Etude d'un traitement combiné bio-physico-chimique pour la ...
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N° d’ordre 2004ISAL0045 Année 2004<br />
Thèse<br />
<strong>Etude</strong> d’un <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
<strong>bio</strong>-<strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong> <strong>pour</strong> <strong>la</strong><br />
décontamination des eaux polluées en<br />
atrazine<br />
Présentée devant<br />
L’institut national des sciences appliquées de Lyon<br />
Pour obtenir<br />
Le grade de docteur<br />
Formation doctorale<br />
Sciences et Techniques du Déchet<br />
École doctorale<br />
Chimie, Procédés et Environnement de Lyon<br />
Par<br />
Sophie GENDRAULT DERVEAUX<br />
(Maître ès Sciences en Biochimie)<br />
Soutenue le 22 septembre 2004 devant <strong>la</strong> Commission<br />
d’examen<br />
Jury MM.<br />
Mr J. Bourgois, Professeur (Mines de Saint Etienne)<br />
Mr A. Pauss, Professeur (UTC Compiègne)<br />
Mr B. Fabre, Professeur (UHA Mulhouse – Colmar)<br />
Mr R. Gourdon, Professeur (INSA de Lyon)<br />
Mr J.M. B<strong>la</strong>nchard, Professeur (INSA de Lyon)<br />
Mr R. Bayard, Maître de conférences (INSA de Lyon)<br />
Président<br />
Rapporteur<br />
Rapporteur<br />
Directeur de thèse
REMERCIEMENTS<br />
Toute mon estime et mes premiers remerciements vont à mon directeur de thèse, Rémy Gourdon, un<br />
homme exceptionnel qui a su me soutenir tout au long de cette épreuve qu’est celle du doctorat,<br />
jusque dans les moments parfois désespérés. Merci <strong>pour</strong> ton amitié, ta sympathie et ta bonne humeur<br />
quotidienne. Je ressors de ces années avec des cantiques plein <strong>la</strong> tête ! Merci <strong>pour</strong> ton efficacité,<br />
c’est un véritable bonheur de travailler à tes côtés.<br />
Je remercie Pierre Moszkowicz, directeur du LAEPSI qui m’a accueillie depuis mon année de DEA<br />
dans son <strong>la</strong>boratoire.<br />
Une pensée particulière va à mes collègues et amis de <strong>la</strong> FEUP de Porto, où une partie de ce travail<br />
a été réalisé. Je pense particulièrement à Paulo, Nuno et Patricia, des amis <strong>pour</strong> <strong>la</strong> vie.<br />
Ces années n’auraient pas été aussi gaies et festives sans notre « Pépito National ». Merci Rémy<br />
<strong>pour</strong> tes conseils, ton soutient et ton amitié. Tu verras, un jour l’informatique te sourira !<br />
Ces quelques années au LAEPSI ont été l’occasion de rencontres exceptionnelles. Merci à toi<br />
Khalilou de nous sortir parfois de notre rationalité accab<strong>la</strong>nte. La philosophie peut alléger nos<br />
pensées, elle peut aussi les troubler.<br />
Merci à tous mes collègues et amis : Bada, sacrée partenaire de bureau et leader avec moi de<br />
nombreuses festivités au <strong>la</strong>boratoire ! Vincent, Sonia, Danie<strong>la</strong>, Marion et tous les autres, partenaires<br />
de franches rigo<strong>la</strong>des, futurs Docteurs à qui je souhaite un grand succès. Merci à Christian <strong>pour</strong> tous<br />
les coups de main et les bidouil<strong>la</strong>ges maison.<br />
Spéciale dédicace à mes amis des quatre continents, qui se reconnaîtront ; leur présence est toujours<br />
d’un grand réconfort.<br />
A mes amis musiciens qui ont rythmé cette dernière année de thèse.<br />
Un Merci tout particulier à mes parents et à toute ma famille qui ont cru longtemps que je serai<br />
étudiante à vie. Cette fois j’arrête mes études, c’est promis !<br />
MERCI mon Poussin, tout ton amour a rempli ces années de bonheur et notre séjour au Portugal m’a<br />
<strong>la</strong>issé des souvenirs inoubliables.<br />
« L’Odyssée suit son cours » …<br />
avec l’arrivée de notre premier bébé à qui je dédie ce travail ainsi qu’à toute sa<br />
génération.<br />
1<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESUME<br />
Ce travail concerne l’étude d’un procédé <strong>bio</strong>-<strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong> <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> d’eaux polluées par<br />
de l’atrazine. Le procédé étudié consiste en une <strong>bio</strong>filtration, utilisant l’écorce de pin comme support<br />
d’adsorption et comme agent de <strong>bio</strong>dégradation <strong>la</strong> souche bactérienne Pseudomonas ADP sp.,<br />
connue <strong>pour</strong> sa capacité à minéraliser l’atrazine en tant que source d’azote. Cette technique vise à<br />
éliminer totalement le polluant par minéralisation, valorisant l’écorce de pin, un déchet de l’industrie<br />
du bois, le tout à faible coût.<br />
Dans un premier temps, les essais d’adsorption ont montré que l’atrazine était retenue en faible<br />
quantité sur l’écorce de pin, comparé à <strong>la</strong> capacité d’adsorption d’un charbon actif, rendant le<br />
pesticide disponible <strong>pour</strong> les micro-organismes engagés dans le <strong>traitement</strong>.<br />
L’approche <strong>bio</strong>logique en milieu liquide a montré que <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine pouvait avoir lieu<br />
à pH acide (jusqu’à pH 4,4) imposé par <strong>la</strong> présence de l’écorce en solution aqueuse et à des<br />
températures re<strong>la</strong>tivement basses (jusqu’à 12°C) permettant d’exploiter ce procédé de manière<br />
rustique : pas de chauffage ni besoin de tamponner l’eau à traiter. Pseudomonas ADP sp. a prouvé<br />
qu’elle était capable de survivre en présence des composés organiques de l’écorce de pin et de les<br />
consommer en tant que source unique de carbone. D’autre part, aucune source d’azote<br />
supplémentaire à l’atrazine ne doit être apportée au cours du <strong>traitement</strong> sous peine de voir <strong>la</strong><br />
minéralisation de celle-ci diminuer.<br />
La microflore indigène de l’écorce de pin a montré une légère capacité à minéraliser l’atrazine <strong>pour</strong><br />
des concentrations en atrazine comprises entre 45 µg.L -1 et 20 mg.L -1 permettant, à forte<br />
concentration uniquement, d’augmenter le rendement global du <strong>traitement</strong>. D’une manière générale,<br />
<strong>la</strong> présence de cette microflore n’aurait qu’un très léger effet inhibiteur vis à vis de <strong>la</strong> croissance de<br />
Pseudomonas ADP sp. et de sa capacité à minéraliser l’atrazine.<br />
L’étude du <strong>traitement</strong> combinant adsorption et <strong>bio</strong>dégradation a été réalisée en essais batch et en<br />
colonnes. En batch, 50% de l’atrazine sont minéralisés en 4 jours ; 50% restent adsorbés<br />
irréversiblement à l’écorce et donc non disponibles <strong>pour</strong> les bactéries. En colonne, l’apport de<br />
Pseudomonas ADP sp. améliore l’efficacité du <strong>traitement</strong> de 50% à 100% par rapport au procédé<br />
d’adsorption seul.<br />
Le <strong>traitement</strong> étudié semble inexploitable <strong>pour</strong> traiter des eaux contenant une faible concentration en<br />
atrazine (quelques µg.L -1 ). En revanche, ce procédé <strong>combiné</strong> <strong>pour</strong>rait être envisagé comme pré<strong>traitement</strong><br />
<strong>pour</strong> des eaux fortement polluées (quelques mg.L -1 ).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
2
ABSTRACT<br />
This work concerns the study of a combinated process for the treatment of waters contaminated with<br />
atrazine. The treatment consists in a <strong>bio</strong>filtration ; it uses pine bark as the support of adsorption and<br />
the strain Pseudomonas sp. ADP, known for its capacity to mineralize atrazine, using the pesticide as<br />
sole nitrogen source. This process aims at a total elimination of the pollutant, recycling pine bark, a<br />
by-product of wood industry, at low cost.<br />
In a first step, the adsorption assays showed that atrazine was re<strong>la</strong>tivelyslightly retained by pine bark,<br />
as compared to the adsorption capacity of an activated carbon. This characteristic makes the pollutant<br />
easily avai<strong>la</strong>ble for the micro-organisms involved in the treatment.<br />
The <strong>bio</strong>logical approach in liquid medium showed that atrazine <strong>bio</strong>degradation could occur under<br />
acidic conditions (down to pH 4.4) imposed by the presence of the bark in an aqueous solution and at<br />
low temperatures (until 12°C), allowing the development of the process in rustic conditions: without<br />
heating and without buffering.<br />
Pseudomonas sp. ADP proved that it was able to survive in the presence of the pine bark organic<br />
compounds and metabolize them as a carbon source. Moreover, no other nitrogen source in more of<br />
atrazine has to be added during the treatment, otherwise considerably decreasing the mineralization<br />
of atrazine.<br />
The indigenous microflore of the bark showed a low capacity for the mineralization of atrazine for<br />
concentrations ranging from 45 µg.L -1 to 20 mg.L -1 . At high atrazine concentration, this effect<br />
increases the global capacity of the treatment. The presence of the pine bark microflora was shown to<br />
inhibit very slightly the growth of Pseudomonas sp. ADP and its capacity to mineralize atrazine.<br />
The study of the combinated process was done in batch and in column experiments. In batch assays,<br />
50% of atrazine were mineralized in 4 days, as the other 50% stayed irreversibly adsorbed onto pine<br />
bark and were not avai<strong>la</strong>ble for the micro-organisms. In column assays, the contribution of<br />
Pseudomonas sp. ADP improves by 50 to 100% the efficiency of the treatment as compared to the<br />
adsorption process.<br />
The studied treatment appears be inexploitable for the treatment of waters contaminated with low<br />
concentrations of atrazine. However, the combinated process could be considered as a pre-treatment<br />
for the decontamination of water highly polluted.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
3
LISTE DES ABREVIATIONS<br />
Nomenc<strong>la</strong>ture<br />
Acronymes et symboles<br />
µ Moment dipo<strong>la</strong>ire ues A Atrazine<br />
µ max Vitesse maximale de croissance bactérienne T -1 AFT Anodic Fenton Treatment<br />
C 0 ou C i Concentration initiale en liquide mol.L -1 ATP Adénosine triphosphate<br />
C e Concentration à l'équilibre mol.L -1 BM Bi<strong>la</strong>n Matière<br />
C L Concentration dans le liquide Mol.L -3 C Carbone<br />
δ Diamètre L CA Charbon actif<br />
∆H Charge hydraulique - CAF Charbon actif en fibres<br />
ε Porosité totale ou Indice de vide - CAG Charbon actif en grains<br />
H Consante de Henry P CAP Charbon actif en poudre<br />
η Viscosité dynamique <strong>d'un</strong> fluide M.L -1 .T -1 Cd Cadmium<br />
K Coefficient de perméabilité ou conductivité hydraulique L.T -1 CE50 Concentration à effet particulier chez 50% des individus<br />
k Constante de vitesse T -1 CL Concentration létale<br />
K d Coef. de partage sol/eau (M.M -1 )(L 3 .M -1 ) 1/n Cl Chlore<br />
K F Constante de Freundlich (M.M -1 )(L 3 .M -1 ) 1/n CO Carbone organique<br />
K i Coef. d'inhibition COD Carbone organique dissous<br />
K L Constante d'équilibre adsorbat/adsorbant L 3 M -1 CODB Carbone organique dissous <strong>bio</strong>dégradable<br />
K oc Coef. de distrubution carbone organique/eau (M.M -1 )(L 3 .M -1 ) 1/n COT Carbone organique total<br />
K ow Coef de partage octanol/eau - COV Composé organique vo<strong>la</strong>til<br />
K s Constante de Monod Mol.L -3 Cr Chrome<br />
λ Longueur d'onde L Cu Cuivre<br />
m Masse M DBO Demande <strong>bio</strong>logique en oxygène<br />
Ma Masse d'air M DE50 Dose à effet particulier chez 50% des individus<br />
Me Masse d'eau M DEA Deséthyl-atrazine<br />
Ms Masse de solide M DEDIA Deséthyl-desisopropyl-atrazine<br />
Mt Masse totale M DGRAH Direcção Geral dos Recursos e Aproveitamentos Hidráulicos<br />
ν vitesse de consommation <strong>d'un</strong> substrat M.T -1 ou mol.T -1 DIA Desisopropyl-atrazine<br />
n F Constante de Freundlich - DL Dose létale<br />
ν max vitesse maximale de consommation <strong>d'un</strong> substrat Mol.L -3 .T -1 DMSE Dose maximale sans effet<br />
θ humidité volumique % DO Densité optique<br />
q vitesse de Darcy L.T -1 DT50 ou t 1/2 Temps de demi-vie<br />
Q ou D Débit d'écoulement L 3 .T DthO Demande <strong>bio</strong>logique en oxygène théorique (OCDE-301)<br />
q 0 Concentration initiale dans <strong>la</strong> phase solide M.M -1 ou mol.M -1 Fe Fer<br />
q e Quantité de composé adsobé à léquilibre M.M -1 ou mol.M -1 GUS Groundwater Ubiquity Score<br />
θ eff Teneur en eau effective - H Hydrogène<br />
q m Concentration de soluté dans <strong>la</strong> phase solide - HA ou OHA Hydroxyatrazine<br />
Q max Quantité maximale de composé adsobé M.M -1 ou mol.M -1 Hg Mercure<br />
R Coefficient de retard HIA Hydroxy-isopropy<strong>la</strong>mino-atrazine<br />
ρ app Masse volumique apparente M.L 3 HMDS Hexaméthyldisi<strong>la</strong>zane<br />
ρ re Masse volumique réelle M.L 3 HPLC High Performance Liquid Chromatography<br />
S Solubilité <strong>d'un</strong> composé M.L 3 IFEN Institut Français de l'Environnement<br />
S Surface M 2 IR Infra Rouge<br />
s Degré de saturation L/S Ratio Liquide/Solide<br />
S Concentration en substrat mol.L -1 MEB Microscope Electronique à Ba<strong>la</strong>yage<br />
S i Solubilité <strong>d'un</strong>e molécule non ionisée M.L -1 MM Matière Minérale<br />
τ Tortuosité L MM Milieu minéral<br />
V Volume L 3 MM-Glc Milieu minéral glucosé<br />
Va Volume d'air L 3 MO Matière organique<br />
Ve Volume d'eau L 3 Mso Matière Organique soluble<br />
Vo ou Ve Volume de pore L 3 Na Sodium<br />
Vs Volume de solide L 3 Ni Nickel<br />
Vt Volume total L 3 Ni Azote<br />
Vv Volume de vide L 3 O Oxygène<br />
w Humidité pondérale % OHDEA Hydoxy-deséthyl-atrazine<br />
X Densité ou concentration de <strong>bio</strong>masse M.L -3 OMS Organisation mondiale de <strong>la</strong> santé<br />
Y Coefficient de rendement cellu<strong>la</strong>ire M<strong>bio</strong>.Mol -1 de substrat P Phosphore<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
Pb<br />
PCA<br />
PMPOA<br />
RENQA<br />
RNE<br />
RUP<br />
S<br />
UV-Vis<br />
Zn<br />
Plomb<br />
P<strong>la</strong>te Count Agar<br />
Programme de maîtrise des pollutions d’origine agricole<br />
Rede Nacional de Qualidade da Água<br />
Résidus non extractible<br />
Pesticide restreint d'utilisation<br />
Soufre<br />
Ultra violet - visible<br />
Zinc<br />
4
Cette étude a fait l’objet de :<br />
COMMUNICATIONS ORALES :<br />
Unicum Colloquium. Crop Portection. 33ème Congrès du Groupe Français des Pesticides ;<br />
Aix en Provence, France, Mai 2003. Gendrault S., Bayard R., Nones O.P., and Gourdon R.<br />
“Influence of pine bark on the growth and atrazine degradation activity of Pseudomonas sp.<br />
strain ADP in the treatment of contaminated waters”.<br />
POSTERS :<br />
First European Bioremediation Conference ; Chania, Crete, Greece, Juillet 2001. Gendrault<br />
S., Alves M. A., Manaia C. M., Gourdon R., Bayard R., Nunes O. C. “Remediation of<br />
contaminated natural waters with low concentrations of pesticides: a combination of physical<br />
and <strong>bio</strong>logical method”.<br />
Le CODEGPRA (Comité de Développement du Génie d es Procédés Rhône-Alpes),<br />
« Apports du Génie des procédés aux enjeux sociétaux, Saint Martin d’Hères, Octobre 2003.<br />
Gendrault S., Bayard R., Gourdon R., Nunes O.P. «Remediation of contaminated natural<br />
waters with low concentrations of pesticides: a combination of physical and <strong>bio</strong>logical<br />
method”.<br />
Second European Bioremediation Conference ; Chania, Crete, Greece, Juin 2003. Gendrault<br />
S., Bayard R., Nones O.P., and Gourdon R. “Influence of pine bark micro-flora on the growth<br />
and atrazine degradation activity of Pseudomonas sp. strain ADP in the treatment of<br />
contaminated waters”.<br />
PUBLICATION SOUMISE :<br />
Gendrault S., Bayard R., Nones O.P., and Gourdon R. “Influence of pine bark on the growth<br />
and atrazine degradation activity of Pseudomonas sp. strain ADP in the treatment of<br />
contaminated waters”. Agronomie.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
SOMMAIRE<br />
REMERCIEMENTS…………………………………………………………...1<br />
RESUME………………………………………………………………………..2<br />
LISTE DES ABREVIATIONS…………..…………………………………….4<br />
INTRODUCTION GENERALE……………….………………………………5<br />
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE………………………………………………..8<br />
I. LES PESTICIDES : RÉGLEMENTATION, UTILISATION ET<br />
DEVENIR DANS L’ENVIRONNEMENT...................................................9<br />
I.1 Aspects réglementaires ............................................................................................................... 9<br />
I.1.1 Normes européennes, françaises et portugaises sur les pesticides – cas de l’atrazine ....... 9<br />
I.1.2 Programmes de maîtrise et de réduction des pollutions d’origine agricole ......................... 10<br />
I.2 Caractéristiques de l’atrazine.................................................................................................... 12<br />
I.2.1 Généralités........................................................................................................................... 12<br />
I.2.2 Mode d’utilisation et mode d’action de l’atrazine ................................................................. 12<br />
I.2.3 Aspects Toxicologiques ....................................................................................................... 14<br />
I.3 Dispersion des herbicides dans l’environnement................................................................... 15<br />
I.3.1 Introduction .......................................................................................................................... 15<br />
I.3.2 Devenir dans le sol............................................................................................................... 16<br />
I.3.2.1 Rétention des pesticides dans le sol........................................................................... 17<br />
I.3.2.1.1 Facteurs de l’adsorption.......................................................................................... 18<br />
I.3.2.1.2 Formation de résidus liés........................................................................................ 21<br />
I.3.2.2 Dégradation des pesticides dans le sol....................................................................... 22<br />
I.3.2.2.1 Dégradation a<strong>bio</strong>tique............................................................................................. 23<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
I.3.2.2.2 Dégradation <strong>bio</strong>logique ........................................................................................... 24<br />
I.3.2.2.3 Minéralisation .......................................................................................................... 26<br />
I.3.3 Vo<strong>la</strong>tilisation ......................................................................................................................... 27<br />
I.3.4 Contamination des milieux aquatiques ................................................................................ 28<br />
I.3.4.1 Le Ruissellement : contamination des eaux de surface.............................................. 29<br />
I.3.4.2 Le lessivage: contamination des eaux souterraines ................................................... 29<br />
II.<br />
PROCÉDÉS DE TRAITEMENT DE L’EAU POUR L’ÉLIMINATION<br />
DES PESTICIDES..................................................................................31<br />
II.1 Introduction............................................................................................................................. 31<br />
II.2 Elimination de l’atrazine dans <strong>la</strong> filière c<strong>la</strong>ssique de <strong>traitement</strong> des eaux usées ........... 31<br />
II.3 Procédés <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s dégradatifs ........................................................................... 32<br />
II.3.1 Oxydation à l’ozone.............................................................................................................. 32<br />
II.3.2 Oxydation au peroxyde d’hydrogène ................................................................................... 34<br />
II.3.3 Traitement au réactif de Fenton (AFT, Anodic Fenton Treatment)...................................... 34<br />
II.3.4 Dégradation photo<strong>chimique</strong> ................................................................................................. 35<br />
II.4 Procédés non dégradatifs : adsorption sur matrice poreuse ou membrane................... 35<br />
II.4.1 Procédés d’adsorption sur charbon actif en poudre ou en grains ....................................... 35<br />
II.4.1.1 Généralités .................................................................................................................. 35<br />
II.4.1.2 Application à l’adsorption de l’atrazine sur charbon actif (CA)s.................................. 36<br />
II.4.2 Procédés membranaires : microfiltration, ultrafiltration et nanofiltation ............................... 38<br />
II.4.3 Valorisation des déchets verts <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> de l’eau .................................................. 39<br />
II.4.3.1 Une solution économique............................................................................................ 39<br />
II.4.3.2 Quelques exemples..................................................................................................... 39<br />
II.4.3.3 Cas de l’écorce de pin................................................................................................. 40<br />
II.5 Procédés de dégradation <strong>bio</strong>logique ................................................................................... 43<br />
II.5.1 Caractéristiques générales des <strong>bio</strong>réacteurs....................................................................... 43<br />
II.5.2 Traitements <strong>bio</strong>logiques appliqués aux eaux contaminées par l’atrazine ........................... 44<br />
II.6 Procédés <strong>combiné</strong>s................................................................................................................ 47<br />
II.6.1 Généralités........................................................................................................................... 47<br />
II.6.2 La <strong>bio</strong>filtration....................................................................................................................... 49<br />
II.6.2.1 Introduction.................................................................................................................. 49<br />
II.6.2.2 Principales propriétés des <strong>bio</strong>films.............................................................................. 49<br />
II.6.2.3 Comportement des micro-organismes en <strong>bio</strong>film........................................................ 50<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
II.6.2.4 Formation des <strong>bio</strong>films ................................................................................................ 50<br />
II.6.3 Facteurs influençant <strong>la</strong> formation et l’activité des <strong>bio</strong>films................................................... 52<br />
II.6.3.1 Caractéristiques des micro-organismes...................................................................... 52<br />
II.6.3.2 Le support d’adsorption............................................................................................... 53<br />
II.6.3.2.1 Caractéristiques physiques du support d’adsorption............................................. 55<br />
II.6.3.2.2 Caractéristiques <strong>chimique</strong>s du support d’adsorption............................................. 57<br />
II.6.3.2.3 Caractéristiques micro<strong>bio</strong>logiques du support d’adsorption .................................. 57<br />
II.6.3.3 Composition du fluide.................................................................................................. 58<br />
II.6.3.4 Effet de <strong>la</strong> vitesse de circu<strong>la</strong>tion du fluide ................................................................... 59<br />
II.6.3.5 Effet de <strong>la</strong> température................................................................................................ 60<br />
II.6.4 Cinétique de <strong>bio</strong>dégradation d’un substrat .......................................................................... 60<br />
III. BIODÉGRADATION DE L’ATRAZINE PAR PSEUDOMONAS ADP<br />
SP. ..…………………………………………………………………………...62<br />
III.1 Introduction............................................................................................................................. 62<br />
III.2 Isolement de Pseudomonas ADP sp.................................................................................... 64<br />
III.3 Taxonomie et exigences métaboliques................................................................................ 65<br />
III.4<br />
Mécanisme de dégradation de l’atrazine et isolement des gènes de Pseudomonas ADP<br />
sp. impliqués dans <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine........................................................................... 67<br />
III.5 Différentes applications......................................................................................................... 68<br />
III.5.1 Traitement des eaux résiduelles d’usine de fabrication de pesticides ............................ 68<br />
III.5.2 Traitement des sols pollués............................................................................................. 69<br />
III.5.3 Décontamination de sédiments et aquifères pollués....................................................... 69<br />
IV. DESCRIPTION MATHÉMATIQUE DU PROCESSUS<br />
D’ADSORPTION....................................................................................71<br />
IV.1 Modélisation de l’équilibre d’adsorption ............................................................................. 71<br />
IV.2 Ecoulement dans un milieu poreux...................................................................................... 74<br />
IV.2.1 Organisation du milieu poreux......................................................................................... 74<br />
IV.2.2 Hétérogénéité de l’écoulement........................................................................................ 76<br />
IV.2.3 Loi de Darcy..................................................................................................................... 76<br />
IV.2.4 Vitesse d’écoulement et tortuosité................................................................................... 77<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
ETUDE EXPERIMENTALE…………………………………………………78<br />
I. ETUDE DU SUPPORT D’ADSORPTION : L’ÉCORCE DE PIN<br />
« PINUS PINASTER » ...........................................................................79<br />
I.1 Origine et répartition .................................................................................................................. 79<br />
I.2 Chimie générale des écorces .................................................................................................... 80<br />
I.3 Caractéristiques <strong>physico</strong>- <strong>chimique</strong>s de l’écorce de pin ....................................................... 81<br />
I.3.1 Caractéristiques physiques.................................................................................................. 82<br />
I.3.1.1 Principe de <strong>la</strong> méthode BET........................................................................................ 82<br />
I.3.1.2 Principales caractéristiques......................................................................................... 82<br />
I.3.2 Caractéristiques <strong>chimique</strong>s.................................................................................................. 84<br />
I.3.3 Analyse Infra Rouge des fonctions de surface .................................................................... 85<br />
I.3.3.1 Principe de l’analyse Infra Rouge................................................................................ 86<br />
I.3.3.2 Protocole expérimental................................................................................................ 86<br />
I.3.3.3 Interprétation du spectre IR......................................................................................... 86<br />
I.4 Observations de <strong>la</strong> structure l’écorce de pin au MEB ............................................................ 87<br />
I.5 Préparation de l’écorce en vue des études d’adsorption....................................................... 87<br />
I.6 Préparation d’un extrait aqueux d’écorce de pin .................................................................... 88<br />
I.7 Méthode de stérilisation............................................................................................................. 88<br />
II.<br />
ADSORPTION DE L’ATRAZINE SUR L’ÉCORCE DE PIN............90<br />
II.1. Matériel et Méthodes.............................................................................................................. 90<br />
II.1.1 <strong>Etude</strong> de l’adsorption en batch ............................................................................................ 90<br />
II.1.1.1 L’atrazine : caractéristiques générales et méthodes d’analyses................................. 90<br />
II.1.1.1.1 Caractéristiques <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s ...................................................................... 90<br />
II.1.1.1.2 Méthodes d’analyse ............................................................................................... 92<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
(a) Chromatographie Liquide Haute Pression.............................................................. 92<br />
(b) Dosage par Immuno-essai...................................................................................... 92<br />
(c) Suivi des essais avec des molécules marquées au 14 C.............................................. 93<br />
II.1.1.2 Cinétique d’adsorption................................................................................................. 93<br />
II.1.1.3 Isothermes d’adsorption .............................................................................................. 94<br />
II.1.1.4 Extraction de l’atrazine adsorbée sur l’écorce de pin.................................................. 94<br />
II.1.2 <strong>Etude</strong> de l’adsorption en colonne......................................................................................... 95<br />
II.1.2.1 Courbes d’élution d’un soluté ...................................................................................... 95<br />
II.1.2.2 Caractérisation de l’écoulement à l’aide de traceurs .................................................. 97<br />
II.1.2.2.1 Choix du traceur..................................................................................................... 97<br />
II.1.2.2.2 Suivi du traceur en sortie de colonne..................................................................... 97<br />
II.1.2.3 Méthodes expérimentales d’adsorption en colonne.................................................... 98<br />
II.1.2.3.1 Préparation des colonnes ...................................................................................... 98<br />
II.1.2.3.2 Suivi du COD, du pH et de <strong>la</strong> conductivité en sortie de colonne ......................... 100<br />
II.1.2.3.3 Adsorption de l’atrazine en colonne..................................................................... 101<br />
II.2 Résultats et discussion ....................................................................................................... 102<br />
II.2.1 <strong>Etude</strong> de l’adsorption en batch .......................................................................................... 102<br />
II.2.1.1 Cinétiques d’adsorption............................................................................................. 102<br />
II.2.1.2 Isothermes d’adsorption ............................................................................................ 103<br />
II.2.1.2.1 Influence de <strong>la</strong> granulométrie de l’écorce de pin sur l’adsorption de l’atrazine ... 103<br />
II.2.1.2.2 Influence du pH sur l’adsorption de l’atrazine...................................................... 104<br />
II.2.1.2.3 Isotherme d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin dans une <strong>la</strong>rge gamme de<br />
concentrations ........................................................................................................................ 105<br />
II.2.2 <strong>Etude</strong> de l’adsorption en colonnes a<strong>bio</strong>tiques ................................................................... 107<br />
II.2.2.1 <strong>Etude</strong> hydrodynamique des colonnes ....................................................................... 108<br />
II.2.2.2 Suivi du COD, pH et conductivité en sortie de colonne ............................................ 109<br />
II.2.2.3 Adsorption de l’atrazine en colonne d’écorce de pin en conditions a<strong>bio</strong>tiques......... 111<br />
II.2.3 Conclusion ......................................................................................................................... 113<br />
III. BIODÉGRADATION DE L’ATRAZINE EN CULTURE PURE DE<br />
PSEUDOMONAS ADP SP. .................................................................115<br />
III.1 Matériel et méthodes............................................................................................................ 115<br />
III.1.1 Milieux de culture........................................................................................................... 115<br />
III.1.1.1 Les milieux liquides ................................................................................................... 115<br />
III.1.1.1.1 Milieu minéral MM............................................................................................... 115<br />
III.1.1.1.2 Milieu riche complexe LB .................................................................................... 116<br />
III.1.1.1.3 Extrait aqueux d’écorce de pin............................................................................ 116<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
III.1.1.2 Les milieux solides .................................................................................................... 117<br />
III.1.2 Préparation et utilisation des cellules congelées........................................................... 117<br />
III.1.2.1 Préparation de cellules congelées ............................................................................ 117<br />
III.1.2.2 Utilisation de stocks congelés ou de précultures ...................................................... 118<br />
III.1.3 Suivi de <strong>la</strong> croissance des micro-organismes et de l’activité respiratoire ..................... 120<br />
III.1.3.1 Suivi de <strong>la</strong> croissance cellu<strong>la</strong>ire ................................................................................ 120<br />
III.1.3.1.1 Mesure de turbidité ............................................................................................. 120<br />
III.1.3.1.2 Dénombrement sur boite de Pétri....................................................................... 121<br />
III.1.3.1.3 Dosage des protéines par <strong>la</strong> méthode de Folin- Lowry : .................................... 121<br />
III.1.3.1.4 Dosage des protéines par <strong>la</strong> méthode Bradford :............................................... 121<br />
III.1.3.2 Suivi de l’activité respiratoire (ou Demande Bio<strong>chimique</strong> en Oxygène DBO)........... 122<br />
III.1.3.2.1 Principe de <strong>la</strong> mesure ......................................................................................... 122<br />
III.1.3.2.2 Protocole expérimental ....................................................................................... 123<br />
III.1.3.3 Détermination du taux de croissance maximal ......................................................... 123<br />
III.1.4 Suivi de <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine......................................................................... 124<br />
III.1.4.1 Biodégradation primaire de l’atrazine........................................................................ 124<br />
III.1.4.2 Minéralisation de l’atrazine........................................................................................ 125<br />
III.1.4.2.1 Préparation des solutions mères d’atrazine marquée ........................................ 126<br />
III.1.4.2.2 Principe des essais de minéralisation................................................................. 126<br />
III.1.4.2.3 Protocole expérimental ....................................................................................... 127<br />
III.1.5 Influence de paramètres <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s ................................................................. 128<br />
III.1.5.1 Influence des sources de carbone ............................................................................ 128<br />
III.1.5.2 Influence de <strong>la</strong> température et du pH........................................................................ 128<br />
III.1.5.3 Influence d’une source additionnelle d’azote ............................................................ 129<br />
III.1.5.3.1 Croissance bactérienne et dégradation primaire de l’atrazine ........................... 129<br />
III.1.5.3.2 Minéralisation de l’atrazine ................................................................................. 129<br />
III.1.5.4 Influence des composés solubles de l’écorce de pin................................................ 130<br />
III.1.5.4.1 Influence sur l’Activité Respiratoire de Pseudomonas ADP sp. ......................... 130<br />
III.1.5.4.2 Influence sur <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp.et <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de<br />
l’atrazine 131<br />
III.2 Résultats et dissussion ....................................................................................................... 132<br />
III.2.1 Introduction .................................................................................................................... 132<br />
III.2.2 Influence de paramètres <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s ................................................................. 132<br />
III.2.2.1 Croissance et <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine à différentes températures.................... 132<br />
III.2.2.2 Croissance et <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine à différents pH ...................................... 134<br />
III.2.2.3 Influence d’une source additionnelle d’azote ............................................................ 135<br />
III.2.2.3.1 Influence sur <strong>la</strong> dégradation primaire de l’atrazine............................................. 136<br />
III.2.2.3.2 Influence sur <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine........................................................ 137<br />
III.2.3 Influence des composés solubles de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp......... 138<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
III.2.3.1 Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin .. 139<br />
III.2.3.2 Croissance de Pseudomonas ADP sp. et <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine en extrait<br />
d’écocre de pin............................................................................................................................ 140<br />
III.3 Conclusions .......................................................................................................................... 144<br />
IV. CARACTÉRISATION ET RÔLE DE LA MICROFLORE INDIGÈNE<br />
DE L’ÉCORCE DE PIN........................................................................146<br />
IV.1 Matériel et méthodes............................................................................................................ 146<br />
IV.1.1 Isolement et identification des micro-organismes de l’écorce de pin ............................ 146<br />
IV.1.2 Capacité de <strong>la</strong> flore indigène à dégrader l’atrazine ....................................................... 147<br />
IV.1.2.1 Biodégradation de l’atrazine en consortium ou en cultures pures ............................ 147<br />
IV.1.2.2 Minéralisation de l’atrazine par <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce de pin.......................... 147<br />
IV.1.3 Influence de <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp...................... 148<br />
IV.1.3.1 Croissance de Pseudomonas ADP sp. ..................................................................... 148<br />
IV.1.3.2 Biodégradation de l’atrazine...................................................................................... 148<br />
IV.1.3.2.1 Suivi de <strong>la</strong> dégradation primaire de l’atrazine en extrait aqueux d’écorce de pin<br />
148<br />
IV.1.3.2.2 Suivi de <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine ............................................................... 149<br />
IV.2 Résultats et discussion ....................................................................................................... 150<br />
IV.2.1 Isolement de <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin ................................................................ 150<br />
IV.2.2 Capacité de <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce à <strong>bio</strong>dégrader l’atrazine................................ 151<br />
IV.2.2.1 Biodégradation primaire de l’atrazine........................................................................ 151<br />
IV.2.2.2 Minéralisation de l’atrazine........................................................................................ 152<br />
IV.2.3 Influence de <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp...................... 154<br />
IV.2.3.1 Croissance de Pseudomonas ADP sp. et <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine en présence de<br />
<strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin ................................................................................................... 154<br />
IV.2.3.2 Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en présence de <strong>la</strong> microflore<br />
de l’écorce................................................................................................................................... 156<br />
IV.3 Conclusion ............................................................................................................................ 158<br />
V. ETUDE DU TRAITEMENT COMBINÉ...........................................160<br />
V.1 Matériel et méthodes............................................................................................................ 160<br />
V.1.1 Essais en batch.................................................................................................................. 160<br />
V.1.1.1 Protocole expérimental.............................................................................................. 160<br />
V.1.1.2 Distribution de <strong>la</strong> radioactivité dans les essais en batch........................................... 162<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
V.1.1.2.1 Radioactivité en solution...................................................................................... 163<br />
V.1.1.2.2 Radioactivité associée à l’écorce ........................................................................ 164<br />
V.1.1.3 Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong>............................ 165<br />
V.1.2 Essais en colonnes ............................................................................................................ 166<br />
V.1.2.1 Choix des paramètres ............................................................................................... 166<br />
V.1.2.2 Inocu<strong>la</strong>tion et caractérisation du <strong>bio</strong>film et de l’hydrodynamique des colonnes ....... 167<br />
V.1.2.2.1 Observation au MEB des micro-organismes sur l’écorce de pin ........................ 167<br />
(a) Inocu<strong>la</strong>tion des colonnes....................................................................................... 168<br />
(b) Traitement des échantillons <strong>pour</strong> observation au MEB ........................................ 168<br />
V.1.2.2.2 Influence des micro-organismes sur le comportement hydrodynamique des<br />
colonnes 169<br />
V.1.2.3 Protocole expérimental des essais de <strong>bio</strong>filtration .................................................... 170<br />
V.2 Résultats et discussion ....................................................................................................... 173<br />
V.2.1 <strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> en batch .............................................................................. 173<br />
V.2.1.1 Minéralisation de l’atrazine en présence d’écorce de pin ......................................... 173<br />
V.2.1.2 Analyses des composés radioactifs en solution en cours d’incubation .................... 176<br />
V.2.1.3 Répartition de <strong>la</strong> radioactivité résiduelle en fin de <strong>traitement</strong> ................................... 179<br />
V.2.1.4 Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du <strong>traitement</strong> .......................................... 181<br />
V.2.1.5 Conclusions ............................................................................................................... 184<br />
V.2.2 <strong>Etude</strong> en colonne du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> .......................................................................... 186<br />
V.2.2.1 <strong>Etude</strong> du développement de Pseudomonas ADP sp. en colonne d’écorce de pin... 186<br />
V.2.2.2 Influence du <strong>bio</strong>film sur l’hydrodynamique de <strong>la</strong> colonne.......................................... 187<br />
V.2.2.3 Traitement <strong>combiné</strong> en colonne................................................................................ 188<br />
V.2.2.4 Conclusions ............................................................................................................... 194<br />
CONCLUSION GENERALE ET PERPECTIVES…...…………………196<br />
ANNEXES………………………………………………………………..….199<br />
ANNEXE 1 : Spectre IR de l’écorce de pin en poudre – Identification des fonctions de surface…….200<br />
ANNEXE 2 : Observation au MEB d’écorce de pin et de charbon actif…………………………………201<br />
ANNEXE 3 : Caractéristiques des colonnes – <strong>Etude</strong> hydrodynamique…………………………………203<br />
ANNEXE 4 : Caractéristiques des colonnes – Adsorption de l’atrazine en conditions a<strong>bio</strong>tiques…...204<br />
ANNEXE 5 : Observation au MEB de Pseudomonas ADP sp. en colonne d’écorce de pin………….205<br />
ANNEXXE 6 : Caractéristiques des colonnes – Influence d’un <strong>bio</strong>film sur l’hydrodynamique……….211<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES………………………………….212<br />
LISTE DES FIGURES……………………………………………………..227<br />
LISTE DES TABLEAUX…………………………………………………..234<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
INTRODUCTION GENERALE<br />
L’utilisation intensive de fertilisants et de produits phytosanitaires principalement par les exploitants<br />
agricoles provoquent de nombreuses pollutions du milieu naturel. L’utilisation des pesticides entraîne<br />
entre autre le passage de molécules indésirables dans les eaux de surface ou les eaux souterraines.<br />
Le transfert de ces pesticides à travers le sol et jusque dans les eaux naturelles peut avoir <strong>pour</strong><br />
conséquence le dépassement de <strong>la</strong> concentration limite légale fixée par les autorités européennes<br />
(0,1 µg.L -1 par pesticide ou 0,5 µg.L -1 de pesticides cumulés) jusqu’à parfois entraîner l’interdiction de<br />
<strong>la</strong> consommation de l’eau par les habitants résidant aux alentours de <strong>la</strong> zone contaminée. D’autre<br />
part, les rejets issus de <strong>la</strong> manipu<strong>la</strong>tion de ces substances polluantes (<strong>la</strong>vage de cuves, rejets de<br />
production…) peuvent engendrer de fortes pollutions locales (de l’ordre de plusieurs dixaines de<br />
mg.L -1 ).<br />
Face à ces problèmes récurrents, de nombreuses recherches ont été mises en œuvre, d’une part afin<br />
de diminuer le pouvoir polluant (toxicité ou rémanence) des pesticides utilisés, et d’autre part afin de<br />
traiter les eaux polluées de façon efficace. Aujourd’hui, de nombreuses techniques existent <strong>pour</strong><br />
traiter ces eaux chargées en pesticides. Il s’agit le plus souvent de <strong>traitement</strong>s physiques (adsortion<br />
sur charbon actif (Martin-Gullon et Font, 2001)) ou <strong>chimique</strong>s (procédés d’oxydation variés (Acero et<br />
al., 2000)). Ces procédés re<strong>la</strong>tivement coûteux, ne sont finalement que très peu mis en œuvre et des<br />
alternatives moins onéreuses ont été imaginées. Les <strong>traitement</strong>s <strong>bio</strong>logiques, notamment, répondent<br />
à cette contrainte ; ils sont souvent simples et bon marché et d’une bonne efficacité. Les <strong>traitement</strong>s<br />
<strong>bio</strong>logiques entraînent <strong>la</strong> consommation par <strong>bio</strong>dégradation ou minéralisation des substances<br />
polluantes par une <strong>bio</strong>masse capable d’utiliser le pesticide comme source nutritive. Des <strong>traitement</strong>s<br />
combinant « filtration » et <strong>bio</strong>remédiation dits « procédés de <strong>bio</strong>filtration » ont également fait leurs<br />
preuves dans ce domaine (Sénat, 2004 ; Cemagref, 2004).<br />
L’utilisation de matériaux naturels tels que des déchets végétaux comme support de <strong>bio</strong>filtration a été<br />
étudiée avec succès à plusieurs reprises. Ces techniques concernent le plus souvent l’élimination de<br />
métaux lourds contenus dans des eaux naturelles ; <strong>la</strong> décontamination d’eaux polluées par les<br />
pesticides n’ayant été que très rarement abordée. Parmi les matériaux naturels testés, on peut citer<br />
l’utilisation de bagasse (Peternel et al. 1999), coton (Bailey et al. 1999), fibres de betterave (Rima et<br />
al. 2004) ou encore rafles de maïs (Hawthorne-Costa et al. 1995) <strong>pour</strong> l’adsorption de métaux comme<br />
le cadmium, le plomb, le cuivre, le mercure, le nickel ou le zinc.<br />
L’écorce de pin, un sous-produit issu de l’industrie du bois, abondamment disponible, notamment au<br />
Portugal et en France, présente une bonne affinité <strong>pour</strong> les polluants métalliques (Al-Asheh et al.<br />
5<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
2000 ; Vázquez et al. 2002 ; Farm 2003) et certains composés hydrophobes comme les pesticides<br />
organochlorés (Bras et al. 1999 ; Rato<strong>la</strong> et al. 2003). Certains auteurs re<strong>la</strong>tent également l’utilisation<br />
de l’écorce de pin comme garnissage de <strong>bio</strong>filtre <strong>pour</strong> traiter des gaz chargés en méthane (Du Plessis<br />
et al. 2003).<br />
De nombreuses études (en <strong>la</strong>boratoire) réalisées sur l’écorce de pin ont ainsi été entreprises et de<br />
nouveaux procédés ont été é<strong>la</strong>borés comme techniques alternatives aux <strong>traitement</strong>s c<strong>la</strong>ssiques.<br />
Notre étude concerne particulièrement l’élimination de l’atrazine, un herbicide <strong>la</strong>rgement utilisé à<br />
travers le monde, notamment dans les cultures de maïs, mais également épandu comme herbicide<br />
total sur les routes, les voies publiques, les voies ferrées ou les terrains non cultivés. Désormais<br />
interdite d’utilisation dans plusieurs pays européens, dont <strong>la</strong> France depuis juin 2003, <strong>la</strong> présence de<br />
traces d’atrazine dans les eaux naturelles nécessite encore aujourd’hui <strong>la</strong> mise en p<strong>la</strong>ce de<br />
<strong>traitement</strong>s spécifiques.<br />
Cette étude concerne <strong>la</strong> faisabilité du <strong>traitement</strong> d’eaux polluées par une technique de <strong>bio</strong>filtration,<br />
combinant l’adsorption sur un support naturel peu onéreux, l’écorce de pin Pinus pinaster, et <strong>la</strong><br />
<strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine par une espèce bactérienne déjà décrite dans <strong>la</strong> littérature <strong>pour</strong> ses<br />
capacités à minéraliser l’atrazine, Pseudomonas ADP sp. (Mandelbaum et al. 1993). Depuis 1993,<br />
Pseudomonas ADP sp. fait l’objet de nombreuses recherches et est testée <strong>pour</strong> ses capacités à<br />
dégrader l’atrazine dans différents scénarii. Certains auteurs ont ainsi imaginé traiter les eaux<br />
résiduelles d’usines de fabrication de pesticides (concentrations des eaux à traiter : 25 mg.L -1 ) avant<br />
leur rejet dans les eaux résiduelles municipales (Shapir et al 1998). D’autres ont pensé utiliser<br />
Pseudomonas ADP sp. <strong>pour</strong> traiter in situ des sols pollués par une technique de <strong>bio</strong>-augmentation<br />
(Masaphy et Mandelbaum 1997 ; Newcombe et Crowley 1999)), étudiant notamment l’influence de <strong>la</strong><br />
présence de matière organique et du vieillissement (Kristensen et al. 2001) sur <strong>la</strong> <strong>bio</strong>disponibilité de<br />
l’atrazine dans les sols vis à vis de Pseudomonas ADP sp. Des études re<strong>la</strong>tant le <strong>traitement</strong> de<br />
sédiments ou d’aquifères pollués à l’atrazine ont également été mises en œuvre utilisant<br />
Pseudomonas ADP sp. (C<strong>la</strong>usen et al. 2002 ; Kristensen et al. 2001).<br />
L’intérêt d’un <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> est double:<br />
- D’une part il permet de concentrer les polluants traces sur un support d’adsorption. Un<br />
composé concentré (dans les limites de toxicité) sera plus facilement consommé par les<br />
micro-organismes que lorsqu’il est présent dans un milieu sous forme de traces.<br />
- D’autre part, l’utilisation d’un support solide permet également de concentrer une <strong>bio</strong>masse<br />
fixée à sa surface et d’obtenir des densités cellu<strong>la</strong>ires par unité de volume de réacteur<br />
supérieures aux densités cellu<strong>la</strong>ires obtenues en milieu dispersé (réacteurs à <strong>bio</strong>masse libre).<br />
Ainsi, les vitesses de dégradation du polluant seront d’autant plus grandes que <strong>la</strong><br />
concentration en <strong>bio</strong>masse sera grande. La <strong>bio</strong>filtration est un procédé <strong>la</strong>rgement connu<br />
aujourd’hui <strong>pour</strong> son efficacité et re<strong>la</strong>tivement répandu (Exemple de <strong>la</strong> société canadienne<br />
Technologies St Laurent, www.dsp-psd.pwgsc.gc.ca, 2004).<br />
6<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
Le <strong>traitement</strong> étudié a été mis en œuvre afin de répondre aux deux problématiques suivantes :<br />
1- Le <strong>traitement</strong> d’eaux naturelles polluées par de faibles concentrations en atrazine (de l’ordre<br />
du µg.L -1 )<br />
2- Le <strong>traitement</strong> d’eaux polluées à plus fortes concentrations (quelques centaines de µg.L -1 ,<br />
voire quelques mg.L -1 ), correspondant à une pollution ponctuelle locale due, par exemple, à<br />
des <strong>la</strong>vages de cuves, ou concernant des effluents issus d’usines de production de<br />
pesticides. Dans ce cas, le <strong>bio</strong>-procédé serait mis en p<strong>la</strong>ce comme pré-<strong>traitement</strong><br />
