d’incubation des biomètres, 1 mL de solution est prélevé, centrifugé
(7000 rpm, 20 min) pour éliminer les cellules ou débris cellulaires ainsi que les particules d’écorce en
poudre, puis analysé au compteur à scintillation (ajout de 7 mL de liquide à scintillation) afin de
quantifier la radioactivité résiduelle en solution.
D’autres échantillons (1 ml) ont été prélevés et analysés à l’aide d’une HPLC (Waters 600 E) équipée
d’un module Waters 996 à photodiode et d’un auto-injecteur 717 Plus Autosampler. La colonne
utilisée était une Cartridge Nova Pack 60A C18 (dimension 4 µm, 4.6 x 20). La radioactivité est
détectée à l’aide d’un détecteur Radiomatic Flo-one Packard. Ces analyses ont permis d’étudier la
répartition de la radioactivité des composés en solution (atrazine ou métabolites intermédiaires).
Thèse S.GENDRAULT 2004
163

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
L’analyse HPLC a permis de détecter les métabolites suivants :
- OHA : 2-hydroxy-atrazine
- OHDEA : Deséthyl-2-hydroxy-atrazine
- OHDIA : Desisopropyl-2-hydroxy-atrazine
- DEA : Deséthyl-atrazine
- DIA : Desisopropyl-atrazine
- DEDIA : deséthyl-desisopropyl-atrazine
- A : atrazine
Les éluants utilisés étaient:
- A : Eau Ultra Pure / HCl 0,5 M, 95/5 avec Dodécylsulfate de sodium (SDS) 1,44g.L -1
-
B : Méthanol pour analyse /Eau Ultra Pure / HCl 0,5 M, 90/5/5 avec SDS 1,44g.L -1
La durée d’une analyse était de 45 min réalisée selon la table d’élution suivante (Tableau 16), avec un
rinçage de 15 minutes (éluant A) entre deux injections.
Tableau 16 : Table d’élution pour analyse HPLC de l’atrazine et des métabolites de dégradation
Temps (min) Débit (ml.min -1 ) %A %B
0 1 100 0
1 1 62 38
8 1 60 40
10 1 40 60
30 1 0 100
35 1 100 0
L’identification de l’atrazine et de ses métabolites a été plutôt qualitative que quantitative du fait des
concentrations très faibles de chacun des composés en solution en fin d’incubation.
V.1.1.2.2
Radioactivité associée à l’écorce
A la fin de la première phase de l’étude (350 h, voir Figure 45), l’écorce de pin de l’un des triplicats (A)
est récupérée par centrifugation de l’ensemble de la suspension (10000 rpm, 20 min), puis deux
extractions successives sont effectuées avec 10 mL d’une solution de CaCl 2 (0,1 M) puis 10 mL de
méthanol pur sur la totalité de l’écorce (2,5 g). Les solutions sont analysées au compteur à scintillation
afin d’évaluer le pourcentage de résidus extractibles.
Thèse S.GENDRAULT 2004
164

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
Après ces extractions, les résidus liés non extractibles ont été quantifiés après séchage de l’écorce de
pin de chacun des biomètres (80°C pendant 12h), par combustion d’une aliquote représentative
d’environ 150 mg d’écorce dans un Oxidizer Packard modèle A307.
Les échantillons d’écorce sont placés dans un cône en papier avec une pointe de cellulose en poudre
pour faciliter la combustion ; le tout est recouvert d’un second cône en papier et placé sur une
résistance chauffante dans l’Oxidizer.
La combustion est effectuée durant 2 minutes sous courant d’oxygène dans un four à 800°C. Les
combustions ont été réalisées en triplicats.
Le 14 CO 2 libéré par la combustion de l’écorce contenant les résidus liés radioactifs est retenu dans
une colonne contenant un adsorbant chimique (Carbosorb) puis élué au liquide à scintillation dans
une fiole à scintillation. La radioactivité est directement quantifiée au compteur à scintillation.
L’étalonnage de l’appareil est réalisé à l’aide d’une solution radioactive d’atrazine de concentration
connue. Un volume précis (10µL) de solution est déposé sur la poudre de cellulose dans un cône en
papier, puis brûlé dans l’Oxidizer pendant 2 minutes. L’étalonnage est réalisé en triplicats.
V.1.1.3
Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du traitement combiné
Le devenir de l’écorce issue de la première phase des essais en batch (contenant des traces
d’atrazine résiduelle et/ou de métabolites, ainsi que divers résidus et des micro-organismes) a été
suivi sur 7 mois. En effet, l’écorce après traitement devient un sous produit du traitement et il convient
de caractériser son évolution en vu d’une valorisation éventuelle.
L’évolution du « déchet-écorce » a été étudiée sur l’écorce débarrassée ou non de la plupart du milieu
liquide dans lequel elle se trouvait (essais en microcosme et essais en milieu liquide, ratio
L/S=20 mL.g -1 ). Pour cela, les réplicats B et C ont été utilisés (voir Figure 45).
La minéralisation de l’atrazine ou de ses résidus a été suivie par capture du CO 2 dans les pièges à
soude. Après 7 mois d’incubation à température ambiante, des extractions et combustions selon les
protocoles décrits ci-dessus ont permis de quantifier respectivement les résidus d’atrazine non liés et
les résidus liés. L’analyse des solutions dans le cas des essais en milieu liquide (L/S 20 mL.g -1 ) a
permis d’établir un bilan de la radioactivité et d’étudier l’évolution du « Déchet-Ecorce ».
Thèse S.GENDRAULT 2004
165

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
V.1.2 Essais en colonnes
Les essais en colonnes représentent la mise en œuvre du traitement combiné sous forme d’une
« Biofiltration ».
La biofiltration est réalisée par circulation de la solution polluée en atrazine à travers le filtre d’écorce
de pin en poudre dans lequel Pseudomonas ADP sp. a été inoculée et s’est développée sous forme
d’un biofilm.
Dans un premier temps, la capacité de Pseudomonas ADP sp. à former un biofilm à la surface de
l’écorce de pin a été étudiée.
Dans un deuxième temps, la circulation d’une solution polluée en atrazine dans différentes conditions
(flux, différents âges de biofilm, conditions biotiques ou abiotiques, concentrations initiales en atrazine
différentes) a été mise en œuvre.
V.1.2.1
Choix des paramètres
Les colonnes ont été préparées comme présenté au § II.1.2.3.1 avec 10 g d’écorce de pin (particules
d

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
est conseillé pour les biofiltre (Martin et al., 1993). De plus, une capacité en eau
comprise entre 40 et 80% (massique) est convenable quand le support est saturé
(Ottengraf 1986 ; Devinny 1999) ; c’est le cas pour l’écorce de pin en poudre.
- Différentes concentrations initiales en atrazine de la solution à traiter ont été
testées. Des essais à 0,2 mg.L -1 ont été suivis par analyse HPLC (au dessus de la
limite de détection de 0,03 mg.L -1 ). Cette concentration correspond bien sûr à une
pollution massive, et nous a permis de tester l’efficacité de la biofiltration dans des
conditions extrêmes. D’autres essais ont été réalisés à une concentration initiale de
2,34 µg.L -1 , correspondant à une pollution courante d’eaux naturelles, et suivis par
dosages immuno-essai (II.1.1.1.2(b)) couvrant une gamme de concentrations de 0,1 à
3 µg.L -1 . Ces essais ont été en nombre limités à cause du coût de ces analyses.
- Les essais en colonnes ont été effectués à une température de 20 ± 2°C,
correspondant à une température ambiante moyenne ; les essais de biodégradation
de l’atrazine en milieu liquide ayant prouvé que Pseudomonas ADP sp. était capable
de minéraliser l’atrazine jusqu’à 12°C.
- Afin de se rapprocher de conditions réelles de traitement d’eaux naturelles polluées,
la solution d’atrazine à traiter à été préparée dans l’eau du robinet, qui apporte aux
micro-organismes des nutriments divers.
- Les essais ont été réalisés avec de l’écorce de pin préalablement stérilisée ou non
afin d’évaluer l’influence de l’activité de la flore indigène de l’écorce de pin sur
l’efficacité du procédé de biofiltration.
V.1.2.2
Inoculation et caractérisation du biofilm et de l’hydrodynamique des colonnes
V.1.2.2.1
Observation au MEB des micro-organismes sur l’écorce de pin
L’étude du développement d’un biofilm sur les particules d’écorce dans les colonnes a été réalisée de
façon qualitative, par observation au Microscope Electronique à Balayage selon les méthodes décrites
ci-dessous.
Les observations au MEB ont été réalisées au Centre Technologique des Microstructures de
l’Université Claude Bernard – Lyon 1. Ces observations ont permis de déterminer un temps idéal de
mise en contact avec les bactéries, pour l’obtention de la fixation des cellules ou la formation d’un
biofilm à sa surface. L’effet de la flore indigène de l’écorce de pin sur le développement d’un biofilm de
Pseudomonas ADP sp. a également pu être observé qualitativement par cette technique.
Thèse S.GENDRAULT 2004
167

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
(a) Inoculation des colonnes
Une culture de Pseudomonas ADP sp. en phase exponentielle de croissance, cultivée 20h à 30°C en
milieu minéral (MM) additionné de 1g.L -1 de glucose et 1g.L -1 de sulfate d’ammonium, est injectée en
circuit fermé à travers les colonnes d’écorce stérilisées ou non, pendant 2 ou 6 jours. Des nutriments
et cellules fraîches issues de cultures quotidiennes sont additionnés tous les jours à la culture initiale.
A la fin de la circulation, les colonnes sont rincées à l’eau du robinet (stérile) avec un volume de 50Vo
(débit 1 mL.min -1 ).
(b) Traitement des échantillons pour observation au MEB
Les lits d’écorce de pin contenus dans les colonnes sont alors récupérés et des prélèvements de
quelques milligrammes d’écorce sont réalisés au niveau de l’entrée et du centre de la colonne (photos
Figure 47).
Figure 47 : Lits d’écorce de pin issus des colonnes après inoculation de Pseudomonas ADP sp. pendant
2 ou 6 jours ; prélèvements pour analyses au MEB
Les prélèvements d’écorce sont ensuite traités pour l’observation au MEB selon le protocole décrit cidessous.
La préparation des échantillons pour l’observation de cellules à la surface d’un support demande un
travail particulier différent ce celui effectué pour l’observation de la structure du support brut. Elle se
déroule en 4 étapes principales :
• Fixation des cellules sur le support : l’échantillon solide à observer est plongé pendant
60 minutes dans une solution (50/50, V/V) glutaraldéhyde 4% / tampon (cacodylate de sodium 0,2
M, pH 7).
• Rinçage : l’échantillon est ensuite rincé dans 3 bains successifs de 10 minutes, dans une solution
de tampon de cacodylate 0,2 M.
Thèse S.GENDRAULT 2004
168