(éventuellement sur site) avant rejet des eaux dans le réseau d’eaux résiduelles municipales<br />
ou avant de subir un <strong>traitement</strong> spécifique.<br />
Dans le premier cas (eau polluée par des traces de pesticide), l’utilisation du procédé <strong>combiné</strong><br />
(adsorption et <strong>bio</strong>dégradation) permettrait de concentrer l’atrazine sur le support d’écorce de pin <strong>pour</strong><br />
faciliter et stimuler sa <strong>bio</strong>dégradation.<br />
Dans le second cas, l’application du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> à des eaux plus fortement polluées en<br />
atrazine permettrait par rapport à un <strong>traitement</strong> <strong>bio</strong>logique simple, d’obtenir une densité cellu<strong>la</strong>ire plus<br />
importante, comparé à un réacteur en milieu dispersé, et par conséquent d’obtenir des vitesses de<br />
dégradation plus importantes.<br />
Dans les deux cas, l’intervention de bactéries dans le procédé a <strong>pour</strong> but d’éliminer totalement le<br />
polluant par minéralisation, débarrassant le support d’adsorption de sa charge polluante et permettant<br />
dans le meilleur des cas de régénérer le support d’adsorption par libération des sites d’adsorption.<br />
Dans le cas d’un procédé d’adsorption simple, le support d’adsorption lorsqu’il est saturé, est éliminé<br />
par incinération ou mise en décharge avec sa charge polluante, ou régénéré par d’autres techniques<br />
complémentaires.<br />
L’étude s’est déroulée en trois étapes principales :<br />
Dans un premier temps une étude concernant le support d’adsorption d’écorce de pin a été<br />
entreprise afin de déterminer les principales caractéristiques <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong> de ce<br />
matériau. Puis l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce a été étudiée en conditions a<strong>bio</strong>tiques en<br />
milieu dispersé et en colonnes.<br />
L’approche <strong>bio</strong>logique a été l’objet de <strong>la</strong> deuxième phase de cette étude. Elle a permis de<br />
mettre en évidence les capacités de <strong>la</strong> souche bactérienne Pseudomonas ADP sp. choisie<br />
<strong>pour</strong> ce <strong>traitement</strong>, à minéraliser l’atrazine dans différentes conditions expérimentales et<br />
notamment dans les conditions imposées par <strong>la</strong> présence de l’écorce de pin. L’influence de <strong>la</strong><br />
microflore indigène de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp. a également fait l’objet<br />
d’une étude particulière.<br />
Enfin, le <strong>traitement</strong> combinant adsorption et <strong>bio</strong>dégradation a été testé en milieu dispersé et<br />
en colonne, faisant l’objet de <strong>la</strong> troisième partie de cette étude.<br />
7<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
8<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
I. Les pesticides : réglementation, utilisation et devenir<br />
dans l’environnement<br />
La pollution des eaux de surface et des eaux souterraines par les fertilisants (engrais<br />
<strong>chimique</strong>s, effluents d’élevages, effluents agroalimentaires et boues) ou les produits de <strong>traitement</strong> des<br />
cultures (produits phytosanitaires) est principalement due à l’exploitation des sols <strong>pour</strong> l’agriculture.<br />
Ces pollutions entraînent <strong>la</strong> dégradation des milieux aquatiques et ont conduit à plusieurs reprises à<br />
l’interdiction de l’utilisation de l’eau destinée à <strong>la</strong> consommation humaine.<br />
Pour maîtriser les pollutions d’origine agricole, les pouvoirs publiques s’appuient sur <strong>la</strong> combinaison<br />
de différents outils : réglementaires, économiques ou basés sur le volontariat.<br />
I.1 Aspects réglementaires<br />
I.1.1<br />
Normes européennes, françaises et portugaises sur les pesticides – cas de l’atrazine<br />
La directive européenne 98/83/CE du 3 novembre 1998, re<strong>la</strong>tive à <strong>la</strong> qualité des eaux destinées à <strong>la</strong><br />
consommation humaine, et sa transposition en droit français, à travers le décret 2001 – 1220 du 20<br />
décembre 2001, et en droit portugais à travers l’annexe IV de <strong>la</strong> loi D.L. 236/98, du 1 er août 1998,<br />
fixent à 0,1 µg.L -1 <strong>la</strong> concentration maximale admissible <strong>pour</strong> chaque pesticide, avec une limite de<br />
0,5 µg.L -1 <strong>pour</strong> <strong>la</strong> concentration totale en pesticides.<br />
La protection des milieux aquatiques vis à vis des produits phytosanitaires s’organise et s’appuie sur<br />
des lois telles qu’ en France, « <strong>la</strong> loi sur l’Eau » du 2 janvier 1992, qui oblige <strong>la</strong> création d’un périmètre<br />
de protection autour des sites de captage d’eau brute destinée à <strong>la</strong> consommation. Cette mesure<br />
préventive tend à limiter très nettement <strong>la</strong> présence de pesticides dans les eaux.<br />
De plus, en France, depuis le 1 er janvier 2000, le principe de pollueur-payeur est appliqué aux<br />
pollutions diffuses d’origine agricole par <strong>la</strong> création d’une « Pollutaxe » sur les produits<br />
phytosanitaires, dans le cadre de <strong>la</strong> Taxe générale sur les activités polluantes. Cette taxe a <strong>pour</strong> but<br />
d’inciter les industriels à développer des substances moins toxiques <strong>pour</strong> l’homme et l’environnement,<br />
et inciter les agriculteurs à choisir les produits les moins nocifs.<br />
Ces dernières années, les alertes à <strong>la</strong> pollution à l’atrazine se sont multipliées en France, dans de<br />
nombreuses communes de l’Ouest, du Sud-Ouest et dans 4 départements bretons, conduisant<br />
localement les maires à interdire <strong>la</strong> consommation d’eau pendant l’été 2000 et le mois d’avril 2001<br />
(source AFP, 2001).<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
9
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
En 2001, Jean G<strong>la</strong>vany, à l’époque ministre de l’Agriculture, saisissait <strong>la</strong> commission d’étude sur <strong>la</strong><br />
toxicité <strong>pour</strong> évaluer <strong>la</strong> pollution des eaux par les triazines. Le ministère soulignait alors <strong>la</strong> présence<br />
de plus en plus fréquente d’atrazine dans les eaux de surface mais également dans les eaux<br />
souterraines. Les bi<strong>la</strong>ns établis par l’Institut Français de l’Environnement (IFEN) sont inquiétants :<br />
En 2003, l’Institut Français de l’Environnement (IFEN) a publié un rapport a<strong>la</strong>rmant sur <strong>la</strong> qualité des<br />
eaux en France. 90% des points surveillés en rivières et 58% des points en eaux souterraines<br />
contiennent des pesticides (Noualhat, 2003). 5% de <strong>la</strong> popu<strong>la</strong>tion aurait été alimentée au robinet en<br />
2001 par une eau ayant dépassée au moins une fois <strong>la</strong> limite légale de 0,1 µg.L -1 . Le premier rapport<br />
de l’IFEN date de 1998. Déjà a<strong>la</strong>rmant, il avait eu <strong>pour</strong> conséquence, le <strong>la</strong>ncement en 2000 d’un p<strong>la</strong>n<br />
d’action <strong>pour</strong> <strong>la</strong> réduction des pollutions par les produits phytosanitaires, le P<strong>la</strong>n Phyto (voir aussi<br />
II.1.2). Le P<strong>la</strong>n Phyto a ainsi entraîné le retrait total de certaines substances du marché. C’est le cas<br />
de l’atrazine, herbicide du maïs retrouvé sur 5960 analyses, qui en septembre 2002, fut retiré du<br />
marché et interdit à l’utilisation en juin 2003, malgré les résultats optimistes de <strong>la</strong> commission des<br />
Toxiques du Ministère de l’Agriculture et de <strong>la</strong> Pêche, concluant le 3 mai 2003, à l’absence de danger<br />
<strong>pour</strong> <strong>la</strong> santé humaine.<br />
Au Portugal, en réponse aux nouvelles directives européennes (transposées en droit national à<br />
travers le Decreto-lei 74/90 du 7 mars et revu par le décret 236/98 du 1 er août), une <strong>la</strong>rge étude est<br />
engagée dans le cadre du programme portugais de protection de l’eau. Elle est menée par <strong>la</strong><br />
Direcção Geral dos Recursos e Aproveitamentos Hidráulicos (DGRAH) à travers le Réseau National<br />
de <strong>la</strong> Qualité de l’Eau (Rede Nacional de Qualidade da Água (RENQA). Cette étude menée entre<br />
1983 et 1999 montre <strong>la</strong> présence de nombreux pesticides et en particulier de l’atrazine aussi bien<br />
dans les rivières (concentration maximale de 0,63 µg.L -1 dans le Rio Tejo) que dans les eaux<br />
souterraines (concentration maximale de 29 µg.L -1 dans <strong>la</strong> région Ribatejo)(Cerejeira et al., 2003).<br />
I.1.2<br />
Programmes de maîtrise et de réduction des pollutions d’origine agricole<br />
En France, le gouvernement mène une politique globale d’intervention, comprenant, outre les aspects<br />
réglementaires et fiscaux, un programme national de réduction des pollutions par les produits<br />
phytosanitaires, <strong>la</strong>ncé en concertation avec l’ensemble des partenaires, tant professionnels<br />
qu’associatifs. Le ministère chargé de l’environnement porte son effort sur une meilleure<br />
connaissance de l’impact des pesticides sur les milieux aquatiques ainsi que sur le développement de<br />
solutions préventives et curatives les plus adaptées.<br />
A partir des études menées par l’Institut Français de l’Environnement (IFEN) et des études<br />
toxicologiques, l’impact environnemental des résidus de pesticides est évalué et les autorisations de<br />
mise sur le marché de certains produits sont remis en cause.<br />
Des solutions préventives et curatives ont <strong>pour</strong> objectif d’améliorer les pratiques des utilisateurs de<br />
produits agricoles :<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
10
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
• En 1993 les ministères chargés de l’agriculture et l’environnement ont é<strong>la</strong>boré en accord avec<br />
les organisations agricoles, un programme de maîtrise des pollutions d’origine agricole :<br />
le PMPOA. (Ministère de l’écologie et du développement durable, 2003)<br />
Les objectifs sont les suivants :<br />
- protéger les milieux aquatiques<br />
- conserver une agriculture dynamique<br />
Les principales pollutions des eaux d’origine agricole sont visées et tous les systèmes de<br />
production concernés (élevages et cultures).<br />
Les volets de ce programme sont :<br />
- les pollutions par les produits phytosanitaires,<br />
- les pollutions par les nitrates.<br />
• En août 2000, un programme de réduction des pollutions par les produits phytosanitaires (le<br />
P<strong>la</strong>n Phyto) prévoit sur le p<strong>la</strong>n national <strong>la</strong> mise en p<strong>la</strong>ce d’une filière de récupération des<br />
embal<strong>la</strong>ges de produits phytosanitaires, un renforcement des contrôles de l’utilisation de ces<br />
produits et le développement de techniques de protection des cultures alternatives. Cinq<br />
millions d’euros sont injectés chaque année par le ministère de l’Environnement dans ce<br />
programme, surtout chargé d’inciter les changements de pratiques parmi les utilisateurs<br />
(agriculteurs, particuliers ou services techniques). Parmi les mesures prises, <strong>la</strong> publication<br />
d’un livret « Pesticides, Mode d’emploi » par le ministère de l’agriculture et de <strong>la</strong> pêche,<br />
permet d’informer et d’orienter les utilisateurs. La lutte contre <strong>la</strong> pollution de l’eau par les<br />
produits phytosanitaires se fait donc à deux niveaux :<br />
- La prévention, qui vise à limiter l’émission abusive de ces micro-polluants<br />
notamment en informant les utilisateurs sur les bonnes démarches à suivre.<br />
- L’élimination de <strong>la</strong> pollution au niveau des unités de <strong>traitement</strong> de l’eau ; le<br />
<strong>traitement</strong> de nappes phréatiques fortement polluées est également évoqué.<br />
Un programme équivalent au Portugal, Programme de Protection intégrée ou de « Bonne pratique<br />
phytosanitaire » (« Boa Prática Fitossanitaria »), s’organise depuis 1994, visant à aider les<br />
agriculteurs à mettre en œuvre des pratiques agricoles plus respectueuses vis à vis de l’homme et de<br />
l’environnement. Ce programme porte essentiellement sur l’utilisation rationnelle et correcte des<br />
pesticides ; il tend à responsabiliser les utilisateurs de substances phytosanitaires.<br />
La mise en œuvre de politiques de réduction de l’utilisation des pesticides permettra de limiter <strong>la</strong><br />
dégradation, non seulement de <strong>la</strong> qualité de l’eau, mais aussi, et plus généralement, de<br />
l’environnement : <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradabilité lente de certains produits utilisés il y a une dizaine d’année, fait<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
11
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
que l’on trouve encore dans l’environnement, des traces de DDT, <strong>pour</strong>tant interdit en France depuis<br />
1972.<br />
I.2 Caractéristiques de l’atrazine<br />
I.2.1<br />
Généralités<br />
L’atrazine (2-chloro-4-ethy<strong>la</strong>mino-6isopropy<strong>la</strong>mino-1,3,5triazine) est un herbicide sélectif de <strong>la</strong> famille<br />
des s-triazines, <strong>la</strong>rgement utilisé depuis <strong>la</strong> fin des années 50 par les agriculteurs <strong>pour</strong> lutter contre les<br />
mauvaises herbes infestant les cultures de céréales, d’asperges, de cannes à sucre, d’ananas ainsi<br />
que les vignes. L’atrazine est, en outre, épandue comme herbicide total sur les routes, les voies<br />
publiques, les voies ferrées et les terrains non cultivés.<br />
L’atrazine a été introduit sur le marché en 1962 par <strong>la</strong> société J.R.Geigy (actuellement Novartis Crop<br />
Protection AG). C’est un herbicide de C<strong>la</strong>sse III (légèrement toxique) (selon <strong>la</strong> c<strong>la</strong>ssification de<br />
l’OMS), c<strong>la</strong>ssé comme pesticide restreint d’utilisation (RUP) dû à son fort potentiel de contamination<br />
des eaux souterraines (les RUP ne pouvant être utilisés que par des applicateurs certifiés).<br />
L’atrazine est une base faible (pKa de l’acide conjugué 1,64), peu soluble dans l’eau (30 mg.L -1 à<br />
20°C) avec un coefficient de partage Kow de 398. Les caractéristiques <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s de<br />
l’atrazine sont présentées au § II.1.1.1(1) du chapitre « <strong>Etude</strong> Expérimentale ».<br />
Elle fut commercialisée sous une centaine de noms différents : Aatrex (USA - Novartis), Primextra<br />
(Europe – Novartis), Mebazine (Rhône-Poulenc), Vectal (AgrEvo), Gesaprim (Europe – Novartis),<br />
Atrazol (Sipcam),…<br />
I.2.2<br />
Mode d’utilisation et mode d’action de l’atrazine<br />
La France utilisait ces dernières années environ 100000 tones de pesticide par an, ce qui <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ce au<br />
deuxième rang des utilisateurs mondiaux, derrière les Etats Unis. En 2001 l’atrazine était autorisée en<br />
France à une dose maximale de 600 à 650 g de substance active par hectare.<br />
On <strong>la</strong> trouve sous différentes formes : poudre mouil<strong>la</strong>ble, en suspension, en granulés, en solution<br />
avec des teneurs variables en matière active selon les formu<strong>la</strong>tions.<br />
L’atrazine est principalement employée comme herbicide systémique, et le plus souvent, utilisée au<br />
stade de pré-levée, c’est à dire peu après le semis, et avant le développement des adventices. Le<br />
désherbage (lutte contre <strong>la</strong> flore adventice) d’une culture est possible grâce à <strong>la</strong> sélectivité de cette<br />
culture vis à vis des molécules herbicides. Ainsi, certaines p<strong>la</strong>ntes comme le maïs sont capables de<br />
métaboliser les molécules d’atrazine.<br />
12<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
Parmi les mécanismes de métabolisation (Tissut et al., 1992), on peut retenir :<br />
La formation de benzoxadine dans <strong>la</strong> sève au niveau racinaire.<br />
La conjugaison au niveau des parties aériennes avec le glutathion <strong>pour</strong> donner un dérivé<br />
inactif.<br />
La N-déalky<strong>la</strong>tion enzymatique.<br />
Chez le maïs, <strong>la</strong> résistance à l’atrazine est attribuée à une rapide détoxification, par conjugaison au<br />
glutathion, sous l’effet de transferases.<br />
Dans <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte cible, l’atrazine inhibe rapidement le transport d’électrons lors de <strong>la</strong> photosynthèse,<br />
stoppant totalement <strong>la</strong> croissance de celle-ci.<br />
Le transfert de l’herbicide vers <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte se fait par l’eau du sol ; <strong>pour</strong> un <strong>traitement</strong> efficace, une<br />
concentration minimale de 10 µg.L -1 dans l’eau du sol est requise, et doit être maintenue pendant les<br />
deux premiers mois qui suivent le <strong>traitement</strong> (Tissut & Severin, 1984).<br />
Il peut arriver que des p<strong>la</strong>ntes adventices parviennent à développer des résistances aux herbicides<br />
par mutation génique. Il est alors nécessaire de changer de type d’herbicide.<br />
Désormais totalement interdite d’utilisation dans plusieurs pays européens, dont <strong>la</strong> France, l’Italie, les<br />
pays Bas ou l’Allemagne, l’atrazine n’a pas vu son autorisation renouvelée par l’Union européenne<br />
(Décision de <strong>la</strong> commission 2004/248/CE) et les agriculteurs sont à l’affût de solutions alternatives.<br />
« Aucune des nouvelles matières actives homologuées n'est aussi polyvalente que l'atrazine, mais de<br />
nombreuses formules permettent, dans des situations données, de diminuer les doses d'atrazine,<br />
voire de les supprimer, lorsque ce<strong>la</strong> sera nécessaire », constate l'AGPM Technique (L’Association<br />
Générale des Producteurs de Maïs).<br />
En effet, <strong>la</strong> présence généralisée dans l’eau de traces d’atrazine et de ses produits dérivés<br />
nécessitent, encore aujourd’hui, <strong>la</strong> mise en p<strong>la</strong>ce de <strong>traitement</strong> spécifiques. D’autre part, l’observation<br />
d’une efficacité de moins en moins avérée de l’atrazine, liée entre autre à l’apparition de phénomènes<br />
de résistance de certaines mauvaises herbe explique l’interdiction de celle-ci sur le marché européen.<br />
Le Portugal comme l’Espagne, le Royaume Uni ou l’Ir<strong>la</strong>nde bénéficient exceptionnellement d’une<br />
autorisation <strong>pour</strong> un usage spécifique de produits phytosanitaires contenant de l’atrazine jusqu’au 30<br />
juin 2007 (Décision de <strong>la</strong> Commission du 10 mars 2004 concernant <strong>la</strong> non-inscritpion de l’atrazine à<br />
l’annexe I de <strong>la</strong> Directive 91/414/CEE du Conseil et le retrait des autorisations accordées aux produits<br />
phytopharmaceutiques contenant cette substance active ; 2004/248/CE)<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
13
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
I.2.3<br />
Aspects Toxicologiques<br />
C’est le manque de sélectivité des pesticides vis-à-vis de leur cible qui provoque <strong>la</strong> plupart des effets<br />
nocifs <strong>pour</strong> l’environnement. Les animaux absorbent les pesticides via <strong>la</strong> nourriture ou l’eau, via l’air<br />
respiré ou au travers de leur peau. Ayant franchi diverses barrières naturelles, le toxique peut<br />
perturber certaines réactions métaboliques. On utilise habituellement <strong>pour</strong> estimer <strong>la</strong> toxicité d’une<br />
substance <strong>chimique</strong>, <strong>la</strong> dose (ou concentration) qui provoque un effet particulier chez <strong>la</strong> moitié de <strong>la</strong><br />
popu<strong>la</strong>tion soumise au toxique (DE50 ou CE50). Si cet effet est <strong>la</strong> mort, on parle de dose (ou<br />
concentration) létale (DL50 ou CL50). La dose maximale sans effet (DMSE) est <strong>la</strong> dose<br />
immédiatement inférieure à celle qui provoque le moindre effet dans <strong>la</strong> même épreuve expérimentale<br />
(Severn et Bal<strong>la</strong>rd, 1990).<br />
Si le coefficient de partage octanol-eau d’un composé est élevé et <strong>la</strong> vitesse de dégradation faible, <strong>la</strong><br />
substance s’accumulera à des concentrations croissantes dans les organismes se succédant le long<br />
de <strong>la</strong> chaîne trophique. C’est ce qu’on appelle <strong>la</strong> <strong>bio</strong>accumu<strong>la</strong>tion (<strong>bio</strong>magnification, Cooper, 1991).<br />
Pour les substances liposolubles comme certains pesticides, <strong>la</strong> <strong>bio</strong>accumu<strong>la</strong>tion dépend donc du<br />
coefficient de partage octanol-eau K ow (K ow = 398 <strong>pour</strong> l’atrazine).<br />
La toxicité aiguë de l’atrazine chez les mammifères est très faible. En raison de sa faible solubilité, il<br />
ne se produit pas de résorption cutanée. Elle est très facilement résorbée après injection orale et plus<br />
de 50% des quantités ingérées sont éliminées par l’urine en l’espace de 24h. Dans les expériences<br />
sur l’animal, aucun effet mutagène ou tératogène n’a été observé.<br />
Pour l’atrazine comme <strong>pour</strong> d’autres pesticides, l’Organisation Mondiale de <strong>la</strong> Santé (OMS) a publié<br />
en 1994 une liste qui donne les valeurs guides <strong>pour</strong> chacun des pesticides. La consommation<br />
quotidienne pendant toute une vie d’une eau potable contenant cette concentration guide, serait sans<br />
conséquence <strong>pour</strong> <strong>la</strong> santé humaine. Ainsi, l’OMS annonce une valeur guide de 2 µg.L -1 <strong>pour</strong><br />
l’atrazine dans les eaux de boisson.<br />
A titre indicatif, le Tableau 1 donne quelques valeurs de DL50 de l’atrazine <strong>pour</strong> différents types<br />
d’animaux vis à vis de l’atrazine.<br />
Tableau 1 : Toxicité de l’atrazine ; DL50 par voie orale sur quelques animaux (Trotter et al., 1990)<br />
Animal Rats Souris Lapins Hamsters Canards Oiseaux<br />
DL 50 (mg/kg) 672-3000 850-1750 750 1000 >2000 >10000<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
14
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
I.3 Dispersion des herbicides dans l’environnement<br />
I.3.1<br />
Introduction<br />
Dans les années 40, les premiers pesticides sont apparus sur le marché, avec des résultats très<br />
positifs quant à l’augmentation des rendements agricoles. Vingt ans plus tard, les premières<br />
accusations d’atteinte à <strong>la</strong> santé publique et à l’environnement commençaient à se faire entendre<br />
(Carson, 1962).<br />
On estime aujourd’hui que 2,5 millions de tonnes de pesticides sont appliqués chaque année sur les<br />
cultures de <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nète. La part qui entre en contact avec les organismes cibles – ou qui est intergrée –<br />
est minime. La plupart des chercheurs l’évaluent à moins de 0,3%, ce qui veut dire que 99,7% des<br />
substances déversées s’en vont « ailleurs » (Pimentel, 1995).<br />
Depuis <strong>la</strong> fin des années 70, l’agriculture intégrée à permis de réduire les intrants comme les engrais<br />
ou les produits phytosanitaires issus de <strong>la</strong> chimie (Hol<strong>la</strong>nd, 1994). Aujourd’hui, on est en mesure<br />
d’informer l’agriculteur sur l’impact environnemental d’un <strong>traitement</strong>. L’impact d’un pesticide dépend<br />
du degré d’exposition, résultant de sa dispersion et de sa concentration dans l’environnement, et de<br />
ses caractéristiques toxicologiques (Serven et Bal<strong>la</strong>rd 1990 ; Emans et al. 1992).<br />
Depuis une dizaine d’années, les caractéristiques <strong>chimique</strong>s des pesticides ont radicalement évolué ;<br />
de produits extrêmement peu solubles dans l’eau, fortement adsorbés (très hydrophobes, coefficient<br />
de partage élevé), et non mobiles, nous sommes passés à une génération de pesticides plus solubles<br />
et peu mobilisables (plus hydrophiles, coefficient de partage plus faible) et par conséquent plus<br />
mobiles (Carsel & Smith ; 1987). Cette évolution a eu lieu suite à une prise de conscience des<br />
problèmes environnementaux (<strong>bio</strong>accumu<strong>la</strong>tion et magnification) causés par <strong>la</strong> présence de ces<br />
produits phytosanitaires et de ce fait à l’apparition d’organismes résistants (insectes, microorganismes<br />
ou p<strong>la</strong>ntes) vis à vis des pesticides chlorés.<br />
Les propriétés des pesticides ainsi que <strong>la</strong> quantité appliquée déterminent leur devenir après<br />
application au champ. La vo<strong>la</strong>tilité, l’hydrosolubilité et les phénomènes d’adsorption vont déterminer <strong>la</strong><br />
distribution re<strong>la</strong>tive du pesticide entre <strong>la</strong> phase vapeur (vo<strong>la</strong>tilisation et évapotranspiration), <strong>la</strong> phase<br />
liquide (dissolution) et les surfaces solides (fixation sur particules de sol, racines, microorganismes…).<br />
Ainsi <strong>la</strong> persistance d’un pesticide dans un sol va dépendre directement de ses<br />
propriétés <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s et de celles du sol. Un composé persistant va être difficilement<br />
hydrolysable, faiblement <strong>bio</strong>dégradable, avec une constante de vo<strong>la</strong>tilisation (ou constante de Henry)<br />
faible et un fort coefficient de partage. Il va ainsi limiter <strong>la</strong> contamination des eaux souterraines ou de<br />
surface (Carsel & Smith ; 1987) mais augmenter les risques d’adaptation d’organismes résistants et<br />
de <strong>bio</strong>-accumu<strong>la</strong>tion.<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
15
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
I.3.2<br />
Devenir dans le sol<br />
Lors de l’application d’un produit phytosanitaire, <strong>la</strong> substance active va se répartir, dans des<br />
proportions variant avec le stade de <strong>la</strong> culture, <strong>la</strong> formu<strong>la</strong>tion du produit, <strong>la</strong> cible, <strong>la</strong> technique<br />
d’application (liquide pulvérisé, incorporation au sol, dépôt de granulés…)et les conditions<br />
météorologiques, entre le sol, le feuil<strong>la</strong>ge de <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nte ou les résidus de culture, et les pertes dues à <strong>la</strong><br />
« dérive » (entraînement par le vent).<br />
Dès qu’ils atteignent le sol, les pesticides sont soit dégradés (<strong>chimique</strong>ment ou <strong>bio</strong>logiquement), soit<br />
dispersés, soit retenus. Les matières actives peuvent se vo<strong>la</strong>tiliser, ruisseler ou être lessivées et<br />
atteindre les eaux de surfaces environnantes ou les eaux souterraines. Elles peuvent également être<br />
adsorbées par les particules du sol, les p<strong>la</strong>ntes ou des organismes du sol.<br />
Les processus suivants déterminent les différents comportements des pesticides dans les sols (Figure<br />
1) :<br />
• Dégradation par les micro-organismes<br />
• Dégradation <strong>chimique</strong> (hydrolyse, oxydation, photodégradation…)<br />
• Rétention par des composants organiques et minéraux du sol<br />
• Adsorption par les racines des p<strong>la</strong>ntes<br />
• Vo<strong>la</strong>tilisation<br />
• Effet de dilution par les mouvements de l’eau<br />
• Adsorption par certains végétaux<br />
UV<br />
Vo<strong>la</strong>tilisation<br />
Photodégradation<br />
Adsorption<br />
Rétention<br />
C 8 H 14<br />
C H ON C ClN 5<br />
H ON ...<br />
5 → C 8 H 815 ON 15 5 → 5 C 6 H 116 ON 11 5 → … 5<br />
Dégradation<br />
<strong>bio</strong>logique<br />
Dégradation<br />
<strong>chimique</strong><br />
Dilution<br />
Ruissellement ou lixiviation<br />
Figure 1 : Comportement des pesticides dans les sols<br />
16<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
Le devenir des pesticides dans les sols est directement lié à <strong>la</strong> notion de persistance. La persistance<br />
est définie par le temps de résidence d’un composé dans un compartiment défini (Greenhalgh, 1986).<br />
La persistance d’un pesticide dépend des caractéristiques des cultures (morphologie, phase de<br />
croissance au moment du <strong>traitement</strong>, taux de croissance, caractéristiques des cuticules), des<br />
propriétés du pesticide (constante de Henry, solubilité, potentialité à subir des transformations<br />
<strong>chimique</strong>s, physiques ou <strong>bio</strong>logiques), des conditions environnementales (intensité des pluies, durée<br />
et fréquence ; vitesse du vent ; humidité ; température ; intensité de <strong>la</strong> lumière ; nébulosité) et des<br />
conditions d’applications (Himel et al., 1990).<br />
Sirons et al. (1982) expriment <strong>la</strong> persistance de certains pesticides dans les p<strong>la</strong>ntes par <strong>la</strong> re<strong>la</strong>tion<br />
suivante :<br />
C= k(a * b * log t)<br />
où :<br />
- k : taux de disparition<br />
- t : le temps après application<br />
- a et b des coefficients.<br />
Pour un herbicide, on peut en réalité distinguer trois formes de persistance (Heydel, 1998) :<br />
- La persistance agronomique : temps durant lequel un effet phytotoxique est<br />
observable sur les p<strong>la</strong>ntes sensibles.<br />
- La persistance <strong>bio</strong>logique : temps au cours duquel un effet est observable sur les<br />
organismes vivants du sol.<br />
- La persistance <strong>chimique</strong> : temps qui s’écoule entre le <strong>traitement</strong> et celui où<br />
l’herbicide ne peut plus être détecté dans le sol, sans préjugé des voies de<br />
disparition.<br />
I.3.2.1<br />
Rétention des pesticides dans le sol<br />
La rétention englobe les processus d’adsorption sur le sol lui-même, sur les micro-organismes du sol<br />
ainsi que sur les p<strong>la</strong>ntes. La rétention contrôle, et est contrôlée par des procédés de transformation<br />
<strong>chimique</strong> ou <strong>bio</strong>logique ; elle influence les transports du pesticide vers l’atmosphère, les eaux de<br />
surface ou les eaux souterraines (Himel et al., 1990).<br />
Elle est l’un des principaux facteurs responsables de l’efficacité d’un pesticide et a été <strong>la</strong>rgement<br />
étudiée au cours de ces trente dernières années (Hamaker & Thompson, 1972 ; Yamane et Green ,<br />
1972 ; Weber et al., 1974 ; Calvet, 1989).<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
17
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
L’adsorption correspond à <strong>la</strong> rétention d’un composé à l’interface sol-eau ou sol-air (Calvet, 1989).<br />
L’adsorption/désorption est un processus dynamique au cours duquel les molécules sont<br />
continuellement en équilibre entre <strong>la</strong> phase solide et <strong>la</strong> phase liquide (ou gazeuse).<br />
Le phénomène d’adsorption est directement lié aux caractéristiques de <strong>la</strong> molécule et à celles de<br />
l’adsorbant. Différentes interactions ou liaisons peuvent s’établir entre une molécule organique et un<br />
support d’adsorption ; il peut s’agir de forces de van der Waals, de liaisons hydrogène, d’interactions<br />
dipôle-dipôle, de liaisons ioniques, liaisons covalentes ou d’effet de protonation (Himel et al., 1990).<br />
On peut également rencontrer des interactions hydrophobes (Chiou et al., 1979).<br />
I.3.2.1.1<br />
Facteurs de l’adsorption<br />
(a) Propriétés des molécules de pesticide<br />
Les propriétés molécu<strong>la</strong>ires du pesticide jouent un rôle important dans les phénomènes<br />
d’adsorption. Quatre propriétés sont déterminantes (Calvet et al., 1980) :<br />
• le structure électronique de <strong>la</strong> molécule<br />
• l’aptitude à être ionisée<br />
• le volume molécu<strong>la</strong>ire<br />
• <strong>la</strong> solvatation des molécules par l’eau ou les solvants organiques<br />
Dans le cas de structures covalentes comme l’atrazine, il faut tenir compte de <strong>la</strong> répartition et de <strong>la</strong><br />
mobilité des charges (po<strong>la</strong>rité). L’atrazine possède un moment dipo<strong>la</strong>ire de 4,63.10 -18 ues. (plus po<strong>la</strong>ire<br />
que l’eau (µ=1,85.10 -18 ues))<br />
L’atrazine est une base faible (pKa de l’acide conjugué 1,68) (Calvet et al., 1980). Dans un sol<br />
agricole (pH 4-8,5) l’atrazine n’est pas ionisée, ce qui exclut les phénomènes d’adsorption ionique. La<br />
solubilité des bases faibles augmente quand l’acidité du milieu s’accroît ; dans le cas des triazines,<br />
Yamane et Green (1972) ont décrit cet effet par une re<strong>la</strong>tion simple :<br />
S= Si [1 + 10 (pKa – pH) ]<br />
où Si est <strong>la</strong> solubilité de <strong>la</strong> molécule non ionisée (30 mg.L -1 à 20°C <strong>pour</strong> l’atrazine).<br />
(b) Propriétés des matériaux adsorbants du sol<br />
Les propriétés des matériaux adsorbants sont complémentaires des propriétés molécu<strong>la</strong>ires et<br />
contribuent en partie à déterminer <strong>la</strong> nature des liaisons entre les molécules de pesticides et <strong>la</strong><br />
surface de l’adsorbant.<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
18
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
L’adsorption va dépendre de <strong>la</strong> composition du sol et de sa teneur en minéraux (argile, oxydes,<br />
hydroxydes et allophanes (aluminosilicates hydratés)) et de sa composition en constituants<br />
organiques. Elle dépendra également des paramètres <strong>physico</strong><strong>chimique</strong>s du sol en question.<br />
Les argiles présentent des propriétés d’échange d’ions importantes, dues à <strong>la</strong> présence de charges<br />
positives à leur surface. Des travaux ont montré que les propriétés d’adsorption des argiles<br />
provenaient très souvent de <strong>la</strong> présence d’hydroxydes amorphes sur ces surfaces (Calvet et al.,<br />
1980). Tercé et Calvet (1978) ont déterminé <strong>pour</strong> l’atrazine, les constantes de l’isotherme d’adsorption<br />
de Freundlich sur une montmorillonite (n f = 0,78 et Kf = 65) et une illite (n f = 0,35 et Kf = 7,2).<br />
Tandis que <strong>la</strong> présence d’oxydes et d’hydroxydes cristallisés dans les sols joue un rôle minime<br />
dans les phénomènes d’adsorption des bases faibles comme l’atrazine (Tercé et Calvet, 1975), les<br />
hydroxydes libres présentent quant à eux une grande capacité d’adsorption en raison de leur aire de<br />
surface élevée (400-800 m 2 /g) et de <strong>la</strong> présence de nombreux groupes hydroxyles (sites potentiel de<br />
liaison hydrogène) (Calvet et al., 1980).<br />
Les allophanes (aluminosilicates hydratés) possèdent une aire de surface élevée (environ 500 m 2 /g)<br />
et des charges positives ou négatives leur confèrent des propriétés d’échange d’ions.<br />
La teneur en matière organique (MO) est un indice essentiel dans l’adsorption des pesticides dans le<br />
sol. De manière générale, l’adsorption des pesticides est significativement plus importante <strong>pour</strong> les<br />
sols dont <strong>la</strong> teneur en carbone organique est <strong>la</strong> plus forte (Calvet et al., 1980). Celle-ci est<br />
essentiellement responsable de <strong>la</strong> rétention des matières actives non ioniques.<br />
Dans le cas d’un sol, il est parfois difficile d’établir une re<strong>la</strong>tion étroite entre les coefficients K d et le<br />
teneur en MO. La constante normalisée K oc (coefficient de distribution carbone organique/eau, en<br />
dm 3 .kg -1 ) est définie par <strong>la</strong> re<strong>la</strong>tion suivante<br />
K = oc<br />
K d<br />
.100<br />
%CO<br />
où K d (le coefficient de partage sol-eau) exprime le degré d’adsorption du pesticide dans le sol et<br />
%CO est le <strong>pour</strong>centage de carbone organique du sol considéré (Leonard 1990) ; K oc rend compte de<br />
<strong>la</strong> mobilité du pesticide.<br />
Par rapport au K d , le K oc ainsi déterminé, permet une meilleure appréciation <strong>pour</strong> différents types de<br />
sol. Si <strong>la</strong> matière organique est le principal adsorbant qui intervient dans les sols, le K oc devient un<br />
indice caractéristique de <strong>la</strong> molécule de pesticide <strong>pour</strong> ce type de sol.<br />
Les différentes études d’adsorption de l’atrazine, ont montré une grande variabilité du K oc en fonction<br />
des sols, pouvant aller d’environ 100 l/kg (Gustafson, 1989 ; Wauchope et al. (1992)) à 1680 l/kg <strong>pour</strong><br />
Roy et Krapac (1994). La constante K oc varie également en fonction de <strong>la</strong> profondeur du sol. De <strong>la</strong><br />
19<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
même façon les études de Barriuso et al. (1994) montrent qu’il existe une variation du coefficient<br />
d’adsorption K d de l’atrazine en fonction de <strong>la</strong> profondeur du sol.<br />
(c) Influence des paramètres <strong>physico</strong><strong>chimique</strong>s du sol<br />
D’une façon générale, <strong>la</strong> protonation d’un composé, imposée par ou contrô<strong>la</strong>nt le pH environnant, va<br />
favoriser son adsorption dans un sol (Wang et al., 1991 ; De<strong>la</strong>ge, 1995 ; C<strong>la</strong>y et al., 1988).<br />
L’adsorption des formes protonées se fait au niveau des sites chargés négativement (argiles ou MO<br />
tels que les substances humiques). La Figure 2 montre l’évolution de <strong>la</strong> capacité d’adsorption de<br />
l’atrazine en présence d’acides humique (0,4 g.L -1 ) en fonction du pH.<br />
Binding capac ity of At. (x 10 3 M/ g<br />
Atrazine adsorbée (x 10 3 M.g -1 AH)<br />
HA)<br />
1,6<br />
1,4<br />
1,2<br />
1,0<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,0<br />
0 2 4 6 8<br />
pH<br />
Figure 2 : Evolution de <strong>la</strong> capacité d’adsorption de l’atrazine sur les acides humiques (AH) (0,4 g/L) en<br />
fonction du pH, d’après Wang et al. (1991)<br />
Weber (1966) en étudiant l’adsorption des triazines par <strong>la</strong> Montmorillonite, a montré que <strong>la</strong> rétention<br />
était maximale <strong>pour</strong> des pH voisins du pKa des molécules en question.<br />
Pour les triazines, qui sont des bases faibles, <strong>la</strong> protonation a lieu a des pH très acides (pKa = 1,6<br />
<strong>pour</strong> l’acide conjugué de l’atrazine). Les valeurs de pH rencontrées <strong>pour</strong> les sols (4,5 à 8,5 (Calvet et<br />
al. 1980)) sont en général supérieures à celle du pKa des triazines ; ainsi, le <strong>pour</strong>centage de <strong>la</strong> forme<br />
protonée <strong>pour</strong> l’atrazine est très faible. On peut donc penser que les variations de pH n’auront qu’une<br />
faible influence sur l’adsorption de l’atrazine dans les sols.<br />
La solubilité d’un composé est fonction de <strong>la</strong> température du milieu, de <strong>la</strong> pression de vapeur mais<br />
aussi de l’excitation molécu<strong>la</strong>ire. La solubilité augmente souvent avec <strong>la</strong> température, et l’adsorption<br />
<strong>chimique</strong> étant un phénomène exothermique, elle doit théoriquement diminuer lorsque <strong>la</strong> température<br />
augmente. Ainsi Schiavon (1980) et Montiel (1990) confirment cette hypothèse. Ba<strong>la</strong>yannis (1988)<br />
constate que l’augmentation de température de 3°C à 27°C, entraîne une diminution des coefficients<br />
d’adsorption de l’atrazine (respectivement 26,2 et 12,4 g.kg -1 ) dans un sol limoneux. Cependant,<br />
20<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
Calvet et al. (1980) ont observé après de nombreuses études, que l’élévation de température<br />
conduisait à une promotion de l’adsorption sur le sol en présence de matière organique (acides<br />
humiques) et à une diminution ou à un effet nul dans le cas d’une adsorption sur les argiles. Avant<br />
eux, Dunigan et Mc Intosh (1971) avaient également constaté que l’affinité des acides humiques <strong>pour</strong><br />
l’atrazine augmentait en même temps que <strong>la</strong> température. Ceci peut s’expliquer par le fait que<br />
l’agitation molécu<strong>la</strong>ire augmentant avec <strong>la</strong> température, <strong>la</strong> probabilité de choc est multipliée et<br />
l’adsorption favorisée.<br />
La force ionique peut influencer l’adsorption de certains pesticides sur les sols. Calvet (1980) et<br />
Schiavon (1980) mentionnent ainsi que l’adsorption des triazines augmente en même temps que <strong>la</strong><br />
force ionique.<br />
Une variation de l’état d’hydratation peut modifier l’agrégation de l’adsorbant et augmenter ou<br />
diminuer les surfaces accessibles aux molécules de soluté (Calvet et al., 1980). Ainsi, Calvet et Tercé<br />
(1975) ont observé que <strong>la</strong> quantité d’atrazine adsorbée par <strong>la</strong> Montmorillonite calcique augmente<br />
quand <strong>la</strong> teneur en eau diminue. Cette augmentation est attribuée à l’effet de l’acidité de <strong>la</strong> surface de<br />
l’argile qui est moins neutralisée dans les échantillons à faibles teneurs en eau.<br />
I.3.2.1.2<br />
Formation de résidus liés<br />
On appelle résidus liés (ou « non extractibles ») les résidus adsorbés de façon irréversible par les<br />
constituants du sol et qui ne peuvent par conséquent pas être extraits par les méthodes c<strong>la</strong>ssiques<br />
d’extraction (solvants organiques ou solutions aqueuses, extractions à chaud, agitation…). Ces<br />
résidus comprennent aussi bien les molécules mères que leurs produits de dégradation. D’une<br />
manière générale, <strong>la</strong> quantité de résidus liés augmente avec le temps de contact entre <strong>la</strong> molécule<br />
active et le milieu adsorbant, diminuant ainsi <strong>la</strong> <strong>bio</strong>disponibilité de ces molécules vis à vis des microorganismes<br />
et par là même, <strong>la</strong> dégradation <strong>bio</strong>logique du pesticide.<br />
La formation de résidus non extractibles (RNE) peut également être <strong>la</strong> conséquence d’une<br />
incorporation <strong>bio</strong>logique : rétention du pesticide par les p<strong>la</strong>ntes ou les micro-organismes du sol (Calvet<br />
et Barriuso, 1994).<br />
Les taux de RNE <strong>pour</strong> l’atrazine varient entre 23 et 47% de <strong>la</strong> dose appliquée sur un sol limoneux ou<br />
argileux en conditions naturelles, avec un maximum de RNE observé après 180 jours d’incubation<br />
(Schiavon et al. 1990).<br />
Les études de Stolpe et Schea (1995) montent qu’un sol traité à l’atrazine et incubé à 22°C présente<br />
après 120 jours 46% de résidus liés dans les 15 cm supérieurs du sol, et seulement 3% de RNE au<br />
niveau des couches plus profondes (150 à 240 cm).<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
21
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
I.3.2.2<br />
Dégradation des pesticides dans le sol<br />
Les pertes de pesticides dans le sol, du fait de <strong>la</strong> présence de micro-organismes ou de réactions<br />
<strong>chimique</strong>s, sont confondues sous le vocable de dégradation.<br />
La dégradation est un processus essentiel entraînant <strong>la</strong> disparition du produit par sa transformation et<br />
influant sur <strong>la</strong> persistance et les possibilités de contamination. Ce processus peut entraîner <strong>la</strong><br />
dégradation totale du pesticide ou simplement former des produits de dégradation intermédiaires.<br />
La cinétique de dégradation est souvent bien décrite par une loi exponentielle, traduisant le fait que <strong>la</strong><br />
quantité dégradée par unité de temps est proportionnelle à <strong>la</strong> quantité restante (cinétique de 1 er<br />
ordre) ; cette hypothèse est admise quel que soit le processus de dégradation, <strong>bio</strong>tique ou a<strong>bio</strong>tique.<br />
La vitesse de dégradation est indiquée par le temps de demi-vie de <strong>la</strong> substance (DT50 ou t 1/2 ) (van<br />
der Werf, 1997). Le temps de demi-vie rend compte de <strong>la</strong> persistance d’un pesticide dans le sol et<br />
exprime le temps au bout duquel 50% du produit appliqué au le sol a été dégradé. Elle varie en<br />
fonction de <strong>la</strong> substance active elle-même (propriété <strong>chimique</strong>, persistance, solubilité…), du sol dans<br />
lequel elle se trouve (paramètres <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s, composition,…) et des interactions entre eux ; <strong>la</strong><br />
vitesse de dégradation influe donc sur <strong>la</strong> persistance et <strong>la</strong> disponibilité du produit en question dans le<br />
sol.<br />
Le processus de dégradation d’un pesticide dans un sol, qu’il soit <strong>chimique</strong> ou <strong>bio</strong>logique est<br />
indissociable des notions de persistance et de disponibilité (ou <strong>bio</strong>disponibilité).<br />
La constante de vitesse de dégradation k, et le temps de demi-vie sont les deux paramètres qui<br />
permettent de caractériser une cinétique de dégradation.<br />
Dans le cas de l’atrazine, l’augmentation du pH du sol entraîne une augmentation du temps de demivie<br />
(Walker et al., 1983).<br />
Ainsi comme montre le Tableau 2, les temps de demi-vie de l’atrazine peuvent varier de 14 à 248<br />
jours suivant les conditions et le type de sol.<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
22
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
Tableau 2 : Exemples de temps de demi-vie de l’atrazine dans différents sols<br />
Temps demi-vie (j) Type de sol, pH, T Références<br />
55 Limoneux Weed et al. 1995<br />
46 Sable limoneux Lafrance et Banton 1995<br />
57 et 131 Sableux pH 4,7 et 6,5 Walker et B<strong>la</strong>cklow 1994<br />
30, 32 et 16 Sable, limoneux, lim-argileux Topp et al. 1994<br />
36 ± 6 Sable limoneux Gish et al. 1994<br />
50 à 120 25 sols différents Reinhardt et Nel 1993<br />
11-27<br />
22°C (0-15 cm)<br />
Stolpe et Shea 1995<br />
107-248<br />
81-160<br />
(45-120 cm)<br />
(150-240 cm)<br />
14, 28 35°C, 25°C Walker et Zimdahl 1981<br />
59 - Lafrance et al. 1992<br />
60 à 73 Helling et al. 1988<br />
64 - Jury et al. 1987<br />
35 - Rao et Davidson 1982<br />
I.3.2.2.1<br />
Dégradation a<strong>bio</strong>tique<br />
Des phénomènes <strong>chimique</strong>s peuvent conduire à une transformation dans le sol des substances<br />
actives.<br />
La photo-décomposition sous l’effet de rayonnements ultra-violets est l’une des voies de dégradation<br />
a<strong>bio</strong>tique (Pelizzetti et al., 1990). La photo-décomposition de l’atrazine conduit à <strong>la</strong> formation<br />
d’hydroxyatrazine et de dérivés déalkylés (Pelizzetti et al., 1990).<br />
Ce processus de dégradation, qui peut avoir lieu à <strong>la</strong> surface du sol, dans l’air ou dans les eaux de<br />
surface, est d’intensité re<strong>la</strong>tivement faible <strong>pour</strong> l’atrazine par rapport aux autres voies de dégradation,<br />
surtout sous un climat tempéré (Heydel, 1998).<br />
L’hydrolyse de l’atrazine en son dérivé hydroxylé est <strong>la</strong> principale voie de dégradation <strong>chimique</strong> de cet<br />
herbicide (Armstrong et al. 1967 ; Li et Felbeck, 1972 ; Nearpas, 1972 ; Plust et al., 1981) ; celle-ci a<br />
lieu essentiellement dans les premiers centimètres du sol et aboutit principalement à <strong>la</strong> formation<br />
d’hydroxyatrazine.<br />
Une étude de Plust et al. (1981) montre que <strong>la</strong> réaction d’hydrolyse est d’ordre 1 (réaction de<br />
protonation) et a permis d’élucider les paramètres catalytiques et énergétiques de cette réaction. En<br />
milieu acide, le mécanisme proposé se compose des étapes suivantes :<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
23
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
1° Protonation du cycle (réaction d’ordre 1) :<br />
Cl<br />
Cl<br />
N<br />
N<br />
K a1<br />
N<br />
N<br />
C H 3<br />
NH<br />
N<br />
NH<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
+ H+ N<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
C H 3<br />
NH<br />
H<br />
+<br />
NH<br />
2° Réaction de l’entité protonée avec une molécule d’eau :<br />
Cl<br />
OH<br />
C H 3<br />
NH<br />
N<br />
+<br />
N<br />
H<br />
N<br />
NH<br />
CH 3<br />
CH 3 + H 2<br />
O<br />
k 1<br />
C H 3<br />
NH<br />
N<br />
N<br />
N<br />
NH<br />
CH 3<br />
+ 2 H + Cl<br />
+<br />
-<br />
CH 3<br />
Dans le sol, <strong>la</strong> matière organique constitue <strong>la</strong> principale source de protons : en particulier les acides<br />
humiques et les acides fulviques (Li et Felbeck, 1972 ; Gamble et Kahn, 1985)<br />
I.3.2.2.2<br />
Dégradation <strong>bio</strong>logique<br />
La dégradation <strong>bio</strong>logique est <strong>la</strong> conséquence de <strong>la</strong> présence de certains micro-organismes (bactéries<br />
et champignons essentiellement) dans les sols (Skipper et al. 1967 ; Migrain et al., 1993). Elle est<br />
considérée comme <strong>la</strong> voie principale de dissipation des pesticides dans les sols (Bol<strong>la</strong>g and Liu, 1990)<br />
et dépend de nombreux facteurs (structure <strong>chimique</strong>, type de sol, texture, teneur en MO, pH,<br />
température, humidité…).<br />
La densité de <strong>la</strong> popu<strong>la</strong>tion des micro-organismes diminuant avec <strong>la</strong> profondeur du sol, on observe<br />
une diminution de <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation dans les couches profondes, <strong>la</strong> dégradation a<strong>bio</strong>tique devenant<br />
alors prépondérante.<br />
La matière organique du sol a une influence capitale sur les phénomènes de <strong>bio</strong>dégradation : sa<br />
présence dans le sol va favoriser <strong>la</strong> rétention des pesticides, diminuant <strong>la</strong> <strong>bio</strong>disponibilité de ces<br />
derniers vis à vis de <strong>la</strong> micro-flore. Pen revanche, <strong>la</strong> présence de matière organique dans le sol va<br />
être synonyme de forte activité microbienne.<br />
Le pH du sol joue également un rôle important puisqu’il va favoriser une dégradation <strong>bio</strong>logique <strong>pour</strong><br />
des pH al<strong>la</strong>nt de 5,5 à 8, ou plutôt influencer <strong>la</strong> dégradation vers une voie <strong>chimique</strong> (hydrolyse par<br />
exemple) dans un sol acide (
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
En règle générale, <strong>la</strong> voie <strong>bio</strong>logique de dégradation s’accentue avec l’augmentation de <strong>la</strong><br />
température et de l’humidité du sol (jusqu’à une certaine limite). Ainsi certains auteurs ont remarqué<br />
que l’augmentation de 25 à 35°C de <strong>la</strong> température d’incubation d’un sol (25% d’humidité) divise par<br />
deux le temps de demi-vie de l’atrazine (Walker et Zindahl, 1981).<br />
La <strong>bio</strong>dégradation peut entraîner <strong>la</strong> minéralisation complète d’une substance, ou plus souvent, <strong>la</strong><br />
formation d’intermédiaires de dégradation, pouvant parfois être plus toxiques que le produit original.<br />
La dégradation <strong>bio</strong>logique peut être assurée par un seul organisme ou par les effets <strong>combiné</strong>s de<br />
plusieurs organismes consommant les pesticides comme sources d’azote ou de carbone (Kaufman et<br />
Kearney, 1970). Grâce à leur forte capacité d’adaptation et de mutation, les micro-organismes sont<br />
capables d’exprimer des enzymes de dégradation lorsqu’ils sont exposés régulièrement à des<br />
substances étrangères indésirables. Ainsi, le <strong>traitement</strong> pluriannuel d’une parcelle avec le même<br />
herbicide, va favoriser <strong>la</strong> présence d’une popu<strong>la</strong>tion spécifique de micro-organismes capables de<br />
métaboliser <strong>la</strong> substance active. Ainsi, Barriuso et Houot (1996) ont montré que le taux de<br />
minéralisation de l’atrazine augmente dans le sol avec <strong>la</strong> fréquence des applications de cet herbicide.<br />
Ce résultat a également été confirmé par Vanderheyden et al. (1997) et Pussemier et al. (1997).<br />
La dégradation <strong>bio</strong>logique de l’atrazine aboutit principalement à <strong>la</strong> formation de résidus déalkylés<br />
(Deséthyl-atrazine DEA, Desisopropyl-atrazine DIA, Deséthyl-desisopropyl-atrazine DEDIA) et<br />
également à <strong>la</strong> formation de résidus déhalogénés (Hydroxyatrazine HA) (Kaufman et Kearrney, 1970 ;<br />
Behki et Khan, 1986 ; Mougin et al., 1994), déaminés ou à noyau clivé (Gschwing, 1992 ;<br />
Mandelbaum et al., 1993a et 1995).<br />
Une réaction de dégradation de l’atrazine a été proposée <strong>pour</strong> les s-triazines ; celle-ci conduit à <strong>la</strong><br />
formation de l’acide cyanurique (dernier intermédiaire) avant une série d’hydrolyse (clivage du noyau),<br />
entraînant <strong>la</strong> formation de CO 2 et NH + 4 , dans le cas d’une dégradation totale dite minéralisation (Cook<br />
et al., 1981 et 1987).<br />
Le clivage du noyau triazine ne <strong>pour</strong>rait se faire que suite à une hydroxy<strong>la</strong>tion (Kaufman et Kearrney,<br />
1970).<br />
A titre d’exemple, Giardina et al. (1985) proposent un schéma de dégradation de l’atrazine par<br />
Niocardia en précisant les voies possibles de dégradation <strong>chimique</strong> pouvant intervenir simultanément<br />
dans les sols (Figure 3).<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
25
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
Cl<br />
N<br />
N<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
C H 3<br />
NH<br />
N<br />
NH<br />
Cl<br />
OH<br />
N<br />
N<br />
N<br />
N<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
N H 2<br />
N<br />
NH<br />
N H 2<br />
N<br />
NH<br />
Cl<br />
Cl<br />
O<br />
N<br />
N<br />
N<br />
N<br />
N<br />
NH<br />
N H 2<br />
N<br />
NH 2<br />
N H 2<br />
N<br />
H 2 N<br />
N<br />
O<br />
HN NH 2<br />
H N NH<br />
2<br />
Dégradation Biologique<br />
Dégradation Chimique<br />
Figure 3 : Exemple de mécanisme de dégradation <strong>bio</strong>logique et <strong>chimique</strong> de l’atrazine, d’après Giardini et<br />
al., 1985<br />
En 1993 (a et b), Mandelbaum et al. montrent que certaines bactéries isolées d’un sol pollué utilisent<br />
l’atrazine comme seule source d’énergie. La dégradation est négligeable à des températures<br />
inférieures à 7°C, mais significative entre 15 et 25°C, à un pH de 5,5 à 7,3. Ils observent une<br />
conversion supérieure à 80% d’atrazine entre 4 et 8 jours, à une concentration initiale de 100 mg.L -1 ,<br />
tandis que le même taux de conversion peut être atteint entre 0,5 et 2 jours en milieu enrichi en citrate<br />
et sucrose.<br />
I.3.2.2.3<br />
Minéralisation<br />
La minéralisation consiste en <strong>la</strong> dégradation totale d’un composé sous l’action d’une activité <strong>chimique</strong><br />
ou <strong>bio</strong>logique. Dans les sols, <strong>la</strong> minéralisation des pesticides, comme leur <strong>bio</strong>dégradation, peuvent<br />
26<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
être le résultat d’une activité individuelle d’un micro-organisme particulier mais plus souvent d’un effet<br />
<strong>combiné</strong> de diverses souches microbiennes.<br />
La minéralisation représente l’aspect le plus intéressant d’un point de vue environnemental, puisqu’il<br />
entraîne <strong>la</strong> décomposition totale d’un produit indésirable de manière naturelle. Certains microorganismes<br />
présents dans le sol sont capables d’utiliser un pesticide comme nutriment et source<br />
d’énergie ; dans le cas d’une minéralisation, les produits de dégradation sont le CO 2 et autres<br />
composés inorganiques (NH + 4 , H 2 O,..).<br />
De <strong>la</strong> même façon que précédemment, des applications répétées d’atrazine peuvent entraîner<br />