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
• Post-fixation : le tampon de rinçage est remplacé par une solution de tétroxyde d’osmium
tamponnée (OsO 4 1% final dans une solution de cacodylate de sodium 0,1 M final). La postfixation
s’effectue pendant 30 minutes, puis l’échantillon est rincé à l’eau distillée.
• Déshydratation progressive : l’échantillon est déshydraté après fixation, dans des bains
successifs d’éthanol à 30%, 50%, 70%, 80% et 95%, de 10 minutes chacun. Puis 3 bains de
10 minutes dans l’éthanol 100% sont réalisés. La déshydratation est finalement terminée par 1
bain de 10 minutes dans un mélange éthanol 100% / HMDS (50/50 ; V/V), et 3 bains de 10
minutes dans le HMDS (hexaméthyldisilazane) pur. Le dernier bain de HMDS est évaporé sous
hôte.
L’échantillon sec est ensuite déposé sur un porte objet et métallisé à l’or-palladium à l’aide d’un
pulvérisateur cathodique Hummer II Technics.
L’observation des échantillons a ensuite été réalisée au microscope électronique à balayage S800
Hitachi, 15 kV.
V.1.2.2.2
Influence des micro-organismes sur le comportement hydrodynamique des
colonnes
D’autre part, l’influence du développement bactérien dans les colonnes sur l’hydrodynamique du
système a été étudiée à l’aide du traceur KCl comme décrit au chapitre (II.1.2.2.2). Ces tests
hydrodynamiques ont été réalisés avant et après inoculation de Pseudomonas ADP sp. (2 ou 6 jours)
à travers les colonnes d’écorce de pin (préalablement stérilisée ou non).
La Figure 48 résume le protocole utilisé pour ces expériences :
1. Une injection de KCl est réalisée avant inoculation de Pseudomonas ADP sp., pour
caractériser le comportement hydrodynamique initial de chaque colonne.
2. Une culture de Pseudomonas ADP sp. est circulée en circuit fermée comme décrit plus haut
pendant 2 ou 6 jours.
3. Une nouvelle injection de KCl après inoculation (2 ou 6 jours) de Pseudomonas ADP sp. dans
les colonnes d’écorce de pin permet de conclure sur l’influence du biofilm sur le
comportement hydrodynamique des colonnes.
Thèse S.GENDRAULT 2004
169

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
1-3
2
C
Cellule de
conductivité
Analyseur
CONSORT C832
Flux ascendant
1 ml/min
Pseudomonas ADP
sp. Culture en MM
(1g/l sulfate
d’ammonium;
1g/l glucose)
Aération par
barbotage
2
Ordinateur
Traitement
des données
Pompe
peristaltique
1-3
Solution KCl (1g/l)
Figure 48 : Montage expérimental : Hydrodynamique des colonnes avant et après inoculation avec
Pseudomonas ADP sp.
V.1.2.3
Protocole expérimental des essais de biofiltration
La durée de développement du biofilm a été fixée à 6 jours grâce aux expériences précédentes et
deux vitesses de circulation de la solution à travers les colonnes ont été testées : 1 mL.min -1 et
0,3 mL.min -1 . Des colonnes d’écorce de pin stérilisée et non stérilisée ont été testées en parallèle afin
d’évaluer l’influence de la flore indigène sur l’efficacité du traitement.
Thèse S.GENDRAULT 2004
170

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
Protocole expériental (voir Figure 48) :
1. Les colonnes d’écorce de pin sont saturées en eau par circulation ascendante en circuit fermé
d’eau du robinet stérile.
2. Un traçage au KCl est réalisé afin de caractériser l’écoulement des solutions à travers les
colonnes.
3. Après rinçage à l’eau du robinet stérile, une culture de Pseudomonas ADP sp. est circulée
(débit = 1 mL.min -1 ) pendant 6 jours avec apport régulier de nutriments et de cellules fraîches,
en circuit fermé, avec aération de la culture par barbotage. Des échantillons sont prélevés
régulièrement afin de suivre l’évolution de la teneur en carbone (analyse COT) de la culture
cellulaire (la consommation de carbone étant signe d’activité biologique).
4. Un volume de 50 volumes de pore (V 0 ) d’eau du robinet stérile est ensuite circulée afin
d’éliminer les nutriments et notamment l’azote apporté par la culture de Pseudomonas ADP
sp.
5. La solution polluée en atrazine est injectée (flux = 1 ou 0,3 mL.min -1 environ) à travers la
colonne jusqu’à obtention d’un plateau de concentration en atrazine en sortie de colonne.
6. L’effluent est collecté en sortie de colonne par un collecteur de fractions et les fractions sont
analysées par HPLC (essais avec [atrazine] i = 200 µg.L -1 ) ou par test immuno-essai (essais
avec [atrazine] i = 2,34 µg.L -1).
Les expériences en colonnes sont réalisées en chambre thermostatée à 20 ± 2 °C.
Aucun réplicat n’a pu être réalisé, le nombre de colonnes disponibles étant limité à 4 et la durée des
expériences étant de 15 jours environ.
La Figure 48 représente le montage utilisé pour les essais de biofiltration en colonne.
Thèse S.GENDRAULT 2004
171

MATERIEL ET METHODES
Etude du traitement combiné
5
3
6
Collecteur de fractions
Flux ascendant
1ml/min – 0,3 ml/min
Pseudomonas ADP
sp. Culture en MM
Aération par
barbotage
6j
3
HPLC
Immuno-essais
C/Co
V/Vo
Sol. Atrazine
5
200µg.L -1 –
2,3 µg.L -1
Pompe
peristaltique
2-4
H 2 O
Figure 49 : Montage expérimental pour les essais en colonne de traitement combiné d’une solution
polluée à l’atrazine après inoculation des colonnes avec Pseudomonas ADP sp. pendant 6 jours.
Thèse S.GENDRAULT 2004
172

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
V.2 Résultats et discussion
V.2.1 Etude du traitement combiné en batch
Cette étude à permis d’évaluer l’efficacité du traitement combiné en essais batch par quantification de
la minéralisation de l’atrazine en biomètre en présence de Pseudomonas ADP sp. inoculé dans un
milieu contenant de l’écorce de pin en poudre, débarrassée ou non de sa microflore indigène.
D’autre part, en fin d’expérience, la répartition de la radioactivité dans les différents compartiments
(gaz, liquide, solide) a été étudiée.
Enfin, une étude à long terme sur 7 mois a permis de déterminer le comportement du « déchetécorce
» à l’issue du traitement et notamment son évolution quant au devenir de la radioactivité
résiduelle présente dans l’écorce après traitement.
V.2.1.1
Minéralisation de l’atrazine en présence d’écorce de pin
Des essais ont été menés en parallèle, en milieu minéral MM contenant ou non de l’écorce de pin
stérile ou non stérile), afin de quantifier l’effet de la présence d’écorce de pin sur la minéralisation de
l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. à faible (44,2 µg.L -1 ) et à forte (20 mg.L -1 ) concentration initiale
en atrazine.
Les essais ont été réalisés à température ambiante (20 ± 2°C) dans des biomètres équipés d’un piège
à soude, selon le protocole présenté au § V.1.1.1.
Les Figure 50 et Figure 51 présentent les résultats de minéralisation aux deux concentrations initiales
en atrazine testées.
Ces figures reprennent quelques courbes présentées dans les paragraphes précédents ; elles sont à
nouveau présentées ici pour permettre d’établir un bilan global comparatif sur la minéralisation de
l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.
Le Tableau 17 résume les résultats de ces expériences, après incubation de Pseudomonas ADP sp.
pendant 320h dans les différents milieux étudiés.
Thèse S.GENDRAULT 2004
173

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
[Atrazine ]i=44,2 µg/L
% Atrazine mineralisée
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350
Temps (h)
MM
Extrait Aqueux d'Ecorce
MM + Ecorce stérile
MM + Ecorce non stérile
Témoin st. MM + Ecorce non stérile
Témoin st. MM + Ecorce stérile
Figure 50 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM- Glucose
1,25 g.L -1 ), en présence ou non d’écorce en poudre (d

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
dégradation de l’ordre de 0,54 mg.L -1 .h -1 et 1,3 µg.L -1 .h -1 respectivement sur les 24 premières heures
d’incubation. Il existe donc une relation proportionnelle entre concentration initiale en atrazine et
vitesse moyenne de minéralisation dans les deux milieux liquides.
La présence des composés solubles de l’écorce de pin (extrait aqueux d’écorce de pin) n’entraîne
aucun retard de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. que ce soit à faible ou à forte
concentration initiale en atrazine.
La présence de particules d’écorce de pin stérile dans le milieu réduit le taux de minéralisation
d’environ 30% et 50% (respectivement à faible et forte concentration initiale en atrazine) indiquant que
l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce la rend moins disponible pour Pseudomonas ADP sp., et que ce
phénomène a une incidence relative d’autant plus grande que la concentration initiale en atrazine est
élevée (peut être à cause de la diffusion intraparticulaire de l’atrazine).
Pour une concentration initiale en atrazine de 44,2 µg.L -1 , 50,5 ± 4,0 % de l’atrazine est minéralisée en
présence d’écorce de pin stérile contre 47,1 ± 1,9 % en présence d’écorce contenant sa microflore
indigène. Cette différence n’est pas significative au regard des déviations standard sur les résultats
(Figure 51).
A forte concentration initiale, 36,5 ± 1,3 % de l’atrazine sont minéralisés en 320h en présence
d’écorce stérile contre 54 ± 0,6 % en présence d’écorce non stérile. La microflore de l’écorce
augmente donc significativement le taux de minéralisation pour de fortes concentrations en atrazine,
contrairement au phénomène observé plus haut (à faible concentration). Dans les deux cas (faible et
forte concentrations initiales en atrazine) la flore indigène de l’écorce de pin présente une activité de
minéralisation significative : 12 à 14% de l’atrazine sont minéralisés par la microflore indigène de
l’écorce seule (Ecorce non stérile + MM) non inoculée par Pseudomonas ADP sp., respectivement à
forte et à faible concentration initiale en atrazine.
On peut penser qu’à faible concentration (44,2 µg.L -1 ), l’atrazine est adsorbée principalement à la
surface des particules, la laissant accessible à Pseudomonas ADP sp. dont les cellules sont
essentiellement à la surface des grains d’écorce. A plus forte concentration (20 mg.L -1 ), l’atrazine
pourrait pénétrer plus profondément à l’intérieur des pores de l’écorce de pin par diffusion entraînant
ainsi une diminution de la disponibilité de l’atrazine vis à vis de Pseudomonas ADP sp. La présence
de la microflore indigène dans la porosité intraparticulaire pourrait alors expliquer le taux plus élevé de
minéralisation observé avec l’écorce non stérile par rapport à l’écorce stérile.
Thèse S.GENDRAULT 2004
175

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
Tableau 17 : Taux de minéralisation d’atrazine (en %) en 320h d’incubation de Pseudomonas ADP sp. en
biomètre à 20 °C avec [atrazine]i= 44,2 µg.L -1 ou 20 mg.L -1 (st.=stérile)
[Atrazine]i MM Extrait Ecorce st. Ecorce non st. Tém. Ecorce st. Tém. Ecorce non st.
44,2 µg.L -1 70,5 ± 9,0 65,8 ± 7,6 50,5 ± 4,2 47,1 ± 2,0 0,10 ± 0,01 14,4 ± 1,4
20 mg.L -1 72,1 ± 1,3 71,7 ± 0,7 36,5 ± 1,3 54 ± 0,6 0,10 ± 0,01 11,7 ± 3,5
En conclusion, la présence de particules d’écorce dans le milieu réduit notablement le taux de
minéralisation, par effet d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce, diminuant la disponibilité de celle-ci
pour Pseudomonas ADP sp. Cependant, à forte concentration en atrazine, la contribution de la flore
indigène, probablement rendue possible par la diffusion intraparticulaire de l’atrazine, compense en
partie la baisse du rendement de minéralisation.
V.2.1.2
Analyses des composés radioactifs en solution en cours d’incubation
La répartition de la radioactivité en solution entre les différents composés (atrazine ou métabolites de
dégradation) a été suivie en cours d’incubation dans les essais en milieu minéral et en extrait aqueux
d’écorce de pin. Le suivi dans les essais contenant l’écorce de pin a malheureusement posé des
problèmes au niveau des analyses HPLC, dus sans doute à une concentration trop élevée des
composés organiques provenant de l’écorce de pin et par conséquent rendant les résultats
inexploitables.
Témoins non inoculés :
La Figure 52 montre que dans les témoins non inoculés avec Pseudomonas ADP sp., seulement 80%
de la radioctivité initialement apportée au milieu sont retrouvés sous forme d’atrazine. Cette
observation indique qu’il existe des réactions ou transformations chimiques spontanées (qui ne sont
pas de la minéralisation) lorsque l’atrazine est additionnée aux milieux aqueux. A faible concentration
initiale, l’atrazine est toujours présente au bout de 312 h dans les essais en milieu minéral. Les
composés intermédiaires de dégradation DEDIA, DIA, OHDEA et OHA sont présents dans de faibles
proportions relativement constantes tout au long des expériences. Dans l’extrait aqueux d’écorce, les
témoins non inoculés contiennent également 80% d’atrazine et les autres constituants sont la DEDIA,
DEA, OHDEA et OHA.
A forte concentration (Figure 53), l’atrazine est dégradée après 192 h d’incubation traduisant une
contamination du témoin en milieu minéral (MM). Le principal métabolite retrouvé est le DIA.
Dans l’extrait, malgré les problèmes techniques survenus au cours des analyses HPLC et nous faisant
perdre les résultats pour les temps 20 et 48h, on peut noter que la radioactivité en solution est
présente sous forme d’atrazine à 80 % jusqu’à la fin de l’incubation. L’atrazine en solution se dissocie
en différents métabolites ; on retrouve ainsi les composés DEDIA, OHDIA, DIA et OHDEA.
Thèse S.GENDRAULT 2004
176