l’apparition de souches aptes à minéraliser l’atrazine. Ainsi, Ostrofsky et al. (1997) ont montré que <strong>la</strong><br />
minéralisation de l’atrazine atteignait 80% dans un sol traité annuellement depuis 25 ans, alors qu’elle<br />
était inférieure à 30% dans un sol traité une année sur quatre depuis 25 ans, et inférieure à 7% <strong>pour</strong><br />
un sol non traité auparavant.<br />
Plusieurs souches bactériennes provenant de sols contaminés ont ainsi été isolées <strong>pour</strong> leur capacité<br />
à minéraliser l’atrazine (Yanze-Kontchou et al., 1994 ; Mandelbaum et al., 1995 ; Struthers et al.,<br />
1998 ; de Souza et al., 1998). (voir aussi liste complète p.63)<br />
I.3.3<br />
Vo<strong>la</strong>tilisation<br />
La vo<strong>la</strong>tilisation est l’une des causes principales de fuites de pesticides hors de <strong>la</strong> zone cible,<br />
notamment lorsque les <strong>traitement</strong>s visent <strong>la</strong> surface du sol ou celle des végétaux. Ces pertes<br />
dépassent en général les pertes dues à <strong>la</strong> dégradation <strong>chimique</strong>, au ruissellement et au lessivage (<br />
Taylor et Spencer, 1990). La vo<strong>la</strong>tilisation est maximale lorsque l’application est faite par dépôt<br />
aérien ; elle est considérablement réduite par l’incorporation du pesticide directement dans les sols<br />
(sous forme de granulés ou par aspersion). Lors des <strong>traitement</strong>s par aéronef, jusqu’à 50% du produit<br />
peut être entraîné par le vent en dehors des zones à traiter (Pimentel et Levitan, 1986). L’utilisation de<br />
rampes de pulvérisation réduit ces pertes qui peuvent atteindre toutefois entre 1% et 30% selon<br />
Emans et al. (1992) et Pimentel et Levitan (1986). En 1992, Schiavon et al. considéraient que les<br />
pertes par vo<strong>la</strong>tilisation de l’atrazine étaient de l’ordre de 3% maximum de <strong>la</strong> dose appliquée sur une<br />
période de un an. Quelques années plus tard, une étude de Rice et al. (2002) montrait que le taux de<br />
vo<strong>la</strong>tilisation de l’atrazine pouvait atteindre 59%, 4 jours après l’application du pesticide sur un sol<br />
agricole.<br />
Le taux d’évaporation dépend d’une part, des propriétés <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s de <strong>la</strong> molécule en<br />
question et des conditions climatiques et environnementales (humidité et température de l’air,<br />
humidité et température du sol ; intensité du vent).<br />
La constante de Henry H (rapport de <strong>la</strong> pression de vapeur à <strong>la</strong> solubilité dans l’eau), rend compte du<br />
taux de vo<strong>la</strong>tilisation d’une substance (Jury et al., 1984). Les produits ayant un H dépassant<br />
<strong>la</strong>rgement 2,5 sont considérés comme très vo<strong>la</strong>tils (Jury et al 1984).<br />
27<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
D’autre part, le mode de travail du sol influe sur <strong>la</strong> vo<strong>la</strong>tilisation. Pour un sol non travaillé, <strong>la</strong> teneur en<br />
matières organiques est importante : l’adsorption augmente et <strong>la</strong> vo<strong>la</strong>tilisation diminue.<br />
Les molécules vo<strong>la</strong>tilisées sont véhiculées rapidement par les courants aériens et très rapidement<br />
diluées dans l’atmosphère ; à cette dilution s’ajoute également les effets photo<strong>chimique</strong>s et les<br />
oxydations destructrices, limitant ainsi leur impact sur l’environnement. Cependant, des risques<br />
existent : <strong>la</strong> vo<strong>la</strong>tilisation est <strong>la</strong> principale voie de transfert vers les p<strong>la</strong>ntes et donc vers les hommes et<br />
les animaux. Glotfelty (1987) rapporte également que les vapeurs peuvent se concentrer dans les<br />
gouttelettes de brouil<strong>la</strong>rd puis être redéposées sur les végétaux.<br />
I.3.4<br />
Contamination des milieux aquatiques<br />
Tous les ans, des consommateurs sont privés d’eau courante dans les régions de cultures intensives,<br />
et les exemples ne manquent pas : <strong>la</strong> Basse Normandie, le Pays de Loire ou <strong>la</strong> Bretagne, ont<br />
fréquemment connu ces périodes de « crise ».<br />
Les fortes pollutions des eaux de surface sont en général de courte durée, on parle de pic de<br />
pollution. La contamination des eaux souterraines est plus discrète mais aussi plus permanente<br />
(Schiavon et al, 1995 ; Heydel, 1998).<br />
La contamination des eaux souterraines ou des eaux de surface par les pesticides est essentiellement<br />
due aux phénomènes de ruissellement et de lessivage engendrés par les eaux de pluie. Le<br />
ruissellement contribue à <strong>la</strong> pollution des eaux de surface tandis que le lessivage contribue surtout à<br />
celle des eaux profondes. Bien qu’on considère souvent séparément les eaux de surface et les eaux<br />
souterraines, elles sont liées presque partout par le cycle hydrologique. En fonction des gradients<br />
hydrauliques, c’est l’eau de surface qui alimente les aquifères ou l’inverse (Leonard 1990). En<br />
conséquence, les taux de pesticides dans les eaux superficielles peuvent affecter les eaux<br />
souterraines ou dépendre d’elles.<br />
La pollution des eaux est liée aux interactions pesticides-sol et est fortement influencée par les<br />
conditions climatiques. Le caractère polluant d’un produit est en pratique associé à l’incapacité du sol<br />
à le retenir ou à le dégrader, avant que, sous l’effet de l’eau, il ne soit dispersé dans l’environnement.<br />
On peut donc estimer que les possibilités de pollution de l’eau par un produit phytosanitaire sont<br />
corrélées à son état de disponibilité dans le sol au cours du temps (Barriuso et al., 1994).<br />
La stabilité des pesticides et leur potentiel d’entraînement sont responsables de leur transfert des<br />
zones d’applications vers les milieux aquatiques via les eaux de pluie.<br />
Les risques de pollution sont également induits par <strong>la</strong> présence des métabolites de dégradation des<br />
pesticides eux-mêmes. Souvent négligés, ils constituent parfois des risques simi<strong>la</strong>ires voire supérieurs<br />
au pesticide lui-même. Dans le cas de l’utilisation de l’atrazine, Liu et al. (1996) montrent que <strong>la</strong> DIA et<br />
28<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
<strong>la</strong> DEA sont, elles aussi, systématiquement présentes dans le milieu, les fréquences de détection de<br />
l’atrazine et de <strong>la</strong> DEA étant simi<strong>la</strong>ires, et supérieures à celle de <strong>la</strong> DIA, en raison des stabilités<br />
respectives des composés. De plus, Bottoni et al. (1996) rapportent que, du fait de temps de demi-vie<br />
dans le sol supérieurs à celui du composé initial (40 jours <strong>pour</strong> <strong>la</strong> DIA, 72 jours <strong>pour</strong> <strong>la</strong> DEA, 37 jours<br />
<strong>pour</strong> l’atrazine), le potentiel de lessivage des métabolites est supérieur à celui de l’atrazine. Ainsi,<br />
considérer uniquement l’atrazine comme polluant revient à sous-estimer l’état de pollution du milieu et<br />
donc sous-estimer le risque encouru.<br />
I.3.4.1<br />
Le Ruissellement : contamination des eaux de surface<br />
Le ruissellement peut être défini comme le mouvement <strong>la</strong>téral de l’eau à <strong>la</strong> surface du sol et des<br />
matières dissoutes et suspendues qu’elle contient (Leonard, 1990). Ce phénomène a lieu chaque fois<br />
que l’intensité des pluies dépasse <strong>la</strong> capacité d’infiltration du sol. Cet écoulement peut entraîner les<br />
pesticides dissous, en suspension ou adsorbés sur les sédiments. Ce phénomène dépend donc de <strong>la</strong><br />
solubilité des produits dans l’eau et de <strong>la</strong> stabilité de leurs liaisons avec les constituants du sol<br />
(Schiavon et al., 1995), mais aussi du mode d’application du pesticide et du mode de travail du sol. Le<br />
ruissellement emporte – pendant <strong>la</strong> saison d’épandage – en moyenne 2% d’un pesticide appliqué à un<br />
sol, rarement plus de 5 à 10% (Leonard, 1990 ; Schiavon et al., 1995).<br />
Leonard et al. (1979), à partir de données de nombreux bassins versants, ont trouvé que <strong>la</strong><br />
concentration en pesticides dans les écoulements de surface était fortement corrélée aux<br />
concentrations mesurées dans les 10 mm supérieurs du sol à ces endroits. Les substances peu<br />
vo<strong>la</strong>tiles qui sont fortement adsorbées et résistent à <strong>la</strong> dégradation restent longtemps à <strong>la</strong> surface du<br />
sol et sont de ce fait plus sensibles à l’entraînement particu<strong>la</strong>ire ou colloïdal par l’eau. Leur<br />
incorporation dans le sol réduira les risques de ruissellement. Les pesticides solubles seront plutôt<br />
entraînés dans le sol par lessivage.<br />
I.3.4.2<br />
Le lessivage: contamination des eaux souterraines<br />
Le transfert par lessivage ou lixiviation, peut causer <strong>la</strong> pollution des eaux souterraines par mouvement<br />
vertical. Le lessivage est favorisé par les chemins préférentiels du sol ; ainsi, dans certaines<br />
conditions, même les molécules de pesticides de faible solubilité peuvent être entraînées vers les<br />
couches profondes du sol et les eaux de drainage à travers les failles naturelles du sol. L’importance<br />
de ce phénomène dépend de <strong>la</strong> nature du pesticide, des propriétés du sol, de <strong>la</strong> vitesse d’infiltration et<br />
de l’épaisseur de <strong>la</strong> zone non saturée. La mobilité et <strong>la</strong> persistance des pesticides doivent être<br />
simultanément considérées lorsqu’on parle de risque de pollution des eaux souterraines. Gustafson<br />
(1989) a proposé l’utilisation d’un indice simple et unique du risque de contamination par les<br />
substances actives des eaux souterraines : le GUS, ou Groundwater Ubiquity Score.<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
29
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Les Pesticides<br />
Le GUS est donné par <strong>la</strong> formule :<br />
GUS = log(t 1/2 )[4-log(K oc )]<br />
où t 1/2 est le temps de demi-vie et<br />
K = oc<br />
K d<br />
.100<br />
%CO<br />
Les molécules <strong>pour</strong> lesquelles GUS > 2,8 sont considérées comme très mobiles ; celles dont GUS <<br />
1,8 sont peu mobiles.<br />
On retrouve en général dans les eaux souterraines des pesticides ayant un GUS supérieur à 2,8 ;<br />
ceux dont l’indice est inférieur à 1,8 n’ont jamais été mis en évidence.<br />
Concernant l’atrazine, les valeurs de lessivage d’un sol de Lorraine, obtenues <strong>pour</strong> l’année 1981-1982<br />
avec un sol limoneux ont montré un entraînement par les eaux de perco<strong>la</strong>tion de 0,56% de <strong>la</strong><br />
radioactivité, initialement appliquée sous forme de 14C-atrazine ; l’atrazine ne représentant à <strong>la</strong> fin,<br />
que 10%, le reste étant constitué des produits issus de sa dégradation (Schiavon 1988). Albanis et al.<br />
(1988) ont travaillé en lysimètres avec différents types de sol ; leurs résultats indiquent que les<br />
quantités d’atrazine drainées représentaient seulement 0,54% (sol argileux), 0,66% (sol limoneux) et<br />
0,47% (sol limoneux-sableux) de <strong>la</strong> dose initiale appliquée. Pour Gaynor et al. (1992), <strong>la</strong> quantité<br />
d’atrazine et de DEA lessivés dans un sol argileux représente 1,2 à 1,4% de <strong>la</strong> quantité initiale de<br />
substance active épandue. Le mode de travail du sol peut également être un paramètre déterminant ;<br />
une étude de Weed et al. (1995) montre que selon le mode d’exploitation du sol (36 parcelles<br />
travaillées différemment ont été testées) <strong>la</strong> quantité d’atrazine drainée par lessivage variait entre 0,2<br />
et 0,35% de <strong>la</strong> dose initiale appliquée.<br />
Thèse Sophie Gendrault 2004<br />
30
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
II. Procédés de <strong>traitement</strong> de l’eau <strong>pour</strong> l’élimination des<br />
pesticides<br />
II.1 Introduction<br />
L’élimination des pesticides représente aujourd’hui un enjeu important <strong>pour</strong> préserver <strong>la</strong> qualité de<br />
l’eau. La panoplie des procédés existants permet de bien adapter le <strong>traitement</strong> en fonction de <strong>la</strong><br />
nature de <strong>la</strong> pollution (accidentelle ou chronique) et des caractéristiques de l’eau à traiter. De<br />
nombreuses techniques de <strong>traitement</strong> sont aujourd’hui à <strong>la</strong> disposition des industriels. Les principaux<br />
procédés utilisés, énumérés ci-dessous (ozonation, dégradation photo<strong>chimique</strong>, adsorption sur<br />
charbon actif, procédés membranaires), ont déjà fait leur preuve. D’autres procédés, encore à l’état de<br />
recherche (Oxydation au réactif de Fenton, <strong>traitement</strong> <strong>bio</strong>logiques…), sont très prometteurs <strong>pour</strong><br />
l’élimination des pesticides.<br />
Ce chapitre donne une liste non exhaustive des procédés actuellement existants et pouvant être mis<br />
en œuvre <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> des eaux polluées par l’atrazine. Il présente également quelques voies de<br />
dégradation de l’atrazine (<strong>chimique</strong>s ou <strong>bio</strong>logiques) mettant en évidence les métabolismes<br />
préférentiels de l’atrazine (métabolismes qui <strong>pour</strong>ront être comparés aux métabolismes de l’atrazine<br />
par <strong>la</strong> souche bactérienne utilisée dans le cadre de notre étude).<br />
II.2 Elimination de l’atrazine dans <strong>la</strong> filière c<strong>la</strong>ssique de <strong>traitement</strong><br />
des eaux usées<br />
Lors de l’étape de c<strong>la</strong>rification, trois procédés <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s peuvent se succèder en cascade :<br />
La coagu<strong>la</strong>tion-flocu<strong>la</strong>tion, <strong>la</strong> décantation et <strong>la</strong> filtration, permettent d’éliminer les matières en<br />
suspension. Au cours de cette étape, seuls les pesticides aptes à s’adsorber sur les particules<br />
formées lors de <strong>la</strong> coagu<strong>la</strong>tion-flocu<strong>la</strong>tion <strong>pour</strong>ront être éliminés.<br />
Les contrôles effectués sur plusieurs instal<strong>la</strong>tions industrielles montrent que le <strong>pour</strong>centage<br />
d’élimination de l’atrazine au cours de ces étapes ne dépasse pas 12% (Degrémont, 1994).<br />
Randke et al. (1994) observent que les procédés de coagualtion, filtration sur sable et chloration, sont<br />
inefficaces <strong>pour</strong> l’élimination de l’atrazine. Cependant, un apport de 5 mg.L -1 de charbon actif en<br />
poudre, à ce stade du <strong>traitement</strong>, permet un abattement de 40% de l’atrazine (Welte et al., 1996).<br />
L’utilisation du chlore n’aurait quant à elle, aucune efficacité <strong>pour</strong> l’élimination des s-triazines (Guerra-<br />
Sanchez, 2000).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
31
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
Pail<strong>la</strong>rd et al. (1990) montrent que l’atrazine (11,4 µg.L -1 ) présente dans les eaux brutes, n’est pas<br />
bien éliminée par une filière c<strong>la</strong>ssique de production d’eau potable. L’abattement obtenu au cours de<br />
<strong>la</strong> flocu<strong>la</strong>tion –décantation est de 5% en moyenne. En revanche l’addition de 30 mg.L -1 de charbon<br />
actif en poudre pendant <strong>la</strong> coagu<strong>la</strong>tion permet d’éliminer l’atrazine à 80%.<br />
II.3 Procédés <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s dégradatifs<br />
Différents procédés d’oxydation avancée existent actuellement dans les filières de production d’eau<br />
potable. Les procédés d'oxydation avancée sont particulièrement appropriés <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> des<br />
effluents contenant des composés récalcitrants, toxiques ou non-<strong>bio</strong>dégradables.<br />
II.3.1<br />
Oxydation à l’ozone<br />
L’ozone est un oxydant puissant couramment utilisé <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> des eaux potables. L’ozone<br />
peut agir par une réaction directe (réactions très sélectives) ou de façon indirecte par l’intermédiaire<br />
d’espèces secondaires comme les radicaux OH°, formés par décomposition de <strong>la</strong> molécule d’ozone.<br />
Cette action indirecte est peu sélective, mais les cinétiques de réaction sont très variables selon les<br />
matières à oxyder (Degrémont, 1989). Ainsi l’ozone dégrade les molécules avec plus ou moins<br />
d’efficacité. Par exemple, il est totalement inefficace envers le lindane, à des doses compatibles avec<br />
des applications à grande échelle (GLS, 2003)<br />
Lors d’un <strong>traitement</strong> à l’ozone, il faut prendre en compte les contraintes induites par <strong>la</strong> mise en œuvre<br />
d’une ozonation, à savoir <strong>la</strong> nécessité de mettre en p<strong>la</strong>ce une filtration sur charbon actif en grains en<br />
aval afin de retenir d’une part, les sous produits d’oxydation pouvant être nocifs, et d’autre part, les<br />
bromates (composés cancérigènes) qui peuvent se former si l’eau brute contient des bromures.<br />
L’action de l’ozone sur les pesticides peut parfois amener à <strong>la</strong> production de produits toxiques ; en cas<br />
de forte dose d’oxydant, certains composés haloformes sont susceptibles de se former en présence<br />
de matière organique (Dore, 1989, Ch6).<br />
Dans le cas de l’atrazine, l’utilisation de l’ozone à des teneurs d’environ 3mg.L -1 ne permet pas<br />
l’ouverture du cycle triazinique (Nelieu, 1994). Cependant Husley et al. (1993) constatent une<br />
réduction de 80% de l’atrazine présente initialement à une concentration de 5 µg/.L -1 . Welte et al.<br />
(1996) montrent que sous l’effet de l’ozone, l’atrazine subit une déalky<strong>la</strong>tion <strong>pour</strong> former <strong>la</strong> deséthyleatrazine<br />
(DEA).<br />
A titre d’exemple, Acero et al. (2000) ont étudié les voies de dégradation de l’atrazine par ozonation<br />
(Figure 4).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
32
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
Figure 4 : Différentes voies de dégradation de l’atrazine par ozonation selon Acero et al. (2000)<br />
L’ozonation est souvent couplée avec un autre procédé. Beltran et al.(1994) ont étudié <strong>la</strong> possibilité<br />
de coup<strong>la</strong>ge avec l’irradiation UV.<br />
Utilisé en coup<strong>la</strong>ge avec une méthode <strong>bio</strong>logique, l’ozonation est intéressante, car dans certains cas,<br />
elle facilite <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradabilité des composés. Ainsi, Lai et al. (1995) observent que le niveau de<br />
<strong>bio</strong>dégradabilité de <strong>la</strong> simazine (herbicide de <strong>la</strong> famille des s-triazines) est considérablement<br />
augmenté lorsqu’un pré-<strong>traitement</strong> à l’ozone/UV est appliqué.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
33
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
II.3.2<br />
Oxydation au peroxyde d’hydrogène<br />
L’utilisation du peroxyde d’hydrogène permet d’augmenter <strong>la</strong> quantité de radicaux OH • disponibles<br />
<strong>pour</strong> l’oxydation radica<strong>la</strong>ire. Les radicaux OH • , extrêmement réactifs, sont consommés rapidement par<br />
<strong>la</strong> matière organique, les bicarbonates, les carbonates, l’ammonium et les alcools tertiaires.<br />
Le coup<strong>la</strong>ge de ces deux dernières techniques (O 3 / H 2 O 2 ) permet d’éliminer 90% de l’atrazine avec<br />
des taux d’ozonation de l’ordre de 3 mg.L -1 d’O 3 . L’efficacité de ce <strong>traitement</strong> dépend de <strong>la</strong> dose de<br />
H 2 O 2 utilisée ; l’élimination de l’atrazine serait optimale à partir d’un rapport massique O 3 /H 2 O 2 de 2,5.<br />
Selon Gaid et Ravarini (1996) et Degrémont (1994), <strong>la</strong> combinaison O 3 / H 2 O 2 à des rapports<br />
massiques de l’ordre de 4, avec une dose initiale d’ozone d’environ 2 mg.L -1 permettrait un<br />
abattement de l’atrazine de 80%.<br />
Pour une dose d’ozone de 2 mg.L -1 , l’élimination de l’atrazine peut atteindre 46% <strong>pour</strong> une<br />
concentration initiale de 370 µg.L -1 ; elle s’élève à 75% en présence de peroxyde d’hydrogène, ajouté<br />
dans un rapport H 2 O 2 /O 3 de 0,4 g.g -1 (Richard et al., 1991).<br />
II.3.3<br />
Traitement au réactif de Fenton (AFT, Anodic Fenton Treatment)<br />
Ce procédé consiste en une oxydation par les radicaux OH • formés à partir de <strong>la</strong> réaction de Fenton :<br />
Fe 2+ +H 2 O 2 → Fe 3+ +OH - +HO •<br />
Cette méthode utilise une cellule électro<strong>chimique</strong> composée d’électrode de fer (anode et cathode).<br />
L’anode délivre du Fe 2+ à <strong>la</strong> solution tandis que <strong>la</strong> cathode fonctionne comme une électrode inerte.<br />
Les demi-réactions suivantes illustrent les phénomènes mis en jeu lors de <strong>la</strong> réduction de l’eau <strong>pour</strong><br />
former les radicaux OH • réactifs.<br />
Fe → Fe 2+ +2e -<br />
2H 2 O+2e - → H 2(g) +2OH - .<br />
Appliquées à des eaux contenant de l’atrazine, les études ont permis de mettre en évidence 7<br />
produits de dégradation. L’AFT permet <strong>la</strong> dégradation de l’atrazine en 3 minutes (70% d’abattement)<br />
(Saltmiras et al., 2002). Cependant le cycle triazine n’est pas clivé par cette technique.<br />
La dégradation primaire de l’atrazine par réaction de Fenton augmentant sa <strong>bio</strong>dégradabilité<br />
(déalky<strong>la</strong>tion, déchlorination), cette technique <strong>pour</strong>rait être envisagée en coup<strong>la</strong>ge avec un <strong>traitement</strong><br />
<strong>bio</strong>logique.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
34
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
II.3.4<br />
Dégradation photo<strong>chimique</strong><br />
La dégradation photo<strong>chimique</strong> de l’atrazine a été étudiée sous irradiation UV-Vis, en présence ou non<br />
d’un catalyseur (dioxyde de titane, TiO 2 ).<br />
En présence de 500 mg.L -1 de TiO 2 , <strong>la</strong> demi-vie de l’atrazine dans une solution à pH 6 est de l’ordre<br />
de 20 minutes. La desisopropyl-atrazine (DIA) et <strong>la</strong> deséthy-<strong>la</strong>trazine (DEA) sont les sous-produits<br />
principaux, formés au cours de ce <strong>traitement</strong>. La deséthyl-desisopropyl-atrazine (DEDIA) ainsi que<br />
l’hydroxy-deséthyl-atrazine (OHDEA) sont également retrouvées en quantité non négligeable (Héquet<br />
et al., 2001).<br />
Dans tous les cas, le noyau triazine n’est pas clivé mais, comme précédemment, le <strong>traitement</strong><br />
photo<strong>chimique</strong> fragilisant <strong>la</strong> structure mère de l’atrazine <strong>pour</strong>rait être envisagé comme pré-<strong>traitement</strong><br />
à un procédé de dégradation <strong>bio</strong>logique.<br />
II.4 Procédés non dégradatifs : adsorption sur matrice poreuse ou<br />
membrane<br />
II.4.1<br />
Procédés d’adsorption sur charbon actif en poudre ou en grains<br />
II.4.1.1<br />
Généralités<br />
L'adsorption est un <strong>traitement</strong> efficace <strong>pour</strong> retenir les polluants, particulièrement quand <strong>la</strong> charge est<br />
importante et <strong>la</strong> po<strong>la</strong>rité faible. Le charbon actif est utilisé <strong>pour</strong> éliminer des molécules peu solubles,<br />
du type phénols ou hydrocarbures saturés, les pesticides, les métaux lourds, certains agents tensioactifs,<br />
etc...difficilement dégradés par l'ozone.<br />
Les performances des filtres à charbon actif dépendent de <strong>la</strong> température, ainsi que du composé à<br />
adsorber.<br />
La mise en p<strong>la</strong>ce d’une ozonation en amont permet d’améliorer le rendement d’adsorption du charbon<br />
et de le protéger contre toute prolifération bactérienne.<br />
Les différents facteurs qui vont influencer l'adsorption des polluants sur les charbons actifs sont :<br />
• La température : L'adsorption est un phénomène généralement exothermique, toute<br />
élévation de <strong>la</strong> température diminue l'efficacité de l'adsorption.<br />
• La solubilité : Les composants les moins solubles sont adsorbés plus facilement<br />
• La structure molécu<strong>la</strong>ire : Les chaînes à ramifications (encombrement molécu<strong>la</strong>ire<br />
important) sont plus facilement adsorbées que les chaînes non ramifiées.<br />
• La taille molécu<strong>la</strong>ire :Les grosses molécules sont généralement mieux adsorbées que les<br />
plus petites.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
35
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
• La po<strong>la</strong>rité : Les molécules apo<strong>la</strong>ires sont plus facilement adsorbées que les molécules<br />
po<strong>la</strong>ires (dans le cas des charbons actifs, <strong>la</strong> surface est apo<strong>la</strong>ire).<br />
• La saturation de <strong>la</strong> chaîne carbonée : Les molécules contenant des liaisons insaturées sont<br />
plus facilement adsorbés que molécules à liaisons saturées (échanges électroniques).<br />
Il existe deux principaux procédés distincts d’adsorption par charbon actif : l’un utilise le charbon actif<br />
en poudre (CAP), l’autre le charbon actif en grains (CAG). Tous deux reposent sur l’accumu<strong>la</strong>tion à <strong>la</strong><br />
surface ou à l’intérieur des particules de charbon, des polluants contenus dans l’eau par interactions<br />
<strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s. Chacun est utilisé dans des conditions bien spécifiques.<br />
Le CAP est utilisé par injection de barbotine (mé<strong>la</strong>nge eau-charbon en suspension). Cette injection<br />
s’effectue idéalement le plus en amont possible de <strong>la</strong> filière de <strong>traitement</strong> afin d’obtenir des temps de<br />
contact le plus long possible. Il faut également prendre en compte les taux de matières organiques<br />
contenues dans l’eau, matières qui peuvent entrer en compétition avec les pesticides et en limiter<br />
l’adsorption. La chaîne de <strong>traitement</strong> doit comprendre une étape de décantation – filtration située<br />
après l’injection de charbon, de façon à retenir les particules de charbon. L’utilisation de CAP est<br />
particulièrement adaptée aux usines possédant une filière complète de c<strong>la</strong>rification. Elle permet<br />
notamment de traiter des pollutions accidentelles.<br />
Le CAG est utilisé dans le cas de pollutions chroniques, mais <strong>pour</strong> des concentrations re<strong>la</strong>tivement<br />
faibles. Le CAG s’utilise en lit filtrant généralement p<strong>la</strong>cé en fin de chaîne de <strong>traitement</strong>, lits dans<br />
lesquels l’eau percole avec un temps de séjour de 10 à 15 minutes.<br />
Lorsque le filtre est saturé, il est alors régénéré en usine via un <strong>traitement</strong> thermique qui lui permet de<br />
recouvrer ses propriétés adsorbantes.<br />
II.4.1.2<br />
Application à l’adsorption de l’atrazine sur charbon actif (CA)s<br />
L’adsorption sur charbon actif est actuellement l’un des procédés les plus utilisé <strong>pour</strong> éliminer les<br />
composés organiques et notamment les micro-polluants du type pesticide des eaux destinées à <strong>la</strong><br />
consommation humaine.<br />
De nombreuses études ont été réalisées sur <strong>la</strong> capacité des charbons actifs à retenir l’atrazine.<br />
Différents types d’essais ont été réalisés : en réacteurs agités ou en colonne, avec des charbons<br />
actifs de différentes natures : en grain, en poudre, sous forme de fibres…<br />
La durée d’utilisation des CA dépend du type de CA utilisé, de <strong>la</strong> durée de temps de contact et de <strong>la</strong><br />
concentration en pesticide et autres matières organiques présentes dans l’eau.<br />
Les quelques exemples cités ci-dessous donnent une idée de l’efficacité du charbon actif sous ces<br />
diverses formes à retenir l’atrazine.<br />
• Lors des premières études sur <strong>la</strong> capacité du charbon actif à fixer l’atrazine, Holiday et Hardin<br />
(1981) ont montré que 99,9% de l’atrazine présente dans une eau de rivière (concentrations<br />
36<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
initiales 0,5 à 430 mg.L -1 ) pouvaient être éliminés par filtration sur charbon actif (pH de <strong>la</strong><br />
solution circu<strong>la</strong>nte = 9).<br />
• Bouillot et al. (1991) observent une capacité d’adsorption de l’ordre de 38 mg.g -1 de CAG,<br />
tandis que l’utilisation du même CAG en filtre entraîne une diminution de <strong>la</strong> capacité<br />
d’adsorption d’un coefficient 1000 (concentration initiale en atrazine = 1 µg.L -1 ).<br />
• Brunet et al. (1996) ont testé les performances de plusieurs types de charbon actif en filtrant<br />
des eaux de forage dopées en atrazine (concentration initiale = 104 µg.L -1 ). En appliquant une<br />
masse de 10 mg.L -1 de CAP, ils trouvent des capacités d’adsorption de l’ordre de 10 µg.g -1 de<br />
CAP (temps de contact 72h). Lorsque <strong>la</strong> concentration initiale en atrazine est plus faible<br />
(46 µg.L -1 ), <strong>la</strong> capacité de rétention de l’atrazine passe à 30 µg. g -1 .<br />
• Des expériences en colonne CAG menées par Croll et al. (1992) indiquent que <strong>pour</strong> de faibles<br />
concentrations entrantes en atrazine (
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
II.4.2<br />
Procédés membranaires : microfiltration, ultrafiltration et nanofiltation<br />
La nanofiltration est utilisée dans les procédés de purification d’eau, tels que l’adoucissement, <strong>la</strong><br />
décolorisation et l’élimination de micro-polluants. Elle permet d’éliminer des molécules de petite taille<br />
sous une pression élevée. La nano-filtration permet ainsi de retenir une partie importante de <strong>la</strong><br />
matière organique ainsi que les ions divalents et les bactéries. Les résultats des essais de nanofiltration<br />
réalisés par Gaid et Ravarini (1996) sont présentés dans leTableau 3.<br />
Tableau 3 : Elimination d’atrazine par nano-filtration (d’après Gaid et Ravarini, 1996)<br />
Atrazine à l’entrée Atrazine en sortie Taux d’abattement<br />
0,42 µg .L -1
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
II.4.3<br />
Valorisation des déchets verts <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> de l’eau<br />
II.4.3.1<br />
Une solution économique<br />
Le <strong>traitement</strong> des eaux contaminées par les métaux ou les micro-polluants du type pesticide,<br />
colorants ou autres, fait en général intervenir des techniques onéreuses telles que <strong>la</strong> précipitation, <strong>la</strong><br />
filtration sur membrane, l’échange d’ions, l’adsorption sur charbon actif, etc.<br />
Dans un souci économique, social et environnemental et dans le cadre des projets de Développement<br />
Durable défini lors du Sommet de <strong>la</strong> Terre (Rio de Janeiro, 1992), des techniques alternatives sont<br />
aujourd’hui étudiées afin d’une part, de réduire les coûts de <strong>traitement</strong> et d’autre part utiliser au<br />
maximum des ressources renouve<strong>la</strong>bles et valoriser les sous-produits de l’agriculture ou les déchets<br />
issus d’activités industrielles ou agricoles.<br />
Ainsi, les produits naturels, disponibles en <strong>la</strong>rge quantité ou certains déchets industriels ou agricoles<br />
peuvent présenter un potentiel adsorbant intéressant <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> des eaux contaminées. Afin<br />
que le coût de <strong>traitement</strong> soit intéressant par rapport aux techniques c<strong>la</strong>ssiques, le choix de ce<br />
matériau doit se faire en fonction de sa capacité adsorbante, de <strong>la</strong> quantité disponible mais aussi de<br />
sa disponibilité géographique (le transport de matière entraînant un coup et une pollution non<br />
négligeable).<br />
En général, un matériau adsorbant est économique s’il est utilisable dans un procédé simple, s’il est<br />
abondant naturellement (au moins localement) ou s’il constitue un sous-produit ou un déchet d’une<br />
activité industrielle ou agricole.<br />
Ainsi de nombreuses recherches ont été menées sur une grande variété de matériaux tels que les<br />
écorces, les lignines, les chitines, les algues, <strong>la</strong> <strong>bio</strong>masse microbienne morte, <strong>la</strong> canne à sucre, les<br />
fibres de betteraves, les cotons, <strong>la</strong> <strong>la</strong>ine, certaines cendres, <strong>la</strong> tourbe…<br />
Dans notre étude, l’idée d’utiliser des matériaux naturels comme support <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> d’eaux<br />
contaminées par l’atrazine a vu le jour dans un souci économique et environnemental. Ainsi, nous<br />
nous sommes intéressés aux études déjà réalisées <strong>pour</strong> l’é<strong>la</strong>boration de procédés de dépollution des<br />
eaux par filtration sur des matériaux naturels, qui dans <strong>la</strong> plupart des cas, constituent une masse<br />
importante de déchets <strong>la</strong>rgement disponibles et valorisables.<br />
II.4.3.2<br />
Quelques exemples<br />
C’est dans le domaine de l’adsorption des métaux lourds que l’on retrouve aujourd’hui les plus<br />
nombreux exemples d’utilisation de produits naturels adsorbants <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> d’eaux usées. De<br />
nombreux matériaux ligno-cellulosiques ont notamment été étudiés ces dernières années. Le Tableau<br />
4, présente une liste non exhaustive des différents matériaux naturels utilisés <strong>pour</strong> l’adsorption des<br />
métaux lourds.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
39
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
Tableau 4 : Exemple de matériaux naturels utilisés <strong>pour</strong> l’adsorption de métaux lourds dans des procédés<br />
de <strong>traitement</strong> des eaux usées ou effluents<br />
Matériau Polluant Référence<br />
Bagasse Cd(II) et Pb(II) Peternel et al. (1999)<br />
Peau d’oignons Cd(II), Pb(II), Cu(II) et Hg(II) Kumar et Dara (1980) ; Asai et al. (1986)<br />
Brou d’amande Pb(II) et Zn(II) Omgbu et Iweanya. (1990)<br />
Peau de cacahuète Cu(II) Randall et al. (1975)<br />
Matériau cellulosique Cd(II), Cu(II) et Pb(II) Okeimen et al. (1985)<br />
Shuk<strong>la</strong> et Sakhardande (1990)<br />
Ecorce de pin U Freer et al. (1989)<br />
Ecorce de pin<br />
Cd(II), Pb(II), Cu(II) et Hg(II), Vasconcelos (1989)<br />
Cr(III), Fe<br />
Epi de maïs Cu(II) Hawthorne-Costa et al. (1995)<br />
Cotton Hg(II) Bailey et al. (1999)<br />
Tourbe Cr(III) Bailey et al. (1999)<br />
Fibres de betterave Ni(II), Pb(II), Cu(II) et Zn(II) Rima et al. (2004)<br />
La capacité d’adsorption des matériaux naturels, tout comme celle de n’importe quel adsorbant, varie<br />
essentiellement en fonction du pH et de <strong>la</strong> force ionique du milieu environnant et dans une moindre<br />
mesure de <strong>la</strong> température. Ainsi, les études de Peternele et al. (1999) montrent, par exemple, que<br />
l’adsorption du plomb (Pb(II)) et du cadmium (Cd(II)) sur des fibres de bagasse augmentait lorsque <strong>la</strong><br />
force ionique diminuait et le pH augmentait.<br />
Rima et al. (2004) observent un pH optimal de 6 à 6,6 <strong>pour</strong> l’adsorption des métaux lourds sur des<br />
fibres de betteraves et parviennent à éliminer 98% des métaux présents à des concentrations initiales<br />
de quelques centaines de mg.L -1 (soit une adsorption de environ 100 mg.g -1 de matériau ).<br />
II.4.3.3<br />
Cas de l’écorce de pin<br />
Parmi les matériaux naturels potentiellement exploitables dans le domaine de l’adsorption et du<br />
<strong>traitement</strong> de l’eau, l’écorce de pin a fait l’objet ces dernières années de quelques études.<br />
En tant que procédé alternatif aux <strong>traitement</strong>s c<strong>la</strong>ssiques, l’écorce de pin (matériau ligno-cellulosique)<br />
est particulièrement intéressante puisque étant un sous-produit de l’industrie du bois, elle est<br />
abondamment disponible et présente une affinité importante <strong>pour</strong> les composés, entre autres,<br />
hydrophobes.<br />
La littérature révèle deux sortes d’utilisation <strong>pour</strong> l’écorce de pin. Dans certaines études l’écorce est<br />
utilisée comme adsorbant tel quel ; différentes granulométries sont évoquées et parfois une activation<br />
<strong>chimique</strong> permet d’augmenter l’efficacité de cet adsorbant. D’autres études montrent une efficacité<br />
40<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
particulièrement attractive de l’écorce de pin utilisée comme garnissage de <strong>bio</strong>filtres <strong>pour</strong> le<br />
<strong>traitement</strong> des gaz ou <strong>traitement</strong> de l’eau. Dans ce dernier cas, l’écorce joue le rôle de support<br />
d’adsorption des polluants et de croissance <strong>pour</strong> les micro-organismes, eux-mêmes responsables de<br />
<strong>la</strong> transformation ou de <strong>la</strong> dégradation des polluants.<br />
La plupart des études sur l’écorce de pin re<strong>la</strong>tent de <strong>la</strong> capacité d’adsorption de ce support vis à vis<br />
des métaux lourds (Farm, 2003 ; B<strong>la</strong>is et al., 2003 ; Al-Asheh et al., 2000 et 1997 ; Meunier et al.,<br />
2002 ; Or<strong>la</strong>ndo et al., 2002 ). Composée, entre autre, de molécules polyphénoliques tels que les<br />
tanins, l’écorce de pin, à un pH et une température appropriés, présente une certaine capacité à<br />
retenir les cations métalliques en solution (Vazquez et al., 1994). Ces tanins font office d’échangeurs<br />
d’ions (Laks, 1991) ché<strong>la</strong>tants le di-cations comme présentée Figure 5.<br />
Figure 5 : Echange d’ions entre <strong>la</strong> procyanidine (tanin de l’écorce) et un ion métalique divalent (Vazquez<br />
et al. 2002)<br />
L’écorce de pin s’est ainsi révélée efficace <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> d’eaux chargées en ions tels que Pb 2+ ,<br />
Cu 2+ , Cd 2+ , Cr 2+ <strong>pour</strong> ne citer que quelques exemples. Les capacités maximales d’adsorption de<br />
l’écorce vis à vis de Pb 2+ peuvent atteindre jusqu’à 10,3 mg.g -1 d’écorce, 7,5 mg.g -1 <strong>pour</strong> Cd 2+ ou<br />
encore 6,4 mg.L -1 <strong>pour</strong> le Cr 2+ (Al-Asheh et al., 1997). Al-Asheh et al. (1997) ont également étudié<br />
l’influence de certains paramètres sur l’adsorption des métaux lourds ; ainsi, leurs résultats montrent<br />
logiquement qu’une écorce de faible granulométrie (
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
être un indicateur aussi efficace que les mousses ou les lichens quant au suivi de <strong>la</strong> concentration des<br />
métaux lourds présents dans l’atmosphère (Lippo et al., 1995).<br />
L’écorce de pin en poudre a également prouvé sa capacité d’adsorbant vis à vis de pesticides<br />
organochlorés comme le lindane ou l’heptachlore. Brás et al (1999) prétendent ainsi obtenir des taux<br />
d’abattement équivalents à ceux obtenus avec des filtres à charbon actif, <strong>pour</strong> certains organochlorés<br />
présents en solution aqueuse (concentrations initiales 1 à 10 µg.L -1 ). Ils notent également que plus le<br />
composé est hydrophobe, meilleure sera l’adsorption sur l’écorce de pin.<br />
L’écorce de pin préa<strong>la</strong>blement activée par l’épichloridine et <strong>la</strong> diméthylformamide (méthode EDM)<br />
<strong>pour</strong>rait également présenter des capacités d’échange d’anions et être utilisée <strong>pour</strong> l’élimination d’ions<br />
nitrate (Qmax = 1,06 mmol.g -1 ) aussi bien qu’une résine amberliteIRA-900 (Or<strong>la</strong>ndo et al., 2002).<br />
Enfin, certains auteurs ont montré que l’écorce de pin pouvait être utilisée comme garnissage de<br />
<strong>bio</strong>filtre. Ainsi, Du Plessis et al. (2003) utilisent un compost d’écorce de pin comme support de<br />
<strong>bio</strong>filtration <strong>pour</strong> traiter des gaz chargés en méthane et parviennent à des taux d’abattement de<br />
méthane (oxydation) de 70% (temps de rétention 30 minutes, concentration initiale en<br />
méthane > 0,5%, v/v).<br />
A des conditions optimales d’humidité (65%), l’écorce disposée en lit de 0,9 m de hauteur (charge de<br />
65 m 3 .m -2 .h -1 ) peut également servir de support de <strong>bio</strong>filtration <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> d’air malodorant<br />
chargé en sulfure d’hydrogène (Van Langenhove et al., 1986).<br />
Un <strong>bio</strong>filtre à garnissage d’écorce de pin a également été utilisé par Ramirez-Lopez (2001) <strong>pour</strong><br />
l’élimination de composés organiques vo<strong>la</strong>tils (COV) présent dans l’air, tels que le dichlorométhane,<br />
l’éthanol, le toluène ou encore <strong>la</strong> méthyl-éthyl-cétone. Ces études montrent notamment l’importance<br />
de <strong>la</strong> teneur en eau de l’écorce et concluent que l’écorce sèche doit être privilégiée dans un tel<br />
procédé par rapport à l’écorce humide.<br />
Compte tenu de <strong>la</strong> quantité d’écorce de pin disponible au Portugal et dans le sud de <strong>la</strong> France, dans<br />
l’idée de trouver des solutions alternatives aux <strong>traitement</strong>s c<strong>la</strong>ssiques souvent onéreux et à <strong>la</strong> vue des<br />
résultats cités précédemment, nous avons choisi d’utiliser l’écorce de pin comme support d’adsorption<br />
<strong>pour</strong> l’élimination de l’atrazine présente dans les eaux par <strong>bio</strong>filtration.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
42
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
II.5 Procédés de dégradation <strong>bio</strong>logique<br />
Parmi les procédés retenus <strong>pour</strong> <strong>la</strong> décontamination, les <strong>traitement</strong>s <strong>bio</strong>logiques sont susceptibles<br />
d’offrir un avantage économique important comparés aux procédés <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s c<strong>la</strong>ssiques,<br />
souvent plus complexes dans leur réalisation et souvent onéreux.<br />
Les procédés <strong>bio</strong>dégradatifs sont souvent simples à mettre en œuvre et applicables à d’importantes<br />
surfaces ou volumes ; ils peuvent être envisagés in situ ou sur site, ce qui limite considérablement les<br />
frais (excavation, pompage ou transport) et réduit l’impact environnemental.<br />
Les procédés <strong>bio</strong>logiques font appel à des micro-organismes tels que les bactéries, les levures ou les<br />
moisissures <strong>pour</strong> <strong>la</strong> réduction de <strong>la</strong> charge organique des eaux résiduelles ou l’élimination de micropolluants<br />
toxiques spécifiques, récalcitrants aux techniques de <strong>la</strong> filière c<strong>la</strong>ssique de <strong>traitement</strong> de<br />
l’eau.<br />
Les techniques <strong>bio</strong>logiques présentent l’avantage (dans les plus favorables des cas), d’éliminer<br />
totalement les polluants, contrairement aux techniques d’adsorption (le polluant est immobilisé mais<br />
non dégradé) ou aux techniques <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s (dégradation souvent partielle).<br />
II.5.1<br />
Caractéristiques générales des <strong>bio</strong>réacteurs<br />
La mise en œuvre des cultures bactériennes peut revêtir de très nombreuses formes. Il est c<strong>la</strong>ssique<br />
de distinguer les procédés dits à culture libres et les procédés dits à cultures fixées.<br />
Dans les procédés à cultures libres, utilisés uniquement en <strong>traitement</strong> des effluents liquides, on<br />
provoque le développement d’une culture bactérienne dispersée au sein du liquide à traiter. On utilise<br />
<strong>pour</strong> ce<strong>la</strong> un bassin brassé <strong>pour</strong> conserver en suspension <strong>la</strong> culture, et dans lequel on maintient :<br />
soit, une certaine concentration en oxygène : ce sont les procédés aérobies tels que les boues<br />
activées, le <strong>la</strong>gunage aéré ou naturel<br />
soit, au contraire, l’absence d’oxygène : ce sont les procédés anaérobies tels que les procédés à lit de<br />
boue ou le <strong>la</strong>gunage anaérobie.<br />
Dans les techniques à cultures fixées, on utilise <strong>la</strong> capacité qu’ont <strong>la</strong> plupart des micro-organismes à<br />
produire des exo-polymères permettant leur fixation sur divers supports, <strong>pour</strong> former un <strong>bio</strong>film.<br />
Les cultures fixées comme les cultures libres, peuvent s’utiliser en <strong>traitement</strong> aérobie ou anaérobie.<br />
Les cultures libres ont comme avantage essentiel une re<strong>la</strong>tive simplicité de mise en œuvre. Elles sont<br />
limitées cependant par les concentrations en micro-organismes accessibles et conduisent ainsi à des<br />
volumes d’ouvrages importants.<br />
Les cultures fixées en revanche, permettent d’obtenir dans les réacteurs des concentrations en<br />
<strong>bio</strong>masse plus importantes, ce qui permet de réduire leur taille.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
43
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
Dans le milieu particulièrement complexe que représente <strong>la</strong> plupart des eaux résiduaires, les éléments<br />
traces, les vitamines et autres facteurs de croissances sont généralement en concentrations<br />
suffisantes <strong>pour</strong> assurer le renouvellement des micro-organismes et donc une épuration correcte. Il<br />
peut arriver cependant, que l’effluent à traiter ne contienne pas assez de phosphore, ni même<br />
d’azote ; il faut alors en ajouter <strong>pour</strong> stimuler l’activité microbienne. Pour qu’un effluent puisse être<br />
traité par voie <strong>bio</strong>logique, il doit en outre présenter des caractéristiques compatibles avec <strong>la</strong><br />
croissance bactérienne : pH, température, salinité, absence de produits inhibiteurs ou toxiques.<br />
Les substances contenant du carbone organique sont consommées par les micro-organismes. En<br />
effet, le carbone représente le constituant essentiel du matériel cellu<strong>la</strong>ire et les molécules organiques<br />
sont sources de carbone <strong>pour</strong> les hétérotrophes et d’énergie <strong>pour</strong> les chimioorganotrophes. Les<br />
sources d’azote susceptibles d’être consommées par les micro-organismes incluent pratiquement<br />
toutes les formes d’azote organique ou minéral. L’azote est métabolisé <strong>pour</strong> fournir essentiellement<br />
les protéines, les acides nucléiques et les polymères des parois cellu<strong>la</strong>ires.<br />
Le phosphore est également consommé et incorporé dans les acides nucléiques, les phospholipides<br />
et les polymères des parois bactériennes. Il est aussi un élément capital de l’ATP intervenant dans les<br />
échanges énergétiques cellu<strong>la</strong>ires.<br />
Ainsi les matières organiques comme les pesticides peuvent être éliminées par voie <strong>bio</strong>logique ; ils<br />
sont utilisés comme source d’azote ou de carbone selon le pesticide et les micro-organismes. Le<br />
<strong>traitement</strong> <strong>bio</strong>logique spécifique <strong>pour</strong> l’élimination d’un polluant particulier utilise un consortium ou une<br />
souche isolée connue <strong>pour</strong> ces capacités à métaboliser celui-ci.<br />
Dans le cas le plus favorable, le polluant est minéralisé sous forme de CO 2 et H 2 O (minéralisation),<br />
mais dans certains des cas, il est partiellement dégradé et des métabolites intermédiaires de<br />
dégradation sont formés.<br />
II.5.2<br />
Traitements <strong>bio</strong>logiques appliqués aux eaux contaminées par l’atrazine<br />
Au cours des dix dernières années, et suite à l’utilisation intensive de l’atrazine dans les cultures<br />
agricoles, des chercheurs ont imaginé divers procédés d’élimination de cette pollution. De nombreux<br />
micro-organismes (bactéries ou moisissures), utilisés en cultures pures ou en consortium, ont été<br />
isolés à partir de milieux pollués, et testés <strong>pour</strong> leur capacité à métaboliser l’atrazine, aussi bien dans<br />
les sols que dans l’eau. Pour certains d’entre eux, l’atrazine est métabolisée en tant que seule source<br />
de carbone (Behki et Khan, 1986 ; Yanze-Kontchou et Gschwind, 1994) ; <strong>pour</strong> d’autres, l’atrazine est<br />
une source d’azote (Mandelbaum et al., 1995 ; Radosevich et al., 1995). Différents métabolismes de<br />
dégradation de l’atrazine ont été décrits dont un mécanisme général <strong>pour</strong> les s-triazines proposé par<br />
Cook (1987). Dans ce mécanisme général, <strong>la</strong> dégradation des triazines conduit à l’acide cyanurique,<br />
dernier intermédiaire triazinique ; puis, <strong>la</strong> dégradation complète des triazines conduit à <strong>la</strong> formation de<br />
CO 2 et NH + 4 via les composés intermédiaires non cycliques comme le biuret et l’urée. Dans le cas de<br />
l’atrazine, <strong>la</strong> première étape consiste en une N-déalky<strong>la</strong>tion (Mougin et al., 1994 ; Nagy et al.,1995) ou<br />
une hydroxy<strong>la</strong>tion (Mandelbaum et al, 1993a et b).<br />
44<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
Un exemple de dégradation <strong>bio</strong>logique de l’atrazine est proposé par Ostrofsky et al. (2001)<br />
Figure 6 : Exemple de dégradation de l’atrazine par une communauté bactérienne, selon Orstrofsky et al.<br />
(2002)<br />
Yanze-Kontchou et Gschwind (1999) ont montré qu’une communauté bactérienne capable de<br />
minéraliser l’atrazine dans les eaux usées <strong>pour</strong>rait être utilisée dans le cadre d’un procédé de<br />
<strong>traitement</strong> des eaux, au sein d’une station d’épuration.<br />
Certains auteurs proposent de pré-traiter l’eau à l’ozone avant de <strong>la</strong> faire percoler à travers un sol<br />
<strong>bio</strong>logiquement actif (Somich et al., 1990) ou circuler dans un <strong>bio</strong>réacteur contenant des bactéries<br />
disposées en <strong>bio</strong>film à <strong>la</strong> surface d’un support solide (Lesson et al., 1993 ; Hapeman et al., 1995).<br />
Dans ce procédé, l’ozone utilisé en pré-<strong>traitement</strong>, transforme l’atrazine par oxydation en des<br />
composés cycliques plus facilement <strong>bio</strong>dégradables.<br />
Hapeman et al. (1995) parvenaient ainsi, à l’aide d’un pré-<strong>traitement</strong> à l’ozone et l’utilisation de<br />
Klebsiel<strong>la</strong> terragena, à éliminer 80% environ de l’atrazine présente initialement dans l’eau à une<br />
concentration de 110 mg.L -1 , sous forme de CO 2 et NH + 4 , en 1 jour.<br />
Yanze-Kontchou et Gschwind (1994) ont étudiés l’utilisation de Pseudomonas YAYA6 <strong>pour</strong> traiter<br />
aussi bien une eau polluée qu’un sol contaminé par l’atrazine, sans pré-<strong>traitement</strong> à l’ozone.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
45
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
En 1994, alors que Stucki et al. (1995) se penchaient sur un <strong>traitement</strong> <strong>bio</strong>logique <strong>pour</strong> les eaux<br />
souterraines, Feakin et al. (1995) intéressés par un procédé couplé d’adsorption/<strong>bio</strong>dégradation,<br />
proposaient de développer un <strong>bio</strong>film dans des colonnes de charbon actif, avec une bactérie reconnue<br />
<strong>pour</strong> sa capacité à dégrader l’atrazine.<br />
McKin<strong>la</strong>y et Kasperek (1999) quant à eux, ont étudié <strong>la</strong> possibilité de décontaminer des eaux polluées<br />
à l’atrazine provenant de sites agricoles, à l’aide de macrophytes issus de marais (jonc, iris jaune et<br />
roseau), déjà utilisés dans des procédés de <strong>traitement</strong> de l’eau (Figure 7).<br />
Figure 7 : Schéma du procédé de <strong>traitement</strong> imaginé par McKin<strong>la</strong>y et Kasperek (1997)<br />
Dans ce procédé, <strong>la</strong> microflore responsable de <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine est localisée dans <strong>la</strong><br />
rhizosphère des p<strong>la</strong>ntes macrophytes, qui joue le rôle de « tampon environnemental » <strong>pour</strong> les microorganismes.<br />
Quelques résultats de ce procédé sont présentés à <strong>la</strong> Figure 8.<br />
Le système de McKin<strong>la</strong>y et Kasperek (1999) présente des résultats intéressants puisque l’atrazine (à<br />
concentration initiale de 6-7 mg.L -1 ) est totalement éliminée de l’eau circu<strong>la</strong>nte, au bout d’un mois<br />
(<strong>pour</strong> <strong>la</strong> première application d’atrazine avec le jonc) et en 4 jours au bout de <strong>la</strong> quatrième application<br />
d’atrazine.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
46
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
Figure 8 : Dégradation de l’atrazine au cours du temps avec 4 additions successives d’atrazine (6 mg/l)<br />
dans le système de McKin<strong>la</strong>y et Kasperek (1999) <strong>pour</strong> les 4 macrophytes étudiés.<br />
Les divers procédés de <strong>traitement</strong> présentés ci-dessus ne sont encore envisagés qu’au stade de <strong>la</strong><br />
recherche, à l’échelle du <strong>la</strong>boratoire.<br />
II.6 Procédés <strong>combiné</strong>s<br />
II.6.1<br />
Généralités<br />
Actuellement, il est admis que les procédés <strong>bio</strong>logiques représentent un faible impact<br />
environnemental et rentrent donc bien dans <strong>la</strong> liste des technologies utilisables <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> de<br />
l’eau. L’épuration <strong>bio</strong>logique de l’eau, du sol et de l’air a lieu selon un schéma semb<strong>la</strong>ble. Dans tous<br />
les cas, il s’agit de profiter de <strong>la</strong> capacité des micro-organismes à <strong>bio</strong>dégrader une substance<br />
indésirable. Ainsi, <strong>la</strong> <strong>bio</strong>filtration est devenue un procédé d’épuration particulièrement attractif.<br />
L’efficacité de <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation est parfois limitée dans les cas de contamination à faibles<br />
concentrations. Le polluant étant une source d’alimentation <strong>pour</strong> les micro-organismes, celui-ci doit<br />
être présent dans le milieu à une concentration suffisante <strong>pour</strong> permettre <strong>la</strong> croissance microbienne<br />
ou une cinétique de <strong>bio</strong>dégradation significative. Dans le cas de faibles concentrations (de l’ordre du<br />
µg.L -1 ), le polluant ne peut assurer un apport énergétique suffisant et/ou <strong>la</strong> cinétique de<br />
<strong>bio</strong>dégradation est trop faible. L’idée des procédés <strong>combiné</strong>s est donc de concentrer le polluant sur un<br />
support d’adsorption afin que celui-ci puisse être consommé par les micro-organismes présents à <strong>la</strong><br />
surface du support solide.<br />
47<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
D’autre part, les bactéries fixées sur un support présentent généralement des activités spécifiques<br />
supérieures à celles observées en culture libre (Olstead and Weber, 1991).<br />
Le matériau solide utilisé joue donc deux rôles essentiels :<br />
• Adsorption du polluant<br />
• Support de croissance <strong>pour</strong> les micro-organismes<br />
Ce procédé de <strong>traitement</strong> est économique puisqu’il permet <strong>la</strong> régénération des « filtres » par<br />
consommation du polluant par les micro-organismes ; il a un impact environnemental très limité si le<br />
polluant est minéralisé, c’est à dire totalement dégradé sous forme de CO 2 et H 2 O.<br />
Ainsi, l’efficacité d’un tel <strong>traitement</strong> (adsorption + <strong>bio</strong>dégradation) à été prouvée <strong>pour</strong> l’élimination de<br />
phénol (5 µg.L -1 ) et de dichlorophénol (10 µg.L -1 ) en colonne de charbon actif en grain (CAG) inoculée<br />
par des bactéries (Speitel et al., 1989) connues <strong>pour</strong> dégrader ces deux polluants organiques.<br />
Feakin et al. (1995) ont expérimenté un <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> sur colonne de CAG <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong><br />
d’eau polluée par de faibles concentrations en atrazine (10 µg.L -1 ).<br />
Des colonnes inoculées et non inoculées, contenant 10 g de CAG et alimentées par un débit de<br />
0,5 ml.min -1 (temps de contact 40 minutes) ont été suivies pendant 20 jours. Les résultats montraient<br />
que <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation à l’intérieur des colonnes inoculées participait à 53% à l’élimination de l’atrazine<br />
(contre 0% dans les colonnes non inoculées). Les mêmes expériences réalisées sur 302 jours avec<br />
de l’eau de rivière préa<strong>la</strong>blement c<strong>la</strong>rifiée puis ozonée ([atrazine]i = 5µg.L -1 environ) ont montré que <strong>la</strong><br />
présence d’un <strong>bio</strong>film dans <strong>la</strong> colonne réduisait notablement <strong>la</strong> concentration en atrazine de l’eau<br />
traitée en sortie de colonne. Cependant, <strong>la</strong> présence du <strong>bio</strong>film dans les colonnes de CAG ne retardait<br />
pas <strong>pour</strong> autant le passage au-dessus de <strong>la</strong> limite fixée de 0,1 µg.L -1 par rapport à l’utilisation d’une<br />
colonne de CAG non inoculée. La présence de bactéries au sein du CAG participait donc à éliminer<br />
l’atrazine par <strong>bio</strong>dégradation, limitant l’adsorption de celle-ci sur le support mais cette <strong>bio</strong>dégradation<br />
n’était pas assez rapide <strong>pour</strong> empêcher l’accumu<strong>la</strong>tion du polluant sur le CAG et rendre le procédé<br />
efficace.<br />
Nous nous sommes inspirés de cette approche <strong>pour</strong> étudier et tester un <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> utilisant<br />
de l’écorce de pin en tant que support de <strong>bio</strong>filtration et Pseudomonas ADP sp. comme bactérie<br />
capable de minéraliser l’atrazine. Pour cette étude, une connaissance en générale des procédés de<br />
<strong>bio</strong>filtration a été nécessaire et est abordée dans le chapitre qui suit.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
48
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
II.6.2<br />
La <strong>bio</strong>filtration<br />
II.6.2.1<br />
Introduction<br />
Le <strong>bio</strong>filtre est constitué d’un matériau granu<strong>la</strong>ire à <strong>la</strong> surface ou au sein duquel les micro-organismes<br />
sont immobilisés, empilés dans un réacteur généralement cylindrique : l’eau à traiter circule de<br />
manière ascendante ou descendante à travers un lit généralement fixe ainsi constitué. Le polluant<br />
contenu dans l’eau à traiter est adsorbé sur le <strong>bio</strong>film ou les particules de support (« garnissage ») où<br />
<strong>la</strong> dégradation microbienne à lieu.<br />
Le garnissage utilisé peut contenir de <strong>la</strong> matière organique (compost, tourbe…) qui assure une grande<br />
surface d’accrochage et l’apport de nutriments <strong>pour</strong> les micro-organismes.<br />
Les <strong>bio</strong>filtres sont des unités qui utilisent des combinaisons de processus fondamentaux : adsorption,<br />
absorption, <strong>bio</strong>dégradation et désorption (Devinny et al., 1999).<br />
La connaissance et le contrôle des différents mécanismes de formation d’un <strong>bio</strong>film permettent<br />
d’optimiser l’efficacité de celui-ci.<br />
II.6.2.2<br />
Principales propriétés des <strong>bio</strong>films<br />
Un <strong>bio</strong>film est une structure complexe et dynamique dont les caractéristiques peuvent varier en<br />
fonction du temps, du support d’adhésion, des micro-organismes mis en jeu, et des paramètres<br />
<strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s environnants.<br />
Un <strong>bio</strong>film est une matrice d’aspect gé<strong>la</strong>tineuse constituée par une agglutination de micro-organismes,<br />
adhérents à une surface solide et <strong>la</strong> plupart du temps immergée dans un milieu liquide aqueux (Melo,<br />
et al. 1994). L’adhésion au support solide se fait grâce à <strong>la</strong> présence de polymères extracellu<strong>la</strong>ires<br />
(polysaccharides chez les bactéries gram-négatif ou peptidoglycanes chez les bactéries gram-positif)<br />
présents à <strong>la</strong> surface des micro-organismes. Cette structure extracellu<strong>la</strong>ire permettant l’adhésion des<br />
bactéries à un support est aussi appelée glicocalix (Costerton et al., 1995).<br />
Les <strong>bio</strong>films sont le plus souvent hydrophiles ; cette propriété est attribuée à <strong>la</strong> présence de nombreux<br />
sucres hydrophiles au niveau de <strong>la</strong> pellicule extracellu<strong>la</strong>ire de polysaccharides. L’adhésion sera donc<br />
facilitée à <strong>la</strong> surface d’un support hydrophile.<br />
Un <strong>bio</strong>film peut être organisé en différentes couches entre <strong>la</strong> base et <strong>la</strong> superficie du <strong>bio</strong>film. Par<br />
exemple, on peut au sein d’un même <strong>bio</strong>film, trouver des zones anaérobies au niveau de <strong>la</strong> base et<br />
des zones aérobies en contact avec le liquide circu<strong>la</strong>nt.<br />
La couleur d’un <strong>bio</strong>film peut être variée, al<strong>la</strong>nt du b<strong>la</strong>nc translucide au noir, variant selon les microorganismes<br />
présents. Une même souche microbienne va présenter des caractéristiques structurales<br />
différentes lorsqu’elle est libre en solution ou lorsqu’elle est adsorbée à <strong>la</strong> surface d’un support solide.<br />
L’épaisseur et <strong>la</strong> densité du <strong>bio</strong>film varient en fonction des propriétés <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s et<br />
<strong>bio</strong>logiques du milieu environnant (conditions hydrodynamiques, composition du milieu circu<strong>la</strong>nt,<br />
49<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
vitesse de circu<strong>la</strong>tion…). Les densités de <strong>bio</strong>films peuvent varier entre 10 kg/m 3 jusqu’à 105 kg/m 3<br />
(Vieira,1995).<br />
La diffusion d’un soluté à l’intérieur du <strong>bio</strong>film dépend des caractéristiques du <strong>bio</strong>film (densité,<br />
rugosité, etc…) et des conditions de circu<strong>la</strong>tion de <strong>la</strong> solution (vitesse de circu<strong>la</strong>tion du fluide…) ainsi<br />
que des propriétés du soluté en question.<br />
II.6.2.3<br />
Comportement des micro-organismes en <strong>bio</strong>film<br />
Les micro-organismes se comportent de manière très différente lorsqu’ils sont libres en suspension et<br />
lorsqu’ils sont organisés en <strong>bio</strong>film à <strong>la</strong> surface d’un support solide (Fletcher, 1992). Il apparaît dans <strong>la</strong><br />
nature que <strong>la</strong> bactérie « préfère » résider sur une surface dans un milieu aqueux plutôt que « flotter<br />
librement » (Melo, 1997). Les changements fondamentaux au niveau physiologique et cellu<strong>la</strong>ire qui<br />
apparaissent lors de <strong>la</strong> formation d’un <strong>bio</strong>film, peuvent se traduire par une augmentation de <strong>la</strong><br />
résistance des micro-organismes vis à vis des agressions extérieures (O’Toole et al., 2000).<br />
La principale différence est <strong>la</strong> distance entre les micro-organismes : à l’intérieur d’un <strong>bio</strong>film <strong>la</strong><br />
proximité des micro-organismes entre eux est bien supérieure à celle observée en solution. D’autre<br />
part, <strong>la</strong> présence d’une matrice extracellu<strong>la</strong>ire va modifier les propriétés <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s du milieu<br />
(forces d’interactions superficielles). La formation d’un <strong>bio</strong>film va engendrer <strong>la</strong> création de gradient de<br />
concentration, de pH, de champs électriques, de zones d’aéro<strong>bio</strong>se et anaéro<strong>bio</strong>se qui vont induire<br />
nombre de variations dans le comportement des micro-organismes (Melo et al. ,1994).<br />
Parmi les micro-organismes, les bactéries semblent être les plus adaptées à <strong>la</strong> formation de <strong>bio</strong>film ;<br />
ceci est dû à leur petite taille, à leur taux de croissance élevé, à leur capacité d’adaptation au milieu<br />
ainsi qu’à leur forte capacité à synthétiser des polymères extracellu<strong>la</strong>ires (Vieira, 1995).<br />
Au sein des <strong>bio</strong>films formés de communautés bactériennes, on peut trouver de nombreux genres et<br />
espèces différentes. Dans ces communautés, le transfert de gènes est favorisé et les bactéries<br />
échangent leur matériel génétique à des fréquences très élevées (Filloux et Vallet, 2003).<br />
II.6.2.4<br />
Formation des <strong>bio</strong>films<br />
L’épaississement du <strong>bio</strong>film est en général représenté par une sigmoïde (Figure 9). Après une courte<br />
période de conditionnement, le <strong>bio</strong>film se développe rapidement puis se stabilise. Durant le<br />
conditionnement, les (macro)molécules présentes dans le milieu circu<strong>la</strong>nt s’accumulent à <strong>la</strong> surface<br />
du support. Ces (macro)molécules peuvent être des nutriments qui vont attirer les bactéries à <strong>la</strong><br />
surface du support et ainsi initialiser le développement et l’épaississement en <strong>bio</strong>film (Melo, 1997). Au<br />
niveau du p<strong>la</strong>teau, le <strong>bio</strong>film a atteint son épaisseur optimale et un équilibre s’établit entre <strong>la</strong><br />
croissance cellu<strong>la</strong>ire (<strong>bio</strong>disponibilité des nutriments en fonction de l’épaisseur du <strong>bio</strong>film) et l’érosion<br />
du <strong>bio</strong>film due aux forces appliquées par <strong>la</strong> circu<strong>la</strong>tion du liquide.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
50
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
Conditionnement<br />
P<strong>la</strong>teau<br />
Epaisseur du <strong>bio</strong>film<br />
Developpement rapide<br />
Temps<br />
Figure 9 : Developpement idéal d’un <strong>bio</strong>film (Melo, 1997)<br />
La Figure 10 illustre les différentes étapes de formation d’un <strong>bio</strong>film . Ces étapes sont les suivantes :<br />
1. Transfert de masse de (macro)molécules vers <strong>la</strong> surface du support et adsorption de cellesci<br />
: formation d’un film de conditionnement.<br />
2. Transport des micro-organismes vers <strong>la</strong> surface adsorbante et adhésion (réversible)<br />
3. Adsorption irréversible des micro-organismes à <strong>la</strong> surface du support.<br />
4. Transport de nutriments (transfert de masse externe et interne) à l’interface liquide/<strong>bio</strong>film et à<br />
l’intérieur du <strong>bio</strong>film.<br />
5. Métabolisme cellu<strong>la</strong>ire et transformation du <strong>bio</strong>film : production de nouvelles cellules et de<br />
polymères extracellu<strong>la</strong>ires (EPS).<br />
6. Transport des métabolites produits par le <strong>bio</strong>film vers l’extérieur.<br />
7. Processus de détachement du <strong>bio</strong>film : érosion superficielle ou décollement engendré par les<br />
forces hydrodynamiques ou effets internes.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
51
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
Nutriments<br />
FLUX<br />
Métabolites<br />
7<br />
Micro -organismes<br />
4<br />
6<br />
1 2<br />
SUPPORT D’ADSORPTION<br />
3<br />
5<br />
BIOFILM<br />
Film de conditionnement<br />
Figure 10 : Les différentes étapes de formation d’un <strong>bio</strong>film (adapté de Melo, 1994)<br />
La vitesse de formation du <strong>bio</strong>film dépend de <strong>la</strong> vitesse du processus le plus lent. Par exemple, <strong>la</strong><br />
vitesse de transfert des nutriments à l’intérieur du <strong>bio</strong>film limite le taux de consommation du substrat<br />
par le <strong>bio</strong>film et limite donc sa croissance.<br />
II.6.3<br />
Facteurs influençant <strong>la</strong> formation et l’activité des <strong>bio</strong>films<br />
De nombreux facteurs influencent <strong>la</strong> formation du <strong>bio</strong>film. Les principaux paramètres à prendre en<br />
compte sont : les caractéristiques des micro-organismes, <strong>la</strong> composition du support d’adsorption et<br />
ses propriétés <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s, <strong>la</strong> composition du fluide le traversant, ainsi que de nombreux<br />
paramètres <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s tels que <strong>la</strong> température, le pH, <strong>la</strong> force ionique…On devra également<br />
tenir compte de <strong>la</strong> vitesse du fluide et de sa turbulence ainsi que de <strong>la</strong> présence de particules<br />
organiques ou minérales.<br />
II.6.3.1<br />
Caractéristiques des micro-organismes<br />
La formation de pellicule <strong>bio</strong>logique va dépendre de <strong>la</strong> nature des micro-organismes présents ; d’autre<br />
part, l’état physiologique des micro-organismes, associé à l’excrétion des polymères, sera déterminant<br />
<strong>pour</strong> l’adhésion à un support.<br />
O’Toole et Kolter (1998) ont développé une méthode de crib<strong>la</strong>ge génétique qui a permis de<br />
caractériser un certain nombre de déterminants importants dans <strong>la</strong> formation de <strong>bio</strong>film, dont <strong>la</strong><br />
présence d’appendice extracellu<strong>la</strong>ire tels que les f<strong>la</strong>gelles (qui permet à <strong>la</strong> bactérie de se dép<strong>la</strong>cer en<br />
milieu liquide ou semi-solide) les pili de type IV (structures fibril<strong>la</strong>ires présentes au pôle de certaines<br />
bactéries à gram négatif ; Wall et Kaiser 1999) ou encore les appendices extracellu<strong>la</strong>ires comme les<br />
fimbriae ou les curli.<br />
52<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
Les f<strong>la</strong>gelles, les pili de type IV ou encore les Cup (fimbrae ou curli), sont des appendices de surface,<br />
essentiels à <strong>la</strong> formation du <strong>bio</strong>film, plus particulièrement dans sa phase initiale (approche et <strong>la</strong><br />
colonisation de <strong>la</strong> surface). Dans l’étape suivante, ces structures ne sont probablement plus<br />
nécessaires et <strong>la</strong>issent <strong>la</strong> p<strong>la</strong>ce à d’autres déterminants qui vont permettre <strong>la</strong> structuration et <strong>la</strong><br />
différenciation du <strong>bio</strong>film (Filloux et Vallet, 2003). L’adhésion aux supports solides sera ensuite<br />
facilitée <strong>pour</strong> des micro-organismes ayant une forte capacité à produire les polymères extracellu<strong>la</strong>ires<br />
(type alginate, par exemple chez P. aeruginosa, lipopolysaccharides…). Ainsi une souche dite<br />
« muqueuse » <strong>pour</strong>ra donner un <strong>bio</strong>film d’une épaisseur moyenne de 40 µm, alors qu’une souche<br />
« non muqueuse » ne <strong>pour</strong>ra former qu’un <strong>bio</strong>film de 6µm d’épaisseur (Filloux et Vallet, 2003).<br />
II.6.3.2<br />
Le support d’adsorption<br />
La nature du support utilisé joue un rôle essentiel sur <strong>la</strong> capacité d’adsorption des polluants ainsi que<br />
sur <strong>la</strong> fixation des micro-organismes. Ce support peut être constitué de particules homogènes ou<br />
hétérogènes, il peut être rugueux ou lisse. Quel que soit le matériau choisi, <strong>la</strong> connaissance de ses<br />
caractéristiques <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s et <strong>bio</strong>logiques est fondamentale ; l’influence du microflore indigène<br />
pouvant influencer notablement <strong>la</strong> formation d’un <strong>bio</strong>film à sa surface (possibilité de compétition entre<br />
les micro-organismes indigènes et exogènes).<br />
Le support est un matériau solide qui peut être de nature organique, tels que : tourbe, compost<br />
végétal, écorce de pin, fumier, gousse de cacahuètes (Chou et al. 1997 ; Ramirez et al. 1997) ou<br />
charbon actif (Feakin et al. 1995, Servais et al. 1991, Scott et al. 1995, Jones et al. 1998). On trouve<br />
également des matériaux inorganiques comme les matériaux argileux, le verre (Jucker et al. 1996), ou<br />
des matériaux synthétiques comme <strong>la</strong> mousse, les billes de polystyrène (Devinny et al. 1999), des<br />
structures Teflon (Jucker et al. 1996) ou encore des résines de type Ambérlite (Grosser et al. 2000),<br />
etc…<br />
Le Tableau 5 présente quelques exemples de matériaux utilisés <strong>pour</strong> <strong>la</strong> <strong>bio</strong>filtration lors de récentes<br />
études expérimentales.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
53
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
Tableau 5 : Supports utilisés dans les systèmes de <strong>bio</strong>filtration (selon Métivier, 2001)<br />
Support d’adsorption<br />
Références<br />
Compost Cardenas-Gonzales et al. 1999<br />
Compost / perles de polystyrène Jan et al. 1998<br />
Compost / charbon actif / lime / perles polystyrène Campbell et Connor 1997<br />
Compost / charbon actif Hwang et Tang 1997<br />
Compost / celite R-635 Sanchez-Pena et al. 2000<br />
Compost / perlite Morgenroth et al. 1996<br />
Compost de fumier de porc Chou et Cheng 1997<br />
Compost / tourbe / bois Hsu et al. 2000<br />
Compost / perlite / charbon actif Lee at al. 1999<br />
Bioton® / charbon actif Deshusses et al. 1996<br />
Sol / compost / écorce de pin Marran et Lausten 2000<br />
Tourbe Wang et al. 1996<br />
Tourbe / perle en verre Zilli et al. 2000<br />
Tourbe / perlite Budwill et Coleman 2000<br />
Tourbe / matériaux minéraux Wu et al. 1999<br />
Ecorce de pin Doug<strong>la</strong>s Lewis et al. 2000<br />
Déchets des écorces / perlite Lee et al. 1996<br />
Ecorce de pin / compost d’ordure de poulet Lackey et al. 1998<br />
Charbon actif<br />
Feakin et al.1999<br />
Support d’adsorption<br />
Références<br />
Coquilles de cacahuètes Ramirez-L 1997<br />
Billes d’alginate Chung et al. 1997<br />
Boues granulées Gracian et al. 1998<br />
Particules de <strong>bio</strong>masse Jorio et al. 2000<br />
Mousse de polyuréthane Moe et Irvine 2000<br />
Céramique / diatomée Lim et al. 2001<br />
Les principales caractéristiques physiques du support à prendre en compte sont <strong>la</strong><br />
granulométrie, <strong>la</strong> porosité, <strong>la</strong> surface spécifique, <strong>la</strong> taille des pores, <strong>la</strong> perméabilité du lit constitué et <strong>la</strong><br />
capacité de rétention en eau ; ces paramètres permettront d’approcher le comportement<br />
hydrodynamique du <strong>bio</strong>film. Les caractéristiques <strong>chimique</strong>s essentielles d’un support sont le pH de<br />
surface, <strong>la</strong> teneur en carbone, en azote, <strong>la</strong> nature des fonctions de surface et <strong>la</strong> charge, ainsi que <strong>la</strong><br />
composition ; celles-ci seront représentatives de <strong>la</strong> qualité du garnissage <strong>pour</strong> le développement et <strong>la</strong><br />
croissance du <strong>bio</strong>film.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
54
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
En règle générale, le support solide est un milieu poreux ; il doit donc présenter une grande surface<br />
d’adsorption et une faible résistance au passage du fluide afin de réduire les pertes de charge. La<br />
présence de micro-pores peut favoriser l’adsorption en créant une grande surface spécifique (Durham<br />
et al. 1994 ). Parfois, le mé<strong>la</strong>nge de différents matériaux permet d’optimiser l’efficacité du <strong>bio</strong>filtre et<br />
confère au filtre des propriétés mécaniques favorables, permettant par exemple d’éviter des<br />
phénomènes de colmatage.<br />
Pour une bonne adhésion des micro-organismes, le support doit de préférence être hydrophile, avoir<br />
une surface rugueuse et ne doit pas être toxique (Durham et al. 1994).<br />
D’autre part, <strong>la</strong> connaissance de sa <strong>bio</strong>dégradabilité renseignera sur <strong>la</strong> stabilité du support. La<br />
présence d’une activité microbienne à l’intérieur même du milieu filtrant aura également un rôle<br />
essentiel sur le développement du <strong>bio</strong>film, puisque celle-ci <strong>pour</strong>ra engendrer des phénomènes de<br />
compétition parfois non négligeables.<br />
II.6.3.2.1<br />
Caractéristiques physiques du support d’adsorption<br />
Les principales caractéristiques physiques déterminantes <strong>pour</strong> le choix d’un support sont les<br />
suivantes :<br />
Surface spécifique et taille des pores :<br />
Plus <strong>la</strong> surface spécifique du support sera élevée, meilleur sera le développement des microorganismes<br />
à sa surface. La surface spécifique est de l’ordre de 380.10 3 m 2 .m -3 <strong>pour</strong> le compost, de<br />
29.10 3 m 2 .m -3 <strong>pour</strong> l’écorce de pin (Smet et al. 1996), et de 500.10 6 m 2 .m -3 <strong>pour</strong> le charbon actif<br />
(Barbulea, 2000). Les micropores sont peu occupés par les micro-organismes ; Tang et al. (1996)<br />
estiment par exemple, que le <strong>bio</strong>film formé sur un support de compost occupe une surface de<br />
185 m 2 .m -3 seulement. Vieira (1995) a constaté que les supports d’adsorption dont les pores étaient<br />
de dimensions 4 à 5 fois supérieures à <strong>la</strong> taille des micro-organismes, constituaient un support idéal<br />
<strong>pour</strong> l’adhésion et le développement de <strong>bio</strong>film.<br />
Masse volumique :<br />
Les matériaux de faible masse volumique sont recommandés ; un matériau léger et qui comporte de<br />
bonnes propriétés mécaniques évitera ainsi des problèmes de tassement. Les problèmes de<br />
colmatage sont également à prendre en compte. Le compost est un bon exemple de matériau de<br />
faible masse volumique (300 à 500 kg.m -3 , humide) mais pose souvent des problèmes de colmatage à<br />
cause notamment de sa faible granulométrie. Les sols (1000 à 5000 kg.m -3 <strong>pour</strong> un sol en p<strong>la</strong>ce) sont<br />
des matériaux beaucoup plus denses.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
55
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
Indice de vide ou porosité intergranu<strong>la</strong>ire :<br />
C’est l’espace disponible entre les particules d’un support ou garnissage, <strong>pour</strong> le passage d’un fluide<br />
volume de " vide"<br />
liquide ou gazeux à travers un lit. Un indice de vide élevé (ε ≥ 0,7 avec ε =<br />
) peut<br />
volume total<br />
éviter de fortes pertes de charge et des problèmes de colmatage (Kennes et Tha<strong>la</strong>sso 1998 ; Le<br />
Cloirec 1998). Une distribution homogène des diamètres de particules, induit un écoulement du fluide<br />
plus uniforme à travers le lit garni. Un indice de vide compris entre 0,3 et 0,7 est conseillé <strong>pour</strong> un<br />
<strong>bio</strong>filtre ( Martin et al. 1993 ; Baltzis et al. 1994 ; Bohn 1996 ; Kennes and Tha<strong>la</strong>sso 1998).<br />
Capacité de rétention en eau :<br />
Le support doit de préférence posséder une capacité de rétention en eau élevée <strong>pour</strong> fournir aux<br />
micro-organismes l’eau nécessaire à leur croissance. L’eau retenue par le support favorise<br />
l’accrochage des cellules à celui-ci. La capacité de rétention en eau est fondamentale car elle permet<br />
le maintient des propriétés structurales du support. L’eau permet le transfert des polluants vers le<br />
<strong>bio</strong>film. Une capacité de rétention en eau comprise entre 40 et 80% (massique) est convenable quand<br />
le support est saturé (Ottengraf 1986 ; Devinny 1999).<br />
Granulométrie et caractéristiques de surface<br />
La taille des particules d’adsorbant ainsi que leur composition peuvent stimuler ou non l’adhésion du<br />
<strong>bio</strong>film. De manière générale, les études réalisées sur le développement des <strong>bio</strong>films montrent que :<br />
• L’adhésion des micro-organismes sur des particules est facilitée par <strong>la</strong> présence de charges<br />
positives à <strong>la</strong> surface de celles-ci.<br />
• Des inhibiteurs métaboliques ou <strong>la</strong> présence de métaux à <strong>la</strong> surface des particules peuvent<br />
influencer <strong>la</strong> formation du <strong>bio</strong>film.<br />
La rugosité du support affecte particulièrement <strong>la</strong> rétention mécanique des (macro)molécules et des<br />
micro-organismes et donc leur adhésion au support. De manière générale, l’augmentation de <strong>la</strong><br />
rugosité d’un support augmente <strong>la</strong> rétention des micro-organismes à sa surface. Après avoir étudié <strong>la</strong><br />
formation des <strong>bio</strong>films sur différentes surfaces, Mott (1991) observe que sur une surface lisse (tube<br />
d’acier inoxydable électropoli), le développement d’un film bactérien de Pseudomonas fluorescens est<br />
35% moins dense que sur un même tube d’acier non poli.<br />
Ce sont les irrégu<strong>la</strong>rités du support qui vont conditionner <strong>la</strong> formation des premières pellicules<br />
<strong>bio</strong>logiques.<br />
Il est donc nécessaire de trouver un bon équilibre entre tous ces paramètres physiques afin d’assurer<br />
une bonne stabilité du garnissage, d’éviter les colmatages et <strong>la</strong> formation d’agrégats de particules de<br />
support.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
56
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
II.6.3.2.2<br />
Caractéristiques <strong>chimique</strong>s du support d’adsorption<br />
Les principales caractéristiques <strong>chimique</strong>s du support d’adsorption à prendre en compte <strong>pour</strong> le bon<br />
développement d’un <strong>bio</strong>film sont les suivantes :<br />
Le pH :<br />
D’une manière générale, les micro-organismes requièrent <strong>pour</strong> leur bon développement, un pH<br />
proche de <strong>la</strong> neutralité ; le matériau utilisé devra de préférence posséder un pouvoir tampon. Les<br />
supports organiques utilisés possèdent en général des pH compris entre 6 et 8. L’addition de<br />
carbonate de calcium, carbonate de sodium, de soude ou autre composé tampon est préconisée lors<br />
de l’utilisation de garnissage à faible pouvoir tampon. Dans certains cas particuliers, on <strong>pour</strong>ra<br />
observer le développement d’un <strong>bio</strong>film à <strong>la</strong> surface de support possédant de faible pH (5-6) ; c’est le<br />
cas <strong>pour</strong> un garnissage d’écorce de pin (Ramirez-Lopez, 2001).<br />
Nutriments inorganiques et matière organique :<br />
La présence de nutriments dans le garnissage favorise le développement des micro-organismes à sa<br />
surface. Le matériau considéré peut être une source de carbone, d’azote, d’hydrogène ou d’oxygène,<br />
ou source de minéraux, ou encore de vitamines. Pour un support de compost, on trouve des<br />
concentrations en azote, phosphore et potassium aux alentours de 0,4%, 0,15% et 0,15% (w/w sur<br />
produit sec) respectivement, ce qui représente des concentrations satisfaisantes <strong>pour</strong> une bonne<br />
activité microbienne. Dans le cas de garnissage pauvre en nutriments, il sera nécessaire d’apporter<br />
ces nutriments par circu<strong>la</strong>tion d’une solution nutritive.<br />
Les fonctions de surface :<br />
Les fonctions <strong>chimique</strong>s présentes à <strong>la</strong> surface du support peuvent être acides ou basiques et<br />
influencent l’adhésion des micro-organismes et l’adsorption des polluants à sa surface.<br />
II.6.3.2.3<br />
Caractéristiques micro<strong>bio</strong>logiques du support d’adsorption<br />
L’utilisation d’un <strong>bio</strong>film <strong>pour</strong> l’épuration d’un fluide peut se faire de différentes manières :<br />
- dans un premier cas, le <strong>bio</strong>film peut être constitué de micro-organismes endogènes au<br />
support, c’est à dire naturellement présents (dans un compost, une tourbe ou autre). A titre<br />
d’exemple, les supports comme l’écorce de pin ou <strong>la</strong> tourbe contiennent des popu<strong>la</strong>tions<br />
bactériennes spécifiques répondant facilement à de nouvelles conditions d’alimentation en air<br />
ou en eau polluée et sont connues <strong>pour</strong> éliminer certains polluants (Bohn 1996).<br />
- Dans d’autres cas, <strong>pour</strong> un polluant particulier, ou <strong>pour</strong> un garnissage pauvre en microorganismes<br />
(matériau synthétique par exemple), une inocu<strong>la</strong>tion est nécessaire avec des<br />
boues activées, du sol, du compost ou des cultures bactériennes pures ou en consortium, afin<br />
d’obtenir le <strong>bio</strong>film désiré.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
57
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
Dans le cas d’une inocu<strong>la</strong>tion de micro-organismes étrangers au support d’adsorption, il est<br />
nécessaire de s’assurer de <strong>la</strong> survie et de l’adhésion de ces micro-organismes sur le garnissage, qui<br />
peut être perturbée par compétition entre <strong>la</strong> microflore endogène et <strong>la</strong> ou les souches inoculées.<br />
L’inocu<strong>la</strong>tion de micro-organismes exogènes en grande quantité permet d’avantager <strong>la</strong> flore exogène<br />
dans sa compétition avec les différentes souches bactériennes présentes au sein du support.<br />
Dans certains cas, une stérilisation préa<strong>la</strong>ble du support peut être recommandée.<br />
II.6.3.3<br />
Composition du fluide<br />
Le pH de <strong>la</strong> solution circu<strong>la</strong>nte est également l’un des paramètres principaux influençant <strong>la</strong> formation<br />
du <strong>bio</strong>film. Le pH de <strong>la</strong> solution va conditionner <strong>la</strong> physiologie des micro-organismes ainsi que les<br />
propriétés électriques des cellules et du support d’adsorption. En fonction du pH, les fonctions<br />
<strong>chimique</strong>s présentes à <strong>la</strong> surface des cellules, des macro-molécules et du support vont être plus ou<br />
moins répulsives ou attractives (Melo, 1994).<br />
La composition de <strong>la</strong> solution va également affecter <strong>la</strong> production de <strong>bio</strong>-polymères responsables de<br />
l’adhésion des cellules ; cette production est stimulée par un rapport carbone/azote élevé (Wimpenny<br />
et al. 1977, Robinson et al. 1984).<br />
D’autre part, <strong>la</strong> disponibilité des nutriments est également un facteur influençant l’épaisseur de <strong>bio</strong>film<br />
(Bott et Miller 1983). Des expériences menées par Trulear et Characklis (1982) ou Characklis (1990)<br />
démontrent qu’à une vitesse constante, le <strong>bio</strong>film sera d’autant plus épais que <strong>la</strong> charge organique du<br />
fluide sera importante (Figure 11).<br />
300<br />
Epaisseur de <strong>bio</strong>film (µm)<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
-▲- 1 g.m- 2 .h -1<br />
-■ - 0,4 g.m- 2 .h -1<br />
-♦ - 0,2 g.m- 2 .h -1<br />
0 50 100 150 200<br />
Temps (h)<br />
Figure 11 : Influence de <strong>la</strong> charge organique sur l’épaisseur du <strong>bio</strong>film (inspiré de Characklis 1990)<br />
58<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
La présence de nutriments en grande concentration aurait tendance à former des structures de <strong>bio</strong>film<br />
« ouvert » ; avec de plus faibles concentrations, on observe des structures plus compactes (Melo<br />
1997). Une structure ouverte facilite <strong>la</strong> diffusion des nutriments vers les cellules du <strong>bio</strong>film. Pour les<br />
bactéries aérobies, le <strong>bio</strong>film « ouvert » facilite également le transfert d’oxygène.<br />
L’apport répété de fortes charges organiques ainsi que les carences en nutriments peuvent provoquer<br />
le décollement du <strong>bio</strong>film (Characklis et al. 1990).<br />
II.6.3.4<br />
Effet de <strong>la</strong> vitesse de circu<strong>la</strong>tion du fluide<br />
D’une manière générale, l’augmentation de <strong>la</strong> vitesse de circu<strong>la</strong>tion du fluide peut avoir 2 effets<br />
principaux :<br />
L’augmentation du transfert de masse (nutriments <strong>pour</strong> les micro-organismes), qui <strong>pour</strong>ra être<br />
bénéfique <strong>pour</strong> <strong>la</strong> croissance du <strong>bio</strong>film<br />
L’augmentation de l’érosion, pouvant entraîner le décollement du <strong>bio</strong>film.<br />
L’augmentation de <strong>la</strong> vitesse de circu<strong>la</strong>tion entraîne <strong>la</strong> formation de <strong>bio</strong>film plus fins mais plus denses.<br />
Ainsi, <strong>la</strong> diffusion des nutriments est plus difficile dans ceux-ci que dans les <strong>bio</strong>films formés à faibles<br />
flux. Cependant, un <strong>bio</strong>film dense sera plus stable et aura une meilleure résistance à l’érosion,<br />
imposée par les forces hydrodynamiques extérieures.<br />
La Figure 12, tirée des travaux de Pinheiro et al. (1988), représente l’effet de <strong>la</strong> vitesse du fluide<br />
circu<strong>la</strong>nt sur <strong>la</strong> formation du <strong>bio</strong>film. Cette figure montre qu’à faible vitesse (0,25 m.s -1 ), <strong>la</strong> période<br />
d’induction est beaucoup plus longue qu’à des vitesses supérieures ; à faible vitesse, le transfert de<br />
masse est l’étape limitante.<br />
0,004<br />
v = 0,25m/s<br />
0,003<br />
Rf (m 2 .Kg -<br />
Rf (m2.K/W)<br />
0,002<br />
0,001<br />
v = 0,44m/s<br />
v = 0,72m/s<br />
v = 0,80m/s<br />
0<br />
0 2 4 6 8 10 12 14<br />
Temps (j)<br />
v = 1,24m/s<br />
Figure 12 : Effet de <strong>la</strong> vitesse de circu<strong>la</strong>tion sur <strong>la</strong> formation du <strong>bio</strong>film (inspiré de Pinheiro et al., 1988)<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
59
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
II.6.3.5<br />
Effet de <strong>la</strong> température<br />
Les changements de température affectent particulièrement l’état physiologique des microorganismes.<br />
Pour <strong>la</strong> plupart des bactéries, des températures al<strong>la</strong>nt de 30 à 35 °C représentent des<br />
températures idéales de développement et de croissance.<br />
Les micro-organismes sont très sensibles aux changements de températures. Bott et al. (1977) ont<br />
montré que l’épaisseur d’un <strong>bio</strong>film de Escherichia coli augmentait de 80% lorsque <strong>la</strong> température<br />
passait de 30 à 35°C.<br />
II.6.4<br />
Cinétique de <strong>bio</strong>dégradation d’un substrat<br />
dC<br />
La plupart du temps, <strong>la</strong> cinétique de dégradation d’un substrat ( − L<br />
dt<br />
dX<br />
de croissance des micro-organismes ( ), comme suit :<br />
dt<br />
) peut être reliée à <strong>la</strong> vitesse<br />
dX<br />
dt<br />
= µ . X<br />
= −Y<br />
dC<br />
dt<br />
L<br />
où µ est <strong>la</strong> vitesse spécifique ou taux de croissance des micro-organismes (T -1 ) et Y le coefficient de<br />
rendement cellu<strong>la</strong>ire (M cell .mol -1 ).<br />
Le taux de croissance (µ) dépend de <strong>la</strong> concentration en substrat (C L ) disponible <strong>pour</strong> les microorganismes,<br />
et est décrite par l’équation de Monod :<br />
µ<br />
µ<br />
K<br />
s<br />
C<br />
L<br />
+ C<br />
L<br />
= max ( )<br />
Dans le cas particulier où de fortes concentrations de substrat inhibent <strong>la</strong> croissance, l’équation de<br />
Haldane est utilisée :<br />
où K i est <strong>la</strong> constante d’inhibition.<br />
µ<br />
C<br />
max L<br />
µ =<br />
2<br />
K<br />
s<br />
+ CL<br />
+ CL<br />
K<br />
i<br />
Dans un domaine de concentrations non inhibitrices, <strong>la</strong> cinétique de <strong>bio</strong>dégradation d’un substrat peut<br />
alors globalement être décrite par modèle de suivant :<br />
60<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Procédés de <strong>traitement</strong><br />
dC<br />
ν = −<br />
dt<br />
L<br />
=<br />
µ max<br />
Y<br />
CL<br />
K + C<br />
s<br />
L<br />
X<br />
où<br />
ν C<br />
ν = max<br />
K + C<br />
s<br />
L<br />
L<br />
X<br />
avec:<br />
X : Densité ou concentration de <strong>bio</strong>masse (M.L -3 )<br />
µ max : Vitesse maximale de croissance (T -1 )<br />
Y : Coefficient de rendement cellu<strong>la</strong>ire (M <strong>bio</strong> .mol -1 de substrat)<br />
C L : Concentration de polluant dans le liquide (Mol.L -3 )<br />
v max : Vitesse maximale spécifique de dégradation (Mol.L -3 .T -1 )<br />
K s : Constante de Monod (Mol.L -3 )<br />
v : Vitesse de consommation de substrat (Mol.L -3 .T -1 )<br />
Lorsque les concentrations en substrat sont très fortes par rapport à K s , le substrat n’est pas limitant et<br />
<strong>la</strong> vitesse de dégradation tend vers<br />
ν<br />
max<br />
. X =<br />
µ<br />
K<br />
max<br />
. s<br />
Y<br />
X<br />
et <strong>la</strong> cinétique de dégradation sera d’ordre zéro par rapport au substrat. Quand les concentrations en<br />
substrat sont bien inférieures à K s , <strong>la</strong> vitesse de dégradation est quasi proportionnelle à <strong>la</strong><br />
concentration en substrat et <strong>la</strong> cinétique de dégradation sera du premier ordre par rapport au substrat.<br />
On a donc souvent une réaction d’ordre zéro par rapport au substrat près de l’entrée du <strong>bio</strong>filtre, où<br />
les concentrations sont fortes et de premier ordre par rapport au substrat en s’éloignant de l’entrée à<br />
travers le <strong>bio</strong>filtre, où les concentrations décroissent.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
61
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas<br />
III. Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
III.1 Introduction<br />
Les nombreuses pollutions à l’atrazine rencontrées un peu partout dans le monde, dues à l’utilisation<br />
intensive de cet herbicide depuis les années 60, ont motivé de nombreux travaux de recherche sur les<br />
modes de dépollution. Parmi les procédés retenus, <strong>pour</strong> <strong>la</strong> décontamination de sols et des eaux<br />
pollués par les pesticides, les <strong>traitement</strong>s <strong>bio</strong>logiques offrent un avantage économique important<br />
comparé aux procédés <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s c<strong>la</strong>ssiques, beaucoup plus complexes dans leur réalisation<br />
et souvent très onéreux.<br />
La recherche de micro-organismes capables de dégrader les pesticides date d’une vingtaine<br />
d’années. De nombreux chercheurs ont isolé, à partir de sols pollués, différents micro-organismes<br />
<strong>pour</strong> leur capacité à dégrader l’atrazine et donc potentiellement utilisables lors d’un <strong>traitement</strong><br />
<strong>bio</strong>logique. Parmi les nombreuses souches isolées, <strong>la</strong> plupart d’entre elles n’offraient qu’une<br />
dégradation partielle du pesticide (Rhodococcus sp. B30 (Behki et Khan , 1994), Nocardioides sp.<br />
(Topp, 2000), C<strong>la</strong>vibacter michiganese ATZ1 (de Souza, 1998)…), tandis que d’autres parvenaient à<br />
mineraliser l’atrazine (Pseudomonas sp. YAYA6 (Yanze-Kontchou, 1994), Pseudomonas sp. ADP<br />
(Mandelbaum, 1995), Agrobacterium radiobacter J14A (Struthers, 1998), Pseudomonas sp. CN1 (de<br />
Souza, 1998)...) .<br />
Le Tableau 5 donne une liste (non exhaustive) des micro-organismes isolés <strong>pour</strong> leur capacité à<br />
métaboliser l’atrazine.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
62
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas<br />
Tableau 6 : Liste non exhaustive des micro-organismes isolés capables de dégrader l’atrazine<br />
Souche<br />
Produits de<br />
dégradation<br />
Minéralisation<br />
Références<br />
Acinetobacter calcoaceticus DEA, DIA _ Migrain et al. (1993)<br />
Agrobacterium radiobacter<br />
J14A<br />
CO 2 + Struthers et al. (1998)<br />
Arthrobacter aurescens strain alky<strong>la</strong>mines + acide<br />
TC1<br />
cyanurique<br />
_ Strong et al (2002)<br />
Arthrobacter sp. AD1 _ Cai et al. (2003)<br />
Che<strong>la</strong>tobacter heintzii Cit1 Rousseaux et al (2003)<br />
C<strong>la</strong>vibacter michiganese ATZ1 HA + N-ethy<strong>la</strong>mmelide _ De Souza et al. (1998a)<br />
Hymenoscyphus ericae _ Donnelly et al. (1993)<br />
Klebsiel<strong>la</strong> pneumoniae CO 2 + NH 4 + Ernst & Rhem (1995)<br />
Mycelia sterilia INBI 2-26 Vasil’chenko et al. (2002)<br />
Nocardioides sp. C190 HA + N-ethy<strong>la</strong>mmelide _ Topp et al. (2000a)<br />
Nocardioides sp. SP12 Acide cyanurique _ Piutti et al. (2003)<br />
Phaneochaete chrysosporium DEA + DIA _ Mougin et al (1994)<br />
Pleurotus pulmonarius HIA - Masaphy et al. (1993)<br />
Pseudomonas sp. DEA, DIA _ Bekhi & Khan (1986)<br />
Pseudomonas sp. YAYA6 CO 2 +<br />
Yanze-Kontchou & Gschwind<br />
(1994)<br />
Pseudomonas sp. ADP CO 2 + NH 4 + Mandelbaum et al. (1995)<br />
Pseudomonas sp. CN1 Acide cyanurique + CO 2 + De Souza et al. (1998a)<br />
Pseudomonas alcaligenes<br />
+ Agrobacterium sp.<br />
DEA, DIA _ Migrain et al. (1993)<br />
Pseudomonas putida<br />
+ Xanthomonas maltophilia<br />
DEA, DIA _ Migrain et al. (1993)<br />
Pseudoaminobacter sp. CO 2 + Topp et al. (2000b)<br />
Streptomyces sp. PS1/5 DEA + DIA _ Fadullon et al. (1998)<br />
Ralstonia M91-3 Biuret + CO 2 + NH 4 + Radosevich et al. (1995)<br />
Rhizobium sp. HA - Bouquard et al. (1997)<br />
Rhodococcus sp. B30 _ Bekhi & Khan (1994)<br />
Rhodococcus sp. N186/21 HIA _ Nagy et al. (1995)<br />
Rhodococcus TE1 DEA, DIA _ Behki et al. (1993)<br />
HIA = hydroxy-isopropy<strong>la</strong>mino-atrazine<br />
DEA = deséthy<strong>la</strong>mino-atrazine<br />
DIA = desisopropy<strong>la</strong>mino-atrazine<br />
HA = hydroxyatrazine<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
63
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas<br />
Pseudomonas sp. ADP, connue <strong>pour</strong> ses capacités à minéraliser rapidement l’atrazine, a été et est<br />
encore l’une des souches les plus étudiées depuis son isolement en 1995 par Mandelbaum et al.<br />
(1995). De nombreuses équipes se sont penchées sur le métabolisme de dégradation de l’atrazine<br />
par Pseudomonas ADP sp. et sont parvenues à isoler les gènes codant <strong>pour</strong> <strong>la</strong> synthèse des<br />
enzymes impliquées. D’autres ont cherché à utiliser Pseudomonas ADP sp. <strong>pour</strong> des <strong>traitement</strong>s<br />
<strong>bio</strong>logiques de dépollution et ont étudié ses limites d’adaptation à différents environnements.<br />
Pseudomonas ADP sp. est également <strong>la</strong> souche que nous avons choisi d’utiliser dans notre procédé<br />
de <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong>.<br />
Ce chapitre a <strong>pour</strong> but de présenter l’historique de cette souche depuis son isolement en 1995 jusqu’à<br />
l’identification des gènes responsables de <strong>la</strong> dégradation de l’atrazine, ainsi que les différentes<br />
applications de dépollution mettant en jeu Pseudomonas ADP sp.<br />
III.2 Isolement de Pseudomonas ADP sp.<br />
En 1993, l’équipe de Mandelbaum isole d’un sol agricole pollué du Minnesota, le consortium LFB6,<br />
reconnu capable de dégrader l’atrazine dans les sols (Mandelbaum et al. , 1993b). Les expériences<br />
menées avec du 14 C montrent <strong>la</strong> capacité du consortium à minéraliser l’atrazine. La dégradation<br />
observée est très rapide (24 h <strong>pour</strong> une concentration initiale en atrazine de 100 mg.L -1 ) dans un sol<br />
argileux ou dans du sable (Mandelbaum et al. , 1993b) ; elle a lieu aussi bien en présence des cellules<br />
entières qu’avec des extraits protéiques du consortium. L’hydroxyatrazine est <strong>la</strong> première molécule<br />
identifiée comme métabolite intermédiaire de dégradation (Mandelbaum et al. , 1993b).<br />
Rapidement, les capacités du consortium sont testées ; on étudie notamment l’influence de<br />
paramètres c<strong>la</strong>ssiques tels que <strong>la</strong> température, le pH, l’effet de <strong>la</strong> salinité… La <strong>bio</strong>dégradation de<br />
l’atrazine par le consortium LFB6 est observée à partir de 15°C à des pH al<strong>la</strong>nt de 5,5 à 8,5<br />
(Mandelbaum et al, 1993a).<br />
C’est en 1995, à partir du consortium LFB6, que l’équipe parvient finalement à isoler et caractériser <strong>la</strong><br />
souche bactérienne responsable de <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine. Sa séquence ARN16S, comparée<br />
aux bases de données de Genbank, révèle qu’il s’agit d’une Pseudomonas sp. (Mandelbaum et al,<br />
1995). Pseudomonas ADP sp. révèle sa capacité à minéraliser l’atrazine présente à des<br />
concentrations particulièrement élevées (>1000 mg/l) utilisant l’herbicide comme seule source d’azote.<br />
D’autre part, Pseudomonas ADP métabolise plus d’atrazine que ce dont elle a besoin <strong>pour</strong> son propre<br />
métabolisme. En milieu liquide, 100 mg.L -1 d’atrazine sont dégradés en 90 minutes par 9.10 9 cell/ml<br />
(Mandelbaum et al.,1995).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
64
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas<br />
III.3 Taxonomie et exigences métaboliques<br />
Le tableau suivant réalisé à partir des travaux de Mandelbaum et al., résume les principales<br />
caractéristiques taxonomiques de Pseudomonas ADP sp.<br />
Tableau 7 : Principales caractéristiques taxonomiques de Pseudomonas sp.ADP<br />
Gram Mobilité F<strong>la</strong>gelle Forme<br />
Couleur<br />
des<br />
colonies*<br />
Aspect sur<br />
boite*<br />
Contours des<br />
colonies*<br />
Croissance King’s<br />
B<br />
négatif +<br />
1<br />
po<strong>la</strong>ire<br />
bâtonnet<br />
beige<br />
Opaque<br />
Centre foncé<br />
irréguliers<br />
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas<br />
rapport aux études précédentes. Ces études montrent que d’une manière générale, les temps de<br />
demi-vie de l’atrazine dans un sol <strong>bio</strong>logiquement actif est de l’ordre de quelques mois ; dans les<br />
cultures pures ou cultures « enrichies » le temps de demi-vie de l’atrazine est en général de quelques<br />
semaines, contre quelques jours <strong>pour</strong> les cultures de Pseudomonas ADP sp.<br />
Tableau 9 : Demi-vie de l’atrazine dans différentes conditions (cité dans Mandelbaum et al. 1993a)<br />
Milieu pH Température (°C) Demi-vie (jours) Références<br />
Sol 4,8-6,5 22 53-113 Burkart et al. 1988<br />
Sol 5,6-6,6 Cond. Champs 37-168 Erickson et al. 1989<br />
Sol-Eau boueuses 4,5 65-113 Armstrong et al. 1968<br />
Eau filtrée stérile 5-9 25 64-200 Burkart et al. 1988<br />
Bactéries issues de<br />
déchets industriels<br />
>7 Geller et al. 1980<br />
Pseudomonas spp. 6,8-7,0 28 >35 Behiki et al. 1986<br />
Aspergillus fumigatus 24 Helgesen et al. 1975<br />
Culture enrichie >42 DeLuca 1992<br />
Culture Pseudomonas<br />
ADP sp. (12<br />
Mandelbaum et al.<br />
7,3 25 0,5-2<br />
précultures à<br />
1993a<br />
100 mg. L -1 )<br />
Culture Pseudomonas<br />
ADP sp. . (6<br />
Mandelbaum et al.<br />
7,3 25 4-8<br />
précultures à<br />
1993a<br />
100 mg. L -1 )<br />
(références dans Mandelbaum 1993)<br />
Mandelbaum et al. (1995) ont montré que <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. et son activité de<br />
<strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine n’étaient pas directement corrélées. Ainsi, Pseudomonas ADP sp. est<br />
capable de minéraliser l’atrazine dans des conditions non favorables à sa croissance.<br />
Pseudomonas ADP sp. continuerait de métaboliser l’atrazine au delà de ses besoins en azote. Ceci<br />
serait lié au fait que quelques enzymes responsables du métabolisme de l’atrazine seraient présentes<br />
dans le cytop<strong>la</strong>sme ou le perip<strong>la</strong>sme des bactéries.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
66
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas<br />
III.4 Mécanisme de dégradation de l’atrazine et isolement des gènes<br />
de Pseudomonas ADP sp. impliqués dans <strong>la</strong> minéralisation de<br />
l’atrazine<br />
Parmi les différentes bactéries isolées, capables de dégrader l’atrazine, on peut remarquer que <strong>la</strong><br />
première étape de dégradation <strong>bio</strong>logique de l’atrazine a lieu soit par N-dealky<strong>la</strong>tion soit par<br />
dechloration (Struthers et al. 1998).<br />
La Figure 12 représente <strong>la</strong> voie catabolique de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Figure 13 : Mécanisme de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.selon Martinez et al.<br />
(2001)<br />
67<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas<br />
Le métabolisme de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. a été <strong>la</strong>rgement exploré au cours de ces<br />
dernières années et <strong>la</strong> séquence complète des gènes codant <strong>pour</strong> les enzymes impliquées dans le<br />
catabolisme de l’atrazine a été déterminée (gènes AtzA à Atz F). Elle contient 108,845 nucléotides<br />
situés sur le p<strong>la</strong>smide pADP-1 et répartis sur 3 régions différentes.<br />
Des gènes simi<strong>la</strong>ires, codants <strong>pour</strong> ces mêmes enzymes ont été retrouvés chez une grande variété<br />
de bactéries, gram-négatif ou gram-positif (Bouquard et al, 1997 ; de Souza et al., 1998 ; Radosevich<br />
et al., 1995 ; Rousseaux et al., 2001 ; Topp et al., 2000).<br />
Le métabolisme de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. comporte une première étape de<br />
déchloration catalysée par une atrazine chlorohydro<strong>la</strong>se (AtzA) et conduisant à <strong>la</strong> formation<br />
d’hydroxyatrazine (HA) (de Souza et al. 1995 et 1996). AtzB catalyse ensuite l’hydrolyse de<br />
l’hydroxyatrazine (HA) formée à <strong>la</strong> première étape <strong>pour</strong> donner du N-isopropy<strong>la</strong>mmelide (Boundy-Mills<br />
et al. 1997). La troisième étape implique une N-isopropy<strong>la</strong>mmelide isopropy<strong>la</strong>minohydro<strong>la</strong>se (AtzC)<br />
qui par hydrolyse du substrat forme l’acide cyanurique (Sadowsky et al. 1998). S’en suit un clivage du<br />
cycle triazine et <strong>la</strong> formation de Biuret (AtzD), Allophanate (AtzE) <strong>pour</strong> finalement donner de<br />
l’ammonium et du dioxyde de carbone par une ultime réaction (AtzF) (Martinez et al. 2001).<br />
Les produits issus des premières et deuxièmes étapes de dégradations de l’atrazine par<br />
Pseudomonas ADP sp. sont des métabolites non phytotoxiques, et moins mobiles que l’atrazine<br />
(Boundy-Mills et al., 1997).<br />
III.5 Différentes applications<br />
III.5.1<br />
Traitement des eaux résiduelles d’usine de fabrication de pesticides<br />
Certains auteurs ont imaginé utiliser Pseudomonas sp. ADP <strong>pour</strong> traiter les eaux résiduelles d’usine<br />
de fabrication de pesticide, avant qu’elles ne soient rejetées dans les eaux usées municipales. La<br />
présence de forte concentration en sels (> 4%) dans ces eaux résiduelles représente un obstacle <strong>pour</strong><br />
tout <strong>traitement</strong> <strong>bio</strong>logique. Pour survivre dans un milieu dont <strong>la</strong> salinité est élevée les cellules doivent<br />
lutter contre <strong>la</strong> pression osmotique par accumu<strong>la</strong>tion dans le cytosol de solutés dits osmolytes. Shapir<br />
et al. (1998) ont montré que Pseudomonas ADP sp. était capable de survivre dans un milieu riche en<br />
sel (jusqu’à 4% de NaCl) par synthèse de thréalose comme principal osmolyte. De plus, prouvant que<br />
Pseudomonas ADP sp. était capable de minéraliser l’atrazine dans des eaux résiduelles réelles à 3%<br />
de NaCl (réduction de <strong>la</strong> concentration en atrazine de 25 à 3 mg.L -1 en 48h), ils concluent à <strong>la</strong><br />
possibilité d’utiliser cette souche dans le <strong>traitement</strong> des effluents liquides d’usines de synthèse<br />
d’atrazine.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
68
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas<br />
Auparavant, Kauffmann et Mandelbaum (1996) avaient pensé, afin de s’affranchir des problèmes de<br />
survie bactérienne dans les effluents industriels, utiliser les enzymes de Pseudomonas ADP sp.<br />
impliquées dans <strong>la</strong> dégradation de l’atrazine, en les iso<strong>la</strong>nt et en les fixant dans une matrice<br />
(tetraméthyl orthosilicate sol-gel). Les performances de cette technique se sont avérées limitées car <strong>la</strong><br />
production de méthanol lors de <strong>la</strong> formation du gel entraînait une réduction de l’activité des enzymes ;<br />
jusqu’à présent aucune autre étude n’a été publiée à ce sujet.<br />
III.5.2<br />
Traitement des sols pollués<br />
D’autres auteurs, comme Masaphy et Mandelbaum (1997), ont proposé d’utiliser Pseudomonas ADP<br />
sp. <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> in situ de sols contaminés à l’atrazine. Ils ont montré l’efficacité d’un procédé de<br />
<strong>bio</strong>augmentation (addition de micro-organismes au sol) et étudié l’effet du vieillissement (et donc de <strong>la</strong><br />
<strong>bio</strong>disponibilité) de l’atrazine dans le sol, sur <strong>la</strong> capacité des bactéries à consommer l’herbicide. Ainsi,<br />
dans un sol contenant initialement environ 20 µg d’atrazine par gramme de sol sec, jusqu’à 80% sont<br />
minéralisés par <strong>bio</strong>augmentation avec Pseudomonas ADP sp.<br />
Newcombe et Crowley (1999) ont également suggéré l’utilisation de Pseudomonas ADP sp. <strong>pour</strong><br />
traiter des sols pollués par <strong>bio</strong>augmentation. Ils ont noté que l’application répétée de Pseudomonas<br />
ADP sp. sur un sol pollué, augmentait significativement le taux de minéralisation de l’atrazine. Ainsi,<br />
dans leurs expériences en mesocosmes (atrazine initialement présente à 100 mg.kg -1 de sol), 90% de<br />
l’atrazine sont minéralisés en 35 jours dans le sol inoculé tous les 3 jours avec Pseudomonas ADP sp.<br />
contre 17% seulement lorsque le sol est inoculé une fois seulement.<br />
Kristensen et al. (2001) remarquent que le temps de résidence de l’atrazine dans le sol à traiter influe<br />
particulièrement sur <strong>la</strong> <strong>bio</strong>disponibilité de celle-ci vis à vis des micro-organismes et donc sur sa<br />
minéralisation : plus l’atrazine aura été en contact longtemps avec le sol, plus elle aura formé des<br />
liaisons avec le matériau, moins <strong>la</strong> minéralisation sera efficace. Chung et Alexander (1998) notent<br />
également que plus le sol contient de <strong>la</strong> matière organique, plus l’effet de <strong>bio</strong>disponibilité en fonction<br />
du temps de séjour de l’atrazine est important.<br />
III.5.3<br />
Décontamination de sédiments et aquifères pollués<br />
C<strong>la</strong>usen et al. (2002) ont quant à eux étudié <strong>la</strong> capacité de Pseudomonas ADP sp. a survivre et<br />
minéraliser l’atrazine dans des sédiments en conditions aérobies et en conditions de dénitrification.<br />
Leurs expériences montrent qu’à 10°C, Pseudomonas ADP sp. est capable de minéraliser 50% de<br />
l’atrazine présente initialement 0,6 mg.L -1 en 14 jours aussi bien en conditions aérobies qu’en<br />
conditions d’anoxie en présence de nitrates comme accepteurs final d’électrons. Ils notent cependant,<br />
qu’à fortes concentrations en nitrate (100 mM) <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP<br />
69<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas<br />
sp est inhibée. Quelques années auparavant, Bichat et al. (1999) et Katz et al. (2000) avaient déjà<br />