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
Essais inoculés :
Dans les essais inoculés (MM et extrait), l’atrazine est totalement dégradée après 48 h d’incubation
quelque soit la concentration initiale d’atrazine testée (Figure 52 et Figure 53). Les métabolites de
dégradation sont principalement présents sous forme de DEDIA et OHA (premiers métabolites de
dégradation de l’atrazine), puis, après 300 h d’incubation l’OHA devient majoritaire dans le milieu MM.
On remarque que certains composés intermédiaires comme la DEDIA sont présents de façon
représentative en solution ; pourtant celui-ci ne figure pas comme métabolite intermédiaire du
mécanisme de minéralisation décrit pas Martinez et al. (2001) (voir Figure 13 du chapitre Etude
Bibliographique). Il en est de même pour les composés tels que l’OHDIA ou la OHDEA. En fait, les
analyses montrent que l’aire des pics correspondants à ces composés reste globalement équivalente
au cours du temps. La distribution augmente donc puisqu’il y a minéralisation de l’atrazine mais les
composés initialement présents dans le milieu comme la DEDIA prennent une proportion en
conséquence plus importante puisqu’ils ne sont pas dégradés. On notera à ce propos qu’aucune
enzyme chez Pseudomonas ADP sp. n’a été décrite comme étant capable de dégrader ces
métabolites.
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Témoin MM
0 20 48 144 216 312
Temps (h)
Autres
% OHA
% OHDEA
% OHDIA
% DEA
% DIA
% DEDIA
% A
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Témoin Extrait
0 20 48 216 312
Temps (h)
Autres
% OHA
% OHDEA
% OHDIA
% DEA
% DIA
% DEDIA
% A
100%
80%
60%
40%
20%
0%
MM
20 48 144 216 312
Temps (h)
Autres
% OHA
% OHDEA
% OHDIA
% DEA
% DIA
ND
% DEDIA
% A
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Extr ait
20 48 144 216 312
Temps (h)
Autres
% OHA
% OHDEA
% OHDIA
% DEA
% DIA
ND
% DEDIA
% A
Figure 52 : Distribution de la radioactivité en solution dans les essais de minéralisation
([atrazine]i=44,2µg.L -1 ) en milieu minéral (MM) et en extrait stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation
lente au barreau aimenté ; incubation 15 jours
Thèse S.GENDRAULT 2004
177

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Témoin MM
20 48 192 432
Temps (h)
% OHA
% OHDEA
% DEA
% DIA
% DEDIA
% A
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Témoin Extrait
20 48 144 432
Temps (h)
% OHA
% OHDEA
% OHDIA
% DEA
% DIA
% DEDIA
% A
100%
80%
60%
40%
20%
0%
MM
48 144 192 432
Temps (h)
Autres
% OHA
% OHDEA
% OHDIA
% DEA
% DIA
% DEDIA
% A
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Extr ait
20 144 192 432
Temps (h)
Autres
% OHA
% OHDEA
% OHDIA
% DEA
% DIA
% DEDIA
% A
Figure 53 : Distribution de la radioactivité en solution dans les essais de minéralisation ([atrazine]i=20
mg.L -1 ) en milieu minéral (MM) et en extrait stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation lente au barreau
aimenté ; incubation 15 jours
Avec,
- OHA : 2-hydroxy-atrazine
- OHDEA: Deséthyl-2-hydroxy-atrazine
- OHDIA: Desisopropyl-2-hydroxy-atrazine
- DEA: Deséthyl-atrazine
- DIA: Desisopropyl-atrazine
- DEDIA: deséthyl-desisopropyl-atrazine
En conclusion, on note que l’atrazine est transformée même lorsque Pseudomonas ADP sp. n’est pas
inoculée et que l’atrazine se trouve en milieu stérile ; l’atrazine dans les témoins stériles ne représente
que 80% de la radioactivité totale.
D’autre part, on retrouve beaucoup plus de métabolites intermédiaires de dégradation à faible
concentration qu’à forte concentration initiale en atrazine.
De plus, la différence principale observée entre la dégradation de l’atrazine en milieu minéral et en
extrait aqueux d’écorce de pin est la présence d’OHDEA comme métabolite de dégradation en milieu
MM, absent dans les essais en extrait d’écorce de pin.
Beaucoup d’intermédiaires de dégradation de l’atrazine sont présents, qui ne figurent pas dans le
schéma de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. décrit par Martinez et al. (2001).
Thèse S.GENDRAULT 2004
178

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
Une étude quantitative serait donc nécessaire pour décrire en détail le mécanisme de dégradation
dans les conditions de notre étude (Milieu minéral ou extrait aqueux d’écorce de pin).
V.2.1.3
Répartition de la radioactivité résiduelle en fin de traitement
Au bout de 15 jours de traitement en biomètre et de suivi de la minéralisation, des extractions au
CaCl 2 (0,1 M) et au méthanol ont été réalisées sur les essais contenant l’écorce stérile ou non stérile
afin de quantifier la radioactivité résiduelle (protocole § V.1.1.2). Les résidus radioactifs non
extractibles ont été quantifiés après extraction par combustion de l’écorce et les résidus en solution
ont été analysés par HPLC.
Pour les deux concentrations en atrazine étudiées (44,2 µg.L -1 et 20 mg.L -1 ) la répartition de la
radioactivité dans les différents compartiments du biomètre (phase gazeuse, phase liquide et phase
solide) est présentée sur les Figure 54 et Figure 55.
Dans les essais « liquides », en milieu minéral (MM) et extrait aqueux d’écorce de pin, la part de
résidus non extractibles représente la radioactivité retrouvée après filtration des solutions et
combustion des filtres supportant les cellules présentes dans les milieux à la fin des expériences
(t = 350 h ou 15 jours).
Les résultats montrent que le bilan de radioactivité totale se clôture à plus de 80% ce qui est un bon
résultat de restitution.
100%
[Atrazine]i= 44,2 µg.L -1
Bilan matière
80%
60%
40%
20%
Autres
Résidus liés
Résidus extractibles
En solution
Minéralisation
0%
MM
Extrait
E
E st.
E non
st.
Tém. E
st.
Tém. E
non st.
Figure 54 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu minéral (MM-Glucose), extrait aqueux d’écorce de
pin, en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
[Atrazine]i= 20g.mL -1
100%
Bilan matière
80%
60%
40%
20%
Autres
Résidus liés
Résidus extractibles
En solution
Minéralisation
0%
MM Extrait E st. E non st. Tém st. Tém non
st.
Figure 55 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu minéral (MM-Glucose), extrait aqueux d’écorce de
pin, en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
sur les 22 à 38% de radioactivité résiduelle retrouvée dans l’écorce dans les essais inoculés avec
Pseudomonas ADP sp.
Dans les essais non inoculés (« Témoin Ecorce non stérile » et « Témoin écorce stérile »), la
radioactivité non extractible retrouvée dans l’écorce représente respectivement entre 74 et 92% de la
radioactivité totale en fin d’expérience à faible concentration et entre 63 et 81% pour les essais à forte
concentration. On note ainsi, qu’en présence de la microflore de l’écorce de pin, le taux d’atrazine (ou
autres résidus radioactifs) retenue sur l’écorce est moindre par rapport au taux observé en absence
de cette microflore. D’autre part, la présence de Pseudomonas ADP sp. dans le milieu réduit de plus
de la moitié le pourcentage de radioactivité résiduelle retrouvée sur l’écorce de pin.
Ces résultats montrent que l’atrazine (ou ses métabolites de dégradation) est globalement très
difficilement extractible, rendant difficile sa disponibilité et donc sa consommation par les microorganismes.
Après 15 jours d’incubation, une fraction importante est fortement liée à l’écorce (Figure
54 et Figure 55) et le taux de minéralisation n’évolue plus.
V.2.1.4
Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du traitement
Le devenir de l’écorce en tant que déchet à l’issue du traitement combiné réalisé plus haut à été
étudié sur une durée de 7 mois par suivi de la minéralisation (dégagement de 14 CO 2 ) puis combustion
des écorces en fin d’expérience. Les essais ont été réalisés dans des biomètres, tels qu’utilisés cidessus,
en présence de milieu liquide (MM, ratio L/S=20 mL.g -1 ) et sur l’écorce humide issue des
essais précédents. Le protocole de ces essais est détaillé au § V.1.1.3.
Les Figure 57 et Figure 58 présentent les résultats obtenus en milieu liquide et en microcosme,
respectivement, pour une concentration initiale en atrazine de 20 mg.L -1 et 44,2 µg.L -1 . Il s’agit de
résultats cumulés avec ceux obtenus à t=350 h. Ces résultats sont également présentés sous fome de
tableau récapitulatif (Tableau 18).
Globalement, on remarque que l’évolution de la radioactivité dans les biomètres, que ce soit en
microcosme ou en milieu liquide, est similaire au bilan établi après 350 h d’incubation (Figure 56) ; la
Figure est de nouveau présentée ici pour faciliter la comparaison entre le bilan à 15 jours et le bilan à
7 mois. Le processus d’évolution est donc très lent dans les conditions expérimentales traduisant une
bonne stabilité du matériau.
Thèse S.GENDRAULT 2004
181