montré <strong>la</strong> capacité de Pseudomonas ADP sp. à minéraliser l’atrazine en conditions d’anoxie, en<br />
présence d’une source exogène en azote (NH 4 , NO 3 , Urée ou Glycine) et concluaient que <strong>la</strong><br />
dégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. n’était pas affectée par <strong>la</strong> présence d’azote<br />
exogène.<br />
L’existance de telles souches microbiennes capables de dégrader un polluant dans des conditions<br />
d’anoxie en présence de nitrate comme accepteur d’électrons présente un avantage économique<br />
important <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> de sols ou de sédiments comparé aux <strong>traitement</strong> <strong>bio</strong>logiques aérobie où<br />
l’aération forcée à travers le matériau pollué représente un coût non négligeable.<br />
Au Danemark, Kristensen et al. (2001) ont également étudié en <strong>la</strong>boratoire le <strong>traitement</strong> <strong>bio</strong>logique<br />
d’aquifères crayeux. Les résultats de minéralisation montrent que le temps de résidence de l’atrazine<br />
dans le milieu crayeux avait une légère influence sur sa minéralisation par Pseudomonas ADP sp. 50<br />
% de l’atrazine sont minéralisés lorsque celle-ci est incorporée 1 jour avant <strong>bio</strong>augmentation, contre<br />
40% lorsque l’atrazine est incorporé 3 mois plus tôt.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
70
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
<strong>Etude</strong> de d’adsorption<br />
IV. Description mathématique du processus d’adsorption<br />
Ce chapitre a <strong>pour</strong> but de rappeler les bases scientifiques nécessaires à l’exploitation de nos résultats<br />
concernant les phénomènes d’adsorption et d’hydrodynamique <strong>pour</strong> les études en colonne. Il décrit<br />
globalement les modèles c<strong>la</strong>ssiques utilisés <strong>pour</strong> décrire l’adsorption d’un substrat sur une phase<br />
solide et l’écoulement d’une solution à travers un milieu poreux.<br />
IV.1 Modélisation de l’équilibre d’adsorption<br />
L’adsorption s’effectue par formation de liaisons entre les molécules de solutés (adsorbat) et les<br />
groupes fonctionnels ou sites d’adsorption à <strong>la</strong> surface des particules solides (adsorbant). Lors d’un<br />
processus d’adsorption sur un milieu poreux, les molécules sont transférées par diffusion vers <strong>la</strong><br />
surface externe de <strong>la</strong> particule d’adsorbant et sont ensuite éventuellement transférées vers les cavités<br />
constituées par les pores internes du matériau (surfaces internes).<br />
L’adsorption est un phénomène <strong>chimique</strong> ou physique ; il est souvent difficile de faire <strong>la</strong> distinction<br />
entre ces deux types de mécanismes. D’une manière générale, on peut dire que les chaleurs<br />
d’adsorption <strong>pour</strong> les interactions de type physique sont de l’ordre de quelques kJ par mole, tandis<br />
qu’une adsorption <strong>chimique</strong> entraînera des chaleurs plus importantes, en général supérieures à 2-3<br />
kJ.mol -1 . On peut également différencier ces deux phénomènes en comparant leur spécificité :<br />
l’adsorption <strong>chimique</strong> est hautement spécifique alors l’adsorption physique est non spécifique. D’autre<br />
part, l’adsorption physique est favorisée par <strong>la</strong> diminution de <strong>la</strong> température alors que le phénomène<br />
<strong>chimique</strong> est souvent favorisé par une augmentation de température (Ruthven, 1938).<br />
L’adsorption physique met en jeu des forces d’attraction faibles dont : des interactions<br />
électrostatiques, forces de van der Waals, dipôle-dipôles,…<br />
Le transfert d’électrons impliqué dans l’adsorption de type <strong>chimique</strong> entraîne <strong>la</strong> formation de liaisons<br />
covalentes entre le soluté et <strong>la</strong> surface de l’adsorbant.<br />
Pour décrire l’équilibre d’adsorption à l’interface liquide/solide, on exprime <strong>la</strong> quantité de soluté<br />
adsorbée à l’équilibre par unité de masse d’adsorbant (q e ), en fonction de <strong>la</strong> concentration restante<br />
dans <strong>la</strong> solution à l’équilibre (C e ). Une fonction de ce type représente une isotherme d’adsorption et<br />
définit l’équilibre thermodynamique à une température constante.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
71
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
<strong>Etude</strong> de d’adsorption<br />
Le bi<strong>la</strong>n matière utilisé <strong>pour</strong> représenter l’équilibre d’adsorption à un seul composé en milieu dispersé<br />
parfaitement agité est donné par l’équation suivante :<br />
V ( C0 − Ce<br />
) = m ( qe<br />
− q0<br />
)<br />
où :<br />
V : volume de <strong>la</strong> suspension (L 3 )<br />
C 0 : concentration initiale dans <strong>la</strong> phase liquide (M.L -3 )<br />
C e : concentration dans <strong>la</strong> phase liquide à l’équilibre (M.L -3 )<br />
q 0 : concentration initiale dans <strong>la</strong> phase solide (M soluté.M -1 d’adsorbant)<br />
q e : concentration dans <strong>la</strong> phase solide à l’équilibre (M soluté.M -1 d’adsorbant)<br />
m : masse d’adsorbant (M)<br />
Différents modèles mathématiques ont été établis <strong>pour</strong> représenter l’équilibre d’adsorption d’un seul<br />
composé. Parmi les modèles les plus souvent utilisés on peut citer :<br />
Le modèle de Langmuir :<br />
C’est un modèle d’adsorption en monocouche développé à <strong>la</strong> base <strong>pour</strong> modéliser l’adsorption<br />
<strong>chimique</strong> des gaz sur des surfaces solides homogènes (Langmuir, 1918).<br />
Ce modèle est basé sur les hypothèses suivantes :<br />
• La molécule adsorbée est située sur un site bien défini de l’adsorbant (adsorption localisée)<br />
• Chaque site ne peut fixer qu’une molécule<br />
• L’énergie d’adsorption est identique <strong>pour</strong> chaque site et indépendante de <strong>la</strong> présence de<br />
molécules adsorbées sur les sites voisins (pas d’interaction entre les molécules)<br />
L’équation de Langmuir s’écrit comme suit :<br />
1<br />
q<br />
e<br />
=<br />
1<br />
q<br />
m<br />
+<br />
q<br />
m<br />
1<br />
K<br />
L<br />
C<br />
e<br />
q m : concentration max de soluté dans <strong>la</strong> phase solide (M soluté.M -1 adsorbant)<br />
K L : constante d’équilibre qui dépend de <strong>la</strong> température et du type d’interaction adsorbat –<br />
adsorbant (L 3 .M -1 )<br />
C e : concentration du soluté à l’équilibre dans <strong>la</strong> phase liquide (M.L -3 )<br />
L’équation de Langmuir présente deux cas limites. Pour une solution à faible concentration<br />
(K L. C e
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
<strong>Etude</strong> de d’adsorption<br />
D’autre part si <strong>la</strong> concentration dans <strong>la</strong> phase liquide est élevée (K L C e >>1), l’équation est une droite<br />
horizontale de <strong>la</strong> forme :<br />
q<br />
e<br />
= q m<br />
Le modèle de Freundlich :<br />
La re<strong>la</strong>tion empirique de Freundlich a été <strong>la</strong>rgement utilisée <strong>pour</strong> les systèmes hétérogènes et en<br />
particulier <strong>pour</strong> décrire les phénomènes d’adsorption de composés organiques sur le charbon actif<br />
(Freudlich, 1906). La forme de l’équation est <strong>la</strong> suivante :<br />
ln q = ln K + n ln C<br />
e<br />
F<br />
e<br />
K F et n sont les constantes de Freundlich et sont uniques <strong>pour</strong> un composé donné.<br />
Le modèle de Freundlich est plus représentatif des surfaces hétérogènes. Toutefois il est uniquement<br />
adapté sur une intervalle réduite de concentration. Généralement lorsque le modèle s’adapte bien<br />
avec des données à forte concentration, ce n’est pas le cas <strong>pour</strong> les très faibles concentrations.<br />
On peut également citer Modèle Brunauer, Emmett et Teller (BET) (Brunauer et al., 1938) qui est<br />
une extension du modèle de Langmuir vers l’adsorption multi-couche et qui répond aux hypothèses<br />
suivantes :<br />
• Chaque molécule adsorbée dans <strong>la</strong> première couche forme un site d’adsorption <strong>pour</strong> <strong>la</strong><br />
seconde et ainsi de suite <strong>pour</strong> les couches supérieures.<br />
• Les molécules des couches supérieures se conduisent essentiellement comme le liquide<br />
saturé sous une réaction de condensation.<br />
• Les couches supérieures peuvent se former sans que <strong>la</strong> couche antérieure ait rempli<br />
complètement <strong>la</strong> surface d’adsorbant.<br />
• La constante d’équilibre des premières molécules adsorbées est différente de celle des<br />
couches molécu<strong>la</strong>ires supérieures.<br />
Cette équation est particulièrement adaptée <strong>pour</strong> <strong>la</strong> détermination de <strong>la</strong> capacité maximale<br />
d’adsorption de <strong>la</strong> plupart des adsorbants.<br />
La Théorie du Potentiel proposée par Po<strong>la</strong>ny (1916) suppose que l’adsorption est due aux forces<br />
d’attraction qui s’étendent au-delà de <strong>la</strong> surface d’adsorbant. La théorie considère un espace<br />
d’adsorption proche de <strong>la</strong> surface d’adsorbant et un potentiel d’adsorption ε, qui représente <strong>la</strong><br />
différence d’énergie potentielle entre les molécules du soluté adsorbées et le soluté dans <strong>la</strong> solution.<br />
73<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
<strong>Etude</strong> de d’adsorption<br />
D’autres modèles existent aujourd’hui qui permettent de modéliser l’adsorption d’un composé sur un<br />
support solide (isotherme d’Elovich, de Temkin…) ; nous ne les aborderons pas ici.<br />
IV.2 Ecoulement dans un milieu poreux<br />
Dans le cadre de nos études en colonne, nous avons été amenés à étudier l’écoulement à travers<br />
notre support poreux d’écorce de pin et à utiliser quelques notions de base présentées ci-dessous<br />
concernant les vitesses d’écoulement.<br />
L’écoulement en milieu poreux est décrit par une loi principale, <strong>la</strong> loi de Darcy, et fait intervenir un<br />
certain nombre de paramètres comme <strong>la</strong> tortuosité ou <strong>la</strong> vitesse de pore, énumérés ci-dessous.<br />
IV.2.1 Organisation du milieu poreux<br />
Les milieux poreux contiennent un certain <strong>pour</strong>centage de vides qui peuvent être occupés par de<br />
l’eau ou d’autres fluides. D’un point de vue macroscopique, le milieu poreux peut être divisé en trois<br />
composantes principales : une composante solide, une composante aqueuse et une composante<br />
gazeuse. La Figure 14 définit les principales re<strong>la</strong>tions qui existent entre les volumes V et masses M<br />
des différentes entités.<br />
Re<strong>la</strong>tions Volumiques<br />
Re<strong>la</strong>tions Massiques<br />
Va<br />
AIR<br />
Ma<br />
Vt<br />
Ve<br />
EAU<br />
Me<br />
Mt<br />
Vs<br />
SOLIDE<br />
Ms<br />
Figure 14 : Représentation des différentes phases d’un milieu poreux<br />
Les principales caractéristiques permettant de définir un milieu poreux sont :<br />
• La masse volumique apparente à l’état sec :<br />
m<br />
ρ s<br />
b<br />
=<br />
Vt<br />
74<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
<strong>Etude</strong> de d’adsorption<br />
• La masse volumique apparente totale :<br />
m<br />
ρ<br />
t<br />
app<br />
=<br />
Vt<br />
• La Porosité totale :<br />
Avec le volume de vide : Vv = Va + Ve<br />
ε =<br />
volume de " vide"<br />
Va + Ve<br />
=<br />
volume total Vt<br />
La porosité se subdivise en trois catégories, selon <strong>la</strong> c<strong>la</strong>ssification adoptée par l’IUPAC (International<br />
Union of Pure and Applied Chemistry) :<br />
Macroporosité : diamètre de pore > 50 nm<br />
Mesoporosité : diamètre de pore de 2 à 50 nm<br />
Microporosité : diamètre de pore < 2 nm<br />
Certains auteurs distinguent également deux catégories de micropores : les micropores primaires<br />
(ultramicropores) dont le diamètre est inférieure à 0,8 nm, et les micropores secondaires dont le<br />
diamètre est compris entre 0,8 et 2 nm (Lastokie et al., 1993).<br />
• Le Degré de saturation :<br />
Ve<br />
s =<br />
Ve + Va<br />
• L’indice de vide :<br />
Va + Ve<br />
e =<br />
Vs<br />
• La Teneur en eau est caractérisée par deux paramètres essentiels :<br />
- l’humidité pondérale w<br />
masse d'<br />
eau<br />
w =<br />
=<br />
masse de sol sec<br />
m<br />
m<br />
a<br />
s<br />
- l’humidité volumique θ<br />
volume d'<br />
eau<br />
θ =<br />
volume total<br />
=<br />
Ve<br />
Vt<br />
D’autre part, on peut définir <strong>la</strong> structure du milieu poreux comme l’arrangement réciproque et<br />
l’orientation des particules entre elles. Il existe notamment des structures à particules isolées, des<br />
structures massives et des structures en agrégats. Dans le cadre de notre étude, nous nous<br />
restreindrons au cas des milieux poreux granu<strong>la</strong>ires, formés de particules poreuses isolées.<br />
En outre, dans nos conditions, nous considérerons le milieu comme étant saturé en eau (Va=0).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
75
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
<strong>Etude</strong> de d’adsorption<br />
IV.2.2 Hétérogénéité de l’écoulement<br />
Les caractéristiques hydrodynamiques peuvent être différentes au sein même de <strong>la</strong> matrice du fait de<br />
son hétérogénéité. Dans certaines régions du volume poreux, l’écoulement est plus ou moins lent,<br />
parfois même nul. Les paramètres responsables de cette hétérogénéité de l’écoulement sont :<br />
La structure du milieu<br />
La teneur en eau au moment de l’infiltration<br />
De fortes vitesses d’écoulement qui ont tendance à favoriser les écoulements préférentiels<br />
La présence d’une <strong>la</strong>me d’eau à <strong>la</strong> surface qui favorise également les écoulements<br />
préférentiels.<br />
Les phénomènes principaux qui participent à l’écoulement sont :<br />
• La convection, qui désigne l’écoulement massique de <strong>la</strong> solution dans <strong>la</strong> porosité<br />
perco<strong>la</strong>nte (pores ouverts ou connectés). Le soluté se dép<strong>la</strong>ce avec <strong>la</strong> phase mobile.<br />
• La dispersion hydrodynamique, différenciée en :<br />
Dispersion cinématique, provoquée par l’hétérogénéité de <strong>la</strong> distribution des<br />
vitesses d’écoulement dans un milieu poreux (fonction de <strong>la</strong> structure et de <strong>la</strong><br />
texture du milieu)<br />
Diffusion molécu<strong>la</strong>ire, due aux gradients de concentrations entre les zones<br />
mobiles (porosité perco<strong>la</strong>nte) et les zones stagnantes (porosité intraparticu<strong>la</strong>ire<br />
ou pores semi-ouverts ou mal connectés ou zones stagnantes par<br />
écoulement non homogène de <strong>la</strong> porosité perco<strong>la</strong>nte).<br />
IV.2.3 Loi de Darcy<br />
La loi de Darcy permet de décrire simplement l’écoulement, qui dans <strong>la</strong> configuration réelle d’une<br />
matrice poreuse est trop compliquée <strong>pour</strong> être considérée dans ses détails microscopiques, car les<br />
vitesses de fluide varient considérablement d’un point à un autre et même le long d’un même<br />
parcours.<br />
Dans le cas des milieux saturés continus, le débit d’un liquide incompressible s’écou<strong>la</strong>nt à travers un<br />
milieu poreux peut se calculer grâce à <strong>la</strong> re<strong>la</strong>tion suivante :<br />
Q = −K<br />
. S . ∆H<br />
(m 3 /s)<br />
où<br />
S : surface de <strong>la</strong> section d’écoulement (m 2 )<br />
76<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE<br />
<strong>Etude</strong> de d’adsorption<br />
∆H : charge hydraulique (-)<br />
K : coefficient de perméabilité ou conductivité hydraulique (m/s)<br />
(K est le rapport entre <strong>la</strong> perméabilité k et <strong>la</strong> viscosité dynamique η du fluide)<br />
La vitesse de Darcy, q, est une vitesse fictive du fluide à <strong>la</strong> sortie du massif, comme si toute <strong>la</strong> section<br />
du massif était soumise à l’écoulement.<br />
q =<br />
Q<br />
(m/s)<br />
S<br />
Limite de <strong>la</strong> Loi de Darcy<br />
La re<strong>la</strong>tion entre le flux et le gradient hydraulique n’est plus linéaire aux grandes vitesses<br />
d’écoulement <strong>pour</strong> lesquelles les forces d’inertie ne sont plus négligeables par rapport aux forces de<br />
viscosité. On peut aussi obtenir des phénomènes qui s’écartent de <strong>la</strong> loi de Darcy à l’autre extrémité<br />
de <strong>la</strong> gamme de vitesses d’écoulement, notamment aux faibles gradients et dans les petits pores.<br />
IV.2.4 Vitesse d’écoulement et tortuosité<br />
D’une manière générale, on considère que l’écoulement ne se fait pas à travers toute <strong>la</strong> section S, car<br />
seule <strong>la</strong> fraction correspondant à <strong>la</strong> porosité est ouverte à l’écoulement. De plus, le chemin réel<br />
d’écoulement δ est plus grand que <strong>la</strong> longueur L de <strong>la</strong> colonne à cause de <strong>la</strong> tortuosité τ:<br />
δ<br />
τ = (-)<br />
L<br />
D’autre part, l’eau ne s’écoule qu’à travers les pores du milieu. Une définition correcte de <strong>la</strong> vitesse<br />
d’écoulement implique donc une redéfinition de <strong>la</strong> section à travers <strong>la</strong>quelle s’effectue l’écoulement.<br />
On définit donc <strong>la</strong> vitesse de pore comme le rapport entre <strong>la</strong> vitesse de Darcy et <strong>la</strong> teneur en eau<br />
effective :<br />
q<br />
v = (m/s)<br />
θ<br />
eff<br />
où θ eff<br />
prend tient compte uniquement de <strong>la</strong> fraction d’eau qui participe à l’écoulement.<br />
77<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
227
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
234
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
78<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
<strong>Etude</strong> du support d’adsorption :Ecorce de pin<br />
I. <strong>Etude</strong> du support d’adsorption : l’écorce de pin « Pinus<br />
pinaster »<br />
I.1 Origine et répartition<br />
Le pin maritime (Pinus pinaster) se rencontre près des côtes at<strong>la</strong>ntiques et méditerranéennes, en<br />
Espagne, en Italie, au Maroc mais plus particulièrement au Portugal dans les régions du centre et du<br />
nord, et sur côtes at<strong>la</strong>ntiques du sud ouest de <strong>la</strong> France. La Figure 1 représente l’occupation de Pinus<br />
pinaster en Europe et Afrique du Nord.<br />
Figure 1 : Distribution de Pinus pinaster en Europe et en Afrique du Nord (Rato<strong>la</strong>, 2002)<br />
Au Portugal, le pin maritime représente 31% des espèces rencontrées en forêt ; mais aujourd’hui le<br />
nombre de pins maritime décroît régulièrement en faveur de l’eucalyptus. La Figure 2 représente <strong>la</strong><br />
répartition des espèces peup<strong>la</strong>nt les forêts portugaises.<br />
Autres feuillus<br />
3%<br />
Chêne vert<br />
14%<br />
Chataigner<br />
1%<br />
Eucalyptus<br />
21%<br />
Chêne faginé<br />
ou rouvre<br />
4%<br />
Autres<br />
résineux<br />
1%<br />
Pinus pinaster<br />
(maritime)<br />
31%<br />
Pinus pinea<br />
(parasol)<br />
2%<br />
Chêne liège<br />
23%<br />
Figure 2: Répartition des espèces forestière du Portugal (Inventaire National des forets – 3 ème édition,<br />
1998)<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
79
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
<strong>Etude</strong> du support d’adsorption :Ecorce de pin<br />
En France, le pin maritime également appelé pin des Landes, est imp<strong>la</strong>nté dans <strong>la</strong> région du sudouest<br />
depuis l’antiquité ; il fut cultivé de manière intensive à partir du XIX ème siècle afin d’enrayer le<br />
phénomène d’ensablement de <strong>la</strong> côte <strong>la</strong>ndaise et d’assainir les zones marécageuses. Aujourd’hui, il<br />
recouvre près d’un million d’hectares et constitue l’une des essences forestières les plus importantes<br />
de France.<br />
Pinus pinaster est un résineux de 20 à 30 mètres de haut, au tronc flexueux, à <strong>la</strong> cime peu compacte<br />
et à l’écorce brun-rouge (figure 3).<br />
Figure 3 : Ecorce de pin Pinus pinaster<br />
Au Portugal le pin maritime, dit « pinheiro bravo », représente <strong>la</strong> principale source de matière<br />
première <strong>pour</strong> les scieries, qui représente près de 70% de <strong>la</strong> production totale de bois. (Rato<strong>la</strong>, 2002).<br />
Le Portugal produirait chaque année 6 millions de mètres cube de bois de pin (Rato<strong>la</strong>,2002). En<br />
considérant que 1 m 3 de bois sec produit 100 kilos d’écorce, 600 000 tonnes d’écorce <strong>pour</strong>raient être<br />
disponibles annuellement (Fradinho et al., 2002). Ainsi, l’écorce en tant que matériau abondant et<br />
gratuit (déchet de l’industrie du bois) représenterait une source valorisable intéressante.<br />
I.2 Chimie générale des écorces<br />
Les écorces sont, en général, constituées d’une fine couche intérieure (phloem) et d’une couche<br />
externe (rytidom) séparées par une couche intermédiaire (periderm). L’épaisseur de l’écorce varie en<br />
fonction de l’espèce de l’arbre et de son âge. Les parois cellu<strong>la</strong>ires qui constituent le phloem sont<br />
principalement riches en amidon, en acides gras et en tanins. Les résines circulent quant à elles, à<br />
l’intérieur de minuscules canaux. Le periderm est composé de trois couches dont l’épaisseur varie<br />
avec l’espèce.<br />
La liste des composés rencontrés dans l’écorce est très longue ; on peut cependant citer les<br />
principales familles de composés qui sont : les hydrates de carbone (cellulose, hemicellulose), les<br />
80<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
<strong>Etude</strong> du support d’adsorption :Ecorce de pin<br />
pectines, les lignines, <strong>la</strong> subérine, les terpènes (f<strong>la</strong>vonoïdes, salicines, tanins, stilbènes et autres), et<br />
des poly-f<strong>la</strong>vonoïdes.<br />
La composition des lignines des écorces de conifères reste mal connu à cause de <strong>la</strong> difficulté qu’il<br />
existe à isoler celles-ci sans contamination par des impuretés phénoliques. Cependant quelques<br />
études suggèrent des structures particulières et indiquent que les lignines de l’écorce sont bien<br />
différentes des lignines du bois ; elles contiennent notamment plus d’acides dicarboxyliques et moins<br />
d’acide 3-4-dimetoxibenzoïque, éther diaril et dimères biphényl.<br />
D’autre part, des acides dicarboxyliques ainsi que des acides gras libres (acide béenique, acide<br />
lignocérique, et phérulique) ont été identifiés comme constituants des cires d’écorce, ainsi que de<br />
petites quantités d’acides gras insaturés et des résines acides.<br />
La subérine de l’écorce serait un complexe formé principalement par des hydroxyacides gras. Des<br />
acides phénoliques sont également présents dans cette composition. Certains hydroxyacides gras<br />
seraient unis entre eux par une liaison ester.<br />
D’après ce qu’on connaît sur <strong>la</strong> chimie de l’écorce, on peut considérer que l’écorce <strong>pour</strong>rait être<br />
utilisée comme matrice « échangeur d’ions ». Le contenu important de groupes fonctionnels,<br />
principalement <strong>la</strong> présence de groupes hydroxyles, carboxyliques et phénoliques, rend l’écorce<br />
intéressante <strong>pour</strong> des fixations ioniques.<br />
I.3 Caractéristiques <strong>physico</strong>- <strong>chimique</strong>s de l’écorce de pin<br />
Différentes études menées dans divers domaines (Ramirez Lopez, 2001 ; Vazquez et al 1994 ; …)sur<br />
l’écorce de pin ont permis de mettre en évidence les caractéristiques <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s générales de<br />
l’écorce de pin Pinus pinaster. Des analyses supplémentaires ont été réalisées dans le cadre de notre<br />
étude.<br />
L’écorce de pin utilisée dans cette étude provient d’une scierie du nord du Portugal. Elle nous a été<br />
livrée sous forme brute, n’ayant subi aucun <strong>traitement</strong> préa<strong>la</strong>ble (morceaux d’environ 10 cm de long<br />
sur 4 cm de <strong>la</strong>rge).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
81
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
<strong>Etude</strong> du support d’adsorption :Ecorce de pin<br />
I.3.1 Caractéristiques physiques<br />
La surface spécifique de notre matériau, le volume de pore et <strong>la</strong> taille des pores ont été déterminés à<br />
l’Institut de Recherche en Catalyse (CNRS, Villeurbanne) selon les méthodes BET, Single Point, t.Plot<br />
et BJH.<br />
I.3.1.1<br />
Principe de <strong>la</strong> méthode BET<br />
Les surfaces spécifiques du matériau ont principalement été obtenues par application de <strong>la</strong> théorie de<br />
Brunauer, Emmett et Teller (BET) aux isothermes d’adsorption d’azote à 77°K. La théorie repose sur<br />
l’hypothèes d’une adsorption multimolécu<strong>la</strong>ire due à des liaisons faibles du type Van der Waals.<br />
L’énergie d’adsorption d’une molécule sur <strong>la</strong> surface est différente de celle d’une molécule située sur<br />
<strong>la</strong> deuxième couche. Le calcul permet d’établir l’équation BET de l’isotherme d’adsorption :<br />
P<br />
P0<br />
1 C −1<br />
P<br />
= +<br />
V ( 1−<br />
P ) Vm.<br />
C Vm.<br />
C P0<br />
P<br />
0<br />
où :<br />
V : volume de gaz adsorbé à <strong>la</strong> pression re<strong>la</strong>tive P/P 0<br />
V m : volume de gaz nécessaire <strong>pour</strong> couvrir <strong>la</strong> surface d’une monocouche<br />
C : facteur proportionnel à <strong>la</strong> différence entre l’énergie d’adsorption de <strong>la</strong> première couche et<br />
l’énergie de liquéfaction<br />
P<br />
P0<br />
Pour obtenir <strong>la</strong> surface spécifique, on porte<br />
en fonction de P/P 0 . La courbe théorique est<br />
V (1 − P )<br />
P<br />
C −1<br />
1<br />
une droite de pente et d’ordonnée à l’origine .<br />
Vm.<br />
C<br />
V m<br />
. C<br />
En pratique <strong>la</strong> courbe est linéaire que <strong>pour</strong> l’intervalle de pression re<strong>la</strong>tive P/P 0 compris entre 0,05 et<br />
0,35. La surface spécifique est calculée à partir de <strong>la</strong> valeur V m déduite de <strong>la</strong> transformée linéaire<br />
BET.<br />
0<br />
I.3.1.2<br />
Principales caractéristiques<br />
La masse volumique apparente (ρ app ), <strong>la</strong> masse volumique réelle (ρ re ) ainsi que l’indice de vide (ε 0 ) ont<br />
été déterminés sur <strong>la</strong> poudre d’écorce de pin de diamètre d inférieur à 200 µm.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
82
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
<strong>Etude</strong> du support d’adsorption :Ecorce de pin<br />
La masse volumique apparente (ρ app ) de <strong>la</strong> poudre d’écorce a été déterminée par remplissage d’un<br />
récipient de volume connu (Vt) avec le matériau en question, tassé de <strong>la</strong> même manière que <strong>pour</strong> les<br />
expériences en colonnes.<br />
La masse volumique réelle (ρ re ) a été déterminée après remplissage d’eau des lits d’écorce de pin<br />
ainsi formés. Le volume d’eau utilisé était le volume de vide (V v ) accessible à l’eau, on a :<br />
m<br />
ρ<br />
re<br />
=<br />
et<br />
V −V<br />
t<br />
v<br />
ρ<br />
app<br />
=<br />
m<br />
V<br />
t<br />
Avec :<br />
m : masse de l’échantillon dans le récipient (kg)<br />
V t : volume total du récipient (m 3 )<br />
V v : volume de vide (m 3 )<br />
ρ re : masse volumique réelle (kg/m 3 )<br />
ρ app : masse volumique apparente (kg/m 3 )<br />
La porosité totale (ε) adimensionnelle est donnée par l’équation :<br />
ε =<br />
V<br />
V<br />
v<br />
t<br />
Les principales caractéristiques physiques de notre écorce sont présentées dans le Tableau 1.<br />
Tableau 1 : Caractéristiques physiques de l’écorce de pin (d
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
<strong>Etude</strong> du support d’adsorption :Ecorce de pin<br />
Une analyse BET a également été réalisée en parallèle sur l’écorce en poudre stérilisée (voir<br />
procédure de stérilisation I.7) et non stérilisée. Les résultats présentés au Tableau 2, montrent que <strong>la</strong><br />
stérilisation ne modifie pas significativement <strong>la</strong> surface spécifique du matériau.<br />
Tableau 2 : Analyse de <strong>la</strong> surface spécifique de l’écorce de pin (BET sur écorce broyée à d
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
<strong>Etude</strong> du support d’adsorption :Ecorce de pin<br />
La caractérisation de <strong>la</strong> matière organique (MO) de l’écorce de pin (Tableau 4) montre que le<br />
constituant majeur est d’origine ligneuse (environ 50% de <strong>la</strong> MO). L’écorce possède ainsi une grande<br />
stabilité <strong>bio</strong>logique. Celle-ci peut être exprimée par le paramètre Tr (sadef.fr 2003) défini comme suit :<br />
MO Hemicellulose fraction de Van der Soest Lignine<br />
Tr = a − b<br />
+ c<br />
+ d +<br />
MSo MSo<br />
MSo<br />
MSo<br />
MM<br />
MSo<br />
avec :<br />
MO : % matière organique<br />
MSo : %matière organique soluble<br />
MM : % matière minérale<br />
(a, b, c et d sont des coefficients)<br />
On note également que <strong>la</strong> matière organique soluble représente environ 15% de <strong>la</strong> matière organique.<br />
Si cette matière organique soluble n’est pas toxique <strong>pour</strong> les micro-organismes et si elle est<br />
suffisamment <strong>bio</strong>dégradable, on peut imaginer qu’elle <strong>pour</strong>ra être utilisée comme source de carbone<br />
par les bactéries utilisées dans notre procédé <strong>combiné</strong> de <strong>bio</strong>filtration.<br />
Tableau 4 : Caractérisation de <strong>la</strong> matière organique<br />
% de <strong>la</strong> matière organique<br />
Matière organique soluble 14,9<br />
Matière Hémicellulosiqiue 1,1<br />
Matière ligneuse 54,8<br />
Matière cellulosique 29,2<br />
Stabilité <strong>bio</strong>logique (Tr) 126 (Sadef.fr 2003)<br />
I.3.3 Analyse Infra Rouge des fonctions de surface<br />
Une analyse par spectrométrie IR a été réalisée à l’Unité de Recherche en Génie Civil (URGC, INSA<br />
de Lyon) afin d’identifier les principales fonctions <strong>chimique</strong>s présentes à <strong>la</strong> surface du matériau<br />
« Ecorce de pin ». La connaissance des fonctions de surface a permis d’émettre des hypothèses<br />
quant aux types de liaisons susceptibles de s’établir lors des phénomènes d’adsorption ou absorption<br />
de l’atrazine sur le support d’écorce de pin.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
85
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
<strong>Etude</strong> du support d’adsorption :Ecorce de pin<br />
I.3.3.1<br />
Principe de l’analyse Infra Rouge<br />
La spectrométrie infra-rouge est une méthode d’analyse non destructive, basée sur l’étude de<br />
l’absorption par l’échantillon des radiations électromagnétiques de longueurs d’ondes λ comprises<br />
entre 1 et 1000 µm, soit un nombre d’onde ν=1/λ compris entre 1 et 10 -3 m -1 . La partie <strong>la</strong> plus riche en<br />
informations et <strong>la</strong> plus accessible d’un point de vue expérimental est celle du moyen infra-rouge<br />
(λ compris entre 2,5 et 25 µm soit ν compris entre 0,04 et 0,4 µm -1 ). Les absorptions dans ce<br />
domaine forment une sorte d’empreinte spectrale des composés caractéristiques des liaisons<br />
interatomiques qui les composent.<br />
I.3.3.2<br />
Protocole expérimental<br />
L’analyse IR s’effectue sur des pastilles de KBr fabriquées en respectant les proportions suivantes :<br />
300 mg de KBr et 5 mg de matériau broyé finement. La masse de mé<strong>la</strong>nge prélevée <strong>pour</strong> faire <strong>la</strong><br />
pastille est de 30 mg. L’analyse est répétée 5 fois <strong>pour</strong> un nombre d’onde variant entre 400 et<br />
4000 cm -1 . Le spectre obtenu résulte de <strong>la</strong> moyenne de ces 5 ba<strong>la</strong>yages.<br />
L’appareil utilisé est un Perkin Elmer de type dispersif (Spectrum One, FTIR Spectrometer) Les<br />
spectres ont été traités avec le logiciel Spectrum.<br />
Le spectre d’adsorption Infra Rouge obtenu <strong>pour</strong> l’analyse de l’écorce de pin en poudre (fraction<br />
d
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
<strong>Etude</strong> du support d’adsorption :Ecorce de pin<br />
I.4 Observations de <strong>la</strong> structure l’écorce de pin au MEB<br />
La microstructure de l’écorce de pin en poudre a été caractérisée par observation au Microscope<br />
Electronique à Ba<strong>la</strong>yage Jeol 840 LGS au Centre d’<strong>Etude</strong>s et de Caractérisations Micro-structurales<br />
de l’INSA de Lyon. Ces observations ont permis de comparer les structures des particules d’écorce<br />
selon leur granulométrire et de les comparer à celle du charbon actif en poudre.<br />
La préparation des échantillons a été réalisée par séchage (chauffage à 80°C) des matériaux à<br />
étudier, puis métallisation à l’or dans un pulvérisateur cathodique BLAZERS SCD 040.<br />
Les clichés obtenus (ANNEXE 2) par observation au MEB des particules d’écorce de pin et de<br />
charbon actif montrent que <strong>la</strong> structure de surface de ces deux matériaux est ressemb<strong>la</strong>nte,<br />
présentant une structure en nid d’abeille (Figure 1). Cependant, le charbon actif semble présenter une<br />
surface plus régulière que l’écorce de pin. L’observation des structures longitudinales des particules<br />
d’écorce et de charbon actif montre également que le charbon actif présente un réseau de canaux<br />
profonds et organisés (le diamètre des pores est d’environ 15 µm) alors que l’écorce est beaucoup<br />
moins organisée et présente de plus gros pores, d’environ 50 µm de diamètre (Figures 2 et 3).<br />
Lorsque l’écorce est broyée à 200 µm, <strong>la</strong> structure longitudinale des particules est détruite et les<br />
canaux internes ne sont plus visibles ; seule une structure en feuillets superposés est encore<br />
observable.<br />
Le charbon semble ainsi présenter une structure poreuse beaucoup plus importante que l’écorce de<br />
pin.<br />
I.5 Préparation de l’écorce en vue des études d’adsorption<br />
Les morceaux d’écorce brute ont été broyés dans un broyeur à <strong>la</strong>me (Retsch SM 2000/1430 UPM) sur<br />
une grille de 2 mm. La poudre d’écorce a ensuite été séparée en différentes fractions<br />
granulométriques sur des tamis de 200 µm, 400 µm, 700 µm et 2 mm. L’écorce en poudre a été<br />
séchée dans une étuve à 80°C pendant 24 h avant chaque utilisation puis conservée si nécessaire<br />
dans un récipient hermétique.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
87
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
<strong>Etude</strong> du support d’adsorption :Ecorce de pin<br />
Figure 4 : Ecorce brute de pin Pinus Pinaster<br />
I.6 Préparation d’un extrait aqueux d’écorce de pin<br />
L’utilisation d’extrait d’écorce de pin nous a permis de réaliser des expériences en milieu liquide, tout<br />
en gardant des conditions <strong>chimique</strong>s simi<strong>la</strong>ires aux conditions imposées par <strong>la</strong> présence de l’écorce<br />
elle-même (pH acide et présence des composés hydrosolubles de l’écorce). L’utilisation d’extrait a<br />
ainsi permis d’étudier <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. ainsi que sa capacité à dégrader<br />
l’atrazine dans ces conditions tout en s’affranchissant des autres processus liés à <strong>la</strong> présence de<br />
particules dans le milieu tels que les phénomènes d’adsorption.<br />
L’extrait d’écorce de pin a été obtenu en mettant au contact de <strong>la</strong> poudre d’écorce (d
ETUDE EXPERIMENTALE<br />
<strong>Etude</strong> du support d’adsorption :Ecorce de pin<br />
méthode a été inspirée d’une étude réalisée sur les méthodes de stérilisation des sols (Wolf et al.<br />
1989).<br />
L’extrait aqueux d’écorce de pin a, quant à lui, été stérilisé par filtration à 0,2 µm sur des membranes<br />
de nitrate de cellulose.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
89
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
II. Adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
II.1. Matériel et Méthodes<br />
II.1.1 <strong>Etude</strong> de l’adsorption en batch<br />
II.1.1.1<br />
L’atrazine : caractéristiques générales et méthodes d’analyses<br />
II.1.1.1.1<br />
Caractéristiques <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s<br />
La formule développée (Figure 5) ainsi que les principales caractéristiques <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s de<br />
l’atrazine sont présentées dans le Tableau 5.<br />
Cl<br />
N<br />
N<br />
N<br />
N<br />
N<br />
H<br />
H<br />
(2-chloro-4-ethy<strong>la</strong>mino-6isopropy<strong>la</strong>mino-1,3,5triazine)<br />
Figure 5 : Formule développée de l’atrazine<br />
Tableau 5 : Propriétés <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s de l’atrazine (source : Dialogweb.com)<br />
Formule brute C 8 H 14 ClN 5<br />
Aspect<br />
Cristallin solide, incolore<br />
Masse mo<strong>la</strong>ire 215,69 g.mol -1<br />
Masse volumique 1,2 g/cm 3 à 20°C<br />
pKa* 1,64<br />
Solubilité dans eau 30 mg.L -1 à 20°C ; 70 mg.L -1 à 25°C<br />
Solubilité dans méthanol 15000 mg/l à 20°C<br />
Pression de vapeur 3.85 x 10 -5 Pa à 25°C<br />
Point de fusion 175,8 °C<br />
Point d’ébullition<br />
205,0 °C / 101 kPa<br />
Stabilité<br />
Re<strong>la</strong>tivement stable à pH neutre, légèrement acide ou basique.<br />
Rapidement hydrolysé à pH très acide ou très basique et à 70°C à pH<br />
7.<br />
DT50 9,5 j. (pH 1), 86 j. (pH 5), 5,0 j. (pH 13)<br />
Kow 398<br />
Coefficient de partition log P : 2,5 log Kow : 2,6<br />
Moment dipo<strong>la</strong>ire 4,63 Debye (Weber 1967)<br />
* pKa de <strong>la</strong> forme protonée<br />
90<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
On retiendra essentiellement de ces caractéristiques que l’atrazine est une base faible (pKa de <strong>la</strong><br />
forme protonée 1,64), et qu’elle n’est donc pas ionisée à des pH aux alentours de 4-5 souvent<br />
imposés par <strong>la</strong> présence de l’écorce de pin dans un milieu liquide aqueux.<br />
On note également <strong>la</strong> faible hydrosolubilité de l’atrazine qui nous a conduits à utiliser des solutions<br />
mères à 2000 mg.L -1 préparées dans le méthanol et diluées dans l’eau au moment des essais <strong>pour</strong><br />
obtenir les concentrations initiales souhaitées. La présence résiduelle de méthanol agissant comme<br />
cosolvant dans les solutions aqueuses ainsi préparées a permis de travailler à des concentrations en<br />
atrazine al<strong>la</strong>nt jusque 50 mg.L -1 .<br />
L’effet du méthanol résiduel sur l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin a été testé (Figure 6).<br />
q (mg/g)<br />
0,14<br />
0,12<br />
A- Sol. mère / MeOH<br />
B- Atrazine dans Eau<br />
y = 0,3036x + 0,0038<br />
0,10<br />
0,08<br />
y = 0,1845x + 0,0031<br />
0,06<br />
0,04<br />
0,02<br />
0,00<br />
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5<br />
Ceq (mg/l)<br />
Figure 6 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en présence de MeOH (A) ou sans<br />
MeOH (B) ; diamètre des particules d’écorce :d
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
II.1.1.1.2<br />
Méthodes d’analyse<br />
(a) Chromatographie Liquide Haute Pression<br />
L’atrazine a été dosée par chromatographie liquide en mode isocratique grâce à une HPLC Waters<br />
Module I Plus équipée d’une colonne RP-18 Supelcosil (prévue <strong>pour</strong> <strong>la</strong> séparation des pesticides<br />
organochlorés) et d’un détecteur UV réglé à 220 nm. La phase mobile, constituée d’un mé<strong>la</strong>nge<br />
d’acétonitrile / Eau ultra Pure (50 :50, vol :vol), a été utilisée à un débit de 1 mL.min -1 .<br />
L’eau Ultra Pure est préparée grâce à un appareil Millipore MilliQ Gradient. Les phases mobiles ont<br />
été dégazées à l’hélium pendant toute <strong>la</strong> durée des analyses (20 mL.min -1 ).<br />
Dans ces conditions opératoires, le temps de rétention de l’atrazine est d’environ 7,3 minutes et <strong>la</strong><br />
limite de détection de 0,03 mg.L -1 .<br />
Les chromatogrammes ont été traités à l’aide du logiciel d’integration APEX.<br />
(b) Dosage par Immuno-essai<br />
Le dosage de l’atrazine à de faibles concentrations, de l’ordre de quelques µg.L -1 , a été réalisé avec le<br />
kit Atrazine Hach (Atrazine Reagent Set, ref. 27627-10) commercialisé par Hach C ie et utilisé comme<br />
méthode semi-quantitative. La gamme de concentrations à utiliser <strong>pour</strong> ce kit est de 0,1 µg.L -1 à<br />
3 µg.L -1 . Cette méthode a été utilisée dans les expériences en colonnes (V.1.2). L’emploi de ce kit a<br />
permis de travailler à des concentrations correspondant à une pollution réelle (de quelques µg.L -1<br />
d’atrazine).<br />
Le principe du dosage en kit consiste en une réaction antigène-anticorps ; le dosage est réalisé dans<br />
des cuves de 1 mL recouvertes d’anticorps spécifiques à l’atrazine. La concentration en atrazine est<br />
déterminée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 450 nm. La concentration en atrazine<br />
est inversement proportionnelle à l’intensité de <strong>la</strong> couleur développée.<br />
Protocole de dosage immuno-essai :<br />
La solution à doser (0,5 mL) est introduite dans une cuve, contenant les anticorps « anti-atrazine »<br />
fixés sur ses parois. Une solution d’enzyme conjuguée (0,5 mL) est additionnée et le tout est<br />
vigoureusement agité pendant 30 secondes. La réaction s’effectue pendant 20 minutes puis le<br />
contenu de <strong>la</strong> cuve est jeté et <strong>la</strong> cuve est rincée 4 fois à l’eau déminéralisée.<br />
Une solution permettant le développement de <strong>la</strong> couleur est p<strong>la</strong>cée dans <strong>la</strong> cuve (0,5 mL), agitée puis<br />
<strong>la</strong> réaction se fait pendant 10 minutes. Enfin, 0,5 mL de solution d’arrêt permettant de bloquer <strong>la</strong><br />
réaction colorimétrique sont additionnés avant lecture au spectrophotomètre à 450 nm.<br />
Des étalons fournis avec le kit (concentrations 0,1 µg.L -1 ; 0,5 µg.L -1 ; 3 µg.L -1 ) ont été utilisés afin de<br />
tracer <strong>la</strong> courbe de calibration.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
92
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
(c) Suivi des essais avec des molécules marquées au 14 C<br />
Des études d’adsorption à faibles concentrations en atrazine ont pu être réalisées grâce à l’utilisation<br />
d’atrazine marquée [U-ring- 14 C]-atrazine commercialisée par Sigma Aldrich (pureté 98,6% ; activité<br />
26,4 mCi.mmol -1 ).<br />
Suivie de <strong>la</strong> radioactivité en solution<br />
Le suivi de <strong>la</strong> radioactivité dans <strong>la</strong> phase liquide des essais d’adsorption a été réalisé par prélèvement<br />
de 0,1 à 1 mL de solution contenant initialement une quantité connue de [U-ring- 14C ]-atrazine. 7 mL de<br />
liquide à scintil<strong>la</strong>tion sont additionnés au prélèvement puis le mé<strong>la</strong>nge est analysé au compteur à<br />
scintil<strong>la</strong>tion.<br />
II.1.1.2<br />
Cinétique d’adsorption<br />
L’étude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin a, dans un premier temps, été réalisée en<br />
batch. Les cinétiques d’adsorption ont ainsi été déterminées à 20°C en milieu dispersé en mettant en<br />
contact l’atrazine en solution aqueuse avec une quantité connue d’écorce de pin en poudre dans des<br />
tubes en verre de contenance 20 mL (ratio liquide/solide = 10 mL.g -1 ; 1g d’écorce stérile (d
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
triplicats et des b<strong>la</strong>ncs sans écorce et/ou sans atrazine ont permis d’identifier les éventuelles pertes<br />
ou transformations de l’atrazine, et d’identifier les pics provenant du re<strong>la</strong>rgage des composés solubles<br />
de l’écorce dans l’eau.<br />
II.1.1.3<br />
Isothermes d’adsorption<br />
Des isothermes d’adsorption ont été réalisées dans les mêmes conditions de température et<br />
d’agitation que celles citées ci-dessus (II.1.1.2). Un temps d’agitation de 24h, correspondant à<br />
l’équilibre apparent déterminé grâce aux études cinétiques, a été respecté. Les essais d’adsorption de<br />
l’atrazine ont ensuite été réalisés avec différentes granulométries d’écorce de pin : d< 200µm,<br />
200
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
II.1.2 <strong>Etude</strong> de l’adsorption en colonne<br />
II.1.2.1<br />
Courbes d’élution d’un soluté<br />
La courbe obtenue par l’analyse de <strong>la</strong> solution en sortie de colonne est appelée « courbe d’élution ».<br />
Lorsque l’injection de <strong>la</strong> solution contenant le traceur (ou tout autre soluté) est effectuée en créneau,<br />
<strong>la</strong> caractéristique de <strong>la</strong> courbe d’élution peut se présenter de différentes manières (Figure 8).<br />
C(t)<br />
Co<br />
Injection<br />
C/Co<br />
1<br />
V<br />
V/Vo<br />
C/Co<br />
2<br />
C/Co<br />
3<br />
Co<br />
V/Vo<br />
V/Vo<br />
Figure 8 : Différentes courbes d’élution rencontrées suite à une injection en créneau (1 à 3). C et V<br />
expriment respectivement <strong>la</strong> concentration en soluté et le volume de solution cumulé récolté en sortie de<br />
colonne ; Vo représente le volume d’eau total contenu dans <strong>la</strong> colonne, C 0 est <strong>la</strong> concentration entrante<br />
de soluté<br />
- 1 : Courbe d’élution symétrique ; son sommet correspond au temps de séjour moyen.<br />
Elle représente une fonction de distribution de type gaussien, qui signifie que<br />
l’écoulement se déroule dans une structure homogène sans zone morte ni chemin<br />
préférentiel. L’é<strong>la</strong>rgissement de <strong>la</strong> courbe par rapport au créneau résulte de <strong>la</strong><br />
dispersion axiale et radiale du soluté.<br />
- 2 : Courbe asymétrique dans <strong>la</strong>quelle le front compressif (montée) est plus rapide que<br />
le front diffusif (descente). Cet effet est lié à <strong>la</strong> présence de zones mortes ou<br />
stagnantes, où l’échange entre les molécules entrantes et les molécules sortantes est<br />
très lent.<br />
- 3 : <strong>la</strong> présence de deux pics résulte de l’existence de chemins préférentiels.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
95
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
L’expression de ces courbes en concentration re<strong>la</strong>tive (C/Co) par rapport au volume re<strong>la</strong>tif (V/Vo) ou<br />
au temps t permet de s’affranchir de certaines variations dans les conditions opératoires (variation de<br />
<strong>la</strong> concentration en entrée, de <strong>la</strong> vitesse d’écoulement, etc.) et permet de comparer les différentes<br />
courbes d’élution entre elles. La représentation d’une courbe d’élution exprimée en concentration<br />
re<strong>la</strong>tive en fonction du temps ou du volume re<strong>la</strong>tif est appelée « courbe de distribution des temps de<br />
séjour » (DTS).<br />
L’analyse de <strong>la</strong> courbe d’élution fournit un certain nombre de paramètres caractéristiques, comme le<br />
bi<strong>la</strong>n de masse BM et le facteur de retard R.<br />
Le bi<strong>la</strong>n de masse s’exprime comme suit :<br />
µ<br />
BM = 0<br />
∆t<br />
où ∆t est le temps d’injection du soluté (correspondant à 1 V 0 dans le cas du traceur).<br />
µ 0 exprime l’aire sous <strong>la</strong> courbe d’élution et est calculée par :<br />
µ<br />
0<br />
∞<br />
C(<br />
t)<br />
= ∫<br />
C<br />
0 0<br />
dt<br />
La valeur de BM permet de décrire le comportement du soluté:<br />
• Si BM = 1, toute <strong>la</strong> masse de soluté injectée en entrée est récupérée en sortie. Les<br />
interactions pouvant se produire au cours de l’écoulement sont entièrement réversibles et le<br />
soluté est dit « conservatif ».<br />
• Si BM
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
où ,<br />
- L : Longueur de <strong>la</strong> colonne (m)<br />
- ε : Teneur en eau dans <strong>la</strong> colonne (-)<br />
- q : Vitesse de Darcy en entrée de colonne (m.s -1 )<br />
Le facteur de retard R est un indicateur des interactions éventuelles existantes :<br />
o Si R = 1, il n’existe aucune interaction entre le soluté et <strong>la</strong> matrice.<br />
o Si R < 1, l’avancement du soluté est plus rapide que celui des molécules<br />
d’eau. Ceci peut être dû à l’exclusion anionique.<br />
o Si R > 1, le soluté est soumis à des interactions avec <strong>la</strong> matrice au cours de<br />
son transfert, et est donc élué en retard par rapport aux molécules non<br />
réactives de <strong>la</strong> solution.<br />
II.1.2.2<br />
Caractérisation de l’écoulement à l’aide de traceurs<br />
Le traçage est une procédure expérimentale qui permet de rendre observable le dép<strong>la</strong>cement réel de<br />
l’eau, dans un milieu poreux, suivant une ou des trajectoires définies, entre un point d’origine et un ou<br />
plusieurs points de détection, au moyen de traceurs artificiels.<br />
II.1.2.2.1<br />
Choix du traceur<br />
Un traceur idéal a, en tout point, un comportement identique à celui de l’eau ou du liquide qui s’écoule<br />
à travers du milieu poreux. C’est donc une substance non réactive. En pratique, on utilise souvent des<br />
traceurs anioniques. Parmi ceux-ci on peut citer les sels de bromure, les chlorures ou certains<br />
colorants.<br />
II.1.2.2.2<br />
Suivi du traceur en sortie de colonne<br />
Après saturation de <strong>la</strong> colonne en eau, un volume de 1V 0 de <strong>la</strong> solution de KCl (1g.L -1 ) est injecté en<br />
créneau grâce à une vanne d’entrée, à l’intérieur de <strong>la</strong> colonne. La concentration en KCl est suivie en<br />
sortie de colonne par conductimétrie. Une cellule de conductivité (XE100 Radiometer) reliée à un<br />
analyseur CONSORT C832 permet de suivre <strong>la</strong> conductivité en continu par intégration sur ordinateur<br />
des données toutes les 45 secondes. La solution circu<strong>la</strong>nte est envoyée avec un débit de 1 mL.min -1 .<br />
La courbe d’élution est exprimée en C/Co en fonction de V/Vo.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
97
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
II.1.2.3<br />
Méthodes expérimentales d’adsorption en colonne<br />
II.1.2.3.1<br />
Préparation des colonnes<br />
Les colonnes utilisées sont des colonnes en verre de chromatographie (fournisseur Amersham<br />
Biosciences) de dimensions L = 400 mm de hauteur et 25 mm de diamètre interne. Les colonnes sont<br />
équipées de deux pistons dont l’extrémité qui est mise en contact avec le milieu poreux est protégée<br />
par une grille p<strong>la</strong>stique (maille de 1 mm 2 ) recouvert d’une membrane en nylon (diamètre des pores<br />
10 µm). L’étanchéité est assurée grâce à des joints caoutchouc. Les tubulures utilisées sont en<br />
polyéthylène. La Figure 9 représente le détail des colonnes utilisées.<br />
Tube PTFE<br />
Colonne de verre(D int 26mm, L 400 mm)<br />
Joint caoutchouc<br />
Grille protectrice<br />
Membrane nylon<br />
Figure 9 : Schéma d’une colonne<br />
Les colonnes sont remplies avec environ 10 g de milieu poreux (écorce de pin en poudre ou charbon<br />
actif dans certains cas). Le remplissage est fractionné, c’est à dire que tous les 2 g, une pression est<br />
appliquée sur le matériau afin d’homogénéiser le tassement. Le milieu est ensuite pressé entre les<br />
deux pistons (<strong>la</strong> hauteur de <strong>la</strong> colonne contenant le support d’adsorption représente environ 7 cm).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
98
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
Les colonnes sont dans un premier temps saturées en eau par circu<strong>la</strong>tion en flux ascendant d’eau<br />
déminéralisée stérile pendant 12 h environ jusqu’à obtenir un poids constant des colonnes.<br />
Un traçage au KCl est ensuite effectué (comme décrit ci-dessus II.1.2.2.2) ; il permet de rendre<br />
compte du comportement hydrodynamique des colonnes. Lorsque aucune irrégu<strong>la</strong>rité ne survient (le<br />
pic d’élution est symétrique), les essais d’adsorption peuvent commencer. Si <strong>la</strong> courbe d’élution du<br />
traceur présente une asymétrie, <strong>la</strong> colonne est vidée, remplie de nouveau et testée de nouveau.<br />
Chaque colonne mise en p<strong>la</strong>ce est caractérisée par un certain nombre de paramètres cités dans le<br />
tableau ci-dessous (Tableau 6)<br />
Tableau 6 : Caractéristiques d’une colonne<br />
Paramètres colonne Symbole Unité<br />
Diamètre interne d cm<br />
Section S cm 2<br />
Hauteur du lit L cm<br />
Masse de milieu poreux m g<br />
Volume du lit V t cm 3<br />
Volume de pore V e ou V 0 cm 3<br />
Indice de vide e (V e /V s ) -<br />
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) -<br />
Flux D cm 3 .h -1<br />
Vitesse de Darcy q (D/S) cm.h -1<br />
Vitesse de pore V (q/ ε) cm.h -1<br />
Le volume d’air V a est considéré comme nul, et le degré de saturation s=1.<br />
L’écorce de pin utilisée en colonne est constituée de particules de diamètre inférieur à 200 µm.<br />
Pour certains essais l’écorce de pin stérilisée a été utilisée afin de tester l’influence de <strong>la</strong> stérilisation<br />
sur l’adsorption de l’atrazine. La stérilisation de l’écorce de pin a été réalisée comme précisé au § I.7.<br />
L’hydrodynamique de l’écorce de pin et du charbon actif a également été comparée.<br />
Les particules de charbon actif utilisé (Darco G-60 fourni par Aldrich) possèdent un diamètre inférieur<br />
à 200 µm.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
99
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
II.1.2.3.2<br />
Suivi du COD, du pH et de <strong>la</strong> conductivité en sortie de colonne<br />
Lors de <strong>la</strong> circu<strong>la</strong>tion de l’eau à travers <strong>la</strong> colonne, certains composés organiques de l’écorce de pin<br />
sont solubilisés dans <strong>la</strong> solution circu<strong>la</strong>nte ; une analyse du carbone organique dissous (COD) en<br />
sortie de colonne permet d’évaluer <strong>la</strong> quantité de carbone re<strong>la</strong>rguée au cours du temps. D’autre part,<br />
lors de <strong>la</strong> solubilisation des composés de l’écorce en solution, le pH de l’eau ainsi que <strong>la</strong> conductivité<br />
varient avec le volume de solution filtrée. Un système d’électrodes, positionné en sortie de colonne,<br />
permet de suivre en ligne l’évolution du pH et de <strong>la</strong> conductivité en fonction du volume passé à travers<br />
<strong>la</strong> colonne.<br />
Le pH et <strong>la</strong> conductivité sont suivis simultanément par un appareil CONSORT C832 relié à une<br />
électrode pHC3001 et une cellule de conductivité XE100 Radiometer. Chaque électrode est plongée<br />
dans une cellule à débordement de 1mL, traversée par <strong>la</strong> solution en sortie de colonne. L’instal<strong>la</strong>tion<br />
est représentée Figure 10. Le Multianalyser CONSORT C832 est relié à un ordinateur à partir duquel<br />
sont enregistrées les données toutes les 45 secondes.<br />
Pour l’analyse du COD, les échantillons collectés ont été filtrés sur une membrane filtrante de<br />
0,45 µm ; le carbone inorganique a été éliminé par acidification à l’acide phosphorique puis purgé par<br />
barbotage à l’hélium. Les échantillons collectés ont été analysés au COT mètre O.I. Analytical 1020A<br />
selon <strong>la</strong> norme européenne EN 1484.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
100
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
Cond.<br />
pH<br />
10 g écorce de pin<br />
Multianalyser CONSORT C832<br />
- pH<br />
- Conductivité<br />
Collecteur de<br />
fractions<br />
Aquisition<br />
informatique<br />
COTMètre<br />
HPLC<br />
Flux : 1 ml/min<br />
Eau déminéralisée<br />
ou<br />
Solution d’atrazine<br />
Pompe<br />
Peristaltique<br />
Conditions stériles<br />
Figure 10 : Dispositif expérimental <strong>pour</strong> l’étude de l’adsorption en colonne<br />
II.1.2.3.3<br />
Adsorption de l’atrazine en colonne<br />
Les essais d’adsorption de l’atrazine en colonne d’écorce de pin ont été réalisés à une concentration<br />
entrante d’environ 0,2 mg.L -1 , dans un premier temps. La capacité d’adsorption de l’atrazine a été<br />
testée avec l’écorce préa<strong>la</strong>blement stérilisée (Cf. I.7) ou non stérilisée ; une colonne de charbon actif<br />
a également été préparée.<br />
Les colonnes sont préparées et remplies comme décrit ci-dessus (II.1.2.3.1) ; après saturation en eau,<br />
le comportement hydrodynamique des colonnes est contrôlé par un traçage au KCl (II.1.2.2.2). Un<br />
<strong>bio</strong>cide (NaN 3 200 mg.L -1 ) est additionné à <strong>la</strong> solution entrante d’atrazine afin d’assurer des conditions<br />
a<strong>bio</strong>tiques et ainsi s’affranchir de tout phénomène <strong>bio</strong>logique pouvant entraîner une dégradation<br />
partielle du pesticide. L’instal<strong>la</strong>tion est représentée Figure 10.<br />
La solution est injectée dans les colonnes en flux ascendant à des débits de 1 mL.min -1 ou<br />
0,3 mL.min -1 . Les échantillons sont prélevés à intervalle de temps régulier par un collecteur de<br />
fractions directement p<strong>la</strong>cé en sortie de colonne. Les échantillons sont ensuite analysés par HPLC<br />
permettant de détecter une concentration minimale en atrazine de 0,03 mg.L -l .<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
101
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
II.2 Résultats et discussion<br />
II.2.1 <strong>Etude</strong> de l’adsorption en batch<br />
II.2.1.1<br />
Cinétiques d’adsorption<br />
Les études de cinétique d’adsorption ont été réalisées <strong>pour</strong> des concentrations initiales en atrazine<br />
(C i ) comprises entre 0,5 mg.L -1 et 15 mg.L -1 , dans des tubes en verre soumis à une agitation par<br />
retournement pendant environ 50 heures, selon le protocole (II.1.1.2).<br />
Les cinétiques ont permis de fixer le temps d’équilibre apparent d’adsorption de l’atrazine sur le<br />
support d’écorce de pin. Les résultats sont présentés ci-dessous.<br />
Atrazine adsorbée (mg.l<br />
-1 )<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
Ci=0,5 mg/l<br />
0,0<br />
0 10 20 30 40<br />
Temps (h)<br />
Atrazine adsorbée (mg.l<br />
-1 )<br />
1,6<br />
1,2<br />
0,8<br />
0,4<br />
Ci=1,4 ppm<br />
0,0<br />
0 10 20 30 40<br />
Temps (h)<br />
Atrazine adsorbée (mg.l<br />
-1 )<br />
2,8<br />
2,1<br />
1,4<br />
0,7<br />
Ci=2,7 mg/l<br />
0,0<br />
0 10 20 30 40<br />
Temps (h)<br />
Atrazine adsorbée (mg.<br />
l-1 )<br />
6,0<br />
4,0<br />
2,0<br />
Ci=5 mg/l<br />
0,0<br />
0 10 20 30 40<br />
Temps (h)<br />
Atrazine adsorbée (mg.l<br />
-1 )<br />
15,0<br />
10,0<br />
5,0<br />
Ci=15 ppm<br />
0,0<br />
0 10 20 30 40<br />
Temps (h)<br />
Atrazine adsorbée (mg.l<br />
-1 )<br />
12,0<br />
8,0<br />
4,0<br />
Ci=10,7 ppm<br />
0,0<br />
0 10 20 30 40<br />
Temps (h)<br />
Figure 11 : Cinétique de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin (d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
avons choisi d’utiliser <strong>pour</strong> réaliser tous les essais ultérieurs d’adsorption en batch de l’atrazine sur<br />
l’écorce.<br />
II.2.1.2<br />
Isothermes d’adsorption<br />
Les isothermes d’adsorption ont été tracées afin de comparer <strong>la</strong> capacité de l’écorce à adsorber le<br />
polluant atrazine dans différentes conditions expérimentales. Ainsi, les essais d’adsorption ont été<br />
réalisés <strong>pour</strong> différents ratios liquide/solide, différentes granulométries de particules d’écorce, à<br />
différents pH et dans une gamme de concentrations en atrazine re<strong>la</strong>tivement étendue : de quelques<br />
µg.L -1 à plusieurs dizaines de mg.L 1 .<br />
II.2.1.2.1<br />
Influence de <strong>la</strong> granulométrie de l’écorce de pin sur l’adsorption de l’atrazine<br />
Afin de sélectionner les meilleures conditions d’adsorption de l’atrazine <strong>pour</strong> notre procédé de<br />
<strong>traitement</strong>, des études sur l’influence de <strong>la</strong> granulométrie de l’écorce sur sa capacité d’adsorption ont<br />
été menées selon le protocole décrit au § II.1.1.3, <strong>pour</strong> 3 diamètres différents de particules d’écorce :<br />
d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
Campos et al. (2000) obtiennent à titre d’exemple, <strong>pour</strong> l’adsorption d’atrazine sur un charbon actif en<br />
poudre des constantes de Freundlich de l’ordre de 50 (mg. g -1 )(L.mg -1 ) 1/n (n=0,44).<br />
Tableau 7 : Coefficients du modèle de Freundlich caractérisant les isothermes d’adsorption de l’atrazine<br />
sur des particules d’écorce de pin autoc<strong>la</strong>vée de différentes granulométries<br />
(µm) K f n<br />
d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
0,25<br />
0,2<br />
pH 4<br />
pH 7<br />
y = 0,233x + 0,0103<br />
y = 0,1677x + 0,0034<br />
q (mg.g -1 )<br />
0,15<br />
0,1<br />
0,05<br />
0<br />
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1<br />
Ceq (mg.L -1 )<br />
Figure 13 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoc<strong>la</strong>vée (d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
Les Figure 14 et Figure 15 représentent les isothermes d’adsorption <strong>pour</strong> deux gammes de<br />
concentrations différentes. Dans les deux cas, <strong>la</strong> diminution du ratio L/S entraîne <strong>la</strong> réduction de<br />
l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce. Ce résultat indique que <strong>la</strong> dispersion des particules d’écorce en<br />
suspension est modifiée en fonction du ratio liquide/solide utilisé ; l’agrégation des particules d’écorce<br />
à faible ratio L/S <strong>pour</strong>rait entraîner <strong>la</strong> réduction de l’accessibilité des molécules d’atrazine aux sites<br />
d’adsorption de l’écorce.<br />
80<br />
70<br />
L/S=1000<br />
y = 0,2087x + 1,8534<br />
60<br />
L/S=100<br />
y = 0,1214x + 1,4086<br />
q (µg/g)<br />
50<br />
40<br />
30<br />
L/S=10<br />
y = 0,0227x + 0,2525<br />
20<br />
10<br />
0<br />
0 50 100 150 200 250 300 350 400<br />
Ceq (µg/l)<br />
Figure 14 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine ([atrazine] i = 2,6 à 749 µg.L -1 ) sur l’écorce de pin en<br />
poudre (d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
L’adsorption à ratio L/S=10 à faible concentration est réduite comparée à l’adsorption observée à plus<br />
forte concentration. Cette observation peut être expliquée par un phénomène d’agrégation des<br />
particules d’écorce entre elles, ce qui diminuerait <strong>la</strong> surface totale d’adsorption <strong>pour</strong> les molécules<br />
d’atrazine.<br />
Si l’on compare l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en poudre (d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
matière organique libérée par l’écorce de pin ; le pH et <strong>la</strong> conductivité ont également été suivis en<br />
sortie de colonne.<br />
II.2.2.1<br />
<strong>Etude</strong> hydrodynamique des colonnes<br />
Le comportement hydrodynamique des colonnes d’écorce de pin stérile et des colonnes d’écorce non<br />
stérile a été étudié en parallèle.<br />
La Figure 17 présente les courbes d’élution <strong>pour</strong> ces deux types de colonnes après injection de 1V 0<br />
d’une solution de KCl (1g.L -1 ). Les caractéristiques des colonnes sont présentées ANNEXE 3.<br />
1,0<br />
Ecorce non stérile<br />
Ecorce non stérile<br />
1,0<br />
Ecorce stérile stérile<br />
0,8<br />
0,8<br />
C/Co<br />
0,6<br />
0,4<br />
C/Co<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,0<br />
0 1 2 3 4 5 6 7 8<br />
V/Vo<br />
0,2<br />
0,0<br />
0 1 2 3 4 5 6 7 8<br />
V/Vo<br />
Figure 17 : Comportement hydrodynamique : Transfert de KCl dans les colonne d’écorce de pin stérile<br />
(droite) ou non stérile (gauche) ; Débit de colonne = 1 mL.min -1 ; 22°C<br />
Les comportements hydrodynamiques des colonnes d’écorce de pin stérile ou non stérile sont très<br />
semb<strong>la</strong>bles. Dans les deux cas, le point d’inflexion de <strong>la</strong> courbe ascendante est obtenu après 1V 0,<br />
(R=1,002 et 0,96 <strong>pour</strong> l’écorce stérile et non stérile respectivement) indiquant l’absence de retard<br />
dans l’élution du KCl. Cependant un dé<strong>la</strong>i de restitution du KCl est observé (phase descendante)<br />
suggérant <strong>la</strong> présence de phénomènes de dispersion. Ce retard peut être expliqué par <strong>la</strong> présence de<br />
zones stagnantes à l’intérieur de <strong>la</strong> colonne ou <strong>la</strong> dilution de <strong>la</strong> solution en sortie de colonne dans les<br />
cellules contenant l’électrode de conductivité (dilution dans 1-2 mL). L’apparition d’un léger p<strong>la</strong>teau<br />
dans le cas de l’écorce non stérile peut s’expliquer par l’existence de chemins préférentiels dans <strong>la</strong><br />
colonne.<br />
Dans les deux cas, le KCl injecté est récupéré en sortie à 100% (Bi<strong>la</strong>n massique BM = 0,98) ; le KCl<br />
n’est donc pas retenu sur l’écorce et constitue un bon traceur <strong>pour</strong> les colonnes d’écorce de pin. Ce<br />
traçage au KCl avant chaque utilisation d’une nouvelle colonne, a permis de mettre en évidence<br />
certains défauts de préparation (zones stagnantes, chemins préférentiels) par <strong>la</strong> présence<br />
d’irrégu<strong>la</strong>rité sur les courbes d’élution. Dans ce cas les colonnes ont été préparées à nouveau.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
108
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
II.2.2.2<br />
Suivi du COD, pH et conductivité en sortie de colonne<br />
Le passage de <strong>la</strong> solution aqueuse polluée à travers <strong>la</strong> colonne entraîne <strong>la</strong> solubilisation de certains<br />
composés organiques solubles de l’écorce de pin, ainsi qu’une acidification de <strong>la</strong> solution. L’évaluation<br />
en sortie de colonne de <strong>la</strong> concentration en Carbone Organique Dissous (COD) ainsi que des<br />
paramètres pH et conductivité a été mise en œuvre selon le schéma présenté Figure 10 (§ II.1.2.3.2)<br />
<strong>pour</strong> des colonnes d’écorce de pin stérile et non stérile. Les caractéristiques des colonnes utilisées<br />
<strong>pour</strong> cette expérience sont présentées en ANNEXE 3.<br />
La Figure 18 montre que <strong>la</strong> libération de matière organique issue de <strong>la</strong> solubilisation de composés de<br />
l’écorce de pin est re<strong>la</strong>tivement identique <strong>pour</strong> les colonnes d’écorce stérile et non stérile. La<br />
concentration de carbone organique est très élevée dans les premiers échantillons collectés (2500<br />
mg.L -1 <strong>pour</strong> l’écorce non stérile et 2300 mg.L -1 <strong>pour</strong> l’écorce stérile). Rapidement, le COD en sortie de<br />
colonne diminue et atteint 70 mg.L -1 entre 10 et 30 V 0 (correspondant à un volume de 200 à 600 mL) ;<br />
puis le COD devient inférieur à 20 mg.L -1 après 35 V 0 . Cette concentration est assez élevée puisque<br />
proche des limites de rejet d’eaux brutes dans dans le milieu naturel (DCO max 125 mg.L -1 , soit une<br />
concentration en carbone d’environ 30-50 mg.L -1 ).<br />
La masse de carbone solubilisée représente 3,64% de <strong>la</strong> masse totale d’écorce stérile et 3,40 %<br />
lorsque l’écorce n’a pas été autoc<strong>la</strong>vée. Ces valeurs sont 3 fois supérieures à celles obtenues lors de<br />
tests de lixiviations en batch à un ratio Liquide/solide de 20 mg.L -1 (COD = 1,16% de <strong>la</strong> masse totale<br />
de l’écorce 2). Dans les colonnes le ratio L/S est environ de 2 mg.L -1 , soit une écorce dix fois plus<br />
concentrée en solution que dans les tests de lixiviation en batch ; ceci explique sans doute <strong>la</strong><br />
différence entre COD en colonne et COD en essais batch.<br />
3000<br />
COD (mg/l)<br />
2500<br />
2000<br />
1500<br />
1000<br />
Ecorce stérile<br />
Ecorce non stérile<br />
500<br />
0<br />
0 10 20 30 40 50<br />
V/Vo<br />
Figure 18 : Suivi du COD en sortie de colonne d’écorce de pin stérile et non stérile traversée par une<br />
solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min -1 ; 22°C ; Temps de séjour ≅ 20 min<br />
Cette libération de carbone organique dissous est importante puisque dans le cadre du <strong>traitement</strong><br />
<strong>bio</strong>logique il sera important de connaître d’une part <strong>la</strong> toxicité de ces composés organiques solubles<br />
de l’écorce de pin sur les micro-organismes utilisés, et d’autre part, <strong>la</strong> capacité des micro-organismes<br />
109<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
à utiliser ces composés comme source de carbone. La consommation des composés solubles de<br />
l’écorce de pin par les micro-organismes <strong>pour</strong>rait alors éviter l’addition lors du <strong>traitement</strong> d’une source<br />
de carbone additionnelle.<br />
Il est également important de connaître le pH et <strong>la</strong> conductivité de l’eau en sortie de colonne (Figure<br />
19 et Figure 20).<br />
pH<br />
5,5<br />
5,3<br />
5,1<br />
4,9<br />
4,7<br />
4,5<br />
4,3<br />
Ecorce stérile<br />
4,1<br />
Ecorce non stérile<br />
3,9<br />
3,7<br />
3,5<br />
0 5 10 15 20 25<br />
V/V0<br />
Figure 19 : Suivi du pH en sortie de colonne (10 g écorce stérile ou d’écorce non stérile) traversée par une<br />
solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min -1 ; 22°C ; temps de séjour ≅ 20 min<br />
900<br />
800<br />
700<br />
C (µS/cm)<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
Ecorce stérile<br />
Ecorce non stérile<br />
0 10 20 30 40<br />
V/V0<br />
Figure 20 : Suivi de <strong>la</strong> conductivité en sortie de colonne (10 g d’écorce stérile ou d’écorce non stérile)<br />
traversée par une solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min -1 ; 22°C ; temps de séjour ≅ 20 min<br />
Le pH de <strong>la</strong> solution d’eau en sortie de colonne est re<strong>la</strong>tivement acide <strong>pour</strong> les premiers mL élués<br />
(environ 3,9) <strong>pour</strong> les colonnes d’écorce stérile comme <strong>pour</strong> l’écorce non stérile. Après circu<strong>la</strong>tion<br />
d’environ 5V 0 , le pH se stabilise à 4,8 et 4,6 <strong>pour</strong> les colonnes d’écorce non stérile et d’écorce stérile<br />
110<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
respectivement. De <strong>la</strong> même façon, <strong>la</strong> conductivité très élevée en début de circu<strong>la</strong>tion 350 à<br />
840 µS.cm -1 ), traduisant <strong>la</strong> lixiviation de composés ioniques de l’écorce de pin, décroît rapidement et<br />
se stabilise après 30 V 0 à une valeur de 20 µS.cm -1 dans les deux colonnes. Une quantité plus<br />
importante de composés ioniques est re<strong>la</strong>rguée par l’écorce de pin non stérilisée (840 µS.cm -1 <strong>pour</strong> le<br />
premier échantillon prélevé) comparé à l’écorce stérilisée (350 µS.cm -1 ), indiquant que <strong>la</strong> stérilisation<br />
stabilise certains composés de l’écorce de pin.<br />
Des essais ultérieurs permettront de dire si Pseudomonas ADP sp. utilisée dans le cadre de notre<br />
procédé <strong>combiné</strong>, sera capable de survivre et de croître dans ces conditions de pH, et de<br />
conductivité.<br />
II.2.2.3<br />
Adsorption de l’atrazine en colonne d’écorce de pin en conditions a<strong>bio</strong>tiques<br />
L’adsorption de l’atrazine a été testée sur les colonnes d’écorce de pin préa<strong>la</strong>blement stérilisée et non<br />
stérilisée selon le protocole décrit au § II.1.2.3.3. Dans les deux cas <strong>la</strong> solution d’atrazine circu<strong>la</strong>nte<br />
contenait un <strong>bio</strong>cide (azoture de sodium 200 mg.L -1 ) afin d’assurer des conditions totalement<br />
a<strong>bio</strong>tiques, évitant ainsi l’intervention de phénomènes <strong>bio</strong>logiques indésirables ici. Le schéma du<br />
montage <strong>pour</strong> ces essais est représenté Figure 10 (p.101). Un essai sur colonne de charbon actif a<br />
également été réalisé en parallèle.<br />
Les caractéristiques des colonnes utilisées <strong>pour</strong> ces essais sont présentées en ANNEXE 4.<br />
On observe que <strong>la</strong> saturation en atrazine des colonnes d’écorce non stérile est atteinte <strong>pour</strong> l’injection<br />
d’un volume de 50 V 0 environ, contre 100 V 0 dans le cas des colonnes d’écorce préa<strong>la</strong>blement<br />
stérilisée (Figure 21). Dans <strong>la</strong> colonne de charbon actif, l’atrazine n’est pas détectée en sortie de<br />
colonne après injection d’un volume correspondant à 170 V 0 ; encore une fois, ce résultat montre <strong>la</strong><br />
bien meilleure capacité d’adsorption du charbon actif par rapport à celle de l’écorce de pin.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
111
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
C/Co<br />
1,0<br />
0,9<br />
0,8<br />
0,7<br />
0,6<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
Ecorce non stérile<br />
Ecorce stérile<br />
Charbon Actif<br />
0,0<br />
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180<br />
V/Vo<br />
Figure 21 : Adsorption de l’atrazine sur écorce de pin (stérile ou non stérile) et sur charbon actif en<br />
colonne (masse d’adsorbant 10g), circu<strong>la</strong>tion en circuit ouvert ; [atrazine] i =0,2 mg.L -1 ; débit = 1 mL.min -1 ;<br />
22°C ; temps de séjour ≅ 20 min<br />
Le calcul de l’aire supérieure de <strong>la</strong> courbe (méthode des trapèzes) permet d’accéder à <strong>la</strong> quantité<br />
d’atrazine adsorbée sur l’écorce de pin. Après l’injection de 164 V 0 , l’équilibre apparent est atteint et<br />
0,031 ou 0,032 mg d’atrazine sont adsorbés par gramme d’écorce non stérile ou stérile<br />
respectivement. Les deux courbes sont à première vue très différentes ; elles <strong>la</strong>issent penser que les<br />
concentrations en atrazine adsorbée seraient significativement différentes entre l’écorce stérile et<br />
l’écorce non stérile. Pourtant les résultats obtenus sont très simi<strong>la</strong>ires (0,031 et 0,032 mg.g -1 ) ; ceci est<br />
expliqué par le fait que les concentrations C 0 et les volumes de pores V 0 de chaque colonne ne sont<br />
pas les mêmes (C 0 =0,23 mg.L -1 et V 0 =25 ml <strong>pour</strong> <strong>la</strong> colonne d’écorce non autoc<strong>la</strong>vée contre<br />
C 0 =0,20 mg.L -1 et V 0 =18 ml <strong>pour</strong> <strong>la</strong> colonne d’écorce autoc<strong>la</strong>vée). Ainsi, ces résultats montrent que<br />
les capacités d’adsorption de l’écorce stérilisée et l’écorce non stérilisée sont tout à fait simi<strong>la</strong>ires.<br />
Si l’on compare l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en colonne et en essais batch (Figure 22),<br />
on remarque que <strong>pour</strong> une concentration à l’équilibre de 0,2 mg.L -1 les quantités d’atrazine adsorbées<br />
sur l’écorce (stérile ou non stérile) sont simi<strong>la</strong>ires : 0,040 mg par gramme d’écorce stérilisée et<br />
0,037 mg par gramme d’écorce non stérilisée, en batch. En colonne comme en milieu dispersé,<br />
l’adsorption de l’atrazine est très légèrement supérieure sur l’écorce stérilisée que sur l’écorce non<br />
traitée.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
112
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
0,25<br />
0,2<br />
q (mg/g)<br />
0,15<br />
0,1<br />
0,05<br />
Ecorce autoc<strong>la</strong>vée<br />
Ecorce non autoc<strong>la</strong>vée<br />
y = 0,2052x + 0,0023<br />
y = 0,1449x + 0,0077<br />
0<br />
0 0,5 1 1,5<br />
Ceq (mg/l)<br />
Figure 22 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoc<strong>la</strong>vée et non autoc<strong>la</strong>vée<br />
(d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin<br />
Les études en colonnes ont montré que <strong>la</strong> solution en sortie de colonne était acide (pH 4,6 et<br />
conductivité 40 µS.cm -1 après 5V 0 ) ; le pH n’évoluant plus après 5 V 0 . La question se pose alors quant<br />
à <strong>la</strong> survie des micro-organismes choisis <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong>, dans les colonnes d’écorce de<br />
pin, dans ces conditions de pH.<br />
Les résultats d’adsorption obtenus en colonne montrent que <strong>la</strong> saturation en atrazine de l’écorce est<br />
atteinte beaucoup plus rapidement dans les colonnes d’écorce non stérilisée que dans les colonnes<br />
d’écorce stérilisée. En revanche, dans les deux cas <strong>la</strong> quantité d’atrazine adsorbée par gramme<br />
d’écorce est équivalente (environ 0,03 mg.g -1 <strong>pour</strong> une solution entrante à 0,2 mg.L -1 ). Ce résultat<br />
concorde avec les résultats obtenus en batch (0,04 mg.g-1 d’écorce stérilisée et 0,037 mg.g -1 d’écorce<br />
non stérilisée). L’écorce préa<strong>la</strong>blement stérilisée présenterait un léger avantage par rapport à l’écorce<br />
brute.<br />
D’autre part, les essais ont permis de mettre en évidence des concentrations en carbone organique<br />
non négligeables en sortie de colonne. Un <strong>traitement</strong> sur écorce de pin serait donc difficilement<br />
envisageable dans le cadre d’une filière c<strong>la</strong>ssique mais en revanche exploitable en tant que pré<strong>traitement</strong><br />
ou <strong>traitement</strong> individuel <strong>pour</strong> de fortes concentrations en atrazine avant que l’eau polluée<br />
ne subisse une filtration sur charbon actif ou soit envoyée en station d’épuration.<br />
Les essais comparatifs réalisés avec le charbon actif montrent que ce dernier est nettement plus<br />
efficace que l’écorce de pin <strong>pour</strong> adsorber l’atrazine. Cependant, dans un procédé de<br />
décontamination par <strong>bio</strong>filtration combinant adsorption et <strong>bio</strong>dégradtion, <strong>la</strong> faible capacité d’adsorption<br />
de l’écorce peut devenir un avantage, puisque le polluant restera plus facilement disponible <strong>pour</strong> les<br />
micro-organismes mis en jeu.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
114
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
III. Biodégradation de l’atrazine en culture pure de<br />
Pseudomonas ADP sp.<br />
III.1 Matériel et méthodes<br />
III.1.1 Milieux de culture<br />
Les milieux de culture doivent contenir les nutriments nécessaires au développement et au<br />
métabolisme des micro-organismes choisis. Ils doivent ainsi contenir au moins une source azotée,<br />
une source carbonée, une source de phosphore, ainsi que des micro et macro-nutriments (sels<br />
minéraux dont métalliques), éventuellement des facteurs de croissance. Les milieux de culture<br />
peuvent être solides ou liquides, synthétiques ou complexes, riches ou pauvres.<br />
III.1.1.1<br />
Les milieux liquides<br />
III.1.1.1.1 Milieu minéral MM<br />
La plupart de nos essais ont été réalisés en milieu liquide minéral glucosé (source de carbone et<br />
d’énérgie <strong>pour</strong> les bactéries), l’atrazine jouant le rôle d’unique source d’azote.<br />
La composition du milieu minéral utilisé était <strong>la</strong> suivante (Barreiros et al., 2003) :<br />
- Tampon Phosphate 27 mM, pH 7,2<br />
- MnCl 2<br />
,4H 2<br />
O 0,51 µM<br />
- CaCl 2<br />
,2H 2<br />
O 0,2 mM<br />
- H 3<br />
BO 3<br />
0,01 mM<br />
- NaCl 7,56 mM<br />
- CoCl , 6H2 2<br />
O 0,8 µM<br />
- MgCl 2<br />
,6H 2<br />
O 0,81mM<br />
- CuCl , 2H2 2<br />
O 0,1 µM<br />
- FeCl 2 ,4H 2<br />
O 5,19 µM<br />
- HCl 1,3 µl.L -1 - NiCl , 6H2<br />
, 25%<br />
2<br />
O 1 µM<br />
- ZnCl 2<br />
0,51 µM<br />
- NaMoO 4<br />
,2H 2<br />
O 0,16 µM<br />
Les solutions suivantes ont été préparées autoc<strong>la</strong>vées 20 minutes à 120°C et conservées<br />
séparément :<br />
- Eau déminéralisée<br />
- Solution de CaCl 2 (0,2 M)<br />
- Solution de nutriments<br />
- Tampon Phosphate (1,35 M)<br />
Chacune des solutions a été conservée à 4°C, à l’exception du tampon phosphate (1,35 M), conservé<br />
à température ambiante.<br />
115<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Composition du tampon Phosphate:<br />
KH 2 PO 4<br />
Na 2 HPO 4 ,2H 2 O<br />
0,37 M<br />
0,98 M<br />
Le tampon est ajusté à pH 7,2 par addition d’une solution de soude 0,1 M.<br />
III.1.1.1.2 Milieu riche complexe LB<br />
Le milieu LB est constitué de :<br />
Extrait de levure<br />
5g<br />
Tryptone<br />
10g<br />
NaCl<br />
10g<br />
L’ensemble est additionné à 1 L d’eau déminéralisée, agité puis autoc<strong>la</strong>vé à 120°C pendant 20<br />
minutes, puis conservé à température ambiante.<br />
III.1.1.1.3 Extrait aqueux d’écorce de pin<br />
L’extrait aqueux d’écorce de pin a été utilisé dans l’idée de nous fournir des informations sur <strong>la</strong><br />
capacité de Pseudomonas sp. ADP à croître et à dégrader l’atrazine dans un milieu contenant les<br />
composés organiques solubles de l’écorce de pin. L’utilisation de ce milieu a permis d’une part de<br />
tester <strong>la</strong> toxicité éventuelle de ces composés sur Pseudomonas sp. ADP et d’autre part de<br />
déterminer si ces composés pouvaient ou non constituer une source de nutriments <strong>pour</strong> les microorganismes.<br />
L’utilisation de l’extrait d’écorce de pin a ainsi permis de s’affranchir des phénomènes d’adsorption<br />
de l’atrazine à <strong>la</strong> surface des particules d’écorce qui aurait modifié sa <strong>bio</strong>disponibilité si les essais<br />
avaient été réalisés en présence d’écorce solide.<br />
La préparation de l’extrait aqueux d’écorce de pin est décrite au paragraphe I.6. Cet extrait<br />
constitue un milieu complexe pauvre car les teneurs en carbone et en azote notamment sont<br />
faibles.<br />
Le Tableau ci-dessous présente <strong>la</strong> composition des extraits réalisés à partir des deux écorces de<br />
pin utilisées au cours de cette étude.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
116
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Tableau 9 : Teneurs en COT et azote total des extraits aqueux d’écorce de pin utilisés <strong>pour</strong> différentes<br />
expériences<br />
Ecorce 1 Ecorce 2<br />
Carbone Organique Total 100 ± 10 mg.L -1 580 ± 10 mg.L -1<br />
Azote Total (Kejdhal) 4 ± 0,2 mg.L -1 4 ± 0,2 mg.L -1<br />
Les deux écorces ont été utilisées l’une après l’autre. Toutes les deux provenaient d’une scierie<br />
du nord du Portugal utilisant Pinus pinaster comme matière première.<br />
Lors de son utilisation en culture pure, l’extrait a été stérilisé par filtration sur une membrane de<br />
nitrate de cellulose à 0,2 µm.<br />
III.1.1.2<br />
Les milieux solides<br />
Le milieu solide riche complexe PCA (P<strong>la</strong>te Count Agar, Merck réf. 1.05463) a été utilisé <strong>pour</strong> <strong>la</strong><br />
croissance des micro-organismes, aussi bien Pseudomonas ADP sp. que <strong>pour</strong> les microorganismes<br />
indigènes de l’écorce de pin.<br />
Les étalements sur boite de Pétri contenant un milieu riche ont également permis de vérifier <strong>la</strong><br />
contamination ou non de certaines cultures réalisées lors des nombreuses expériences de<br />
croissance bactérienne et de dégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Préparation du milieu solide PCA :<br />
A 1 L d’eau déminéralisée sont additionnés,<br />
PCA en poudre<br />
22,5 g<br />
Après dissolution, le milieu est autoc<strong>la</strong>vé à 120°C pendant 20 minutes.<br />
Les boites sont coulées à 80°C en conditions stériles, solidifiées puis séchées pendant 2h à 60°C. Les<br />
boites sont ensuite conservées à 4°C.<br />
III.1.2 Préparation et utilisation des cellules congelées<br />
III.1.2.1<br />
Préparation de cellules congelées<br />
La souche Pseudomonas sp. ADP connue <strong>pour</strong> ces capacités à minéraliser l’atrazine et décrite dans<br />
<strong>la</strong> littérature <strong>pour</strong> <strong>la</strong> première fois par Mandelbaum et al. (1995) (voir <strong>Etude</strong> Bibliographique § III), est<br />
commercialisée par l’entreprise allemande DSMZ sous le numéro de référence 11735.<br />
Des cultures de Pseudomonas ADP sp. ont été dans un premier temps réalisées par étalement sur<br />
boite de Pétri PCA incubées à 30°C pendant 48h. Les colonies ont ensuite été transférées en milieu<br />
117<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
liquide MM contenant 20 mg.L -1 d’atrazine, comme seule source d’azote et 1 g.L -1 de glucose comme<br />
source de carbone. Les cultures ont été incubées à 30°C sous agitation orbitale à 150 rpm pendant<br />
20 h.<br />
Les cultures ont ensuite été centrifugées à 7000 rpm pendant 20 minutes à 8°C et le culot de cellules<br />
resuspendu dans un tampon phosphate (54 mM, pH 7,2) ; cette opération a été répétée afin<br />
d’effectuer un deuxième <strong>la</strong>vage. Le culot obtenu après deux <strong>la</strong>vages a été resuspendu dans un<br />
volume (V/V) de quelques mL d’un mé<strong>la</strong>nge de glycérol (40%) et de milieu LB (2 x concentré).<br />
La solution concentrée en cellules a été aliquotée (500 µl) dans des tubes cryogéniques et congelée à<br />
–20°C.<br />
Les stocks de cellules directement utilisés <strong>pour</strong> les expériences (inocu<strong>la</strong>tion à partir de cellules<br />
congelées) ont été préparés de <strong>la</strong> même manière mais les cellules ont été ressuspendues dans un<br />
milieu constitué de 50% de milieu minéral (MM) et 50% de glycérol (40%).<br />
Avant chaque utilisation d’un stock de cellules congelées, un comptage est réalisé juste après<br />
décongé<strong>la</strong>tion <strong>pour</strong> quantifier le nombre d’unités cellu<strong>la</strong>ires présentes dans un stock. Ces comptages<br />
sont réalisés par dilution du stock de 10 -4 à 10 -9 et étalement sur boite de gélose PCA.<br />
Ainsi, <strong>la</strong> concentration en cellules étant connue dans les stocks congelés, l’inocu<strong>la</strong>tion de<br />
Pseudomonas sp. ADP dans les essais a pu être re<strong>la</strong>tivement maîtrisée (nombre de CFU/mL connu)<br />
et contrôlée par mesure de densité optique des cultures liquides autour d’une valeur initiale d’environ<br />
0,05.<br />
III.1.2.2<br />
Utilisation de stocks congelés ou de précultures<br />
• Essais menés à partir de précultures<br />
Les essais en cultures pures ont été, en général, réalisés à partir de précultures cellu<strong>la</strong>ires, ellesmême<br />
obtenues à partir des stocks de cellules congelées.<br />
Les précultures de Pseudomonas sp. ADP ont été réalisées par inocu<strong>la</strong>tion d’environ 10 8 CFU/mL<br />
(provenant d’un stock congelé) dans un milieu MM contenant une source de carbone (glucose, 1 g.L -1<br />
et une source d’azote (atrazine 20 mg.L -1 , ou sulfate d’ammonium, 1 g.L -1 )). Les stocks de cellules<br />
congelées contenaient dans des proportions 50/50, un mé<strong>la</strong>nge de milieu MM (milieu minéral) et du<br />
glycérol (40%). Du glycérol résiduel est donc présent dans les culture (environ à 8%). Cependant,<br />
cette source de carbone est mal utilisée par Pseudomonas ADP sp. comme le montre <strong>la</strong> Figure 23 cidessous,<br />
réalisée par mesure de l’activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. Le glucose est quant<br />
à lui facilement <strong>bio</strong>dégradé par Pseudomonas ADP sp.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
118
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
DBO (mg.L -1 )<br />
1600<br />
1400<br />
1200<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
0 10 20 30 40 50<br />
Temps (h)<br />
Glucose (1g/L)<br />
Glycérol (1g/L)<br />
Figure 23 : Utilisation du glycérol ou du glucose comme source de carbone par Pseudomonas ADP sp.<br />
Suivi de <strong>la</strong> respiration de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) en présence d’atrazine (30 mg.L -<br />
1 ) comme source d’azote et 1g.L -1 de glucose ou glycérol comme source de carbone ; 30°C ; agiation 150<br />
rpm<br />
Les cultures de 50 mL ont été agitées (150 rpm) en Erlenmeyers de 250 mL dans une chambre<br />
thermostatée à 30°C pendant 20h. Les essais ont été inoculés à partir de ces précultures lorsque les<br />
micro-organismes étaient en phase exponentielle de croissance (environ 20 h <strong>pour</strong> Pseudomonas<br />
ADP sp. en milieu MM-Glucose). La DO initiale dans chaque essai était d’environ 0,05.<br />
• Essais menés directement à partir de cellules congelées<br />
La densité de cellules dans les précultures réalisées en présence d’atrazine (20 mg.L -1 ) étant très<br />
limitée (DO en fin de croissance aux alentours de 0,18 dans les conditions optimales de croissance),<br />
l’inocu<strong>la</strong>tion des essais impliquait l’introduction d’importants volumes de préculture (environ 10% du<br />
volume initial), introduisant par là même une quantité de nutriments (notamment azotés) non<br />
négligeable et non souhaités dans beaucoup d’essais. Une autre solution envisagée était de<br />
centrifuger les précultures, puis d’effectuer un <strong>la</strong>vage des cellules au tampon phosphate <strong>pour</strong> les<br />
débarrasser de leurs nutriments avant de les inoculer dans chaque essai, ce qui nécessitait <strong>la</strong><br />
préparation d’importants volumes de préculture à centrifuger avec parfois des moyens non adaptés à<br />
ces quantités (volume maximum des tubes à centrifugation disponibles : 30mL).<br />
Le choix d’utiliser directement les stocks de cellules congelées <strong>pour</strong> inoculer les essais, bien que non<br />
« conventionnel », a permis dans tous les cas de réaliser des études comparatives. L’utilisation de<br />
cellules congelées nous permettait ainsi de connaître parfaitement le nombre de cellules inoculées<br />
tout en nous affranchissant des problèmes posés par <strong>la</strong> présence non souhaitée de traces d’atrazine<br />
ou autre source de nutriments dans le cas de l’utilisation de préculture.<br />
L’incertitude liée à l’effet de <strong>la</strong> congé<strong>la</strong>tion et de <strong>la</strong> conservation des cellules congelées sur leur survie<br />
et leur physiologie demeure en l’absence de précultures permettant de contrôler <strong>la</strong> revitalisation des<br />
cellules. Cependant, <strong>la</strong> comparaison d’essais de minéralisation de l’atrazine effectués à partir de<br />
119<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
précultures ou de stocks de cellules congelées a montré que cet effet pouvait être négligé (Figure 24).<br />
Une phase de <strong>la</strong>tence d’une dizaine d’heures environ par rapport à l’utilisation de précultures est<br />
observée, correspondant à <strong>la</strong> phase de revitalisation des cellules congelées.<br />
90<br />
80<br />
70<br />
% Atrazine minéralisée<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
Préculture<br />
Cellules congelées<br />
0<br />
0 50 100 150 200 250 300 350 400<br />
Temps (h)<br />
Figure 24 : Comparaison de <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. inoculé à environ<br />
10 6 cfu/mL à partir d’une préculture ou de cellules congelées, en milieu minéral MM (glucose 1g.L -1 ; 14 C-<br />
atrazine 20 mg.L -1 ), 20°C.<br />
III.1.3 Suivi de <strong>la</strong> croissance des micro-organismes et de l’activité<br />
respiratoire<br />
III.1.3.1<br />
Suivi de <strong>la</strong> croissance cellu<strong>la</strong>ire<br />
Selon les expérimentations menées, <strong>la</strong> croissance cellu<strong>la</strong>ire à été suivie soit :<br />
- par lecture de <strong>la</strong> densité optique à 600 nm.<br />
- par comptage sur boite de Pétri<br />
- par dosage des protéines<br />
III.1.3.1.1 Mesure de turbidité<br />
La croissance cellu<strong>la</strong>ire a été suivie dans certains essais par mesure de <strong>la</strong> turbidité des cultures à<br />
600 nm sur un spectrophotomètre UV-Visible Milton Roy Spectronic 401 multi-cuvettes.<br />
Des aliquotes de 1 mL de culture ont été utilisés.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
120
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
III.1.3.1.2 Dénombrement sur boite de Pétri<br />
Le suivi de croissance bactérienne <strong>pour</strong> les essais contenant de l’écorce de pin en poudre a été<br />
réalisé par étalement sur boite de Pétri PCA (Cf. III.1.1.2) des suspensions décantées (non<br />
centrifugées) et diluées entre 10 -4 et 10 -9 . Les boites ont été incubées à 30°C pendant plusieurs jours.<br />
Le dénombrement est effectué par comptage à l’œil nu des colonies formées.<br />
III.1.3.1.3 Dosage des protéines par <strong>la</strong> méthode de Folin- Lowry :<br />
La culture à doser (1 mL contenant 0 à 100 µg de protéines) est chauffée à 90°C en présence d’une<br />
solution de NaOH (0,2 N) pendant 2 h. La solution traitée est centrifugée à 10000 rpm pendant<br />
15 minutes afin d’éliminer les fractions cellu<strong>la</strong>ires non hydrolysées.<br />
La réaction colorimétrique se fait par mé<strong>la</strong>nge de :<br />
- 1 mL de réactif cuprique (EDTA cuivré 0,25 g.L -1 , NaCO 3 20 g.L -1 , NaOH 0,1 N)<br />
- 0,1 mL de réactif de Folin<br />
- 0,2 mL de surnageant<br />
Le réactif de Folin (solution phénolique contenant des composés de tungstène et de molybdène) est<br />
réduit, passant de <strong>la</strong> couleur du jaune au bleu, par les ions Cu + (réactif cuprique).<br />
La coloration se développe pendant 30 minutes à l’obscurité à température ambiante.<br />
L’absorbance est mesurée à 660 nm contre un b<strong>la</strong>nc sans protéine réalisé de <strong>la</strong> même manière que<br />
l’échantillon à doser.<br />
Une courbe de calibration est effectuée à partir de l’albumine sérique de bœuf entre 0 et 100 µg.<br />
III.1.3.1.4 Dosage des protéines par <strong>la</strong> méthode Bradford :<br />
L’échantillon à doser (100 µl) contenant 0 à 20 µg de protéines est mé<strong>la</strong>ngé à 2 mL de réactif de<br />
Bradford. La coloration se développe en 2 minutes. L’absorbance à 595 nm est lue contre un b<strong>la</strong>nc<br />
sans protéines. La teneur en protéines de l’échantillon est déterminée grâce à une courbe<br />
d’étalonnage réalisée avec de l’albumine sérique de bœuf.<br />
Le réactif de Bradford est composé de :<br />
- Bleu de Coomassie 100 mg<br />
- Ethanol 95% 50 mL<br />
- Acide O-phosphorique 100 mL<br />
- Eau distillée q.s.p. 1000mL<br />
Le réactif est stable pendant 15 jours à température ambiante.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
121
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
III.1.3.2<br />
Suivi de l’activité respiratoire (ou Demande Bio<strong>chimique</strong> en Oxygène DBO)<br />
La respiration des micro-organismes, témoignant d’une activité <strong>bio</strong>logique aérobie, a été mesurée<br />
dans des f<strong>la</strong>cons de 500 mL équipés de têtes Oxitop® (commercialisés par WTW) permettant <strong>la</strong><br />
mesure directe de <strong>la</strong> pression à l’intérieur des f<strong>la</strong>cons.<br />
III.1.3.2.1 Principe de <strong>la</strong> mesure<br />
Dans des f<strong>la</strong>cons hermétiques (Figure 25), le CO 2 expiré par les micro-organismes résultant de <strong>la</strong><br />
consommation d’oxygène <strong>pour</strong> l’oxydation de <strong>la</strong> matière organique du milieu est dissous dans <strong>la</strong><br />
soude, p<strong>la</strong>cée sous forme de pastilles solides dans un piège en caoutchouc au-dessus de <strong>la</strong> solution.<br />
La quantité de soude p<strong>la</strong>cée dans <strong>la</strong> trappe doit être suffisante par rapport à <strong>la</strong> quantité de matière<br />
organique présente dans les f<strong>la</strong>cons et potentiellement <strong>bio</strong>dégradable.<br />
Dans ces conditions, <strong>la</strong> consommation d’oxygène et <strong>la</strong> dissolution du CO 2 expiré crée une dépression<br />
dans le f<strong>la</strong>con mesuré par des détecteurs de pression présents dans les têtes Oxitop® ; cette<br />
dépression est ensuite exprimée en consommation de O 2 en mg.L -1 ou mg.g -1 de carbone organique.<br />
La réaction de dissolution du CO 2 dans <strong>la</strong> soude (NaOH) est <strong>la</strong> suivante :<br />
CO2 + 2 NaOH → Na2CO3<br />
+ H<br />
2O<br />
La mesure de variation de pression et <strong>la</strong> consommation d’oxygène sont reliées par <strong>la</strong> loi des gaz<br />
parfaits.<br />
Ce système nécessite une approximation préa<strong>la</strong>ble de <strong>la</strong> DBO, calculée à partir de <strong>la</strong> DBO théorique<br />
dite DthO normalisée (OCDE-301-AnnexeIV) dont <strong>la</strong> formule suit :<br />
16<br />
DthO =<br />
[ 2C<br />
+ 0,5( H − Cl − 3N)<br />
+ 3S<br />
+ (5/ 2) P + (1/ 2) Na − O]<br />
Mr<br />
Pour une molécule considérée, chaque lettre représente le nombre d’atomes (correspondant au<br />
symbole <strong>chimique</strong>) contenu dans celle-ci, et Mr son poids molécu<strong>la</strong>ire.<br />
Pour le glucose (C 6 H 12 O 6 ), on trouve par exemple une DthO de 1,07 g de O 2 .g -1 de glucose.<br />
La connaissance de <strong>la</strong> DthO, de <strong>la</strong> température d’incubation et de <strong>la</strong> pression atmosphérique permet<br />
d’évaluer le volume d’échantillon à introduire dans les f<strong>la</strong>cons <strong>pour</strong> avoir un volume d’air suffisant à <strong>la</strong><br />
respiration des micro-organismes <strong>pour</strong> un intervalle de temps déterminé.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
122
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
III.1.3.2.2 Protocole expérimental<br />
Les essais de respirométrie ont été réalisés dans des f<strong>la</strong>cons stériles de 500 mL contenant 20 ou<br />
50 mL de milieu de culture selon les cas. Les f<strong>la</strong>cons ont été agités à 150 rpm sur une table orbitale<br />
p<strong>la</strong>cée à 30 °C à l’obscurité pendant toute <strong>la</strong> durée de l’incubation. Les essais ont été inoculés à partir<br />
de stock de cellules congelées (environ 10 6 cfu.mL -1 ).<br />
Les essais ont été réalisés en triplicats. Des témoins a<strong>bio</strong>tiques ont été traités de <strong>la</strong> même manière<br />
mais sans inocu<strong>la</strong>tion. Des témoins « vides » (f<strong>la</strong>cons vides) ont permis d’enregistrer les variations<br />
éventuelles de pression ou de température au cours du temps.<br />
Grâce au boîtier Oxitop®, les données ont été récupérées soit à <strong>la</strong> fin des essais soit au fur et à<br />
mesure de <strong>la</strong> mesure grâce au logiciel OC Achat (commercialisé avec le matériel Oxitop par WTW).<br />
Les données ont ensuite été traitées sur Excel. La Figure 25 représente le matériel Oxitop® utilisé lors<br />
de ces essais de respirométrie.<br />
Figure 25 : F<strong>la</strong>con de DBO équipé de tête Oxitop® utilisé lors des études de respirométrie<br />
III.1.3.3<br />
Détermination du taux de croissance maximal<br />
Le taux de croissance des bactéries µ max est calculé dans <strong>la</strong> phase exponentielle de croissance.<br />
Ainsi, µ max est exprimé selon <strong>la</strong> re<strong>la</strong>tion suivante, lorsque S supporte <strong>la</strong> croissance (source de<br />
carbone) :<br />
linéarisé en<br />
X = X<br />
0 .<br />
e<br />
µ max . t<br />
ln X = ln X µ . t<br />
0 +<br />
max<br />
avec X, <strong>la</strong> concentration cellu<strong>la</strong>ire au temps t et X 0 <strong>la</strong> concentration cellu<strong>la</strong>ire au temps t=0.<br />
La vitesse de consommation du substrat S est exprimée selon l’équation :<br />
123<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
−<br />
dS<br />
dt<br />
1<br />
= ⋅<br />
Y<br />
dX<br />
dt<br />
où : S : Concentration en substrat (atrazine) au temps t (n S .V -1 )<br />
µ m : Taux de croissance maximale (T -1 )<br />
Y : Taux de conversion <strong>bio</strong>masse/substrat (Nbre Cell. M -1 )<br />
X 0 : Concentration cellu<strong>la</strong>ire à t=0 (n Cell .V -1 )<br />
L’intégration de cette équation entre t 0 et t donne :<br />
soit<br />
S − S<br />
S = S<br />
1<br />
= ( X<br />
Y<br />
0 0<br />
− X<br />
X<br />
( e<br />
0 µ<br />
0<br />
−<br />
m t<br />
−<br />
Y<br />
)<br />
1)<br />
avec<br />
X<br />
=<br />
X<br />
0 .<br />
e<br />
µ max . t<br />
Ainsi, seulement si l’atrazine est support de croissance de Pseudomonas ADP sp. nous <strong>pour</strong>rons<br />
déterminer des vitesses de croissance en fonction du taux de conversion Y.<br />
III.1.4 Suivi de <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine<br />
III.1.4.1<br />
Biodégradation primaire de l’atrazine<br />
La <strong>bio</strong>dégradation primaire de l’atrazine a été suivie par analyse HPLC des échantillons liquides,<br />
après filtration à 0,45 µm sur membranes de nitrate de cellulose.<br />
Le protocole <strong>pour</strong> l’analyse HPLC de l’atrazine est décrit au § (a). Les analyses HPLC en détection<br />
UV nous ont permis de quantifier l’atrazine à des concentrations supérieures à 0,03 mg.L -1 .<br />
Au-dessous de cette concentration, l’utilisation d’atrazine uniformément marquée [U-ring- 14 C]-atrazine<br />
a été requise.<br />
Les composés intermédiaires de dégradation de l’atrazine n’ayant pas été pas détectés grâce à cette<br />
méthode, l’analyse HPLC (dans le cas de l’utilisation d’atrazine froide) a simplement permis d’étudier<br />
<strong>la</strong> disparition de l’atrazine du milieu ; ainsi, l’information donnée par ces analyses ne renseigne pas<br />
sur <strong>la</strong> minéralisation mais seulement sur <strong>la</strong> dégradation primaire de l’atrazine.<br />
124<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
L’atrazine a été ajoutée au milieu de culture à partir d’une solution mère concentrée (2000 mg.L -1 )<br />
préparée dans le méthanol, en suivant une procédure inspirée des protocoles utilisés par<br />
Mandelbaum et al. (1993, 1995). Dans les essais, le méthanol est ainsi présent entre 1 et 2,5 % dans<br />
le milieu de culture.<br />
La Figure 26 montre que dans ces conditions (semb<strong>la</strong>bles à celles des futurs essais en milieu minéral,<br />
glucose 1g.L -1 et atrazine quelques dizaines de mg.L -1 ), l’addition d’atrazine à partir d’une solution<br />
mère concentrée préparée dans le méthanol n’a pas d’effet sur <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP<br />
sp.<br />
0,18<br />
0,16<br />
0,14<br />
0,12<br />
DO 600nm<br />
0,1<br />
0,08<br />
0,06<br />
0,04<br />
Atrazine sans MeOH<br />
Atrazine dans MeOH<br />
0,02<br />
0 10 20 30 40 50 60<br />
Temps (h)<br />
Figure 26 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM-glucosé à 1 g.L -1 ) avec atrazine<br />
(30 mg.L -1 ) additionnée au milieu à partir d’une solution mère concentrée dans le méthanol ou dissoute<br />
directement en poudre dans le milieu MM ; 30°C ; agitation 150 rpm<br />
En revanche, nous n’avons pas identifié si le méthanol était utilisé par Pseudomonas ADP sp. en tant<br />
que source de carbone (aucune référence trouvée dans <strong>la</strong> littérature).<br />
D’autre part, les résultats présentés au § III.1.2.2 montrent que le glycérol est très mal assimilé par<br />
Pseudomonas ADP sp. et que par conséquent l’utilisation de cellules congelées contenant 20% de<br />
glycérol ne contribue pas à alimenter les cultures en source de carbone utilisable par Pseudomonas<br />
ADP sp.<br />
III.1.4.2<br />
Minéralisation de l’atrazine<br />
L’étude de <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine a été réalisée grâce à l’utilisation d’atrazine radioactive par<br />
suivi du 14 CO 2 formé.<br />
La [U-ring- 14 C]-atrazine commercialisée par Sigma, d’activité spécifique de 24,6 mCi.mmol - 1 a été<br />
utilisée <strong>pour</strong> réaliser plusieurs séries d’expériences à des concentrations initiales de 20 mg.L -1 et<br />
44,2 µg.L -1 .<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
125
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
III.1.4.2.1 Préparation des solutions mères d’atrazine marquée<br />
Pour les séries à 20 mg.L -1 , une solution mère à 2 g.L -1 a été préparée dans le méthanol à partir d’un<br />
mé<strong>la</strong>nge d’atrazine froide et d’atrazine radioactive. L’activité spécifique de <strong>la</strong> solution mère était de<br />
2 µCi.mL -1 . L’activité initiale dans chaque essai à 20 mg.L -1 était de 1 µCi par fiole (<strong>bio</strong>mètre).<br />
Pour les séries à 44,2 µg.L -1 , une solution mère à 4,4 mg.L -1 a été préparée dans le méthanol à partir<br />
d’atrazine radioactive uniquement. L’activité spécifique de <strong>la</strong> solution mère était de 0,5 µCi.mL -1 .<br />
L’activité initiale dans chaque essai à 44,2 µg.L -1 était de 0,25 µCi par fiole (<strong>bio</strong>mètre).<br />
III.1.4.2.2 Principe des essais de minéralisation<br />
Le dispositif expérimental des essais de minéralisation en <strong>bio</strong>mètres est présenté sur <strong>la</strong> photo cidessous<br />
(Figure 27).<br />
Figure 27 : Photo d’un <strong>bio</strong>mètre <strong>pour</strong> l’étude de <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine<br />
Le CO 2 résultant de <strong>la</strong> respiration des micro-organismes est dissous dans <strong>la</strong> soude (1M) présente<br />
dans un piège p<strong>la</strong>cée au-dessous des bouchons de chaque <strong>bio</strong>mètre.<br />
Suivi de <strong>la</strong> minéralisation. Quantification du 14 CO 2<br />
La minéralisation de l’atrazine a été suivie par quantification du 14 CO 2 dissous dans <strong>la</strong> soude p<strong>la</strong>cée<br />
dans les <strong>bio</strong>mètres utilisés <strong>pour</strong> les expériences de minéralisation en milieu dispersé aussi appelé<br />
« Essai en Batch » (Figure 28).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
126
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Trappe Piège à NaOH C0 2 – NaOH (1 M) (10,5 M) ml 0,5 mL<br />
Milieu liquide<br />
Barreau aimenté<br />
Figure 28 : Représentation schématique d’un <strong>bio</strong>mètre utilisé dans les essais de minéralisation en<br />
« Batch »<br />
La soude (1 M) contenue dans les pièges à CO 2 (0,5 mL) a été prélevée régulièrement au cours du<br />
temps et remp<strong>la</strong>cée par de <strong>la</strong> soude fraîche (deux fois par jour en début d’expériences puis tous les 2<br />
ou 3 jours ensuite). Les 0,5 mL de soude sont p<strong>la</strong>cés dans une fiole à scintil<strong>la</strong>tion dans <strong>la</strong>quelle 7 mL<br />
de liquide scintil<strong>la</strong>nt sont ensuite ajoutés ; après une heure, le mé<strong>la</strong>nge est analysé au compteur à<br />
scintil<strong>la</strong>tion TRI-CARB 2100TR Packard Liquid Scintil<strong>la</strong>tion Analyser (le dé<strong>la</strong>i de 1 heure permet<br />
d’éviter <strong>la</strong> scintil<strong>la</strong>tion de <strong>la</strong> soude (environ 120 dpm)).<br />
Les résultats donnés en dpm (désintégration par minute) sont finalement traduits en % de<br />
minéralisation par rapport à <strong>la</strong> radioactivité initialement présente dans les <strong>bio</strong>mètres.<br />
Suivie de <strong>la</strong> radioactivité en solution<br />
Le suivi de <strong>la</strong> radioactivité dans <strong>la</strong> phase liquide des essais de minéralisation a été réalisé par<br />
prélèvement de 1 mL de solution contenant initialement une quantité connue de [U-ring- 14C ]-atrazine.<br />
7 mL de liquide à scintil<strong>la</strong>tion sont additionnés au prélèvement puis le mé<strong>la</strong>nge est analysé au<br />
compteur de <strong>la</strong> même façon que précédemment.<br />
III.1.4.2.3 Protocole expérimental<br />
Les essais ont été réalisés en <strong>bio</strong>mètre en milieu minéral stérile MM (50 mL/<strong>bio</strong>mètre). Pseudomonas<br />
ADP sp. a été inoculé au milieu à partir de précultures réalisées comme expliqué au chapitre III.1.2.2<br />
<strong>pour</strong> obtenir une DO initiale d’environ 0,05. Les <strong>bio</strong>mètres ont été incubés à 20 ± 2 °C sous une<br />
agitation douce (barreau magnétique). Deux concentrations initiales en atrazine ont été testées<br />
(20 mg.L -1 et 44,2 µg.L -1 ). L’atrazine était <strong>la</strong> seule source d’azote. Le glucose additionné au milieu à<br />
une concentration de 1 g.L -1 était <strong>la</strong> source de carbone.<br />
La minéralisation de l’atrazine a été suivie pendant environ 300 heures (avec renouvellement de l’air à<br />
chaque prélèvement des pièges à soude, soit tous les 2-3 jours au maximum).<br />
Des témoins a<strong>bio</strong>tiques non inoculés avec Pseudomonas ADP sp. ont permis de suivre <strong>la</strong><br />
minéralisation de l’atrazine en milieu a<strong>bio</strong>tique et de vérifier <strong>la</strong> non contamination des milieux utilisés.<br />
127<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Les essais et les b<strong>la</strong>ncs ont été réalisés en triplicats.<br />
III.1.5 Influence de paramètres <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s<br />
L’étude de l’influence de certains paramètres sur <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. et sur sa<br />
capacité à dégrader l’atrazine a permis de fixer certaines limites expérimentales. Les paramètres<br />
comme <strong>la</strong> température, le pH ainsi que l’apport de nutriments ont été testés en culture pure de<br />
Pseudomonas ADP sp.<br />
III.1.5.1<br />
Influence des sources de carbone<br />
Pseudomonas ADP sp. est décrite dans <strong>la</strong> littérature comme une souche capable de minéraliser<br />
l’atrazine en tant que source d’azote (Mandelbaum et al., 1995) ; l’atrazine n’est donc pas utilisée<br />
comme source de carbone. L’addition d’une source de carbone a donc été requise dans les différents<br />
essais afin de subvenir au besoin des bactéries. Le glucose a été choisi comme source de carbone<br />
facilement <strong>bio</strong>dégradable. Mandelbaum et al. (1995) montre que le citrate constitue également une<br />
source facilement assimilée par Pseudomonas ADP sp.<br />
III.1.5.2<br />
Influence de <strong>la</strong> température et du pH<br />
Des essais de croissance bactérienne et de dégradation de l’atrazine ont été menés à des<br />
températures al<strong>la</strong>nt de 12°C, qui <strong>pour</strong>rait correspondre à <strong>la</strong> température d’une eau naturelle à traiter, à<br />
30°C correspondant à <strong>la</strong> température optimale de croissance des bactéries mésophiles.<br />
L’influence du pH sur <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. et sa capacité à dégrader l’atrazine a<br />
été étudié en parallèle.<br />
Protocole expérimental <strong>pour</strong> les essais à différentes températures<br />
La croissance de Pseudomonas ADP sp. a été suivie en milieu minéral MM (§ III.1.1.1.1) en présence<br />
de 50 mg.L -1 d’atrazine (addition d’atrazine dans le milieu à partir d’une solution mère d’atrazine à<br />
2000 mg.L -1 ) en tant que seule source d’azote. La source de carbone était le glucose à 1 g.L -1 .<br />
Les essais de 50 mL ont été inoculés à une DO 600 de 0,05 à partir d’une préculture réalisée à 30°C en<br />
milieu MM pendant 20 h (III.1.2.2) et incubés à 30°C, 20°C ou 12°C, sous une agitation de 150 rpm.<br />
La croissance a été évaluée par lecture de DO 600 et les protéines du milieu ont été quantifiées par <strong>la</strong><br />
méthode de Bradford (III.1.3.1).<br />
Les essais ont été réalisés en triplicats.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
128
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Protocole expérimental <strong>pour</strong> les essais à différents pH<br />
De <strong>la</strong> même manière que les essais précédents, des essais à différents pH ont été réalisés dans un<br />
milieu MM (50 mL) contenant 20 mg.L -1 d’atrazine comme seule source d’azote et 1 g.L -1 de glucose<br />
comme seule source de carbone. Ces essais ont été inoculés à partir de cellules congelées de<br />
Pseudomonas ADP sp. (environ 10 6 cfu.mL -1 , DO initiale environ 0,05) et incubés à 30°C sous<br />
agitation orbitale (150 rpm).<br />
Les 4 pH suivants ont été testés : 3,5 ; 4,4 ; 5,2 ; 7,0.<br />
Les essais ont été réalisés en triplicats.<br />