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
Après 15 jours en milieu liquide L/S=20
[Atrazine]i= 20g.mL-1
[Atrazine]i= 44,2 µg.L-1
100%
100%
Bilan matière
80%
60%
40%
20%
Autres
Résidus liés
Résidus extractibles
En solution
Minéralisation
Bilan matière
80%
60%
40%
20%
0%
Ec st. Ec non st. Tém st. Tém non st.
0%
Ec st. Ec non st. Tém. E st. Tém. E non st.
Figure 56 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., après 15 jours d’incubation à 20 ± 2 °C ; [atrazine]i = 44,2 µg.L -1
(Figure de Gauche) et [atrazine]i = 20 mg.L -1 (Figure de Droite)
A forte concentration initiale en atrazine (20 mg.L -1 ) on observe que 2 à 3% supplémentaires
d’atrazine (par rapport au bilan établi après 350 h) sont minéralisés dans les témoins non inoculés
avec Pseudomonas ADP sp. contenant l’écorce stérile, traduisant sans doute une contamination du
milieu par des micro-organismes extérieurs.
Après 7 mois supplémentaires en
Evolution en milieu liquide L/S=20
à 7 mois
milieu liquide L/S=20
Après 7 mois supplémentaires en
Evolution en microcosme
à 7 mois
100%
100%
Bilan matière
80%
60%
40%
20%
0%
Ec st.
Ec non
st.
Tém. Ec
st.
Tém. Ec
non st.
Autres
Résidus liés
Résidus extractibles
En solution
Mineralisation
Bilan matière
80%
60%
40%
20%
0%
Ec st. Ec non st. Tém. Ec
st.
Tém. Ec
non st.
Figure 57 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
revanche, les Témoins non inoculés contenant initialement l’écorce stérile ou l’écorce non stérile
continuent d’évoluer et des valeurs de minéralisation de 2 à 7% (Ecorce stérile) et 14 à 18% (Ecorce
non stérile) sont observés au bout de 7 mois d’incubation, avec une minéralisation un peu plus
importante en microcosme. La minéralisation observée dans les témoins d’écorce stérile non inoculés
est attribuée à une contamination microbienne survenue en cours d’incubation après les 15 premiers
jours d’incubation.
Après 7 mois supplémentaires en
Evolution en milieu liquide L/S=20
à 7 mois
milieu liquide L/S=20
Après 7 mois supplémentaires en
Evolution en microcosme
à 7 mois
microcosme
100%
100%
Bilan matière
80%
60%
40%
20%
Autres
Résidus liés
Résidus extractibles
En solution
Mineralisation
Bilan matière
80%
60%
40%
20%
0%
Ec st.
Ec non
st.
Tém Ec
st.
Tém Ec
non st.
0%
Ec st.
Ec non
st.
Tém Ec
st.
Tém Ec
non st.
Figure 58 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
rapport au bilan établi à 350h d’incubation (Tableau 18), on note un taux de résidus liés légèrement
supérieur dans les essais à faible concentration initiale en atrazine. Dans les essais contenant
l’écorce non stérile, on retrouve 37,5% de résidus liés après 15 jours d’incubation contre 42,2% de
l’atrazine initialement apportée après 7 mois d’incubation (même observations pour les essais avec
l’écorce stérile ou les Témoins avec écorce non stérile). Le vieillissement du déchet, que ce soit en
milieu liquide ou en microcosme permet aux résidus de se lier plus fortement et irréversiblement au
support, en pénétrant plus profondément dans la structure de l’écorce ou en établissant des liaisons
chimiques plus fortes.
Si l’on compare les essais à forte et à faibles concentrations (Tableau 18), la principale différence
porte sur le pourcentage de résidus liés : pour les essais en milieu liquide en présence d’écorce non
stérile, les résidus non extractibles (ou résidus liés) représentent 17% de la radioactivité totale à forte
concentration initiale en atrazine, contre 42% dans les essais à faible concentration en atrazine. On
remarque le même phénomène dans les Témoins « Ecorce stérile » et « Ecorce non stérile ». Cette
observation est logique puisque plus la concentration à l’équilibre C e sera petite, plus la proportion de
substrat adsorbée (q e /C e ) sera grande ; a forte concentration, les sites d’adsorption sont rapidement
saturés et la proportion de substrat adsorbée est donc moins grande. De plus, on peut imaginer que la
flore indigène de l’écorce consomme plus facilement l’atrazine lorsque celle-ci est présente à forte
concentration ; ainsi, on retrouverait moins (en proportion) de résidus liés à l’écorce à forte
concentration qu’à faible concentration.
D’autre part, le Tableau 18 montre que le pourcentage de résidus non extractibles dans l’écorce par
rapport à la radioactivité totale retrouvée dans celle-ci est dans tous les cas compris entre 90 et 98%.
Ces résultats montrent que l’atrazine au contact de l’écorce est principalement adsorbée
irréversiblement, que ce soit après 15 jours d’incubation ou après 7 mois. Si l’on se réfère aux
cinétiques d’adsorption établies en batch (Figure 11, p.102), on voit que ce phénomème est quasi
instantané et que l’atrazine est majoritairement adsorbée lors de la première heure avec contact
l’écorce. Ceci explique, entre autre, que la distribution de l’atrazine (de la radioactivité plus
exactement) évolue peu, entre les différents compartiments, entre 15 jours et 7 mois d’incubation.
V.2.1.5
Conclusions
Concernant le suivi de minéralisation de l’atrazine en milieu dispersé, les résultats obtenus
permettent de conclure qu’il existe une relation de proportionnalité entre la concentration initiale en
atrazine et la vitesse initiale moyenne de minéralisation, suggérant une cinétique initiale de 1 er ordre
dans le domaine de concentration étudié, avec une constante cinétique de l’ordre de 0,0022 h -1 .
La présence d’écorce de pin dans le milieu diminue de 25 à 30% le taux de minéralisation par rapport
aux taux observés en milieu liquide sans écorce (MM ou extrait aqueux d’écorce de pin).
184
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
Les essais confirment une faible activité minéralisatrice de la microflore indigène de l’écorce de pin :
entre 12 et 14 % de l’atrazine sont minéralisés dans les témoins non inoculés avec Pseudomonas
ADP sp.
A forte concentration initiale en atrazine, dans les essais inoculés avec Pseudomonas ADP sp., cette
microflore augmente significativement le taux global de minéralisation, alors qu’à faible concentration
on n’observe pas d’effet significatif.
Le bilan matière réalisé après 15 jours d’incubation des biomètres à température ambiante montre
que le taux de radioactivité retrouvé en solution est moins élevé dans les témoins « Ecorce stérile »
que dans les témoins « Ecorce non stérile », traduisant à nouveau le rôle de la microflore dans la
biodégradation de l’atrazine (confirmé par le suivi du 14 CO 2 ).
Au bout de 15 jours, une grande proportion d’atrazine est liée à l’écorce de pin (22 à 38%) diminuant
la biodisponibilité de celle-ci vis à vis des micro-organismes impliqués dans la biodégradation. Parmi
cette proportion d’atrazine liée, environ 1 à 2 % seulement sont extractibles (CaCl 2 et MeOH).
L’atrazine est ainsi fortement liée à l’écorce de pin après 15 jours de mise en contact, et la
minéralisation n’évolue quasiment plus.
Concernant le devenir à long terme de l’écorce de pin issue du traitement combiné en batch, on
note peu d’évolution entre 15 jours et 7 mois, que ce soit en microcosme ou en milieu liquide (ratio
L/S=20 mg.L -1 ). En fait, le phénomène d’adsorption qui régit principalement le devenir de l’atrazine a
lieu au cours des premières heures de contact avec l’écorce de pin. Cependant, on note que l’atrazine
est liée plus fortement à l’écorce au bout de 7 mois : le pourcentage de résidus non extractibles parmi
les résidus liés à l’écorce augmente légèrement (quelques %, essais Témoin avec écorce stérile) par
rapport au bilan établi à 15 jours.
Cette interaction forte avec l’écorce limite la biodisponibilité de l’atrazine et donc l’évolution du déchet.
On pourra donc difficilement imaginer un traitement biologique du déchet pour éliminer les résidus
d’atrazine et régénérer le support pour une nouvelle utilisation. L’inoculation régulière des biomètres
tout au long des 7 mois, avec un plus grand nombre de micro-organismes pourrait être testé mais
n’aurait sans doute aucun effet puisque l’atrazine migre dans les particules alors que les microorganismes
apportés s’accumulent à l’extérieur.
Par contre, cette forte interaction diminue la mobilité de l’atrazine, abaissant le risque environnemental
et permettant ainsi d’envisager des filières de stockage ou de valorisation de l’écorce. Des tests
d’écotoxicologie devraient être mis en œuvre pour vérifier cette possibilité.
Thèse S.GENDRAULT 2004
185

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
Si la présence résiduelle de l’atrazine ou de ces produits de dégradation dans l’écorce était jugée
inacceptable environnementalement pour valoriser ce matériau, la combustion serait alors la seule
issue pour ces déchets d’écorce provenant du traitement combiné.
V.2.2 Etude en colonne du traitement combiné
V.2.2.1
Etude du développement de Pseudomonas ADP sp. en colonne d’écorce de pin
Une observation au Microscope Electronique à Balayage (MEB) (voir préparation des échantillons §
V.1.2.2.1) d’échantillons prélevés des cylindres d’écorce de pin (extraits des colonnes) préalablement
inoculés avec Pseudomonas ADP sp. selon le protocole décrit en V.1.2.2, a permis de vérifier la
capacité de Pseudomonas ADP sp. à survivre dans ce contexte et à coloniser le matériau. D’autre
part, ces observations réalisées après différentes durées de circulation d’une culture cellulaire ont
permis d’évaluer une durée minimale d’inoculation pour le développement et la colonisation des
cellules au sein de l’écorce de pin. De plus, ces essais ont été réalisés sur des colonnes d’écorce
stériles ou non stériles ; l’influence de la microflore indigène de l’écorce sur la colonisation de celle-ci
par Pseudomonas ADP sp. a ainsi pu être mise en évidence de manière qualitative.
Deux durées de circulation ont été testées : 2 jours et 6 jours. Les observations au MEB ont été
réalisées sur des échantillons prélevés en entrée de colonne et au centre de la colonne.
Les clichés obtenus sont présentés en ANNEXE 5.
Après deux jours de circulation d’une culture à travers les colonnes, on constate que Pseudomonas
ADP sp. n’a pas proprement dit colonisé l’écorce de pin. Les cellules sont très clairsemées sur le
support ; cependant, on note que sur l’écorce non stérile les cellules sont présentes en plus grand
nombre que sur l’écorce stérilisée. On peut différencier des cellules de tailles variables constituant
une partie de la flore indigène de l’écorce : les grosses cellules (environ 5 µm) pourraient
correspondrent aux levures nommées CP2 préalablement identifiées au cours de l’isolement de la
microflore de l’écorce de pin par microscopie optique (IV.2.1p.150). On note également la présence
de cellules possédant des filaments mycéliens.
Deux jours d’inoculation ne sont pas suffisants pour coloniser l’écorce avec Pseudomonas ADP sp. et
donc pour espérer obtenir une biodégradation de l’atrazine efficace dans le cadre d’un traitement
combiné par biofiltration.
Après 6 jours de circulation d’une culture de Pseudomonas ADP sp. à travers les colonnes, un biofilm
cellulaire plus dense tapisse l’écorce de pin surtout en entrée de colonne, que ce soit sur l’écorce
préalablement stérilisée ou non stérilisée. Les cellules sont encrées dans une sorte de structure
spongieuse vraisemblablement constituée d’exo-polymères sécrétés par les cellules.
Dans les colonnes d’écorce préalablement stérilisée, les cellules sont toutes identiques d’une taille
moyenne de 1 à 2 µm en forme de bâtonnet, caractéristiques de Pseudomonas ADP sp.
186
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
Dans les colonnes d’écorce non stérilisée, ces bâtonnets cohabitent avec d’autre formes cellulaires
(cellules plus grosses et filaments mycéliens). La présence de Pseudomonas ADP sp. semble tout de
même plus limitée que dans l’écorce stérilisée, suggérant de nouveau un effet de compétition entre
les différentes populations microbiennes présentes dans l’écorce.
On note également que, quelle que soit l’écorce (stérilisée ou non) les cellules sont en très grand
nombre en entrée de colonne et qu’elles sont réparties de manière plus éparse au centre de la
colonne. La structure d’exo-polymères est absente du centre de la colonne et ne se retrouve que
lorsque les cellules sont présentes en grand nombre.
Ces observations permettent de conclure qu’une durée d’inoculation de 6 jours est nécessaire pour
une bonne colonisation de l’écorce par Pseudomonas ADP sp. D’autre part, l’écorce stérilisée semble
présenter un avantage par rapport à l’écorce contenant la microflore indigène intacte, pour le
développement d’un biofilm de Pseudomonas ADP sp.
V.2.2.2
Influence du biofilm sur l’hydrodynamique de la colonne
L’influence du biofilm de Pseudomonas ADP sp., observé plus haut, sur l’hydrodynamique des
colonnes d’écorce de pin a été testée par injection du traceur KCl, comme décrit au § V.1.2.2., avant
et après colonisation des colonnes. La Figure 48 (p.170) résume les différentes étapes de ces
expériences.
Seuls les résultats pour une inoculation avec Pseudomonas ADP sp. de 6 jours sont présentés
Figure 59. L’inoculation de 2 jours n’a pas été retenue à cause d’une colonisation trop faible de
l’écorce. Les caractéristiques des colonnes d’écorce sont présentées en ANNEXE 6.
La Figure 59 montre que les courbes d’élution du KCl avant et après inoculation avec Pseudomonas
ADP sp. se superposent quasiment : La présence de Pseudomonas ADP sp. ne modifie pas le
comportement hydrodynamique de la colonne (écorce stérile ou non stérile). L’écoulement a lieu dans
les deux cas (avec et sans Pseudomonas ADP sp.) sans retard (courbe symétrique) et de façon
homogène dans la colonne, sans emprunter de chemins préférentiels. Aucun signe caractéristique de
la présence de zones mortes n’est observé (pas de pics).
Thèse S.GENDRAULT 2004
187

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
Ecorce non stérile
Ecorce stérile
C/Co
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
Without Sans biofilm
Sans Biofilm
With Avec Pseudo biofilm Biofilm
C/Co
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
Sans Without biofilm
Sans Biofilm
With Avec biofilm
Pseudo Biofilm
0,2
0,2
0,1
0
0 1 2 3 4
V/Vo
0,1
0
0 1 2 3 4
V/Vo
Figure 59 : Courbe d’élution de KCl pour les colonnes d’écorce de pin stérile (gauche) ou non stérile
(droite), avant (ronds) et après (carrés) circulation pendant 6 jours d’une culture de Pseudomonas ADP
sp. ; 20 ± 2°C ; débit 1,0 mL.min -1 ; temps de contact 20 min
V.2.2.3
Traitement combiné en colonne
Le traitement combiné « Adsorption + Biodégradation » a été testé sur les colonnes d’écorce de pin
stérile ou non stérile, après inoculation de Pseudomonas ADP sp. pendant 6 jours, défini comme
temps suffisant pour une bonne colonisation du support, selon les résultats obtenus au § V.2.2.1.
Deux débits de circulation de la solution en atrazine ont été testés :
1 mL.min -1 et 0,3 mL.min -1 , correspondant respectivement à des temps de contact d’environ 22 et
100 minutes. Deux concentrations entrantes en atrazine ont également été testées : 0,2 mg.L -1 et
2,34 µg.L -1 . La Figure 49 (p.172) résume les différentes étapes du traitement combiné testé cidessous.
La photo illustre le montage expérimentale utilisé pour ces essais.
Thèse S.GENDRAULT 2004
188

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
Figure 60 : Montage expérimentale pour les essais d’adsorption en colonne composé d’une étuve
climatisée à 20±2°C , d’un multianalyseur (pH, conductivité) ; de deux pompes peristaltiques et d’un
collecteur de fractions
La Figure 61 présente les courbes d’élution d’une solution d’atrazine à 0,2 mg.L -1 , injectée à un débit
de 1 mL.min -1 , à travers les colonnes d’écorce préalablement stérilisée ou non.
Lors du traitement combiné (colonne inoculée avec Pseudomonas ADP sp.) la courbe d’élution
exprimée par C/C 0 en fonction de V/V 0 (V 0 étant le volume d’eau dans la colonne ou volume de pore)
tend plus lentement vers la saturation (C/C 0 =1) que lors d’une simple adsorption sans Pseudomonas
ADP sp. Dans les colonne d’écorce stérilisée, la quantité d’atrazine retenue et/ou dégradée après une
injection de 350 V 0 (calculée par la surface au dessus de la courbe) représente 0,070 mg par gramme
d’écorce par « traitement combiné » contre 0,046 mg.g -1 lorsque la colonne n’est pas inoculée avec
Pseudomonas ADP sp. et que seule l’adsorption intervient dans le traitement. Les résultats sont
résumés dans le Tableau 19 p.192).
Des résultats similaires sont obtenus pour l’écorce non stérilisée : la quantité d’atrazine traitée est de
0,041 mg.g -1 et 0,050 mg.g -1 pour les colonnes non inoculées et inoculées respectivement avec
Pseudomonas ADP sp.. Ces résultats sont cohérents avec ceux obtenus en batch ; pour une
concentration à l’équilibre C e = 0,2 mg.L -1 , la quantité d’atrazine retenue par l’écorce q e était de
0,04 mg.g -1 (Figure 15 p.106) pour un ratio liquide/solide de 10 mL.g -1 . On note cependant que
l’efficacité des colonnes d’écorce stérilisée est légèrement meilleure que celle des colonnes contenant
l’écorce non stérilisée. Ce phénomène peut être expliqué d’une part par l’adsorption de l’atrazine sur
l’écorce et d’autre part, par sa biodégradation par Pseudomonas ADP sp. En effet, dans les essais en
Thèse S.GENDRAULT 2004
189

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
batch nous avons pu mettre en évidence une légère différence entre à la capacité d’adsorption de
l’atrazine sur l’écorce stérilisée et celle sur l’écorce non stérilisée :
L’écorce stérilisée présente des coefficients d’adsorption pour l’atrazine légèrement supérieurs à ceux
obtenus avec l’écorce non stérilisée. D’autre part, nous avons à plusieurs reprises évoqué des
phénomènes de compétition entre Pseudomonas ADP sp. et la microflore indigène de l’écorce,
pouvant également justifier de cette différence d’efficacité observée entre le traitement combiné avec
l’écorce stérilisée et celui utilisant l’écorce non stérilisée.
Ecorce non stérile
Ecorce non stérilisée
Ecorce stérile
Ecorce stérilisée
1,0
1,0
0,9
0,9
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
0,6
C/Co
0,5
0,4
C/Co
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
Adsorption
Traitement combiné
0,3
0,2
0,1
Adsorption
Traitement combiné
0,0
0 50 100 150 200 250 300 350 400
V/Vo
0,0
0 50 100 150 200 250 300 350
V/Vo
Figure 61 : Courbe d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 0,2 mg.L -1 ) traversant une
colonne d’écorce de pin non stérilisée (à gauche) ou d’écorce stérilisée (à droite) inoculée (traitement
combiné) ou non (adsorption) avec Pseudomonas ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement. 20
± 2°C ; débit 1 ml.min -1 ; temps de contact 22 min
Suite à ces essais, le traitement combiné a été testé uniquement sur des colonnes d’écorce de pin
préalablement stérilisée. D’autre part, pour améliorer l’efficacité du traitement, le débit de circulation
de la solution en atrazine a été diminué afin d’augmenter le temps de séjour de l’atrazine dans les
colonnes. Un temps de séjour plus long dans les colonnes pourra éventuellement permettre une
meilleure biodégradation de celle-ci par Pseudomonas ADP sp. et/ou une meilleure adsorption sur le
support écorce/biofilm. Nous avons vu plus haut que la biodégradation de l’atrazine avait lieu
majoritairement dans les premières heures de contact avec Pseudomonas ADP sp. (voir par exemple,
Figure 37 p.144).
Les Figure 62 et Figure 63 présentent les courbes d’élution obtenues pour un débit de circulation de
0,3 ml.min -1 (temps de contact environ 100 minutes) de solutions entrantes à 2,34 µg.L -1 ou
0,2 mg. L -1 d’atrazine respectivement, traversant les colonnes d’écorce de pin stérilisée préalablement
colonisées ou non par Pseudomonas ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement.
Thèse S.GENDRAULT 2004
190

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
[Atrazine]i = 2.34 µg.L -1
C/Co
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Adsorption
Traitement combiné
0 50 100 150 200
V/Vo
Figure 62 : Courbes d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 2,34 µg.L -1 ) traversant une
colonne d’écorce de pin stérile inoculée (traitement combiné) ou non (adsorption) avec Pseudomonas
ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement. 20 ± 2°C ; débit 0,3 ml.min -1 ; temps de contact
100 min
[Atrazine]i= 0,2 mg.L-1
1,0
0,9
0,8
0,7
C/C0
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Adsorption
Traitement combiné
0 50 100 150 200
V/V0
Figure 63 : Courbes d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 0,2 mg.L -1 ) traversant une
colonne d’écorce de pin stérile inoculée (traitement combiné) ou non (adsorption) avec Pseudomonas
ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement. 20 ± 2°C ; débit 0,3 ml.min -1 ; temps de contact
100 min
Thèse S.GENDRAULT 2004
191

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
La variabilité des résultats obtenus à faible concentration en atrazine (Figure 62) est due à l’utilisation
de kit de dosage immunologique permettant de travailler à très petite concentration mais parfois peu
précis dans cette gamme de concentrations (dosage colorimétrique).
D’autre part, la Figure 63 présente une chute brutale de la concentration en atrazine en sortie de
colonne au temps t=120h environ. Cette chute provoquée par un problème technique a impliqué la
stagnation de la solution d’atrazine dans la colonne pendant plusieurs heures. Cette observation
montre qu’avec un temps de contact plus long que celui imposé par un débit de 0,3 mL.min -1 (soit
100 minutes environ), la concentration en atrazine chute et donc que la biodégradation peut avoir lieu
de façon plus importante. Le temps de séjour dans les colonnes serait donc insuffisant pour une
bonne biodégradation.
Le Tableau 19 résume les résultats obtenus pour les différents traitements appliqués (différents
débits, différentes concentrations initiales en atrazine, avec ou sans Pseudomonas ADP sp.) et
permet d’évaluer l’éfficacité du traitement selon les différents paramètres d’étude choisis.
Tableau 19 : Quantité d’atrazine retenue ou dégradée par gramme d’écorce par circulation des solutions
polluées à 0,2 mg.L -1 ou 3 µg.L -1 à des débits de 1 ou 0,3 ml.min -1 dans des colonnes d’écorce de pin
stérilisée, ayant ou non été colonisées par Pseudomonas ADP sp.
Débit = 1 ml.min -1 Débit = 0,3 ml.min -1
[Atrazine]= 0,2 mg.L -1 [Atrazine]= 3 µg.L -1 [Atrazine]= 0,2 mg.L -1 [Atrazine]= 3 µg.L -1
Sans Pseudo. 0,046 mg.g -1 ND 0,046 mg.g -1 0,348 µg.g -1
Avec Pseudo. 0,07 mg.g -1 ND 0,087mg.g -1 0,65 µg.g -1
Lorsque Pseudomonas ADP sp. n’est pas inoculée dans les colonnes d’écorce de pin, l’efficacité du
traitement est équivalente pour les débits de 1 mL.min -1 ou 0,3 mL.min -1 . L’augmentation du temps de
séjour dans les colonnes (multiplié par 3) n’augmente pas l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce. En
effet, les essais en batch ont montré que l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin était un
phénomène quasi instantané (Figure 11, p.102) ; l’atrazine est majoritairement adsorbée lors des
premières minutes de contact avec l’écorce.
Lorsque les colonnes sont colonisées par Pseudomonas ADP sp., la présence du biofilm améliore de
50% la quantité d’atrazine éliminée de la solution par rapport aux colonnes non inoculées, lorsque la
concentration en atrazine de la solution à traiter est de 0,2 mg.L -1 pour un débit de 1 ml.min -1 .
A faible débit (0,3 mL.min -1 ), la présence de Pseudomonas ADP sp. permet de doubler la masse
d’atrazine éliminée, que ce soit pour une concentration entrante de 0,2 mg.L -1 ou 2,34 µg.L -1 .
Thèse S.GENDRAULT 2004
192