Le milieu MM non tamponéa été ajusté au pH désiré à l’aide d’une solution de KH 2 PO 4 (50 g.L -1 ).<br />
Après stérilisation du milieu MM par autoc<strong>la</strong>vage, le pH a été vérifié avant d’utiliser le milieu dans les<br />
essais. Le pH a également été contrôlé en fin d’expérience.<br />
La dégradation primaire de l’atrazine a été suivie par prélèvements entre le temps 0 et 60 heures et<br />
analyse des échantillons par HPLC (§ II.1.1.1.2(a)).<br />
III.1.5.3<br />
Influence d’une source additionnelle d’azote<br />
III.1.5.3.1 Croissance bactérienne et dégradation primaire de l’atrazine<br />
La croissance de Pseudomonas ADP sp. a été suivie en milieu minéral MM (§ III.1.1.1.1) contenant<br />
environ 50 mg.L -1 d’atrazine en présence ou non d’une source additionnelle d’azote ((NH 4 ) 2 SO 4 ,<br />
1 g.L -1 ). La source de carbone était le glucose à 1g.L -1 .<br />
Les essais de 20 mL ont été inoculés à une DO 600 de 0,05 à partir de cellules congelées de<br />
Pseudomonas ADP sp. (environ 10 6 cfu.mL -1 ).<br />
Les essais ont été réalisés en triplicats, incubés à 30°C sous agitation (150 rpm).<br />
La coissance a été suivie par mesure de densité optique à 600 nm, pendant 60 heures.<br />
La <strong>bio</strong>dégradation primaire de l’atrazine a été quantifiée par analyse HPLC des échantillons prélevés<br />
entre t 0 et 60 heures.<br />
III.1.5.3.2 Minéralisation de l’atrazine<br />
Ces expériences à l’atrazine marquée ont été réalisées au CEA (Commissariat à l’Energie Atomique)<br />
de Grenoble, au <strong>la</strong>boratoire DBMS/BBSI.<br />
Le suivi de <strong>la</strong> production du 14 CO 2 a permis de quantifier <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine selon le<br />
protocole décrit en III.1.4.2.2<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
129
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
La minéralisation de l’atrazine a été suivie en MM (Glucose 1 g.L -1 comme source de carbone) en<br />
présence ou non d’une source additionnelle d’azote (Sulfate d’ammonium, 1 g.L -1 ).<br />
Les essais de 50 mL ont été inoculés à une DO 600 de 0,05 correspondant environ à 10 6 cfu/mL.<br />
III.1.5.4<br />
Influence des composés solubles de l’écorce de pin<br />
Le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> envisagé est principalement dépendant de <strong>la</strong> capacité de Pseudomonas ADP<br />
sp. à survivre et à se développer en présence de l’écorce de pin choisie comme support de <strong>bio</strong>filtre.<br />
L’écorce de pin contenant une grande variété de composés organiques, <strong>la</strong> toxicité de ces derniers vis<br />
à vis de <strong>la</strong> souche bactérienne choisie <strong>pour</strong> ce <strong>traitement</strong> a dû être testée. Ainsi, l’activité respiratoire<br />
de Pseudomonas ADP sp., sa capacité à croître et à dégrader l’atrazine en présence des composés<br />
solubles de l’écorce de pin ont été étudiées dans les essais décrits ci-dessous.<br />
Ces essais ont été réalisés en extrait aqueux d’écorce de pin, préparé comme décrit au § I.6 et<br />
stérilisé selon le protocole présenté au § I.7.<br />
Tous les essais réalisés en triplicats, ont été inoculés à partir de cellules congelées de Pseudomonas<br />
ADP sp.<br />
III.1.5.4.1 Influence sur l’Activité Respiratoire de Pseudomonas ADP sp.<br />
Dans une première série d’essais, <strong>la</strong> respiration de Pseudomonas ADP sp. a été suivie en extrait<br />
aqueux d’écorce de pin (20 mL) en présence ou non de sels minéraux additionnels contenus dans le<br />
milieu MM utilisé dans les essais précédents. Aucune source de carbone additionnelle n’a été ajouté à<br />
l’extrait d’écorce, les composés organiques solubles de l’écorce de pin représentant <strong>la</strong> seule source<br />
de carbone <strong>pour</strong> Pseudomonas ADP sp. (COT extrait = 100 mg.L -1 ).<br />
En parallèle à ces essais, des témoins réalisés en MM, ont servi de référence. Dans les témoins en<br />
MM, le glucose a été additionné à 0,25 ou 1 g.L -1 comme seule source de carbone, correspondant<br />
respectivement à 100 mg.L -1 et 400 mg.L -1 de carbone.<br />
Dans tous les essais (MM et extrait), (NH 4 ) 2 SO 4 1 g.L -1 est ajouté comme source d’azote.<br />
Le protocole opératoire <strong>pour</strong> ces essais de respirométrie est décrit au § III.1.3.2.2.<br />
Dans une seconde série d’essais, l’influence de l’addition d’une source de carbone à l’extrait aqueux<br />
d’écorce de pin a été testée selon le même protocole (§ III.1.3.2.2). Les f<strong>la</strong>cons DBO ont été préparés<br />
avec 50 mL de milieu. La source d’azote était l’atrazine (30 mg.L -1 ). Le glucose a été apporté à l’extrait<br />
comme source additionnelle de carbone à différentes concentrations : 0 mg.L -1 ; 0,25 mg.L -1 ;<br />
0,5 mg.L -1 et 1 mg.L -1 .<br />
Des b<strong>la</strong>ncs non inoculés ont également été suivis. Tous les essais ont été incubés en chambre<br />
thermostatée à 30°C.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
130
MATERIEL ET METHODES<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
III.1.5.4.2 Influence sur <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. et <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de<br />
l’atrazine<br />
La croissance de Pseudomonas ADP sp. a été suivie à 30°C (agitation 150 rpm) dans des<br />
Erlenmeyers de 100 mL, dans les milieux suivants (20 mL de milieu):<br />
- Extrait d’écorce de pin seul<br />
- Extrait d’écorce de pin ± une source additionnelle d’azote ((NH 4 ) 2 SO 4 1 g.L -1 ± glucose<br />
(1 g.L -1 ) ± atrazine (50 mg.L -1 ).<br />
Des témoins ont été menés en parallèle en milieu minéral (MM). Des b<strong>la</strong>ncs non inoculés ont<br />
également été suivis. La croissance a été suivie par mesure de <strong>la</strong> DO à 600 nm selon le protocole<br />
décrit au § III.1.3.1.1.<br />
La <strong>bio</strong>dégradation primaire de l’atrazine a été suivie par HPLC selon le protocole décrit au § III.1.4.1.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
131
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
III.2 Résultats et dissussion<br />
III.2.1 Introduction<br />
Pseudomonas ADP sp. a été retenue <strong>pour</strong> ses capacités à minéraliser l’atrazine grâce à <strong>la</strong> présence<br />
de gènes localisés sur le p<strong>la</strong>smide pADP-1 (Martinez et al., 2001) et choisie <strong>pour</strong> participer à<br />
l’élimination de ce polluant dans le cadre de notre procédé de <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong>.<br />
Dans un premier temps, quelques paramètres <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s ont été testés sur cette souche afin<br />
de mieux connaître son comportement dans différents environnements et notamment de répondre aux<br />
questions suivantes : Jusqu’à quelle température peut-on observer <strong>la</strong> croissance de cette bactérie et<br />
l’activité de minéralisation de l’atrazine ? Pseudomonas ADP sp. est-elle capable de survivre dans un<br />
milieu acide (pH 4-5) imposé par <strong>la</strong> présence d’écorce de pin en poudre en solution ? Quelle est<br />
l’influence de <strong>la</strong> présence d’une source d’azote dans le milieu, autre que celle de l’atrazine ?<br />
D’autre part, une partie de ce chapitre a été consacrée à l’étude de l’influence des composés<br />
organiques solubles de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp. La toxicité de ces composés ainsi<br />
que <strong>la</strong> capacité de Pseudomonas ADP sp. à les consommer en tant que source nutritive d’azote ou de<br />
carbone ont été étudiées.<br />
III.2.2 Influence de paramètres <strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong>s<br />
III.2.2.1<br />
Croissance et <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine à différentes températures<br />
Dans un souci de réduction des coûts de <strong>traitement</strong>, l’utilisation de l’eau à décontaminer à<br />
température ambiante présenterait un avantage certain. Les micro-organismes étant sensibles à <strong>la</strong><br />
température et leur genre Pseudomonas étant, dans leur grande majorité, connu <strong>pour</strong> posséder une<br />
activité optimale entre 20 et 42°C (bactéries mésophiles) (voir § III.1.5.2), l’étude qui suit a eu <strong>pour</strong> but<br />
de répondre à <strong>la</strong> question suivante : A basses températures (10°-15°C), pouvant correspondre aux<br />
températures de l’eau à traiter, Pseudomonas ADP sp. peut-elle croître et conserver sa capacité à<br />
consommer l’atrazine ?<br />
Trois températures ont été testées : 12°C, 20°C et 30°C. Le protocole de ces expériences a été décrit<br />
au § III.1.5.2. La croissance et <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation primaire de l’atrazine ont été suivies en milieu<br />
minéral MM avec l’atrazine (environ 50 mg.L -1 ) comme seule source d’azote.<br />
Figure 29 présente le suivi de <strong>la</strong> croissance bactérienne et <strong>la</strong> dégradation primaire de l’atrazine par<br />
Pseudomonas ADP sp. aux trois températures étudiées.<br />
132<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Les résultats montrent que croissance et <strong>bio</strong>dégradation évoluent en fonction de <strong>la</strong> température. On<br />
note bien que l’activité de Pseudomonas ADP sp. est optimale à 30°C. A 20°C, <strong>la</strong> croissance est<br />
légèrement ralentie et <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine est très légèrement affectée (Tableau 11).<br />
A une température de 12°C Pseudomonas ADP sp. est capable de survivre, de croître et dégrader<br />
l’atrazine, mais de manière plus lente qu’aux hautes températures.<br />
L’expression des taux de croissance µ m . (Cf. § III.1.3.3) en fonction de <strong>la</strong> température (Tableau 10)<br />
traduit l’effet de <strong>la</strong> température sur <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. Entre 12 et 30°C, le taux<br />
de croissance µ m évolue linéairement avec <strong>la</strong> température selon l’équation suivante (µ est estimé sur<br />
les 20 premières heures de croissance) :<br />
µ m = 0,0015 θ + 0,0302<br />
où θ est <strong>la</strong> température en °C et µ m le taux de croissance en h -1 (Tableau 10).<br />
La vitesse de dégradation de l’atrazine, quant à elle, n’évolue pas linéairement avec <strong>la</strong> température et<br />
donc pas non plus avec le taux de croissance de Pseudomonas ADP sp. : croissance et <strong>bio</strong>déradation<br />
de l’atrazine en tant que source d’azote ne seraient pas corrélées chez Pseudomonas ADP sp.<br />
On remarque ainsi (Tableau 11) que les quantités d’atrazine dégradées en fonction du temps sont<br />
simi<strong>la</strong>ires à 20 ou à 30°C ; à t=12h, 91 à 98% de l’atrazine initialement présente dans le milieu ont été<br />
dégradés contre 70% seulement à 12°C. L’activité de <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine est c<strong>la</strong>irement<br />
ralentie à cette température.<br />
0,35<br />
0,30<br />
A<br />
70<br />
60<br />
B<br />
0,25<br />
50<br />
0,20<br />
0,15<br />
0,10<br />
12 °C<br />
20°C<br />
0,05<br />
30°C<br />
0,00<br />
0 20 40 60 80 100 120<br />
Temps (h)<br />
40<br />
30<br />
12 °C<br />
20°C<br />
20<br />
30°C<br />
10<br />
0<br />
0 20 40 60 80 100 120<br />
Temps (h)<br />
Figure 29 : Influence de <strong>la</strong> température sur <strong>la</strong> croissance (A) de Pseudomonas ADP sp. et sa capacité à<br />
dégrader l’atrazine (B) en milieu minéral (MM), avec atrazine (environ 50 mg.L - 1) comme seule source<br />
d’azote et glucose (1 g.L -1 ) comme source de carbone ; agitation orbitale (150 rpm) ; pH 7<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
133
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Tableau 10 : Taux de croissance µ m de Pseudomonas ADP sp. calculés sur les 20 premières heures en<br />
fonction de <strong>la</strong> température<br />
T 12°C 20°C 30°C<br />
µ m (h -1 ) 0,0482 0,0602 0,0752<br />
Tableau 11 : Pourcentage d’atrazine dégradée en 12 heures en fonction de <strong>la</strong> température<br />
T 12°C 20°C 30°C<br />
Atz dégradée<br />
t=12h<br />
70% 93% 98%<br />
Ces résultats montrent que le procédé <strong>pour</strong>rait être appliqué sans réchauffement de l’eau à traiter.<br />
Cependant, l’augmentation de <strong>la</strong> température accélérant le taux de <strong>bio</strong>dégradation, une analyse du<br />
rapport Energie/Efficacité/Coût serait nécessaire <strong>pour</strong> déterminer <strong>la</strong> température optimale <strong>pour</strong> ce<br />
<strong>traitement</strong>.<br />
III.2.2.2<br />
Croissance et <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine à différents pH<br />
La croissance de Pseudomonas ADP sp. ainsi que sa capacité à dégrader l’atrazine ont été testées à<br />
différents pH, en particulier dans <strong>la</strong> gamme de pH 4-5 correspondant aux pH imposés par l’écorce de<br />
pin en poudre en suspension dans l’eau. La survie des bactéries dans ces conditions de pH est<br />
essentielle dans le cadre du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong>. En effet, de ces résultats dépendent <strong>la</strong> faisabilité du<br />
procédé.<br />
Le protocole expérimental est décrit au § III.1.5.2 et <strong>la</strong> Figure 30 présente les résultats obtenus <strong>pour</strong><br />
les 4 pH testés.<br />
0,20<br />
0,15<br />
pH 3,5<br />
pH 4,4<br />
0,10<br />
pH 5,2<br />
pH 7<br />
0,05<br />
0,00<br />
0 10 20 30 40 50 60<br />
Temps (h)<br />
20<br />
18<br />
16<br />
14<br />
12<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
0 10 20 30 40 50 60<br />
Temps (h)<br />
pH 3,5<br />
pH 4,4<br />
pH 5,2<br />
pH 7<br />
Figure 30 : Influence du pH sur <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. (A) et sa capacité à dégrader<br />
l’atrazine (B) en milie minéral (MM) ; atrazine comme seule source d’azote (environ 15 mg.L -1 ) ; glucose<br />
(1g mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation orbitale (150 rpm)<br />
134<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Le Tableau 12 présente les taux de croissance µ m de Pseudomonas ADP sp aux différents pH<br />
étudiés (calculé sur les 20 premières heures). Tandis que <strong>la</strong> meilleure croissance est logiquement<br />
obtenue à pH 7, on observe une croissance intéressante entre pH 5,2 et 4,4 avec des taux de<br />
croissance 0,0381 h -1 à ces deux pH. A pH 3,5 le taux de croissance est très faible ; Pseudomonas<br />
ADP sp. semble ne pas survivre dans ces conditions et par conséquent aucune dégradation de<br />
l’atrazine n’est observée. De plus, on remarque que µ n’est pas proportionnel au pH comme c’était le<br />
cas <strong>pour</strong> les températures. Malheureusement, aucune valeurs de µ n’a pu être trouvée <strong>pour</strong><br />
Pseudomonas ADP sp. dans <strong>la</strong> littérature.<br />
La <strong>bio</strong>dégradation primaire de l’atrazine à lieu majoritairement au cours des dix premières heures<br />
d’incubation. Si l’activité de consommation de l’atrazine est maximale à pH 7 et 5,2 (Tableau 13, 96 à<br />
99 % d’atrazine initialement présente sont dégradés en 10 heures), elle est également observée, de<br />
manière légèrement retardée à pH 4,4 (82% de l’atrazine initialement apportée est dégradée en 10h).<br />
Tableau 12 : Taux de croissance de Pseudomonas ADP sp. calculés sur les 20 premières heures et<br />
vitesse de <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine calculée s sur les 10 premières heures en fonction du pH<br />
pH 3,5 pH 4,4 pH 5,2 pH 7<br />
µ (h -1 ) 0,0199 0,0381 0,0381 0,0387<br />
Tableau 13 : Pourcentage d’atrazine dégradée en 10h en fonction du pH<br />
Atrazine<br />
dégradée<br />
T=10h<br />
pH 3,5 pH 4,4 pH 5,2 pH 7<br />
1% 82% 99% 96%<br />
Dans l’hypothèse où l’écorce ne serait pas toxique <strong>pour</strong> Pseudomonas ADP sp., ces résultats<br />
indiquent que ces bactéries seraient en mesure de survivre dans les conditions de pH imposées par<br />
l’écorce de pin et qu’un <strong>traitement</strong> visant à tamponner le milieu <strong>pour</strong>rait ainsi être évité.<br />
III.2.2.3<br />
Influence d’une source additionnelle d’azote<br />
Lors d’une pollution d’eaux de surface ou d’eaux souterraines par l’atrazine, <strong>la</strong> concentration en<br />
pesticide ne représentant souvent que quelques micro-grammes par litre, le problème se pose quant à<br />
<strong>la</strong> survie de Pseudomonas ADP sp. lorsque l’atrazine est <strong>la</strong> seule source d’azote. L’activité<br />
métabolique des bactéries étant essentiellement liée à leur croissance, des expériences ont été<br />
menées afin de tester l’influence qu’aurait l’addition d’une source d’azote (en plus de l’atrazine) sur <strong>la</strong><br />
135<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
capacité de Pseudomonas ADP sp. à dégrader le pesticide. Ces expériences ont été réalisées à des<br />
concentrations en atrazine d’environ 50 mg.L -1 (bien supérieures aux taux de pollution observés dans<br />
<strong>la</strong> nature et obtenues avec du méthanol comme cosolvant) afin d’obtenir des taux significatifs de<br />
croissance et de permettre le suivi de <strong>la</strong> concentration en atrazine par analyse HPLC.<br />
III.2.2.3.1 Influence sur <strong>la</strong> dégradation primaire de l’atrazine<br />
La dégradation primaire de l’atrazine a été suivie par analyse HPLC. Il s’agit en réalité du suivi de <strong>la</strong><br />
disparition de l’atrazine du milieu, les métabolites intermédiaires n’étant pas mis en évidence. La<br />
croissance de Pseudomonas ADP sp. a également été suivie en parallèle à <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de<br />
l’atrazine. Le protocole expérimental <strong>pour</strong> ces essais est présenté au § III.1.5.3.<br />
La Figure 31 montre très c<strong>la</strong>irement que l’apport d’une source supplémentaire d’azote (sulfate<br />
d’ammonium 1 g.L -1 ) a un effet positif sur <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral.<br />
Les taux de croissance estimés dans les différents milieux varient entre 0,0119 h -1 dans le milieu ne<br />
contenant que l’atrazine comme source d’azote (50 mg.L -1 environ, équivalent à 16 mg.L -1 d’azote) et<br />
0,0665 h -1 <strong>pour</strong> un milieu contenant ou non de l’atrazine dans lequel le sulfate d’ammonium est<br />
apporté à 1g.L -1 (équivalent à 200 mg.L -1 d’azote).<br />
mg Prot.L -1<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0 10 20 30 40 50 60<br />
Temps ( h)<br />
50<br />
45<br />
40<br />
35<br />
30<br />
25<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
0<br />
Atrazinez (mg.L -1 )<br />
MM + Sulf . Am.<br />
MM + Atrazine + Sulf. Am.<br />
MM + Atrazine<br />
Figure 31 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et dégradation primaire de l’atrazine présente ou non<br />
(50 mg.L -1 ) en milieu minéral (MM) en présence ou non d’une source additionelle d’azote (sulfate<br />
d’ammonium 1 g.L -1 ) ; Glucose (1 g.L -1 ) ; 30°C ; agitation orbitale 150 rpm<br />
La Figure 31 montre également que lorsque du sulfate d’ammonium est apporté (1g.L -1 ), <strong>la</strong> croissance<br />
est identique en milieu minéral glucosé en présence ou non d’atrazine (µ=0,0665 h -1 et 0,0624 h -1<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
136
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
respectivement) traduisant <strong>la</strong> non toxicité de l’atrazine, à une concentration de 50 mg.L -1 environ, vis à<br />
vis de Pseudomonas ADP sp.<br />
La croissance est très réduite lorsque l’atrazine est <strong>la</strong> seule source d’azote présente dans le milieu ; <strong>la</strong><br />
vitesse de dégradation ne semble pas en être <strong>pour</strong> autant affectée ce qui voudrait dire que croissance<br />
et dégradation du substrat atrazine ne seraient pas directement corrélés. C’est également ce<br />
qu’observent Mandelbaum et al. (1995) (voir étude Bibliographique § III.4).<br />
En effet, les vitesses de dégradation de l’atrazine sont tout à fait comparables que ce soit en présence<br />
ou non d’une source additionnelle d’azote comme le sulfate d’ammonium (3,73 et 3,84 mg.h -1<br />
respectivement). Au bout de 13 heures d’incubation, plus de 95% de l’atrazine présente initialement<br />
dans le milieu sont dégradés dans les deux cas.<br />
Ces résultats montrent que <strong>la</strong> dégradation primaire de l’atrazine n’est pas affectée par <strong>la</strong> présence<br />
d’une source additionnelle d’azote dans le milieu mais ne permettent en aucun cas de conclure sur sa<br />
minéralisation.<br />
Pour cette raison, des études de minéralisation ont été menées avec de l’atrazine radioactive.<br />
III.2.2.3.2 Influence sur <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine<br />
Les expériences de minéralisation ont été conduites selon le protocole décrit au § III.1.5.3.2 en milieu<br />
minéral (MM) enrichi au glucose ou en milieu complexe riche LB en présence d’atrazine marquée<br />
(concentration initiale 20 mg.L -1 ) . La minéralisation a été suivie par mesure de <strong>la</strong> production de 14 CO 2<br />
selon le protocole détaillé au § III.1.4.2.3.<br />
Le sulfate d’ammonium (1g.L -1 ) a été utilisé comme source additionnelle d’azote dans le milieu MM.<br />
Les résultats présentés à <strong>la</strong> Figure 32 montrent qu’aucune minéralisation de l’atrazine n’a lieu en<br />
milieu riche (LB) ; le milieu LB contient une quantité importante de nutriments azotés et carbonés<br />
facilement disponibles <strong>pour</strong> les bactéries ; l’atrazine est « <strong>la</strong>issée » de côté en faveur des autres<br />
substrats du milieu nutritif.<br />
80% de l’atrazine sont minéralisés en milieu minéral glucosé (MM-Glc), en l’espace de 25h, lorsque<br />
aucune source d’azote est ajoutée au milieu, contre 20% seulement lorsque le sulfate d’ammonium<br />
est présent dans le milieu à 1g L -1 .<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
137
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
% Atrazine mineralisée<br />
100<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
MM<br />
MM + Sulf . Am.<br />
LB<br />
0<br />
0 10 20 30 40 50 60 70 80<br />
Temps ( h)<br />
Figure 32 : Minéralisation de l’atrazine (concentration initiale environ 20 mg.L -1 ) par Pseudomonas ADP<br />
sp. en milieu riche (LB) ou en milieu minéral (MM ; glucose 1 g.L -1 ) contenant ou non une source<br />
additionnelle d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 ) ; 30°C ; Agitation 150 rpm ; 14 C-atrazine à 1 µCi/fiole<br />
Si <strong>la</strong> dégradation primaire de l’atrazine n’est pas affectée par <strong>la</strong> présence d’une source additionnelle<br />
d’azote dans le milieu, <strong>la</strong> minéralisation est quant à elle <strong>la</strong>rgement réduite, <strong>la</strong>issant penser que des<br />
métabolites intermédiaires doivent être accumulés. Ce résultat montre également que croissance et<br />
minéralisation ne sont pas couplées puisque l’apport d’azote augmente <strong>la</strong> croissance mais diminue <strong>la</strong><br />
minéralisation. Ce résultat est en accord avec les observations faites par Mandelbaum et al. (1995) :<br />
Biodégradation et croissance ne seraient pas directement corrélées, Pseudomonas ADP sp. étant<br />
capable de minéraliser l’atrazine dans des conditions non favorables à sa croissance.<br />
Ceci implique que le <strong>traitement</strong> devra se faire sans addition d’azote. Les expériences menées en<br />
extrait aqueux d’écorce de pin décrites ci-après ont <strong>pour</strong> objectif d’évaluer l’influence des composés<br />
azotés libérés par l’écorce de pin (environ 4 mg.L -1 <strong>pour</strong> un ratio L/S=20) sur <strong>la</strong> minéralisation de<br />
l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
III.2.3 Influence des composés solubles de l’écorce de pin sur<br />
Pseudomonas ADP sp.<br />
Cette étude a permis de déterminer si les composés organiques solubles de l’écorce de pin,<br />
solubilisés lorsque <strong>la</strong> poudre est en suspension dans l’eau, étaient ou non toxiques <strong>pour</strong> <strong>la</strong> souche<br />
Pseudomonas ADP sp. choisie. De ce résultat dépendait <strong>la</strong> faisabilité du <strong>traitement</strong> ; c’est donc un<br />
point essentiel de cette étude que nous abordons dans ce chapitre. Les essais concernant l’influence<br />
des composés solubles de l’écorce sur Pseudomonas ADP sp. ont été réalisés en extrait aqueux<br />
d’écorce de pin (Cf. §I.6), nous permettant ainsi de suivre des croissances bactérienne par densité<br />
optique et de suivre <strong>la</strong> dégradation de l’atrazine, en s’affranchissant des phénomènes d’adsorption qui<br />
seraient intervenus si nous avions utilisé un milieu contenant l’écorce elle-même.<br />
138<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Différents tests ont été mis en oeuvre : des essais de respirométrie ont permis d’étudier dans un<br />
premier temps <strong>la</strong> toxicité des composés de l’écorce vis à vis de Pseudomonas ADP sp.; d’autre part <strong>la</strong><br />
croissance (par mesure de DO) et <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine (analyse HPLC) ont été suivis en<br />
extrait d’écorce de pin ; l’influence de l’addition d’une source supplémentaire de carbone à l’extrait<br />
d’écorce de pin a également fait l’objet d’une étude particulière.<br />
III.2.3.1<br />
Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin<br />
L’extrait aqueux d’écorce de pin utilisé dans ces essais contenait une quantité d’environ 100 mg.L -1 de<br />
carbone organique dissous (COD) et environ 4 mg.L -1 d’azote, potentiellement utilisables <strong>pour</strong> les<br />
bactéries (Cf. § Tableau 9, p.117).<br />
Le suivi en parallèle de l’activité respiratoire en milieu minéral (MM-Glc) glucosé à 1 ou 0,25 g.L -1 et<br />
sulfate d’ammonium 1 g.L -1 et en extrait d’écorce de pin, a permis d’étudier <strong>la</strong> toxicité des composés<br />
de l’écorce vis à vis de Pseudomonas ADP sp. (Cf. protocole expérimental au § III.1.5.4.2). D’autre<br />
part, aucune source de carbone n’ayant été ici additionnée à l’extrait d’écorce, ces essais ont permis<br />
de tester <strong>la</strong> capacité de Pseudomonas ADP sp. à utiliser les composés organiques solubles de<br />
l’écorce de pin comme source de carbone.<br />
La Figure 33 montre que <strong>pour</strong> une même concentration initiale en carbone organique dissous dans<br />
l’extrait et en milieu minéral (COD 100 mg.L -1 en MM-Glucosé à 0,25 g.L -1 ou en extrait) l’activité<br />
respiratoire de Pseudomonas ADP sp. est re<strong>la</strong>tivement équivalente en milieu minéral (MM) et en<br />
extrait aqueux d’écorce de pin ; on note cependant une croissance très légèrement meilleure en MM.<br />
Cette différence peut être expliquée soit par une faible toxicité des composés solubles de l’écorce de<br />
pin vis à vis de Pseudomonas ADP sp., soit plus probablement par une plus faible <strong>bio</strong>dégradabilité de<br />
ces composés.<br />
1400<br />
1200<br />
1000<br />
DBO (mg.L-1)<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
0 10 20 30 40 50<br />
temps (h)<br />
MM + Glc (1 g/l) + N (1 g/l)<br />
MM + Glc (0.25g/l) + N (1g/l)<br />
Extrait + N (1g/l)<br />
Extrait + N (1g/l) + sels<br />
Figure 33 : Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) en présence de 1 ou<br />
0,25 g.L -1 de glucose comme source de carbone, 1 g.L -1 de sulfate d’ammonium ; en extrait aqueux<br />
d’écorce de pin (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 comme source d’azote) en présence ou non de sels<br />
minéraux ; 30°C ; agitation 150 rpm<br />
139<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Lorsque le glucose est apporté à 1 g.L -1 (correspondant à une concentration en COD de 400 mg.L -1 )<br />
<strong>la</strong> respiration est logiquement supérieure à celle observée avec une concentration plus faible en<br />
glucose. L’apport de nutriments minéraux à l’extrait n’améliore pas l’activité bactérienne par rapport à<br />
l’extrait seul, ce qui permet de conclure que les nutriments minéraux essentiels doivent être présents<br />
en quantité suffisante dans l’extrait <strong>pour</strong> les bactéries.<br />
Ainsi, les composés solubles de l’écorce de pin ne semblent pas présenter de toxicité vis à vis de<br />
Pseudomonas ADP sp. De plus, ces composés peuvent être utilisés par Pseudomonas ADP sp.<br />
comme source de carbone, permettant ainsi d’éviter l’addition d’une source additionnelle de carbone<br />
lors du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong>.<br />
Ces résultats encouragent ainsi l’idée de faisabilité du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> sur écorce de pin.<br />
III.2.3.2<br />
Croissance de Pseudomonas ADP sp. et <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine en extrait<br />
d’écocre de pin<br />
La croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin a été suivie en présence<br />
ou non de sources additionnelles de carbone (glucose 1 g.L -1 ) et/ou d’azote (sulfate d’ammonium<br />
1 g.L -1 ) et comparée à <strong>la</strong> croissance en milieu minéral (MM) enrichi en glucose (1 g.L -1 ) et en sulfate<br />
d’ammonium (1 g.L -1 ).<br />
Le protocole de ces essais est détaillé au § III.1.5.4.2.<br />
La Figure 34 montre tout d’abord que <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. est faible<br />
lorsqu’aucune source complémentaire de carbone ou d’azote n’est ajoutée à l’extrait aqueux d’écorce<br />
de pin. La présence d’une source additionnelle d’azote stimule considérablement <strong>la</strong> croissance<br />
indiquant d’une part que <strong>la</strong> quantité d’azote contenue dans l’extrait (environ 4mg.L -1 , avec C/N = 50/1)<br />
est insuffisante <strong>pour</strong> permettre un bon développement des bactéries, et confirmant d’autre part, que<br />
Pseudomonas ADP sp. utilise les composés organiques solubles de l’écorce de pin comme source de<br />
carbone.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
140
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
1,0<br />
DO 600 nm<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
MM + N + Glc<br />
Extract + N<br />
Extract<br />
Extract + Glc + N<br />
Extract + Glc<br />
0,0<br />
0 50 100 150 200<br />
Temps (h)<br />
Figure 34 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait stérile d’écorce de pin ou en milieu minéral<br />
(MM) contenant ou non une source additionnelle de carbone (glucose 1g.L -1 noté Glc) et/ou une source<br />
d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm<br />
L’addition de glucose (1 g.L -1 ) à l’extrait induit une inhibition de <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP<br />
sp., en présence ou non d’une source complémentaire d’azote (respectivement C/N=100/200 avec<br />
une source additionnelle d’azote et C/N=100/0,8 sans source additionnelle d’azote) Dans les essais<br />
contenant du glucose, des agrégats sont formés <strong>la</strong>issant penser que les cellules se regroupent <strong>pour</strong><br />
constituer une forme défensive, ce qui <strong>pour</strong>rait indiquer que <strong>la</strong> présence de glucose additionnel n’est<br />
pas favorable à leur croissance. Cette hypothèse est confirmée par les essais menés en extrait<br />
aqueux d’écorce de pin contenant différentes concentration de glucose (Figure 35).<br />
D’autre part, <strong>la</strong> Figure 34 montre également que <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait<br />
est retardée par rapport à <strong>la</strong> croissance observée en milieu minéral (MM glucosé et azoté)<br />
correspondant à une phase d’adaptation des micro-organismes d’environ 40h au milieu contenant les<br />
composés organiques solubles de l’écorce de pin.<br />
L’activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. a été suivie <strong>pour</strong> des concentrations en glucose<br />
comprises entre 0 et 1 g.L -1 (Figure 35).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
141
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
1200<br />
DBO (mg.L -1 )<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
Sans glucose<br />
Glucose 0,25 g/l<br />
Glucose 0,5 g/l<br />
Glucose 1g/l<br />
B<strong>la</strong>nc stérile<br />
0<br />
0 20 40 60 80 100 120 140<br />
Temps (h)<br />
Figure 35 : Activité respiratoire (exprimée en mg de O 2 .L -1 ) de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux<br />
d’écorce de pin contenant (0,25 mg.L -1 ; 0,5 mg.L -1 ou 1 mg.L -1 ) ou non du glucose ; 30°C ; agitation 150<br />
rpm.<br />
La présence d’une source additionnelle de carbone (glucose) dans l’extrait d’écorce de pin a un effet<br />
inhibiteur sur <strong>la</strong> respiration de Pseudomonas ADP sp. La Figure 35 montre que <strong>la</strong> respiration est<br />
meilleure lorsque aucune source de carbone n’est ajoutée à l’extrait. Dans ces conditions, le rapport<br />
C/N est de 100/4 et correspond aux exigences nutritives c<strong>la</strong>ssiques <strong>pour</strong> les bactéries. Pour des<br />
concentrations en glucose supérieures à 0,25 mg.L -1 (C/N>250/4), <strong>la</strong> formation d’agrégats bruns<br />
(1 mm de diamètre environ) a été observée comme précédemment, <strong>la</strong>issant penser à une forme<br />
défensive des cellules.<br />
Des essais de croissance ont également été menés en présence d’atrazine (50 mg.L -1 ) en tant que<br />
source d’azote. La Figure 36 présente les résultats de ces essais et montre à nouveau que <strong>la</strong><br />
croissance en extrait (comme en MM) est très limitée lorsque aucune source d’azote supplémentaire<br />
n’est apportée au milieu. L’apport d’atrazine dans l’extrait (50 mg.L -1 ) comme seule source<br />
additionnelle d’azote stimule légèrement <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. par rapport aux<br />
conditions en extrait seul. Lorsque du sulfate d’ammonium est additionné à l’extrait (1g.L -1 ), le<br />
développement de Pseudomonas ADP sp. se trouve très nettement stimulé que ce soit en présence<br />
d’atrazine ou non, indiquant que l’atrazine en extrait aqueux d’écorce de pin ne présente pas de<br />
toxicité vis à vis de Pseudomonas ADP sp.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
142
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
0,6<br />
Croissance<br />
DO 600nm<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
Extrait + N<br />
Extrait + Atrazine + N<br />
Extrait + Atrazine<br />
Extrait<br />
MM-Glc + Atrazine<br />
0,0<br />
0 10 20 30 40 50 60<br />
Temps (h)<br />
Atrazine en solution (mg.L -1 )<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
Biodégradation<br />
Extrait<br />
Extract + N<br />
Témoin Stérile Extrait<br />
0<br />
0 10 20 30 40 50 60<br />
Temps (h)<br />
Figure 36 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine en extrait aqueux<br />
d’écorce de pin stérile ou en milieu minéral MM (glucose 1 g.L -1 ) en présence d’atrazine (50 mg.L -1 ) avec<br />
ou sans sulfate d’ammonium (1 g.L -1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm<br />
La Figure 36 montre également que <strong>la</strong> dégradation primaire de l’atrazine en extrait seul et en extrait<br />
contenant une source additionnelle d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 ) est équivalente : environ<br />
40 % de l’atrazine initialement apportée au milieu est dégradée en 12 heures) alors que <strong>la</strong> croissance<br />
est meilleure lorsqu’une source d’azote est ajoutée à l’extrait (µ max =0,0547 h -1 en extrait azoté contre<br />
0,0296 h -1 en extrait seul). Cette observation confirme à nouveau que croissance et activité de<br />
<strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine ne seraient pas directement corrélées comme ce<strong>la</strong> a déjà été discuté au<br />
§ III.2.2.3.2 p.137. D’autres auteurs (Mandelbaum et al., 1995) ont également montré que<br />
Pseudomonas ADP sp. est capable de minéraliser l’atrazine dans des conditions non favorables à sa<br />
croissance. Pseudomonas ADP sp. continue de métaboliser l’atrazine au delà de ses besoins en<br />
azote. Ceci serait lié au fait que les enzymes responsables du métabolisme de l’atrazine sont<br />
présentes dans le cytop<strong>la</strong>sme ou le perip<strong>la</strong>sme des cellules bactériennes.<br />
143<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
L’addition d’une source d’azote au milieu, bien que profitable à <strong>la</strong> croissance des bactéries, ne stimule<br />
donc pas <strong>pour</strong> autant <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine. D’autre part, les essais précédents réalisés en<br />
milieu minéral glucosé (MM-Glc) ont montré que l’addition d’une source d’azote diminuait<br />
considérablement le taux de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Ainsi, nous avons écarté l’idée d’ajouter une source additionnelle d’azote <strong>pour</strong> les essais suivants, ne<br />
conservant comme seule source d’azote que l’atrazine et les quelques traces d’azote contenu dans<br />
l’extrait aqueux d’écorce de pin ou les particules d’écorce de pin elles-mêmes.<br />
Concernant les essais de minéralisation, <strong>la</strong> Figure 37 montre les résultats obtenus en extrait stérile<br />
d’écorce de pin et en milieu minéral MM glucosé (protocole expérimental décrit au § V.1.1.1).<br />
80<br />
70<br />
% Atrazine minéralisée<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
MM-Glc + Atrazine<br />
Extrait + Atrazine<br />
0<br />
0 20 40 60 80 100 120 140 160<br />
Temps (h)<br />
Figure 37 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp en extrait aqueux d’écorce de pin stérile<br />
ou en milieu minéral MM (glucose 0,25 g.L -1 ) ; concentration initiale en atrazine 20 mg.L -1 ; 22°C ;<br />
agitation lente<br />
La minéralisation est simi<strong>la</strong>ire en extrait et en milieu minéral glucosé, <strong>pour</strong> une quantité de carbone<br />
équivalente dans les deux milieux (100 mg.L -1 ), à une concentration initiale en atrazine de 20 mg.L -1<br />
(correspondant à un rapport C/N de l’ordre de 100/5-9). Une nouvelle fois ces résultats montrent que<br />
<strong>la</strong> présence des composés organiques de l’écorce de pin ne sont pas néfastes <strong>pour</strong> Pseudomonas<br />
ADP sp. vis à vis de <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine.<br />
III.3 Conclusions<br />
Les principales conclusions concernant <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine en culture pure de<br />
Pseudomonas ADP sp. sont les suivantes :<br />
- Pseudomonas ADP sp. est capable de croître et dégrader l’atrazine de façon<br />
significative à une température de 12°C et à des pH acides compris entre 4,4 et 7.<br />
144<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
- L’addition d’une source d’azote au milieu, en plus de l’atrazine, stimule <strong>la</strong> croissance<br />
des bactéries mais diminue considérablement le taux de minéralisation de l’atrazine,<br />
elle-même consommée en tant que source d’azote par Pseudomonas ADP sp., sans<br />
<strong>pour</strong> autant affecter le taux de dégradation primaire de l’atrazine.<br />
- Pseudomonas ADP sp. est capable de croître et de dégrader l’atrazine en extrait<br />
aqueux d’écorce de pin contenant les composés organiques solubles de l’écorce de<br />
pin. Les taux de minéralisation observés en extrait aqueux d’écorce de pin et en<br />
milieu minéral glucosé (MM-Glc 0,25 g.L -1 ) sont simi<strong>la</strong>ires. Les composés organiques<br />
de l’écorce de pin peuvent être consommés par Pseudomonas ADP sp. en tant que<br />
source de carbone (concentration en carbone dans l’extrait 100 mg.L -1 ). Ils sont par<br />
conséquent <strong>bio</strong>dégradables et non toxiques vis à vis de Pseudomonas ADP sp.<br />
- L’addition de glucose à l’extrait aqueux d’écorce de pin provoque une inhibition de <strong>la</strong><br />
croissance de Pseudomonas ADP sp.<br />
En terme d’application, ces résultats suggèrent que :<br />
- La <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine <strong>pour</strong>rait être efficace sans l’ajout d’une source<br />
supplémentaire de carbone comme le glucose. Pseudomonas ADP sp. <strong>pour</strong>rait ainsi<br />
dégrader en parallèle l’atrazine (source d’azote) et les composés organiques solubles<br />
issus de l’écorce de pin (source de carbone).<br />
- La faible concentration en azote contenue dans l’écorce de pin <strong>pour</strong>rait stimuler<br />
l’utilisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en tant que source d’azote.<br />
L’addition d’une source d’azote supplémentaire induirait une réduction du taux de<br />
minéralisation de l’atrazine.<br />
- La <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine pouvant avoir lieu à des pH acides imposés par <strong>la</strong><br />
présence des composés organiques de l’écorce (pH 4,4), le <strong>traitement</strong> <strong>pour</strong>rait être<br />
conduit sans addition de tampon. D’autre part, <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégration ayant été observée à<br />
12°C, le réchauffement de l’eau à traiter ne serait pas indispensable. Ainsi, des<br />
conditions de <strong>traitement</strong> re<strong>la</strong>tivement « rustiques » <strong>pour</strong>raient être envisagées.<br />
Cependant, le contrôle du pH et de <strong>la</strong> température dans les zones optimales<br />
permettrait bien évidemment d’optimiser l’efficacité du procédé.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
145
MATERIEL ET METHODES<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
IV. Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore Indigène de<br />
l’écorce de pin<br />
La capacité de Pseudomonas ADP sp. à coexister, à croître et à dégrader l’atrazine en présence de <strong>la</strong><br />
microflore indigène de l’écorce de pin est un aspect important de <strong>la</strong> faisabilité du procédé <strong>combiné</strong><br />
envisagé.<br />
Quelle influence cette microflore indigène a-t-elle sur <strong>la</strong> souche bactérienne Pseudomonas ADP sp. ?<br />
Sont-elles en compétition ?<br />
D’autre part, <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin peut-elle également intervenir dans le processus de<br />
dégradation de l’atrazine ? Les expériences décrites ci-dessous ont été conduites <strong>pour</strong> répondre à ces<br />
questions.<br />
IV.1 Matériel et méthodes<br />
IV.1.1 Isolement et identification des micro-organismes de l’écorce de pin<br />
L’isolement des principaux micro-organismes extraits de l’écorce de pin a permis d’identifier<br />
qualitativement les espèces revivifiables prédominantes et de tester, en cultures pures ou en<br />
consortium, leur capacité à croître dans un milieu contenant de l’atrazine et à <strong>la</strong> dégrader.<br />
L’isolement de <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce de pin a été réalisé à partir de <strong>la</strong> poudre d’écorce<br />
(particules d’écorce d
MATERIEL ET METHODES<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
Il ne fait pas de doute que <strong>la</strong> totalité des micro-organismes présents dans l’écorce n’a pas été isolée<br />
par cette technique de revitalisation. Il est connu que dans les sols, cette approche ne touche que<br />
quelques % des cellules (Giacomazzi, 2002). Cependant, on peut penser que les micro-organismes<br />
mis en évidence selon l’isolement effectué ci-dessus représentent les espèces indigènes majoritaires<br />
de l’écorce de pin.<br />
IV.1.2 Capacité de <strong>la</strong> flore indigène à dégrader l’atrazine<br />
Les quatre iso<strong>la</strong>ts obtenus à partir de l’isolement des micro-organismes de l’écorce de pin sont notés<br />
CP1 à CP4.<br />
IV.1.2.1<br />
Biodégradation de l’atrazine en consortium ou en cultures pures<br />
La <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine par le consortium, contenant les 4 souches isolées (CP1, CP2, CP3,<br />
CP4) de l’écorce de pin, ou par des cultures pures de chacune des souches, a été testée en milieu<br />
liquide LB et en extrait aqueux d’écorce de pin. Le milieu riche LB a été utilisé afin d’obtenir une<br />
bonne croissance des micro-organismes présents, et donc une forte activité métabolique ; l’extrait<br />
aqueux d’écorce de pin a quant à lui permis de simuler les conditions du milieu d’origine des différents<br />
micro-organismes isolés.<br />
Comme précédemment, <strong>la</strong> croissance des micro-organismes a été suivie par mesure de DO 600<br />
(III.1.3.1.1); <strong>la</strong> dégradation de l’atrazine du milieu a été analysée par HPLC (II.1.1.1.2(a)) sur les<br />
prélèvements effectués entre le temps 0 à 200 heures environ.<br />
Les essais ont été réalisés en Erlenmeyers dans 20 mL de milieu (LB ou extrait aqueux d’écorce de<br />
pin) à 30°C sous agitation (150 rpm). Les fioles ont été inoculées à partir des stocks de cellules<br />
congelées avec environ 10 6 cfu.mL -1 de chacune des 4 souches isolées.<br />
L’atrazine a été ajoutée aux essais à environ 50 mg.L -1 .<br />
Les essais ont été réalisés en triplicats.<br />
IV.1.2.2<br />
Minéralisation de l’atrazine par <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce de pin<br />
L’utilisation d’atrazine marquée uniformément au 14 C a permis d’étudier <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine<br />
par <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce de pin en présence même d’écorce de pin en poudre dans un milieu<br />
minéral (MM).<br />
Les expériences ont été réalisées en <strong>bio</strong>mètre en présence de 50 mL de MM stérile contenant 2,5 g<br />
(ratio L/S =20 mL.g -1 ) d’écorce de pin en poudre non stérile (d>200nm). C’est donc l’écorce de pin qui<br />
ici, apporte les micro-organismes indigènes au milieu. Deux concentrations initiales en atrazine ont<br />
147<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
MATERIEL ET METHODES<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
été testées : 44 µg.L -1 et 20 mg.L -1 . Les <strong>bio</strong>mètres ont été p<strong>la</strong>cés à 20 ± 2°C et agités doucement avec<br />
un barreau magnétique.<br />
Les témoins a<strong>bio</strong>tiques ont été préparés à partir de 2,5 g d’écorce préa<strong>la</strong>blement stérilisée (§ I.7) et<br />
50 ml de milieu MM stérile.<br />
La minéralisation a été suivie par quantification du 14 CO 2 formé selon le protocole décrit au<br />
§ III.1.4.2.3.<br />
IV.1.3 Influence de <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas<br />
ADP sp.<br />
Le travail qui suit a consisté à étudier <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. ainsi que sa capacité à<br />
<strong>bio</strong>dégrader et à minéraliser l’atrazine en présence de <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin. Les essais ont<br />
été réalisés en extrait aqueux d’écorce de pin dans un premier temps puis en présence d’écorce en<br />
poudre.<br />
IV.1.3.1<br />
Croissance de Pseudomonas ADP sp.<br />
Pseudomonas ADP sp. a été cultivé dans des Erlenmeyers de 250 mL contenant 50 mL d’extrait<br />
aqueux d’écorce de pin stérile, ou non stérile, ou 50 mL de milieu minéral stérile (MM) contenant de<br />
l’écorce de pin en poudre (diamètre
MATERIEL ET METHODES<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
d’écorce de pin puisqu’en présence de particules d’écorce l’adsorption ne peut pas être distinguée de<br />
<strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation.<br />
IV.1.3.2.2 Suivi de <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine<br />
La minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en présence de <strong>la</strong> microflore indigène de<br />
l’écorce de pin a été étudiée en milieu minéral (MM) en présence d’écorce de pin en poudre (non<br />
stérile, ratio L/S=20 mL.g -1 ). Pour ces expériences, l’atrazine était <strong>la</strong> seule source additionnelle<br />
d’azote. Deux concentrations initiales en atrazine ont été testées : 44,2 µg.L -1 (correspondant à une<br />
pollution probable) et 20 mg.L -1 (concentration en azote permettant un développement microbien<br />
important). Les composés solubles de l’écorce de pin étaient <strong>la</strong> seule source de carbone (COT<br />
initial = 580 mg.L -1 ) (Tableau 9, p.117). Les composés solubles de l’écorce de pin apportaient au<br />
milieu une concentration en azote d’environ 4 mg.L -1 . Pseudomonas ADP sp. a été inoculé à partir de<br />
précultures à une DO initiale de 0,05. Les essais ont été réalisés à 20 ± 2°C dans des <strong>bio</strong>mètres et<br />
agités doucement à l’aide de barreaux magnétiques.<br />
Les témoins contenant l’écorce stérilisée (débarrassée de sa microflore) ont été inoculés de <strong>la</strong> même<br />
façon que précédemment (préculture de Pseudomonas ADP sp.) et incubés dans les mêmes<br />
conditions.<br />
La minéralisation a également été suivie dans des témoins non inoculés par Pseudomonas ADP sp.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
149
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
IV.2 Résultats et discussion<br />
IV.2.1 Isolement de <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin<br />
L’isolement de colonies issues de l’écorce de pin réalisé selon le protocole présenté au § IV.1.1 a<br />
permis de mettre en évidence 4 iso<strong>la</strong>ts majoritaires nommés CP1, CP2, CP3 et CP4.<br />
Les caractéristiques morphologiques et physiologiques de ces iso<strong>la</strong>ts sont résumées dans le Tableau<br />
14.<br />
Tableau 14 : Description des colonies de micro-organismes isolés de l’écorce de pin sur boite de Pétri<br />
Colonie Taille Forme Contour Epaisseur Aspect Couleur Gram Fi<strong>la</strong>ment<br />
CP1 2-3 mm circu<strong>la</strong>ire régulier p<strong>la</strong>t opaque b<strong>la</strong>nc + oui<br />
incrusté<br />
dans l’agar<br />
CP2 7 mm circu<strong>la</strong>ire régulier p<strong>la</strong>t lisse beige Coque - non<br />
ou ovale<br />
muqueux<br />
translucide<br />
CP3 2-3 circu<strong>la</strong>ire régulier p<strong>la</strong>t translucide beige Bacile - non<br />
bril<strong>la</strong>nt<br />
lisse<br />
CP4 2-3 circu<strong>la</strong>ire régulier p<strong>la</strong>t translucide<br />
bril<strong>la</strong>nt<br />
lisse<br />
jaune Coque + non<br />
Chacun des 4 iso<strong>la</strong>ts mis en évidence par cette méthode présente une morphologie particulière<br />
(couleur, forme, taille, présence de fi<strong>la</strong>ment…) ce qui a permis de les identifier assez facilement sur<br />
boite de Pétri et de les distinguer de Pseudomonas ADP sp.<br />
Si CP1, CP3 et CP4 présentent l’aspect de bactéries, l’observation de CP2 au microscope optique se<br />
rapproche d’une structure de levure de part sa taille et sa forme (Coque 10 à 20 µm). Suite à cet<br />
isolement, des stocks de cellules congelées de chacun des iso<strong>la</strong>ts ont été préparés et conservés <strong>pour</strong><br />
être utilisés, de <strong>la</strong> même façon que Pseudomonas ADP sp., lors des études qui suivent.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
150
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
IV.2.2 Capacité de <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce à <strong>bio</strong>dégrader l’atrazine<br />
L’objectif de cette étude est de déterminer si <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce de pin joue ou non un rôle<br />
significatif dans <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine. Chaque iso<strong>la</strong>t (CP1 à CP4) a donc été testé <strong>pour</strong> ses<br />
capacités à dégrader l’atrazine en culture pure et en consortium, en milieu complexe riche (LB) et en<br />
extrait aqueux d’écorce de pin.<br />
IV.2.2.1<br />
Biodégradation primaire de l’atrazine<br />
Les essais de <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine ont été conduits en milieu riche LB et en extrait aqueux<br />
d’écorce de pin selon le protocole décrit au § IV.1.2.1., en présence d’atrazine (concentration initiale<br />
d’environ 50 mg.L -1 ) comme source d’azote ; aucune source de carbone n’a été ajoutée à l’extrait<br />
d’écorce de pin.<br />
La Figure 38 montre que, l’atrazine est <strong>bio</strong>dégradée par le consortium (CP1, CP2, CP3 et CP4 à<br />
environ 10 6 cfu.mL -1 chacun) en milieu complexe riche LB. Aucune <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine n’est<br />
en revanche observée dans l’extrait aqueux d’écocre de pin. De plus, <strong>la</strong> croissance du consortium en<br />
milieu LB est nettement supérieure à celle observée en extrait d’écorce de pin où elle est quasiment<br />
nulle. Ce phénomène peut être lié à une carence en azote dans l’extrait aqueux d’écorce de pin<br />
(l’atrazine, 50 mg.L -1 environ, représente <strong>la</strong> seule source d’azote <strong>pour</strong> les bactéries, équivalent à<br />
environ 17 mg.L -1 d’azote). Les micro-organismes de l’écorce peuvent également être inaptes à<br />
consommer les composés organiques dissous de l’écorce de pin ou incapables de cométaboliser<br />
l’atrazine en présence de ces composés organiques.<br />
Croissance<br />
1,8<br />
1,6<br />
1,4<br />
1,2<br />
1<br />
0,8<br />
Extrait + Atrazine<br />
LB + Atrazine<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0<br />
0 100 200 300<br />
Temps (h)<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
Biodégradation<br />
0 100 200 300<br />
Temps (h)<br />
Témoin stérile<br />
Extrait + Atrazine<br />
LB + Atrazine<br />
Figure 38 : Croissance du consortium isolé à partir de l’écorce de pin et <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine en<br />
milieu LB ou en extrait aqueux d’écorce de pin inoculé avec environ 10 6 cfu.mL -1 de chaque iso<strong>la</strong>t (CP1 à<br />
CP4) ; atrazine comme source d’azote (55 mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation 150 rpm<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
151
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
Afin d’identifier les micro-organismes de <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce de pin responsables de <strong>la</strong><br />
dégradation de l’atrazine en milieu LB, les mêmes expériences ont été répétées en culture pure de<br />
chaque iso<strong>la</strong>t.<br />
La Figure 39 présente les résultats de <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine obtenus en cultures pures.<br />
70<br />
60<br />
Atrazine (mg.L -1 )<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
0 50 100 150 200 250 300 350<br />
Temps (h)<br />
CP4<br />
CP3<br />
CP1<br />
CP2<br />
Figure 39 : Biodégradation de l’atrazine en milieu LB par les micro-organismes isolés de l’écorce de pin<br />
(inoculé avec environ 10 6 cfu.mL -1 de CP1, CP2, CP3 ou CP4) ; atrazine comme source d’azote (environ 55<br />
mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation 150 rpm<br />
Alors que les iso<strong>la</strong>ts CP3 et CP4 ne semblent pas présenter d’activité de dégradation significative de<br />
l’atrazine, les iso<strong>la</strong>ts CP1 et surtout CP2, quant à eux, présentent une activité significative. En<br />
présence de l’iso<strong>la</strong>t CP1, environ 50% de l’atrazine présente initialement dans le milieu sont dégradés<br />
en 310 heures, contre 83% dans ce même intervalle de temps en présence de l’iso<strong>la</strong>t CP2,<br />
correspondant à <strong>la</strong> dégradation observée avec le consortium. L’iso<strong>la</strong>t CP2, et dans une moindre<br />
mesure CP1, seraient donc responsables de <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine observée en présence du<br />
consortium en milieu LB.<br />
Ces résultats sont à analyser avec précaution puisqu’il s’agit ici de <strong>bio</strong>dégradation primaire de<br />
l’atrazine et non pas de minéralisation.<br />
IV.2.2.2<br />
Minéralisation de l’atrazine<br />
La capacité de <strong>la</strong> microflore indigène de l’écorce de pin à minéraliser l’atrazine a été étudiée grâce à<br />
l’utilisation d’atrazine marquée au 14 C par suivi du dégagement de 14 CO 2 dans des <strong>bio</strong>mètres, selon le<br />
protocole présenté au § IV.1.2.2.<br />
Ces expériences ont été réalisées en présence même de particules d’écorce (d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
Deux concentrations initiales d’atrazine ont été testées : <strong>la</strong> première, 20 mg.L -1 a permis d’apporter<br />
une source d’azote significative <strong>pour</strong> <strong>la</strong> croissance des micro-organismes (aucune autre source<br />