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
La diminution du débit de 1 à 0,3 mL.min -1 , rend également le procédé de biofiltration plus efficace
(+ 25 % d’atrazine éliminée à 0,3 mL.min -1 par rapport au débit de 1 mL.min -1 ), contrairement à ce qui
a été observé plus haut dans les colonnes non inoculées. L’augmentation du temps de séjour permet
donc d’obtenir un meilleur taux de biodégradation de l’atrazine.
Les études en batch (Figure 50, Figure 51, p.174) ont montré que la minéralisation de l’atrazine avait
lieu majoritairement au cours des 15 premières heures. Il pourrait donc être intéressant de répéter ces
expériences soit avec des débits plus faibles, afin d’atteindre des temps de séjour de plusieurs heures
dans la colonne (alors, la diminution du débit pourrait entraîner des problèmes d’oxygénation ou
d’apport en nutriments pouvant devenir limitant pour les micro-organismes) soit par recirculation de la
solution à traiter, ce qui augmenterait le temps de séjour de l’atrazine sans poser de problème
d’aération des colonnes. Dans le cas de l’utilisation de débit plus faible, l’utilisation de colonnes
aérées, type Airlift pourrait être la solution au problème d’oxygénation des bactéries.
Les analyses de carbone organique dissous (COD) effectuées tout au long de ces expériences ont
montré des concentrations toujours inférieures à 1g.L -1 , soit une charge organique acceptable pour
être rejetée dans le milieu naturel. De plus, ces analyses ont montré que cette concentration en COD
en sortie de colonne variait très peu au cours du temps. L’activité biologique (consommation de la
matière organique de l’écorce) à l’intérieur de la colonne pourrait être responsable du transfert de
composés de l’écorce e solution et donc de la stabilité de la concentration en COD en sortie de
colonne (équilibre entre consommation de la matière organique et dissolution de celle-ci dans la
phase aqueuse circulante).
Si on calcule le volume d’élution par gramme d’écorce pour lequel on obtient en sortie de colonne la
concentration en atrazine maximale autorisée (soit 0,1 µg.L -1 ), on voit que pour traiter une eau
naturelle polluée à 2,34 µg.L -1 cette concentration maximale est atteinte pour un volume d’environ
40 ml pour 1 gramme d’écorce (débit de 0,3 ml.min -1 ) avec ou sans Pseudomonas ADP sp. Il faudrait
donc 25 kg d’écorce pour traiter 1m 3 de cette eau, ce qui représente une masse considérable.
L’efficacité du traitement étudié reste donc limitée par rapport à un traitement classique sur charbon
actif puisque la capacité d’adsorption de l’atrazine sur un charbon actif en poudre est d’environ de 10
à 30 g.m -3 pour une concentration en atrazine de 0,1 µg.L -1 , et utilise donc environ 1000 fois moins
d’adsorbant qu’un traitement sur écorce de pin (Detoc, 1998).
Dans le cas du traitement d’une solution polluée à environ 0,2 mg.L -1 , correspondant à une forte
pollution (eaux provenant de lavage de cuve contenant des pesticides, eaux accidentellement émises
par une usine de production ou issues d’une mauvaise utilisation ou d’un mauvais stockage), on
observe un taux d’abattement de 60% après circulation d’environ 3 litres de solution lorsque la
colonne ne contient pas Pseudomonas ADP sp. contre 6 litres lorsque la colonne a été inoculée avec
Pseudomonas ADP sp. L’efficacité du traitement est doublée lorsque adsorption et biodégradation
sont combiné. La capacité de l’écorce pour abattre 60% de l’atrazine initialement présente à
0,2 mg.L - 1 est 1500 g.m -3 . On pourrait donc imaginer mettre en œuvre ce procédé de traitement dans
193
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
le cadre d’une pollution ponctuelle, avec des quantités d’eau à traiter de quelques dizaines de mètres
cube.
Le traitement combiné pourrait dans ces conditions être utilisé comme un pré-traitement pour abattre
la majeure partie de la pollution, avant d’être envoyée dans une filière de traitement classique, en tête
de station d’épuration ou de subir un traitement final sur charbon actif.
V.2.2.4
Conclusions
Les résultats obtenus lors de l’étude du traitement combiné en colonne montrent qu’un temps
d’inoculation de 6 jours est nécessaire pour coloniser la colonne d’écorce de pin avec
Pseudomonas ADP sp., avant qu’elle ne soit utilisée comme biofiltre.
D’autre part, la présence de la microflore de l’écorce de pin diminue faiblement la colonisation par
Pseudomonas ADP sp. suggérant à nouveau l’existence d’une faible compétition entre cette flore
indigène et Pseudomonas ADP sp. pour les nutriments à leur disposition.
Lorsque le biofilm est établi, celui-ci ne modifie pas le comportement hydrodynamique des colonnes
d’écorce de pin.
D’une manière générale, les quantités d’atrazine éliminées par le traitement combiné ne sont pas très
importantes. On note cependant que la présence de Pseudomonas ADP sp. dans les colonnes
améliore de 50 à 100 % l’efficacité du traitement par rapport au procédé d’adsorption seul. On note
également que la diminution du débit de circulation de la solution polluée dans les colonnes (de 1 à
0,3 ml.min -1 ), soit l’augmentation du temps de séjour de l’atrazine dans les colonnes augmente
significativement le taux de biodégradation de celle-ci.
Globalement, les conditions testées dans ces essais n’ont pas été favorables à la biodégradation. Il
pourrait donc être intéressant d’optimiser ces conditions (diminution du débit circulation de la solution
polluée ou recirculation de la solution afin d’augmenter le temps de contact entre atrazine et écorce)
afin de provoquer la biodégradation de manière plus efficace. D’autre part, la connaissance de la
densité cellulaire à l’intérieur des colonnes permettrait d’accéder aux valeurs de taux de croissance et
de déterminer des vitesses de dégradation de l’atrazine dans les colonnes. En connaissant les
vitesses de dégradation, un débit optimal (ou temps de séjour) pourrait être calculé pour traiter de
façon optimisée l’eau polluée.
Ces essais ont montré que le traitement combiné était d’une manière générale inexploitable pour
traiter des eaux contenant de faibles concentrations en atrazine. Cette méthode utiliserait des
quantités considérables d’écorce de pin. Le traitement sur charbon actif (inoculé ou non) est dans ce
cas beaucoup plus efficace et plus adapté malgré un coût supérieur du support d’adsorption.
194
Thèse S.GENDRAULT 2004

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
En revanche, dans le cas d’une forte pollution ponctuelle en atrazine, le traitement combiné sur
écorce de pin inoculée peut être envisagé en tant que pré-traitement. L’eau serait ainsi
débarrassée de la majeure partie de sa charge polluante avant d’être envoyée dans les filières de
traitement classique. Ainsi, on peut imaginer qu’un agriculteur lavant ses cuves de pesticides ou un
producteur d’atrazine pourrait, sur site, être équipé de colonne ou de bioréacteur individuel pour traiter
ses eaux fortement concentrées en atrazine, afin d’éliminer la plus grosse partie de la pollution. Cette
solution est d’ailleurs en accord avec la politique actuelle qui tend à responsabiliser de plus en plus
les pollueurs.
Thèse S.GENDRAULT 2004
195

RESULTATS ET DISCUSSION
Etude du traitement combiné
196
Thèse S.GENDRAULT 2004

CONCLUSION GENERALE
CONCLUSION GENERALE ET
PERSPECTIVES
A l’heure où les pays industrialisés sont conscients de la nécessité impérative de protection de la
qualité de l’environnement, de plus en plus de travaux sont mis en œuvre pour trouver, dans tous les
domaines et des solutions économiquement, socialement et environnementalement sont proposées.
Notre étude s’inscrit dans ce contexte de gestion durable de l’environnement, d’une part parce qu’elle
prétend dépolluer des eaux contaminées par un pesticide et d’autre part parce qu’elle permet de
valoriser un déchet abondement disponible dans les pays comme la France ou le Portugal.
L’utilisation de l’écorce de pin pour le traitement de l’eau permettrait d’économiser de l’énergie
(consommée par exemple pour la fabrication de charbon actif) et des matières premières, que l’on se
doit de protéger si l’on veut préserver notre planète. D’autre part, la connaissance et l’isolement de
nombreux micro-organismes pour leur capacité à consommer les polluants permet aujourd’hui
d’éliminer totalement un composé par minéralisation (soit transformation en CO 2 et H 2 O). Le polluant
n’est plus stocké (pollution concentrée et déplacée) ou incinéré (impliquant une éventuelle pollution de
l’air par combustion) il peut être littéralement éliminé par ce type de traitement biologique.
Cette étude a engendré un grand nombre de travaux concernant séparément l’adsorption et la
biodégradation avant de pouvoir mener à bien les essais concernant le traitement lui-même,
combinant adsorption et biodégradation. Ces essais ont permis d’étudier la faisabilité de ce traitement
combiné sur écorce de pin avec Pseudomonas ADP sp. Elles ont notamment servi à fixer certains
paramètres d’études appliqués ensuite au traitement désiré.
Nos études ont montré que :
l’écorce de pin possédait une capacité d’adsorption très limitée par rapport à un charbon actif
(couramment utilisé pour l’élimination de micro-polluants présents dans les eaux). Cependant,
de par sa faible capacité adsorbante vis à vis de l’atrazine et dans le cadre d’une biofiltration,
l’écorce présente l’avantage de rendre le polluant plus disponible pour les micro-organismes
impliqués dans le traitement.
L’écorce a de plus, l’avantage d’être peu onéreuse puisque qu’il est un déchet de l’industrie du
bois, et disponible.
Pseudomonas ADP sp. est capable de survivre et de minéraliser l’atrazine en présence
d’écorce de pin en poudre, supportant le pH imposé par la présence de celle-ci en solution
196
Thèse S.GENDRAULT 2004

CONCLUSION GENERALE
aqueuse (pH 4-5) et même d’utiliser les composés organiques solubles de l’écorce comme
source de carbone pour son propre métabolisme. D’autre part, Pseudomonas ADP sp. peut
se développer à la surface de l’écorce, et former un biofilm conséquent pour une application
en biofiltration.
La présence dans l’écorce d’une concentration très faible d’azote favorise la minéralisation de
l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. capable d’utiliser cette dernière comme source d’azote.
La microflore indigène de l’écorce de pin a une faible influence sur Pseudomonas ADP sp. (en
terme de croissance ou de capacité à minéraliser l’atrazine), les phénomènes de compétition
étant la plupart du temps négligeables. Lorsque l’atrazine est présente à une forte
concentration dans la solution à traiter (quelques mg.L -1 ), la présence de cette flore indigène
améliore même la biodégradation de l’atrazine.
En terme d’application, les travaux ont permis de faire des choix (qualité de l’écorce en poudre fine,
traitements éventuels à réaliser avant utilisation (stérilisation de l’écorce ou non), etc.), et d’envisager
le traitement combiné, sous forme d’essais en batch ou de biofiltration en colonne. Ces études ont
notamment montré que ce procédé pouvait être mis en oeuvre de façon simple et rustique notamment
par le fait des exigences très réduites de la souche bactérienne utilisée : pas de nécessité d’un apport
de source de carbone supplémentaire, possibilité de travailler à des températures basses (12°C)
pouvant correspondre à la température d’une eau à traiter (pas de chauffage nécessaire), pas de
nécessité non plus de tamponner la solution à traiter. Pseudomonas ADP sp. s’adapte à ces
conditions environnementales contraignantes sans que sa capacité à minéraliser l’atrazine ne soit trop
fortement affectée.
L’étude du traitement combiné a montré que, dans tous les cas, la présence de Pseudomonas ADP
sp. améliorait le taux d’abattement de l’atrazine dans l’eau, présente aussi bien à faible (quelques
µg.L -1 ) qu’à forte concentration (quelques mg.L -1 ) initiale.
Les essais en batch permettent de conclure qu’en 4 jours environ, 50 % de l’atrazine peut être
minéralisée (faible ou forte concentration initiale en atrazine) ; les 50 autres % étant adsorbés sur
l’écorce de manière irréversible à 95% et donc non disponibles pour les bactéries.
Les expériences de biofiltration en colonne ont montré que le traitement combiné était difficilement
envisageable pour traiter des eaux contenant de faibles concentrations en atrazine. Cette méthode
utiliserait des quantités considérables d’écorce de pin.
En revanche, dans le cas d’une forte pollution ponctuelle en atrazine, touchant un volume réduit
d’eau, le traitement combiné sur écorce de pin inoculée pourrait être envisagé après optimisation en
tant que pré-traitement pour débarrasser l’eau polluée de la majeure partie de sa charge polluante
avant d’être envoyée dans les filières de traitements classiques.
197
Thèse S.GENDRAULT 2004

CONCLUSION GENERALE
Le traitement combiné par biofiltration sur écorce de pin en présence de Pseudomonas ADP sp.
pourrait être exploité sur site chez les agriculteurs, sous forme de bioréacteur mobile, ou directement
sur les usines de productions de pesticides.
Des études restent à mener avant d’envisager l’utilisation de ce traitement combiné sur site. Elles
concernent notamment le devenir de l’écorce après son utilisation dans le traitement. Des tests ecotoxicologiques
seraient souhaitables afin de définir l’évolution de ce déchet et sa compatibilité avec
une mise en décharge, une incinération ou une éventuelle valorisation. D’autre part une optimisation
du traitement pourrait être envisagée, principalement par re-circulation de la solution, permettant
l’augmentation du temps de séjour de l’atrazine dans les biofiltres et donc l’augmentation de la
biodégradation par les micro-organismes.
Thèse S.GENDRAULT 2004
198

235
235
Thèse S.GENDRAULT 2004

ANNEXE 1
ANNEXE 1 : Spectre IR de l’écorce de pin en poudre - Identification
des fonctions de surface
C=C aromatique
C=N cyclique
C=O
C=C phenyl conjugué
(CH=CH 2 )
(CH 2 ), (CH)
proche d’un OH
C=O Aldéhyde
ou acide saturé aliphatique
ou substitution sur noyau
aromatique
Phénol
Noyau aromatique
substitué
- OH alcool ou phénol
lié, intermoleculaire
- NH 2 primaire ou
amine secondaire
Le spectre est présenté en détail à la page suivante.
Thèse S.GENDRAULT 2004
200

ANNEXE 2
ANNEXE 2 : Observation au MEB d’écorce de pin et de charbon
actif en poudre
Figure 1 : Observation de la structure de surface du charbon actif (à gauche) et de l’écorce de pin (à
droite (échelle 100 µm)
Figure 2 : Fibre de charbon actif (à gauche) et d’écorce de pin (à droite)
Thèse S.GENDRAULT 2004
201

ANNEXE 2
Figure 3 : Observation de la structure longitudinale interne de particules d’écorce de pin
Thèse S.GENDRAULT 2004
202

ANNEXE 3
ANNEXE 3 : Caractéristiques des colonnes - Etude hydrodynamique
Colonne d’écorce non stérile :
Paramètres colonne Symbole Unité
Diamètre interne d 2,50 cm
Section S 4,91 cm 2
Hauteur du lit L 6,70 cm
Masse de milieu poreux m 9,60 g
Volume du lit V t 32,87 cm 3
Volume de pore V e ou V 0 19,70 cm 3
Indice de vide e (V e /V s ) 11,60
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,60
Flux D 59,40 cm 3 .h -1
Vitesse de Darcy q (D/S) 12,11 cm.h -1
Vitesse de pore V (q/ ε) 20,20 cm.h -1
Colonne d’écorce de pin stérile :
Paramètres colonne Symbole Unité
Diamètre interne d 2,50 cm
Section S 4,91 cm 2
Hauteur du lit L 7,00 cm
Masse de milieu poreux m 10,00 g
Volume du lit V t 34,37 cm 3
Volume de pore V e ou V 0 21,00 cm 3
Indice de vide e (V e /V s ) 11,67
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,61
Flux D 64,80 cm 3 .h -1
Vitesse de Darcy q (D/S) 13,20 cm.h -1
Vitesse de pore V (q/ ε) 21,60 cm.h -1
Colonne de charbon actif :
Paramètres colonne Symbole Unité
Diamètre interne d 2,50 cm
Section S 4,91 cm 2
Hauteur du lit L 5,00 cm
Masse de milieu poreux m 9,90 g
Volume du lit V t 24,53 cm 3
Volume de pore V e ou V 0 21,20 cm 3
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,86
Flux D 60,00 cm 3 .h -1
Vitesse de Darcy q (D/S) 12,23 cm.h -1
Vitesse de pore V (q/ ε) 14,15 cm.h -1
203
Thèse S.GENDRAULT 2004

ANNEXE 4
ANNEXE 4 : Caractéristiques des colonnes - Adsorption de
l’atrazine en conditions abiotiques
Colonne d’écorce non stérile :
Paramètres colonne Symbole Unité
Diamètre interne d 2,50 cm
Section S 4,91 cm 2
Hauteur du lit L 7,00 cm
Masse de milieu poreux m 10,00 g
Volume du lit V t 34,37 cm 3
Volume de pore V e ou V 0 25,00 cm 3
Indice de vide e (V e /V s ) 13,90
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,73
Flux D 58,20 cm 3 .h -1
Vitesse de Darcy q (D/S) 11,83 cm.h -1
Vitesse de pore V (q/ ε) 16,20 cm.h -1
Colonne d’écorce de pin stérile :
Paramètres colonne Symbole Unité
Diamètre interne d 2,50 cm
Section S 4,91 cm 2
Hauteur du lit L 7,00 cm
Masse de milieu poreux m 10,00 g
Volume du lit V t 34,37 cm 3
Volume de pore V e ou V 0 18,00 cm 3
Indice de vide e (V e /V s ) 10,00
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,52
Flux D 58,20 cm 3 .h -1
Vitesse de Darcy q (D/S) 11,85 cm.h -1
Vitesse de pore V (q/ ε) 22,79cm.h -1
Thèse S.GENDRAULT 2004
204

ANNEXE 5
ANNEXE 5 : Observation au MEB de Pseudomonas ADP sp. en
colonne d’écorce de pin
I. Circulation d’une culture de Pseudomonas ADP sp. 2 jours
I.1 Ecorce préalablement stérilisée
Entrée de colonne
I.2 Ecorce non stérilisée
Filament mycélien
Grosses cellules
Entrée de colonne
Thèse S.GENDRAULT 2004
205

ANNEXE 5
Filament mycélien
Milieu de colonne
Thèse S.GENDRAULT 2004
206

ANNEXE 5
II. Circulation d’une culture de Pseudomonas ADP sp. 6 jours
II.1
Ecorce stérile
II.1.1 Entrée de colonne
Structure spongieuse
sous-jacente
Thèse S.GENDRAULT 2004
207

ANNEXE 5
II.1.2 Milieu de colonne
Thèse S.GENDRAULT 2004
208

ANNEXE 5
II.2 Ecroce non stérile
II.2.1 Entrée de colonne
Structure spongieuse Filament mycélien Grosses cellules
Thèse S.GENDRAULT 2004
209

ANNEXE 5
II.2.2 Milieu de colonne
Thèse S.GENDRAULT 2004
210

ANNEXE 6
ANNEXE 6 : Caractéristiques des colonnes - Influence d’un biofilm
sur l’hydrodynamique des colonnes
Colonne d’écorce non stérile :
Paramètres colonne Symbole Unité
Diamètre interne d 2,50 cm
Section S 4,91 cm 2
Hauteur du lit L 5,3 cm
Masse de milieu poreux m 10,10 g
Volume du lit V t 26,03 cm 3
Volume de pore V e ou V 0 18,20 cm 3
Indice de vide e (V e /V s ) 9,29
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,70
Flux D 58,20 cm 3 .h -1
Vitesse de Darcy q (D/S) 11,83 cm.h -1
Vitesse de pore V (q/ ε) 16,90 cm.h -1
Colonne d’écorce de pin stérile :
Paramètres colonne Symbole Unité
Diamètre interne d 2,50 cm
Section S 4,91 cm 2
Hauteur du lit L 6,00 cm
Masse de milieu poreux m 9,60 g
Volume du lit V t 29,46 cm 3
Volume de pore V e ou V 0 19,50 cm 3
Indice de vide e (V e /V s ) 11,47
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,66
Flux D 58,20 cm 3 .h -1
Vitesse de Darcy q (D/S) 11,85 cm.h -1
Vitesse de pore V (q/ ε) 17,95 cm.h -1
Thèse S.GENDRAULT 2004
211

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Thèse S.GENDRAULT 2004
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Thèse S.GENDRAULT 2004
226

LISTE DES FIGURES
Etude Bibliographique
Figure 1 : Comportement des pesticides dans les sols ........................................................................ 16
Figure 2 : Evolution de la capacité d’adsorption de l’atrazine sur les acides humiques (AH) (0,4 g/L) en
fonction du pH, d’après Wang et al. (1991) ................................................................................... 20
Figure 3 : Exemple de mécanisme de dégradation biologique et chimique de l’atrazine, d’après
Giardini et al., 1985........................................................................................................................ 26
Figure 4 : Différentes voies de dégradation de l’atrazine par ozonation selon Acero et al. (2000)...... 33
Figure 5 : Echange d’ions entre la procyanidine (tanin de l’écorce) et un ion métalique divalent
(Vazquez et al. 2002)..................................................................................................................... 41
Figure 6 : Exemple de dégradation de l’atrazine par une communauté bactérienne, selon Orstrofsky et
al. (2002)........................................................................................................................................ 45
Figure 7 : Schéma du procédé de traitement imaginé par McKinlay et Kasperek (1997) .................... 46
Figure 8 : Dégradation de l’atrazine au cours du temps avec 4 additions successives d’atrazine (6
mg/l) dans le système de McKinlay et Kasperek (1999) pour les 4 macrophytes étudiés. ........... 47
Figure 9 : Developpement idéal d’un biofilm (Melo, 1997) ................................................................... 51
Figure 10 : Les différentes étapes de formation d’un biofilm (adapté de Melo, 1994) ......................... 52
Figure 11 : Influence de la charge organique sur l’épaisseur du biofilm (inspiré de Characklis 1990) 58
Figure 12 : Effet de la vitesse de circulation sur la formation du biofilm (inspiré de Pinheiro et al.,
1988).............................................................................................................................................. 59
Figure 13 : Mécanisme de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.selon Martinez et al.
(2001)............................................................................................................................................. 67
Figure 14 : Représentation des différentes phases d’un milieu poreux................................................ 74
Thèse S.GENDRAULT 2004
227

Etude Expérimentale
Figure 1 : Distribution de Pinus pinaster en Europe et en Afrique du Nord (Ratola, 2002)...................79
Figure 2: Répartition des espèces forestière du Portugal (Inventaire National des forets – 3 ème édition,
1998)...............................................................................................................................................79
Figure 3 : Ecorce de pin Pinus pinaster .................................................................................................80
Figure 4 : Ecorce brute de pin Pinus Pinaster .......................................................................................88
Figure 5 : Formule développée de l’atrazine..........................................................................................90
Figure 6 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en présence de MeOH (A) ou sans
MeOH (B) ; diamètre des particules d’écorce :d

Figure 14 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine ([atrazine] i = 2,6 à 749 µg.L -1 ) sur l’écorce de pin en
poudre (d

Figure 26 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM-glucosé à 1 g.L -1 ) avec
atrazine (30 mg.L -1 ) additionnée au milieu à partir d’une solution mère concentrée dans le
méthanol ou dissoute directement en poudre dans le milieu MM ; 30°C ; agitation 150 rpm ......125
Figure 27 : Photo d’un biomètre pour l’étude de la minéralisation de l’atrazine ..................................126
Figure 28 : Représentation schématique d’un biomètre utilisé dans les essais de minéralisation en
« Batch ».......................................................................................................................................127
Figure 29 : Influence de la température sur la croissance (A) de Pseudomonas ADP sp. et sa capacité
à dégrader l’atrazine (B) en milieu minéral (MM), avec atrazine (environ 50 mg.L - 1) comme seule
source d’azote et glucose (1 g.L -1 ) comme source de carbone ; agitation orbitale (150 rpm) ; pH 7133
Figure 30 : Influence du pH sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. (A) et sa capacité à dégrader
l’atrazine (B) en milie minéral (MM) ; atrazine comme seule source d’azote (environ 15 mg.L -1 ) ;
glucose (1g mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation orbitale (150 rpm)..............................................................134
Figure 31 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et dégradation primaire de l’atrazine présente ou
non (50 mg.L -1 ) en milieu minéral (MM) en présence ou non d’une source additionelle d’azote
(sulfate d’ammonium 1 g.L -1 ) ; Glucose (1 g.L -1 ) ; 30°C ; agitation orbitale 150 rpm ...................136
Figure 32 : Minéralisation de l’atrazine (concentration initiale environ 20 mg.L -1 ) par Pseudomonas
ADP sp. en milieu riche (LB) ou en milieu minéral (MM ; glucose 1 g.L -1 ) contenant ou non une
source additionnelle d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 ) ; 30°C ; Agitation 150 rpm ; 14 C-
atrazine à 1 µCi/fiole .....................................................................................................................138
Figure 33 : Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) en présence de 1
ou 0,25 g.L -1 de glucose comme source de carbone, 1 g.L -1 de sulfate d’ammonium ; en extrait
aqueux d’écorce de pin (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 comme source d’azote) en présence ou non
de sels minéraux ; 30°C ; agitation 150 rpm.................................................................................139
Figure 34 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait stérile d’écorce de pin ou en milieu
minéral (MM) contenant ou non une source additionnelle de carbone (glucose 1g.L -1 noté Glc)
et/ou une source d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm..........141
Figure 35 : Activité respiratoire (exprimée en mg de O 2 .L -1 ) de Pseudomonas ADP sp. en extrait
aqueux d’écorce de pin contenant (0,25 mg.L -1 ; 0,5 mg.L -1 ou 1 mg.L -1 ) ou non du glucose ;
30°C ; agitation 150 rpm. .............................................................................................................142
Thèse S.GENDRAULT 2004
230

Figure 36 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en extrait aqueux
d’écorce de pin stérile ou en milieu minéral MM (glucose 1 g.L -1 ) en présence d’atrazine (50 mg.L -
1 ) avec ou sans sulfate d’ammonium (1 g.L -1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm.........................143
Figure 37 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp en extrait aqueux d’écorce de pin
stérile ou en milieu minéral MM (glucose 0,25 g.L -1 ) ; concentration initiale en atrazine 20 mg.L -1 ;
22°C ; agitation lente.....................................................................................................................144
Figure 38 : Croissance du consortium isolé à partir de l’écorce de pin et biodégradation de l’atrazine
en milieu LB ou en extrait aqueux d’écorce de pin inoculé avec environ 10 6 cfu.mL -1 de chaque
isolat (CP1 à CP4) ; atrazine comme source d’azote (55 mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation 150 rpm ......151
Figure 39 : Biodégradation de l’atrazine en milieu LB par les micro-organismes isolés de l’écorce de
pin (inoculé avec environ 10 6 cfu.mL -1 de CP1, CP2, CP3 ou CP4) ; atrazine comme source
d’azote (environ 55 mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation 150 rpm.................................................................152
Figure 40 : Minéralisation de l’atrazine en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de
pin stériles ou non stériles (d

Figure 47 : Lits d’écorce de pin issus des colonnes après inoculation de Pseudomonas ADP sp.
pendant 2 ou 6 jours ; prélèvements pour analyses au MEB.......................................................168
Figure 48 : Montage expérimental : Hydrodynamique des colonnes avant et après inoculation avec
Pseudomonas ADP sp..................................................................................................................170
Figure 49 : Montage expérimental pour les essais en colonne de traitement combiné d’une solution
polluée à l’atrazine après inoculation des colonnes avec Pseudomonas ADP sp. pendant 6 jours.172
Figure 50 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM- Glucose
1,25 g.L -1 ), en présence ou non d’écorce en poudre (d

Figure 56 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., après 15 jours d’incubation à 20 ± 2 °C ;
[atrazine]i = 44,2 µg.L -1 (Figure de Gauche) et [atrazine]i = 20 mg.L -1 (Figure de Droite)............182
Figure 57 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d

Thèse S.GENDRAULT 2004
235

LISTE DES TABLEAUX
Etude Bibliographique
Tableau 1 : Toxicité de l’atrazine ; DL50 par voie orale sur quelques animaux (Trotter et al., 1990)..14
Tableau 2 : Exemples de temps de demi-vie de l’atrazine dans différents sols ...................................23
Tableau 3 : Elimination d’atrazine par nano-filtration (d’après Gaid et Ravarini, 1996)........................38
Tableau 4 : Exemple de matériaux naturels utilisés pour l’adsorption de métaux lourds dans des
procédés de traitement des eaux usées ou effluents ....................................................................40
Tableau 5 : Supports utilisés dans les systèmes de biofiltration (selon Métivier, 2001).......................54
Tableau 6 : Liste non exhaustive des micro-organismes isolés capables de dégrader l’atrazine ........63
Tableau 7 : Principales caractéristiques taxonomiques de Pseudomonas sp.ADP..............................65
Tableau 8 : Pourcentage d’identité de l’ARN16S de Pseudomonas ADP sp. avec d’autres souche de
Pseudomonas et E. coli (Mandelbaum et al., 1995) ......................................................................65
Tableau 9 : Demi-vie de l’atrazine dans différentes conditions.............................................................66
Thèse S.GENDRAULT 2004
234

Etude Expérimentale
Tableau 1 : Caractéristiques physiques de l’écorce de pin (d

Tableau 16 : Table d’élution pour analyse HPLC de l’atrazine et des métabolites de dégradation.... 164
Tableau 17 : Taux de minéralisation d’atrazine (en %) en 320h d’incubation de Pseudomonas ADP sp.
en biomètre à 20 °C avec [atrazine]i= 44,2 µg.L -1 ou 20 mg.L -1 (st.=stérile) ............................... 176
Tableau 18 : % de résidus liés à l’écorce de pin après 15 jours ou 7 mois d’incubation par rapport à la
radioactivité retrouvée dans l’écorce............................................................................................ 183
Tableau 19 : Quantité d’atrazine retenue ou dégradée par gramme d’écorce par circulation des
solutions polluées à 0,2 mg.L -1 ou 3 µg.L -1 à des débits de 1 ou 0,3 ml.min -1 dans des colonnes
d’écorce de pin stérilisée, ayant ou non été colonisées par Pseudomonas ADP sp................... 192
Thèse S.GENDRAULT 2004
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FOLIO ADMINISTRATIF
THESE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE
LYON
NOM : GENDRAULT DERVEAUX DATE de SOUTENANCE : 22 septembre 2004
(avec précision du nom de jeune fille, le cas échéant)
Prénoms : Sophie
TITRE :
Etude d’un traitement combiné bio-physico-chimique pour la décontamination des eaux polluées en atrazine
NATURE : Doctorat
Numéro d'ordre : 03 ISAL
Ecole doctorale : Chimie de Lyon (Chimie, Procédés et Environnement)
Spécialité : Sciences de l’Environnement Industriel et Urbain
Cote B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 / et bis CLASSE :
RESUME :
Ce travail concerne l’étude d’un procédé bio-physico-chimique pour le traitement d’eaux polluées par de l’atrazine. Le procédé
étudié consiste en une biofiltration, utilisant l’écorce de pin comme support d’adsorption et comme agent de biodégradation la
souche bactérienne Pseudomonas ADP sp., connue pour sa capacité à minéraliser l’atrazine en tant que source d’azote. Cette
technique vise à éliminer totalement le polluant par minéralisation, valorisant l’écorce de pin, un déchet de l’industrie du bois, le
tout à faible coût.
Dans un premier temps, les essais d’adsorption ont montré que l’atrazine était retenue en faible quantité sur l’écorce de pin,
comparé à la capacité d’adsorption d’un charbon actif, rendant le pesticide disponible pour les micro-organismes engagés dans
le traitement.
L’approche biologique en milieu liquide a montré que la biodégradation de l’atrazine pouvait avoir lieu à pH acide (jusqu’à
pH 4,4) imposé par la présence de l’écorce en solution aqueuse et à des températures relativement basses (jusqu’à 12°C)
permettant d’exploiter ce procédé de manière rustique : pas de chauffage ni besoin de tamponner l’eau à traiter. Pseudomonas
ADP sp. a prouvé qu’elle était capable de survivre en présence des composés organiques de l’écorce de pin et de les
consommer en tant que source unique de carbone. D’autre part, aucune source d’azote supplémentaire à l’atrazine ne doit être
apportée au cours du traitement sous peine de voir la minéralisation de celle-ci diminuer.
La microflore indigène de l’écorce de pin a montré une légère capacité à minéraliser l’atrazine pour des concentrations en
atrazine comprises entre 45 µg.L -1 et 20 mg.L -1 permettant, à forte concentration uniquement, d’augmenter le rendement global
du traitement. D’une manière générale, la présence de cette microflore n’aurait qu’un très léger effet inhibiteur vis à vis de la
croissance de Pseudomonas ADP sp. et de sa capacité à minéraliser l’atrazine.
L’étude du traitement combinant adsorption et biodégradation a été réalisée en essais batch et en colonnes. En batch, 50% de
l’atrazine sont minéralisés en 4 jours ; 50% restent adsorbés irréversiblement à l’écorce et donc non disponibles pour les
bactéries. En colonne, l’apport de Pseudomonas ADP sp. améliore l’efficacité du traitement de 50% à 100% par rapport au
procédé d’adsorption seul.
Le traitement étudié semble inexploitable pour traiter des eaux contenant une faible concentration en atrazine (quelques µg . L -
1 ). En revanche, ce procédé combiné pourrait être envisagé comme pré-traitement pour des eaux fortement polluées (quelques
mg.L -1 ).
MOTS-CLES :
Atrazine, Ecorce de pin, Adsorption, Biodégradation, Minéralisation, Pseudomonas ADP sp., Biofiltration
Laboratoire de recherches :
Laboratoire d’Analyse Environnementale des Procédés et des Systèmes Industriels (LAEPSI) INSA de Lyon
Directeur de thèse:
Prof. Rémy GOURDON
Président de jury : Professeur J. BOURGOIS
Composition du jury :
Professeur A. PAUSS
Professeur B. FABRE
Professeur R. GOURDON
Professeur J.M. BLANCHARD
Docteur R. BAYARD
(Rapporteur)
(Rapporteur)