d’azote n’a été additionnée au milieu). La seconde concentration en atrazine testée de 44,2 µg.L -1<br />
<strong>pour</strong>rait correspondre à une probable pollution des milieux naturels à l’atrazine.<br />
Les résultats de ces essais <strong>pour</strong> les deux concentrations en atrazine testées sont présentés Figure<br />
40.<br />
% Atrazine minéralisée<br />
20<br />
18<br />
16<br />
14<br />
12<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
0 100 200 300 400<br />
Temps (h)<br />
Ecorce non stérile + Atz 44 µg/L<br />
Ecorce non stérile + Atz 20 mg/L<br />
Témoin stérile (Atz 44 µg/L)<br />
Témoin stérile (Atz 20 mg/L)<br />
Figure 40 : Minéralisation de l’atrazine en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de pin<br />
stériles ou non stériles (d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
IV.2.3 Influence de <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas<br />
ADP sp<br />
Quelle est l’influence de <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin sur le développement de Pseudomonas ADP<br />
sp. utilisée dans le cadre du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> et sur sa capacité à dégrader l’atrazine ? Des essais<br />
ont été réalisés afin de quantifier cet effet, afin de déterminer si une stérilisation de l’écorce serait<br />
nécessaire avant son utilisation en tant que support de <strong>la</strong> <strong>bio</strong>filtration, lors du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
étudié ici.<br />
IV.2.3.1<br />
Croissance de Pseudomonas ADP sp. et <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine en présence<br />
de <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin<br />
L’influence de <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin sur <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. a été<br />
étudiée en extrait aqueux d’écorce de pin non stérile, contenant naturellement une partie de <strong>la</strong> flore<br />
indigène de l’écorce, et en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce non stériles<br />
(d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
Cependant, nous avons considéré que les cellules présentes en milieu aqueux et celle adsorbées<br />
étaient proportionnellement réparties dans les deux phases et que par conséquent, l’évolution de <strong>la</strong><br />
densité de cellules dans le liquide était représentative de <strong>la</strong> croissance globale de Pseudomonas ADP<br />
sp.<br />
En extrait aqueux d’écorce de pin (Figure 42), <strong>la</strong> présence de <strong>la</strong> micro-flore de l’écorce n’affecte pas <strong>la</strong><br />
croissance de Pseudomonas ADP sp. La croissance est en effet équivalente en extrait stérile et en<br />
extrait non stérilisé contenant <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin.<br />
0,25<br />
DO 600nm<br />
0,20<br />
0,15<br />
0,10<br />
0,05<br />
Pseudo en Extrait stérile<br />
Pseudo en Extrait non stérile<br />
Témoin - Extrait stérile<br />
Témoin - Extrait non stérile<br />
0,00<br />
0 20 40 60 80 100 120<br />
Temps (h)<br />
Figure 42 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin stérile ou non stérile<br />
en présence d’atrazine (environ 50 mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation 150 rpm<br />
Concernant l’influence de <strong>la</strong> flore de l’écorce sur <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine par Pseudomonas<br />
ADP sp., <strong>la</strong> Figure 43 montre que <strong>la</strong> dégradation de l’atrazine semble être légèrement réduite en<br />
extrait non stérile d’écorce de pin mais seulement après 40 heures d’incubation, par comparaison à <strong>la</strong><br />
dégradation en extrait stérile. Après 120 heures d’incubation, environ 66% de l’atrazine initialement<br />
présente sont dégradés dans l’extrait d’écorce de pin non stérile contre environ 80% dans l’extrait<br />
stérile, alors qu’après 45h <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation est simi<strong>la</strong>ire (65% environ).<br />
Ce phénomène <strong>pour</strong>rait suggérer l’existence d’une compétition <strong>pour</strong> les nutriments du milieu<br />
(carbone, azote ou minéraux) entre Pseudomonas ADP sp. et les micro-organismes indigènes de<br />
l’écorce de pin présents dans l’extrait. Cependant, ce résultat est incertain car il ne repose que sur un<br />
point de <strong>la</strong> courbe.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
155
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
100<br />
% Atrazine dégradée<br />
80<br />
60<br />
40<br />
20<br />
Pseudo en Extrait stérile<br />
Pseudo en Extrait non stérile<br />
0<br />
0 20 40 60 80 100 120<br />
Temps (j)<br />
Figure 43 : Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux stérile et non stérile<br />
d’écorce de pin ; [atrazine ]i= 30 mg.L -1 ; 30°C ; agitation 150 rpm<br />
La microflore indigène de l’écorce de pin aurait globalement un effet légèrement négatif à <strong>la</strong> fois sur <strong>la</strong><br />
croissance de Pseudomonas ADP sp., en présence de particules d’écorce de pin, et sur sa capacité à<br />
<strong>bio</strong>dégrader l’atrazine. Cette observation suggère l’existence d’une légère compétition entre les microorganismes<br />
de l’écorce et Pseudomonas ADP sp. <strong>pour</strong> <strong>la</strong> consommation des nutriments du milieu,<br />
mais l’incidence en est très faible.<br />
IV.2.3.2<br />
Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en présence de <strong>la</strong> microflore<br />
de l’écorce<br />
Les essais ont été réalisés en <strong>bio</strong>mètres par suivi du 14 CO 2 en milieu minéral (MM) contenant des<br />
particules d’écorce stériles et non stériles, selon le protocole décrit au § IV.1.3.2.2 à deux<br />
concentrations initiales en atrazine (20 mg.L -1 et 44,2 µg.L -1 ).<br />
Pour les deux concentrations initiales en atrazine testées, <strong>la</strong> Figure 44 montre que <strong>la</strong> microflore de<br />
l’écorce seule (MM + écorce non stérile non inoculée par Pseudomonas ADP sp.) est capable de<br />
minéraliser jusqu’à 16% de l’atrazine. Le témoin stérile (MM + Ecorce stérile) ne présente aucune<br />
activité de minéralisation.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
156
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
A<br />
60<br />
% Atrazine minéralisée<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
Ecorce non stérile + Pseudo<br />
Ecorce stérile + Pseudo<br />
Témoin Ecorce non stérile<br />
Témoin Ecorce stérile<br />
0<br />
0 50 100 150 200 250 300 350<br />
Temps (h)<br />
B<br />
60<br />
% Atrazine minéralisée<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
Ecorce stérile + Pseudo<br />
Ecorce non stérile + Pseudo<br />
Témoin Ecorce non stérile<br />
Témoin Ecorce stérile<br />
0<br />
0 50 100 150 200 250 300 350<br />
Temps (h)<br />
Figure 44 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. présente à une concentration initiale de<br />
20 mg.L -1 (A) ou 44,2 µg.L -1 (B) en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de pin stériles ou<br />
non stériles (L/S=20) ; 20 ± 2 °C ; agitation lente<br />
Lorsque l’atrazine est présente dans le milieu à forte concentration (20 mg.L -1 , Figure 44-A), le taux de<br />
minéralisation atteint 52% en présence des particules d’écorce non stériles contre 35% seulement<br />
avec l’écorce stérile, indiquant que <strong>la</strong> présence de <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce aurait un effet positif<br />
sur <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine.<br />
A faible concentration en atrazine (44,2 µg.L -1 , Figure 44-B) le phénomène inverse est observé : <strong>la</strong><br />
microflore de l’écorce de pin induit une légère inhibition de <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine par<br />
Pseudomonas ADP sp. : 45% de l’atrazine sont minéralisés en présence d’écorce non stérile contre<br />
50% environ en présence d’écorce stérile. Ce résultat indique que <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin et<br />
Pseudomonas ADP sp. sont en compétition <strong>pour</strong> l’utilisation des nutriments et/ou des sources de<br />
157<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
carbone du milieu ; cette compétition induit un effet de réduction du taux d’atrazine dégradée par<br />
Pseudomonas ADP sp.<br />
A faible concentration, on peut penser que l’adsorption sur les particules d’écorce doit probablement<br />
avoir lieu principalement en surface des particules, <strong>la</strong>issant ainsi l’atrazine facilement disponible <strong>pour</strong><br />
Pseudomonas ADP sp. A forte concentration, l’atrazine <strong>pour</strong>rait diffuser plus profondément dans les<br />
particules d’écorce, le gradient de concentration étant plus élevé, diminuant <strong>la</strong> disponibilité de<br />
l’atrazine vis à vis de Pseudomonas ADP sp. La présence de <strong>la</strong> microflore à l’intérieur de <strong>la</strong> structure<br />
même des particules d’écorce <strong>pour</strong>rait justifier du fort taux de minéralisation observé dans ces<br />
conditions.<br />
En présence de <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce de pin, les vitesses initiales de minéralisation de l’atrazine<br />
sur les 48 premières heures, atteignent 0,218 mg.L -1 .h -1 et 4,02.10 -4 mg.L -1 .h -1 respectivement <strong>pour</strong><br />
des concentrations initiales en atrazine de 20 mg.L -1 et 44,2 µg.L -1 . Les résultats sont résumés dans le<br />
Tableau 15. Ces données suggèrent une cinétique initiale d’ordre 1 par rapport à l’atrazine avec une<br />
constante de vitesse k de l’ordre de 1.10 -2 h -1 .<br />
Tableau 15 : Vitesse initiale de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. calculée sur les 48<br />
premières heures, en présence d’écorce de pin stérile ou non (en mg.L -1 .h -1 )<br />
[Atrazine] i Pseudo. + écorce stérile Pseudo. + écorce non stérile<br />
20 mg.L -1 0,133 0,218<br />
44,2 µg.L -1 4,54. 10 -4 4,02.10 -4<br />
IV.3 Conclusion<br />
• Quatre iso<strong>la</strong>ts appartenant à <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce de pin ont été obtenus. Ces iso<strong>la</strong>ts<br />
représentent les micro-organismes probablement majoritaires de l’écorce de pin et cultivables<br />
dans les conditions utilisées mais ne sont pas <strong>pour</strong> autant les seuls micro-organismes<br />
constituants cette microflore de l’écorce. Les essais réalisés ont montré une certaine capacité<br />
de <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce à dégrader l’atrazine en consortium. Les iso<strong>la</strong>ts CP2 et dans<br />
une moindre mesure CP1 semblent être responsables de cette activité de dégradation de<br />
l’atrazine.<br />
D’autre part, <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce de pin a été caractérisée comme ayant une activité<br />
non négligeable de minéralisation de l’atrazine (entre 9% et 16% de minéralisation) présente<br />
dans le milieu à forte (20 mg.L -1 ) ou faible (44,2 µg.L -1 ) concentration initiale.<br />
• La présence de <strong>la</strong> microflore de l’écorce aurait un effet légèrement inhibiteur sur <strong>la</strong> croissance<br />
de Pseudomonas ADP sp. Cependant les essais de <strong>bio</strong>dégradation montrent qu’en présence<br />
158<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
Caractérisation et rôle de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
de cette microflore, le taux de minéralisation de l’atrazine (essais inoculés avec Pseudomonas<br />
ADP sp.) est augmenté par rapport au taux de minéralisation observé en milieu contenant des<br />
particules d’écorce stériles lorsque l’atrazine était présente initialement dans le milieu à une<br />
forte concentration ([atrazine]i= 20 mg.L -1 ).<br />
A faible concentration ([atrazine]i= 44,2 µg.L -1 ), <strong>la</strong> présence de <strong>la</strong> microflore de l’écorce n’a<br />
qu’un effet très limité sur <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. Le taux de<br />
minéralisation est très légèrement réduit par <strong>la</strong> présence de <strong>la</strong> microflore de l’écorce<br />
suggérant que les micro-organismes présents dans le milieu (Pseudomonas ADP sp. et <strong>la</strong><br />
microflore de l’écorce) sont en compétition <strong>pour</strong> les nutriments et/ou source de carbone du<br />
milieu. Cette compétition induirait un très léger effet négatif sur l’efficacité de l’élimination de<br />
l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
159
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
V. <strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
L’étude de faisabilité du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> (adsorption/<strong>bio</strong>dégradation) a été abordée sous deux<br />
angles différents :<br />
- Des essais en batch ont permis un suivi précis du devenir de l’atrazine au cours du<br />
<strong>traitement</strong> grâce à l’utilisation d’atrazine radioactive.<br />
- Des essais en colonne ont permis de comparer l’intérêt d’utiliser Pseudomonas ADP<br />
sp. par rapport à un <strong>traitement</strong> physique simple d’adsorption.<br />
En accord avec les résultats obtenus aussi bien dans les études d’adsorption que lors de l’approche<br />
<strong>bio</strong>logique, des choix ont été faits quant à l’orientation du <strong>traitement</strong> et <strong>la</strong> nécessité d’apporter ou non<br />
certains éléments pouvant améliorer l’efficacité du <strong>traitement</strong>.<br />
V.1 Matériel et méthodes<br />
V.1.1 Essais en batch<br />
Dans les essais en milieu dispersé, dits « Essais en Batch », le devenir de l’atrazine a pu être suivi<br />
grâce à l’utilisation de [U-ring- 14C ]-atrazine.<br />
Ces expériences ont été menées à l’Unité de Micro<strong>bio</strong>logie et de Génétique de l’INSA de Lyon (UMR<br />
5122 CNRS) et à l’Unité Environnement et Grandes Cultures de l’INRA de Versailles-Grignon.<br />
V.1.1.1<br />
Protocole expérimental<br />
Les essais ont été réalisés dans des <strong>bio</strong>mètres (voir schéma Figure 28 p.127) contenant 50 mL de<br />
milieu minéral liquide (MM) et 2,5 g d’écorce de pin stérile ou non stérile (ratio L/S=20 mg.g -1 ), incubés<br />
à 20 ± 2°C sous agitation lente à l’aide d’un barreau magnétique, pendant environ 350 heures (15<br />
jours).<br />
Des essais sans écorce, réalisés en parallèle en extrait aqueux d’écorce de pin et en milieu minéral<br />
glucosé (MM + glucose 1,25 g.L -1 , 50 ml), ont permis de mettre en évidence l’influence de <strong>la</strong> présence<br />
de l’écorce de pin dans le milieu, sur <strong>la</strong> capacité de Pseudomonas ADP sp. à minéraliser l’atrazine.<br />
La [U-ring- 14 C]-atrazine commercialisée par Sigma, d’activité spécifique de 24,6 mCi.mmol - 1 a été<br />
utilisée <strong>pour</strong> réaliser plusieurs séries d’expériences à des concentrations initiales de 20 mg.L -1 et<br />
44,2 µg.L -1 . La préparation des solutions mères d’atrazine est détaillée au § III.1.4.2.1 (p.126).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
160
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Pseudomonas ADP sp. a été inoculé a partir de cellules provenant de précultures et réalisées selon le<br />
protocole décrit au § III.1.2.2 (p.118) ; <strong>la</strong> DO initiale dans chaque <strong>bio</strong>mètre atteignant une valeur<br />
d’environ 0,05.<br />
Les essais ont été réalisés en triplicats.<br />
La minéralisation a été suivie par comptage de <strong>la</strong> radioactivité dans les pièges à soude selon <strong>la</strong><br />
méthode décrite en III.1.4.2.2.<br />
Les essais ont été réalisés en 2 phases :<br />
- Dans un premier temps, <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine a été suivie sur 15 jours (1 ère<br />
Phase) par dosage du 14 CO 2 .<br />
- Dans une deuxième phase, des extractions et combustions ont permis d’établir un<br />
bi<strong>la</strong>n carbone. Puis, l’évolution à long terme de l’atrazine résiduelle a été suivie sur<br />
7 mois dans 2 conditions différentes : 1) en milieu dispersé et 2) en microcosmes.<br />
Lors de cette deuxième phase, les 3 replicats ont été utilisés à des fins différentes :<br />
o Les réplicats A ont subi extractions et combustions <strong>pour</strong> établir un bi<strong>la</strong>n<br />
carbone en quantifiant <strong>la</strong> radioactivité résiduelle dans chacun des<br />
compartiments au terme des 15 premiers jours.<br />
o Les réplicats B sont restés incubés en milieu dispersé (L/S=20 mg.L -1 )<br />
pendant 7 mois. Le devenir à long terme de l’atrazine résiduelle a pu être<br />
suivi par dosage régulier du 14 CO 2 . Au terme des 7 mois un bi<strong>la</strong>n carbone a<br />
été établi grace à des extractions et combustions permettant de quantifier <strong>la</strong><br />
radioactivité dans les différents compartiments.<br />
o Les réplicats C ont subi le même sort que les réplicats B pendant 7 mois ,<br />
mais cette fois en microcosmes.<br />
La Figure 45 résume l’utilisation des différents réplicats lors de l’étude en batch du <strong>traitement</strong><br />
<strong>combiné</strong>.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
161
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
A<br />
B<br />
C<br />
Essais en triplicat<br />
- Suivi de <strong>la</strong> minéralisation sur 15 jours ( 14 CO 2 )<br />
- Radioactivité en solution au bout de 15 jours<br />
1 ère Phase<br />
Si essais reproductibles<br />
A B C<br />
Collecte de l’écorce<br />
Poursuite de l’incubation<br />
et collecte de l’écorce à 7 mois<br />
2 ème Phase<br />
Extractions<br />
et<br />
Combustion<br />
Suivi minéralisation<br />
sur 7 mois en<br />
Milieu dispersé<br />
L/S=20<br />
Extraction à 7 mois<br />
Combustions à 7<br />
mois<br />
Suivi minéralisation<br />
sur 7 mois en<br />
Microcosmes<br />
Extraction à 7 mois<br />
Combustions à 7<br />
mois<br />
Suivi du devenir à long terme de l’écorce de<br />
pin issue du <strong>traitement</strong><br />
Figure 45 : Utilisation des différents réplicats <strong>pour</strong> l’étude en batch du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
V.1.1.2<br />
Distribution de <strong>la</strong> radioactivité dans les essais en batch<br />
Un bi<strong>la</strong>n complet de <strong>la</strong> distribution de <strong>la</strong> radioactivité été réalisé par mesure de celle-ci en fin<br />
d’expérimentation dans les différents compartiments du <strong>bio</strong>mètre :<br />
- Atrazine ou métabolites en solution aqueuse (Phase liquide)<br />
-<br />
14 CO 2 piégé dans <strong>la</strong> soude, issu de <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine (Phase gazeuse)<br />
- Atrazine ou résidus adsorbés sur l’écorce de pin ou les cellules (extractibles et non<br />
extractibles) (Phase solide).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
162
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
La Figure 46 représente <strong>la</strong> distribution possible de <strong>la</strong> radioactivité dans les différents compartiments<br />
du milieu lors des essais en batch, ainsi que les méthodes de suivi de celle-ci <strong>pour</strong> chacun des<br />
compartiments.<br />
A*<br />
Devenir de l'atrazine*<br />
Localisation<br />
En phase gazeuse<br />
CO 2<br />
En solution<br />
Atrazine<br />
Métabolites de dégradation<br />
En phase solide<br />
Atrazine ou métabolites adsorbés<br />
Autres résidus et cellule<br />
Résidus extractibles<br />
Résidus liés<br />
Méthode<br />
Analyse du 14 CO2<br />
dissous dans<br />
NaOH<br />
Prélèvement<br />
de 1 ml de<br />
solution<br />
Extractions<br />
CaCl 2<br />
MeOH<br />
Combustion de<br />
l’écorce<br />
Oxidizer<br />
Matériel<br />
Compteur à<br />
scintil<strong>la</strong>tion<br />
Figure 46 : Distribution de <strong>la</strong> radioactivité dans les essais batch – Méthodes de suivi de <strong>la</strong> radioactivité<br />
dans les différents compartiments<br />
V.1.1.2.1<br />
Radioactivité en solution<br />
Au bout de 350 heures d’incubation des <strong>bio</strong>mètres, 1 mL de solution est prélevé, centrifugé<br />
(7000 rpm, 20 min) <strong>pour</strong> éliminer les cellules ou débris cellu<strong>la</strong>ires ainsi que les particules d’écorce en<br />
poudre, puis analysé au compteur à scintil<strong>la</strong>tion (ajout de 7 mL de liquide à scintil<strong>la</strong>tion) afin de<br />
quantifier <strong>la</strong> radioactivité résiduelle en solution.<br />
D’autres échantillons (1 ml) ont été prélevés et analysés à l’aide d’une HPLC (Waters 600 E) équipée<br />
d’un module Waters 996 à photodiode et d’un auto-injecteur 717 Plus Autosampler. La colonne<br />
utilisée était une Cartridge Nova Pack 60A C18 (dimension 4 µm, 4.6 x 20). La radioactivité est<br />
détectée à l’aide d’un détecteur Radiomatic Flo-one Packard. Ces analyses ont permis d’étudier <strong>la</strong><br />
répartition de <strong>la</strong> radioactivité des composés en solution (atrazine ou métabolites intermédiaires).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
163
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
L’analyse HPLC a permis de détecter les métabolites suivants :<br />
- OHA : 2-hydroxy-atrazine<br />
- OHDEA : Deséthyl-2-hydroxy-atrazine<br />
- OHDIA : Desisopropyl-2-hydroxy-atrazine<br />
- DEA : Deséthyl-atrazine<br />
- DIA : Desisopropyl-atrazine<br />
- DEDIA : deséthyl-desisopropyl-atrazine<br />
- A : atrazine<br />
Les éluants utilisés étaient:<br />
- A : Eau Ultra Pure / HCl 0,5 M, 95/5 avec Dodécylsulfate de sodium (SDS) 1,44g.L -1<br />
-<br />
B : Méthanol <strong>pour</strong> analyse /Eau Ultra Pure / HCl 0,5 M, 90/5/5 avec SDS 1,44g.L -1<br />
La durée d’une analyse était de 45 min réalisée selon <strong>la</strong> table d’élution suivante (Tableau 16), avec un<br />
rinçage de 15 minutes (éluant A) entre deux injections.<br />
Tableau 16 : Table d’élution <strong>pour</strong> analyse HPLC de l’atrazine et des métabolites de dégradation<br />
Temps (min) Débit (ml.min -1 ) %A %B<br />
0 1 100 0<br />
1 1 62 38<br />
8 1 60 40<br />
10 1 40 60<br />
30 1 0 100<br />
35 1 100 0<br />
L’identification de l’atrazine et de ses métabolites a été plutôt qualitative que quantitative du fait des<br />
concentrations très faibles de chacun des composés en solution en fin d’incubation.<br />
V.1.1.2.2<br />
Radioactivité associée à l’écorce<br />
A <strong>la</strong> fin de <strong>la</strong> première phase de l’étude (350 h, voir Figure 45), l’écorce de pin de l’un des triplicats (A)<br />
est récupérée par centrifugation de l’ensemble de <strong>la</strong> suspension (10000 rpm, 20 min), puis deux<br />
extractions successives sont effectuées avec 10 mL d’une solution de CaCl 2 (0,1 M) puis 10 mL de<br />
méthanol pur sur <strong>la</strong> totalité de l’écorce (2,5 g). Les solutions sont analysées au compteur à scintil<strong>la</strong>tion<br />
afin d’évaluer le <strong>pour</strong>centage de résidus extractibles.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
164
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Après ces extractions, les résidus liés non extractibles ont été quantifiés après séchage de l’écorce de<br />
pin de chacun des <strong>bio</strong>mètres (80°C pendant 12h), par combustion d’une aliquote représentative<br />
d’environ 150 mg d’écorce dans un Oxidizer Packard modèle A307.<br />
Les échantillons d’écorce sont p<strong>la</strong>cés dans un cône en papier avec une pointe de cellulose en poudre<br />
<strong>pour</strong> faciliter <strong>la</strong> combustion ; le tout est recouvert d’un second cône en papier et p<strong>la</strong>cé sur une<br />
résistance chauffante dans l’Oxidizer.<br />
La combustion est effectuée durant 2 minutes sous courant d’oxygène dans un four à 800°C. Les<br />
combustions ont été réalisées en triplicats.<br />
Le 14 CO 2 libéré par <strong>la</strong> combustion de l’écorce contenant les résidus liés radioactifs est retenu dans<br />
une colonne contenant un adsorbant <strong>chimique</strong> (Carbosorb) puis élué au liquide à scintil<strong>la</strong>tion dans<br />
une fiole à scintil<strong>la</strong>tion. La radioactivité est directement quantifiée au compteur à scintil<strong>la</strong>tion.<br />
L’étalonnage de l’appareil est réalisé à l’aide d’une solution radioactive d’atrazine de concentration<br />
connue. Un volume précis (10µL) de solution est déposé sur <strong>la</strong> poudre de cellulose dans un cône en<br />
papier, puis brûlé dans l’Oxidizer pendant 2 minutes. L’étalonnage est réalisé en triplicats.<br />
V.1.1.3<br />
Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Le devenir de l’écorce issue de <strong>la</strong> première phase des essais en batch (contenant des traces<br />
d’atrazine résiduelle et/ou de métabolites, ainsi que divers résidus et des micro-organismes) a été<br />
suivi sur 7 mois. En effet, l’écorce après <strong>traitement</strong> devient un sous produit du <strong>traitement</strong> et il convient<br />
de caractériser son évolution en vu d’une valorisation éventuelle.<br />
L’évolution du « déchet-écorce » a été étudiée sur l’écorce débarrassée ou non de <strong>la</strong> plupart du milieu<br />
liquide dans lequel elle se trouvait (essais en microcosme et essais en milieu liquide, ratio<br />
L/S=20 mL.g -1 ). Pour ce<strong>la</strong>, les réplicats B et C ont été utilisés (voir Figure 45).<br />
La minéralisation de l’atrazine ou de ses résidus a été suivie par capture du CO 2 dans les pièges à<br />
soude. Après 7 mois d’incubation à température ambiante, des extractions et combustions selon les<br />
protocoles décrits ci-dessus ont permis de quantifier respectivement les résidus d’atrazine non liés et<br />
les résidus liés. L’analyse des solutions dans le cas des essais en milieu liquide (L/S 20 mL.g -1 ) a<br />
permis d’établir un bi<strong>la</strong>n de <strong>la</strong> radioactivité et d’étudier l’évolution du « Déchet-Ecorce ».<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
165
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
V.1.2 Essais en colonnes<br />
Les essais en colonnes représentent <strong>la</strong> mise en œuvre du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> sous forme d’une<br />
« Biofiltration ».<br />
La <strong>bio</strong>filtration est réalisée par circu<strong>la</strong>tion de <strong>la</strong> solution polluée en atrazine à travers le filtre d’écorce<br />
de pin en poudre dans lequel Pseudomonas ADP sp. a été inoculée et s’est développée sous forme<br />
d’un <strong>bio</strong>film.<br />
Dans un premier temps, <strong>la</strong> capacité de Pseudomonas ADP sp. à former un <strong>bio</strong>film à <strong>la</strong> surface de<br />
l’écorce de pin a été étudiée.<br />
Dans un deuxième temps, <strong>la</strong> circu<strong>la</strong>tion d’une solution polluée en atrazine dans différentes conditions<br />
(flux, différents âges de <strong>bio</strong>film, conditions <strong>bio</strong>tiques ou a<strong>bio</strong>tiques, concentrations initiales en atrazine<br />
différentes) a été mise en œuvre.<br />
V.1.2.1<br />
Choix des paramètres<br />
Les colonnes ont été préparées comme présenté au § II.1.2.3.1 avec 10 g d’écorce de pin (particules<br />
d
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
est conseillé <strong>pour</strong> les <strong>bio</strong>filtre (Martin et al., 1993). De plus, une capacité en eau<br />
comprise entre 40 et 80% (massique) est convenable quand le support est saturé<br />
(Ottengraf 1986 ; Devinny 1999) ; c’est le cas <strong>pour</strong> l’écorce de pin en poudre.<br />
- Différentes concentrations initiales en atrazine de <strong>la</strong> solution à traiter ont été<br />
testées. Des essais à 0,2 mg.L -1 ont été suivis par analyse HPLC (au dessus de <strong>la</strong><br />
limite de détection de 0,03 mg.L -1 ). Cette concentration correspond bien sûr à une<br />
pollution massive, et nous a permis de tester l’efficacité de <strong>la</strong> <strong>bio</strong>filtration dans des<br />
conditions extrêmes. D’autres essais ont été réalisés à une concentration initiale de<br />
2,34 µg.L -1 , correspondant à une pollution courante d’eaux naturelles, et suivis par<br />
dosages immuno-essai (II.1.1.1.2(b)) couvrant une gamme de concentrations de 0,1 à<br />
3 µg.L -1 . Ces essais ont été en nombre limités à cause du coût de ces analyses.<br />
- Les essais en colonnes ont été effectués à une température de 20 ± 2°C,<br />
correspondant à une température ambiante moyenne ; les essais de <strong>bio</strong>dégradation<br />
de l’atrazine en milieu liquide ayant prouvé que Pseudomonas ADP sp. était capable<br />
de minéraliser l’atrazine jusqu’à 12°C.<br />
- Afin de se rapprocher de conditions réelles de <strong>traitement</strong> d’eaux naturelles polluées,<br />
<strong>la</strong> solution d’atrazine à traiter à été préparée dans l’eau du robinet, qui apporte aux<br />
micro-organismes des nutriments divers.<br />
- Les essais ont été réalisés avec de l’écorce de pin préa<strong>la</strong>blement stérilisée ou non<br />
afin d’évaluer l’influence de l’activité de <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce de pin sur<br />
l’efficacité du procédé de <strong>bio</strong>filtration.<br />
V.1.2.2<br />
Inocu<strong>la</strong>tion et caractérisation du <strong>bio</strong>film et de l’hydrodynamique des colonnes<br />
V.1.2.2.1<br />
Observation au MEB des micro-organismes sur l’écorce de pin<br />
L’étude du développement d’un <strong>bio</strong>film sur les particules d’écorce dans les colonnes a été réalisée de<br />
façon qualitative, par observation au Microscope Electronique à Ba<strong>la</strong>yage selon les méthodes décrites<br />
ci-dessous.<br />
Les observations au MEB ont été réalisées au Centre Technologique des Microstructures de<br />
l’Université C<strong>la</strong>ude Bernard – Lyon 1. Ces observations ont permis de déterminer un temps idéal de<br />
mise en contact avec les bactéries, <strong>pour</strong> l’obtention de <strong>la</strong> fixation des cellules ou <strong>la</strong> formation d’un<br />
<strong>bio</strong>film à sa surface. L’effet de <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce de pin sur le développement d’un <strong>bio</strong>film de<br />
Pseudomonas ADP sp. a également pu être observé qualitativement par cette technique.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
167
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
(a) Inocu<strong>la</strong>tion des colonnes<br />
Une culture de Pseudomonas ADP sp. en phase exponentielle de croissance, cultivée 20h à 30°C en<br />
milieu minéral (MM) additionné de 1g.L -1 de glucose et 1g.L -1 de sulfate d’ammonium, est injectée en<br />
circuit fermé à travers les colonnes d’écorce stérilisées ou non, pendant 2 ou 6 jours. Des nutriments<br />
et cellules fraîches issues de cultures quotidiennes sont additionnés tous les jours à <strong>la</strong> culture initiale.<br />
A <strong>la</strong> fin de <strong>la</strong> circu<strong>la</strong>tion, les colonnes sont rincées à l’eau du robinet (stérile) avec un volume de 50Vo<br />
(débit 1 mL.min -1 ).<br />
(b) Traitement des échantillons <strong>pour</strong> observation au MEB<br />
Les lits d’écorce de pin contenus dans les colonnes sont alors récupérés et des prélèvements de<br />
quelques milligrammes d’écorce sont réalisés au niveau de l’entrée et du centre de <strong>la</strong> colonne (photos<br />
Figure 47).<br />
Figure 47 : Lits d’écorce de pin issus des colonnes après inocu<strong>la</strong>tion de Pseudomonas ADP sp. pendant<br />
2 ou 6 jours ; prélèvements <strong>pour</strong> analyses au MEB<br />
Les prélèvements d’écorce sont ensuite traités <strong>pour</strong> l’observation au MEB selon le protocole décrit cidessous.<br />
La préparation des échantillons <strong>pour</strong> l’observation de cellules à <strong>la</strong> surface d’un support demande un<br />
travail particulier différent ce celui effectué <strong>pour</strong> l’observation de <strong>la</strong> structure du support brut. Elle se<br />
déroule en 4 étapes principales :<br />
• Fixation des cellules sur le support : l’échantillon solide à observer est plongé pendant<br />
60 minutes dans une solution (50/50, V/V) glutaraldéhyde 4% / tampon (cacody<strong>la</strong>te de sodium 0,2<br />
M, pH 7).<br />
• Rinçage : l’échantillon est ensuite rincé dans 3 bains successifs de 10 minutes, dans une solution<br />
de tampon de cacody<strong>la</strong>te 0,2 M.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
168
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
• Post-fixation : le tampon de rinçage est remp<strong>la</strong>cé par une solution de tétroxyde d’osmium<br />
tamponnée (OsO 4 1% final dans une solution de cacody<strong>la</strong>te de sodium 0,1 M final). La postfixation<br />
s’effectue pendant 30 minutes, puis l’échantillon est rincé à l’eau distillée.<br />
• Déshydratation progressive : l’échantillon est déshydraté après fixation, dans des bains<br />
successifs d’éthanol à 30%, 50%, 70%, 80% et 95%, de 10 minutes chacun. Puis 3 bains de<br />
10 minutes dans l’éthanol 100% sont réalisés. La déshydratation est finalement terminée par 1<br />
bain de 10 minutes dans un mé<strong>la</strong>nge éthanol 100% / HMDS (50/50 ; V/V), et 3 bains de 10<br />
minutes dans le HMDS (hexaméthyldisi<strong>la</strong>zane) pur. Le dernier bain de HMDS est évaporé sous<br />
hôte.<br />
L’échantillon sec est ensuite déposé sur un porte objet et métallisé à l’or-pal<strong>la</strong>dium à l’aide d’un<br />
pulvérisateur cathodique Hummer II Technics.<br />
L’observation des échantillons a ensuite été réalisée au microscope électronique à ba<strong>la</strong>yage S800<br />
Hitachi, 15 kV.<br />
V.1.2.2.2<br />
Influence des micro-organismes sur le comportement hydrodynamique des<br />
colonnes<br />
D’autre part, l’influence du développement bactérien dans les colonnes sur l’hydrodynamique du<br />
système a été étudiée à l’aide du traceur KCl comme décrit au chapitre (II.1.2.2.2). Ces tests<br />
hydrodynamiques ont été réalisés avant et après inocu<strong>la</strong>tion de Pseudomonas ADP sp. (2 ou 6 jours)<br />
à travers les colonnes d’écorce de pin (préa<strong>la</strong>blement stérilisée ou non).<br />
La Figure 48 résume le protocole utilisé <strong>pour</strong> ces expériences :<br />
1. Une injection de KCl est réalisée avant inocu<strong>la</strong>tion de Pseudomonas ADP sp., <strong>pour</strong><br />
caractériser le comportement hydrodynamique initial de chaque colonne.<br />
2. Une culture de Pseudomonas ADP sp. est circulée en circuit fermée comme décrit plus haut<br />
pendant 2 ou 6 jours.<br />
3. Une nouvelle injection de KCl après inocu<strong>la</strong>tion (2 ou 6 jours) de Pseudomonas ADP sp. dans<br />
les colonnes d’écorce de pin permet de conclure sur l’influence du <strong>bio</strong>film sur le<br />
comportement hydrodynamique des colonnes.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
169
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
1-3<br />
2<br />
C<br />
Cellule de<br />
conductivité<br />
Analyseur<br />
CONSORT C832<br />
Flux ascendant<br />
1 ml/min<br />
Pseudomonas ADP<br />
sp. Culture en MM<br />
(1g/l sulfate<br />
d’ammonium;<br />
1g/l glucose)<br />
Aération par<br />
barbotage<br />
2<br />
Ordinateur<br />
Traitement<br />
des données<br />
Pompe<br />
peristaltique<br />
1-3<br />
Solution KCl (1g/l)<br />
Figure 48 : Montage expérimental : Hydrodynamique des colonnes avant et après inocu<strong>la</strong>tion avec<br />
Pseudomonas ADP sp.<br />
V.1.2.3<br />
Protocole expérimental des essais de <strong>bio</strong>filtration<br />
La durée de développement du <strong>bio</strong>film a été fixée à 6 jours grâce aux expériences précédentes et<br />
deux vitesses de circu<strong>la</strong>tion de <strong>la</strong> solution à travers les colonnes ont été testées : 1 mL.min -1 et<br />
0,3 mL.min -1 . Des colonnes d’écorce de pin stérilisée et non stérilisée ont été testées en parallèle afin<br />
d’évaluer l’influence de <strong>la</strong> flore indigène sur l’efficacité du <strong>traitement</strong>.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
170
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Protocole expériental (voir Figure 48) :<br />
1. Les colonnes d’écorce de pin sont saturées en eau par circu<strong>la</strong>tion ascendante en circuit fermé<br />
d’eau du robinet stérile.<br />
2. Un traçage au KCl est réalisé afin de caractériser l’écoulement des solutions à travers les<br />
colonnes.<br />
3. Après rinçage à l’eau du robinet stérile, une culture de Pseudomonas ADP sp. est circulée<br />
(débit = 1 mL.min -1 ) pendant 6 jours avec apport régulier de nutriments et de cellules fraîches,<br />
en circuit fermé, avec aération de <strong>la</strong> culture par barbotage. Des échantillons sont prélevés<br />
régulièrement afin de suivre l’évolution de <strong>la</strong> teneur en carbone (analyse COT) de <strong>la</strong> culture<br />
cellu<strong>la</strong>ire (<strong>la</strong> consommation de carbone étant signe d’activité <strong>bio</strong>logique).<br />
4. Un volume de 50 volumes de pore (V 0 ) d’eau du robinet stérile est ensuite circulée afin<br />
d’éliminer les nutriments et notamment l’azote apporté par <strong>la</strong> culture de Pseudomonas ADP<br />
sp.<br />
5. La solution polluée en atrazine est injectée (flux = 1 ou 0,3 mL.min -1 environ) à travers <strong>la</strong><br />
colonne jusqu’à obtention d’un p<strong>la</strong>teau de concentration en atrazine en sortie de colonne.<br />
6. L’effluent est collecté en sortie de colonne par un collecteur de fractions et les fractions sont<br />
analysées par HPLC (essais avec [atrazine] i = 200 µg.L -1 ) ou par test immuno-essai (essais<br />
avec [atrazine] i = 2,34 µg.L -1).<br />
Les expériences en colonnes sont réalisées en chambre thermostatée à 20 ± 2 °C.<br />
Aucun réplicat n’a pu être réalisé, le nombre de colonnes disponibles étant limité à 4 et <strong>la</strong> durée des<br />
expériences étant de 15 jours environ.<br />
La Figure 48 représente le montage utilisé <strong>pour</strong> les essais de <strong>bio</strong>filtration en colonne.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
171
MATERIEL ET METHODES<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
5<br />
3<br />
6<br />
Collecteur de fractions<br />
Flux ascendant<br />
1ml/min – 0,3 ml/min<br />
Pseudomonas ADP<br />
sp. Culture en MM<br />
Aération par<br />
barbotage<br />
6j<br />
3<br />
HPLC<br />
Immuno-essais<br />
C/Co<br />
V/Vo<br />
Sol. Atrazine<br />
5<br />
200µg.L -1 –<br />
2,3 µg.L -1<br />
Pompe<br />
peristaltique<br />
2-4<br />
H 2 O<br />
Figure 49 : Montage expérimental <strong>pour</strong> les essais en colonne de <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> d’une solution<br />
polluée à l’atrazine après inocu<strong>la</strong>tion des colonnes avec Pseudomonas ADP sp. pendant 6 jours.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
172
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
V.2 Résultats et discussion<br />
V.2.1 <strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> en batch<br />
Cette étude à permis d’évaluer l’efficacité du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> en essais batch par quantification de<br />
<strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine en <strong>bio</strong>mètre en présence de Pseudomonas ADP sp. inoculé dans un<br />
milieu contenant de l’écorce de pin en poudre, débarrassée ou non de sa microflore indigène.<br />
D’autre part, en fin d’expérience, <strong>la</strong> répartition de <strong>la</strong> radioactivité dans les différents compartiments<br />
(gaz, liquide, solide) a été étudiée.<br />
Enfin, une étude à long terme sur 7 mois a permis de déterminer le comportement du « déchetécorce<br />
» à l’issue du <strong>traitement</strong> et notamment son évolution quant au devenir de <strong>la</strong> radioactivité<br />
résiduelle présente dans l’écorce après <strong>traitement</strong>.<br />
V.2.1.1<br />
Minéralisation de l’atrazine en présence d’écorce de pin<br />
Des essais ont été menés en parallèle, en milieu minéral MM contenant ou non de l’écorce de pin<br />
stérile ou non stérile), afin de quantifier l’effet de <strong>la</strong> présence d’écorce de pin sur <strong>la</strong> minéralisation de<br />
l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. à faible (44,2 µg.L -1 ) et à forte (20 mg.L -1 ) concentration initiale<br />
en atrazine.<br />
Les essais ont été réalisés à température ambiante (20 ± 2°C) dans des <strong>bio</strong>mètres équipés d’un piège<br />
à soude, selon le protocole présenté au § V.1.1.1.<br />
Les Figure 50 et Figure 51 présentent les résultats de minéralisation aux deux concentrations initiales<br />
en atrazine testées.<br />
Ces figures reprennent quelques courbes présentées dans les paragraphes précédents ; elles sont à<br />
nouveau présentées ici <strong>pour</strong> permettre d’établir un bi<strong>la</strong>n global comparatif sur <strong>la</strong> minéralisation de<br />
l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.<br />
Le Tableau 17 résume les résultats de ces expériences, après incubation de Pseudomonas ADP sp.<br />
pendant 320h dans les différents milieux étudiés.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
173
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
[Atrazine ]i=44,2 µg/L<br />
% Atrazine mineralisée<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
0 50 100 150 200 250 300 350<br />
Temps (h)<br />
MM<br />
Extrait Aqueux d'Ecorce<br />
MM + Ecorce stérile<br />
MM + Ecorce non stérile<br />
Témoin st. MM + Ecorce non stérile<br />
Témoin st. MM + Ecorce stérile<br />
Figure 50 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM- Glucose<br />
1,25 g.L -1 ), en présence ou non d’écorce en poudre (d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
dégradation de l’ordre de 0,54 mg.L -1 .h -1 et 1,3 µg.L -1 .h -1 respectivement sur les 24 premières heures<br />
d’incubation. Il existe donc une re<strong>la</strong>tion proportionnelle entre concentration initiale en atrazine et<br />
vitesse moyenne de minéralisation dans les deux milieux liquides.<br />
La présence des composés solubles de l’écorce de pin (extrait aqueux d’écorce de pin) n’entraîne<br />
aucun retard de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. que ce soit à faible ou à forte<br />
concentration initiale en atrazine.<br />
La présence de particules d’écorce de pin stérile dans le milieu réduit le taux de minéralisation<br />
d’environ 30% et 50% (respectivement à faible et forte concentration initiale en atrazine) indiquant que<br />
l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce <strong>la</strong> rend moins disponible <strong>pour</strong> Pseudomonas ADP sp., et que ce<br />
phénomène a une incidence re<strong>la</strong>tive d’autant plus grande que <strong>la</strong> concentration initiale en atrazine est<br />
élevée (peut être à cause de <strong>la</strong> diffusion intraparticu<strong>la</strong>ire de l’atrazine).<br />
Pour une concentration initiale en atrazine de 44,2 µg.L -1 , 50,5 ± 4,0 % de l’atrazine est minéralisée en<br />
présence d’écorce de pin stérile contre 47,1 ± 1,9 % en présence d’écorce contenant sa microflore<br />
indigène. Cette différence n’est pas significative au regard des déviations standard sur les résultats<br />
(Figure 51).<br />
A forte concentration initiale, 36,5 ± 1,3 % de l’atrazine sont minéralisés en 320h en présence<br />
d’écorce stérile contre 54 ± 0,6 % en présence d’écorce non stérile. La microflore de l’écorce<br />
augmente donc significativement le taux de minéralisation <strong>pour</strong> de fortes concentrations en atrazine,<br />
contrairement au phénomène observé plus haut (à faible concentration). Dans les deux cas (faible et<br />
forte concentrations initiales en atrazine) <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce de pin présente une activité de<br />
minéralisation significative : 12 à 14% de l’atrazine sont minéralisés par <strong>la</strong> microflore indigène de<br />
l’écorce seule (Ecorce non stérile + MM) non inoculée par Pseudomonas ADP sp., respectivement à<br />
forte et à faible concentration initiale en atrazine.<br />
On peut penser qu’à faible concentration (44,2 µg.L -1 ), l’atrazine est adsorbée principalement à <strong>la</strong><br />
surface des particules, <strong>la</strong> <strong>la</strong>issant accessible à Pseudomonas ADP sp. dont les cellules sont<br />
essentiellement à <strong>la</strong> surface des grains d’écorce. A plus forte concentration (20 mg.L -1 ), l’atrazine<br />
<strong>pour</strong>rait pénétrer plus profondément à l’intérieur des pores de l’écorce de pin par diffusion entraînant<br />
ainsi une diminution de <strong>la</strong> disponibilité de l’atrazine vis à vis de Pseudomonas ADP sp. La présence<br />
de <strong>la</strong> microflore indigène dans <strong>la</strong> porosité intraparticu<strong>la</strong>ire <strong>pour</strong>rait alors expliquer le taux plus élevé de<br />
minéralisation observé avec l’écorce non stérile par rapport à l’écorce stérile.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
175
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Tableau 17 : Taux de minéralisation d’atrazine (en %) en 320h d’incubation de Pseudomonas ADP sp. en<br />
<strong>bio</strong>mètre à 20 °C avec [atrazine]i= 44,2 µg.L -1 ou 20 mg.L -1 (st.=stérile)<br />
[Atrazine]i MM Extrait Ecorce st. Ecorce non st. Tém. Ecorce st. Tém. Ecorce non st.<br />
44,2 µg.L -1 70,5 ± 9,0 65,8 ± 7,6 50,5 ± 4,2 47,1 ± 2,0 0,10 ± 0,01 14,4 ± 1,4<br />
20 mg.L -1 72,1 ± 1,3 71,7 ± 0,7 36,5 ± 1,3 54 ± 0,6 0,10 ± 0,01 11,7 ± 3,5<br />
En conclusion, <strong>la</strong> présence de particules d’écorce dans le milieu réduit notablement le taux de<br />
minéralisation, par effet d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce, diminuant <strong>la</strong> disponibilité de celle-ci<br />
<strong>pour</strong> Pseudomonas ADP sp. Cependant, à forte concentration en atrazine, <strong>la</strong> contribution de <strong>la</strong> flore<br />
indigène, probablement rendue possible par <strong>la</strong> diffusion intraparticu<strong>la</strong>ire de l’atrazine, compense en<br />
partie <strong>la</strong> baisse du rendement de minéralisation.<br />
V.2.1.2<br />
Analyses des composés radioactifs en solution en cours d’incubation<br />
La répartition de <strong>la</strong> radioactivité en solution entre les différents composés (atrazine ou métabolites de<br />
dégradation) a été suivie en cours d’incubation dans les essais en milieu minéral et en extrait aqueux<br />
d’écorce de pin. Le suivi dans les essais contenant l’écorce de pin a malheureusement posé des<br />
problèmes au niveau des analyses HPLC, dus sans doute à une concentration trop élevée des<br />
composés organiques provenant de l’écorce de pin et par conséquent rendant les résultats<br />
inexploitables.<br />
Témoins non inoculés :<br />
La Figure 52 montre que dans les témoins non inoculés avec Pseudomonas ADP sp., seulement 80%<br />
de <strong>la</strong> radioctivité initialement apportée au milieu sont retrouvés sous forme d’atrazine. Cette<br />
observation indique qu’il existe des réactions ou transformations <strong>chimique</strong>s spontanées (qui ne sont<br />
pas de <strong>la</strong> minéralisation) lorsque l’atrazine est additionnée aux milieux aqueux. A faible concentration<br />
initiale, l’atrazine est toujours présente au bout de 312 h dans les essais en milieu minéral. Les<br />
composés intermédiaires de dégradation DEDIA, DIA, OHDEA et OHA sont présents dans de faibles<br />
proportions re<strong>la</strong>tivement constantes tout au long des expériences. Dans l’extrait aqueux d’écorce, les<br />
témoins non inoculés contiennent également 80% d’atrazine et les autres constituants sont <strong>la</strong> DEDIA,<br />
DEA, OHDEA et OHA.<br />
A forte concentration (Figure 53), l’atrazine est dégradée après 192 h d’incubation traduisant une<br />
contamination du témoin en milieu minéral (MM). Le principal métabolite retrouvé est le DIA.<br />
Dans l’extrait, malgré les problèmes techniques survenus au cours des analyses HPLC et nous faisant<br />
perdre les résultats <strong>pour</strong> les temps 20 et 48h, on peut noter que <strong>la</strong> radioactivité en solution est<br />
présente sous forme d’atrazine à 80 % jusqu’à <strong>la</strong> fin de l’incubation. L’atrazine en solution se dissocie<br />
en différents métabolites ; on retrouve ainsi les composés DEDIA, OHDIA, DIA et OHDEA.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
176
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Essais inoculés :<br />
Dans les essais inoculés (MM et extrait), l’atrazine est totalement dégradée après 48 h d’incubation<br />
quelque soit <strong>la</strong> concentration initiale d’atrazine testée (Figure 52 et Figure 53). Les métabolites de<br />
dégradation sont principalement présents sous forme de DEDIA et OHA (premiers métabolites de<br />
dégradation de l’atrazine), puis, après 300 h d’incubation l’OHA devient majoritaire dans le milieu MM.<br />
On remarque que certains composés intermédiaires comme <strong>la</strong> DEDIA sont présents de façon<br />
représentative en solution ; <strong>pour</strong>tant celui-ci ne figure pas comme métabolite intermédiaire du<br />
mécanisme de minéralisation décrit pas Martinez et al. (2001) (voir Figure 13 du chapitre <strong>Etude</strong><br />
Bibliographique). Il en est de même <strong>pour</strong> les composés tels que l’OHDIA ou <strong>la</strong> OHDEA. En fait, les<br />
analyses montrent que l’aire des pics correspondants à ces composés reste globalement équivalente<br />
au cours du temps. La distribution augmente donc puisqu’il y a minéralisation de l’atrazine mais les<br />
composés initialement présents dans le milieu comme <strong>la</strong> DEDIA prennent une proportion en<br />
conséquence plus importante puisqu’ils ne sont pas dégradés. On notera à ce propos qu’aucune<br />
enzyme chez Pseudomonas ADP sp. n’a été décrite comme étant capable de dégrader ces<br />
métabolites.<br />
100%<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
Témoin MM<br />
0 20 48 144 216 312<br />
Temps (h)<br />
Autres<br />
% OHA<br />
% OHDEA<br />
% OHDIA<br />
% DEA<br />
% DIA<br />
% DEDIA<br />
% A<br />
100%<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
Témoin Extrait<br />
0 20 48 216 312<br />
Temps (h)<br />
Autres<br />
% OHA<br />
% OHDEA<br />
% OHDIA<br />
% DEA<br />
% DIA<br />
% DEDIA<br />
% A<br />
100%<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
MM<br />
20 48 144 216 312<br />
Temps (h)<br />
Autres<br />
% OHA<br />
% OHDEA<br />
% OHDIA<br />
% DEA<br />
% DIA<br />
ND<br />
% DEDIA<br />
% A<br />
100%<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
Extr ait<br />
20 48 144 216 312<br />
Temps (h)<br />
Autres<br />
% OHA<br />
% OHDEA<br />
% OHDIA<br />
% DEA<br />
% DIA<br />
ND<br />
% DEDIA<br />
% A<br />
Figure 52 : Distribution de <strong>la</strong> radioactivité en solution dans les essais de minéralisation<br />
([atrazine]i=44,2µg.L -1 ) en milieu minéral (MM) et en extrait stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation<br />
lente au barreau aimenté ; incubation 15 jours<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
177
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
100%<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
Témoin MM<br />
20 48 192 432<br />
Temps (h)<br />
% OHA<br />
% OHDEA<br />
% DEA<br />
% DIA<br />
% DEDIA<br />
% A<br />
100%<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
Témoin Extrait<br />
20 48 144 432<br />
Temps (h)<br />
% OHA<br />
% OHDEA<br />
% OHDIA<br />
% DEA<br />
% DIA<br />
% DEDIA<br />
% A<br />
100%<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
MM<br />
48 144 192 432<br />
Temps (h)<br />
Autres<br />
% OHA<br />
% OHDEA<br />
% OHDIA<br />
% DEA<br />
% DIA<br />
% DEDIA<br />
% A<br />
100%<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
Extr ait<br />
20 144 192 432<br />
Temps (h)<br />
Autres<br />
% OHA<br />
% OHDEA<br />
% OHDIA<br />
% DEA<br />
% DIA<br />
% DEDIA<br />
% A<br />
Figure 53 : Distribution de <strong>la</strong> radioactivité en solution dans les essais de minéralisation ([atrazine]i=20<br />
mg.L -1 ) en milieu minéral (MM) et en extrait stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation lente au barreau<br />
aimenté ; incubation 15 jours<br />
Avec,<br />
- OHA : 2-hydroxy-atrazine<br />
- OHDEA: Deséthyl-2-hydroxy-atrazine<br />
- OHDIA: Desisopropyl-2-hydroxy-atrazine<br />
- DEA: Deséthyl-atrazine<br />
- DIA: Desisopropyl-atrazine<br />
- DEDIA: deséthyl-desisopropyl-atrazine<br />
En conclusion, on note que l’atrazine est transformée même lorsque Pseudomonas ADP sp. n’est pas<br />
inoculée et que l’atrazine se trouve en milieu stérile ; l’atrazine dans les témoins stériles ne représente<br />
que 80% de <strong>la</strong> radioactivité totale.<br />
D’autre part, on retrouve beaucoup plus de métabolites intermédiaires de dégradation à faible<br />
concentration qu’à forte concentration initiale en atrazine.<br />
De plus, <strong>la</strong> différence principale observée entre <strong>la</strong> dégradation de l’atrazine en milieu minéral et en<br />
extrait aqueux d’écorce de pin est <strong>la</strong> présence d’OHDEA comme métabolite de dégradation en milieu<br />
MM, absent dans les essais en extrait d’écorce de pin.<br />
Beaucoup d’intermédiaires de dégradation de l’atrazine sont présents, qui ne figurent pas dans le<br />
schéma de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. décrit par Martinez et al. (2001).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
178
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Une étude quantitative serait donc nécessaire <strong>pour</strong> décrire en détail le mécanisme de dégradation<br />
dans les conditions de notre étude (Milieu minéral ou extrait aqueux d’écorce de pin).<br />
V.2.1.3<br />
Répartition de <strong>la</strong> radioactivité résiduelle en fin de <strong>traitement</strong><br />
Au bout de 15 jours de <strong>traitement</strong> en <strong>bio</strong>mètre et de suivi de <strong>la</strong> minéralisation, des extractions au<br />
CaCl 2 (0,1 M) et au méthanol ont été réalisées sur les essais contenant l’écorce stérile ou non stérile<br />
afin de quantifier <strong>la</strong> radioactivité résiduelle (protocole § V.1.1.2). Les résidus radioactifs non<br />
extractibles ont été quantifiés après extraction par combustion de l’écorce et les résidus en solution<br />
ont été analysés par HPLC.<br />
Pour les deux concentrations en atrazine étudiées (44,2 µg.L -1 et 20 mg.L -1 ) <strong>la</strong> répartition de <strong>la</strong><br />
radioactivité dans les différents compartiments du <strong>bio</strong>mètre (phase gazeuse, phase liquide et phase<br />
solide) est présentée sur les Figure 54 et Figure 55.<br />
Dans les essais « liquides », en milieu minéral (MM) et extrait aqueux d’écorce de pin, <strong>la</strong> part de<br />
résidus non extractibles représente <strong>la</strong> radioactivité retrouvée après filtration des solutions et<br />
combustion des filtres supportant les cellules présentes dans les milieux à <strong>la</strong> fin des expériences<br />
(t = 350 h ou 15 jours).<br />
Les résultats montrent que le bi<strong>la</strong>n de radioactivité totale se clôture à plus de 80% ce qui est un bon<br />
résultat de restitution.<br />
100%<br />
[Atrazine]i= 44,2 µg.L -1<br />
Bi<strong>la</strong>n matière<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
Autres<br />
Résidus liés<br />
Résidus extractibles<br />
En solution<br />
Minéralisation<br />
0%<br />
MM<br />
Extrait<br />
E<br />
E st.<br />
E non<br />
st.<br />
Tém. E<br />
st.<br />
Tém. E<br />
non st.<br />
Figure 54 : Répartition de <strong>la</strong> radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de<br />
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu minéral (MM-Glucose), extrait aqueux d’écorce de<br />
pin, en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
[Atrazine]i= 20g.mL -1<br />
100%<br />
Bi<strong>la</strong>n matière<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
Autres<br />
Résidus liés<br />
Résidus extractibles<br />
En solution<br />
Minéralisation<br />
0%<br />
MM Extrait E st. E non st. Tém st. Tém non<br />
st.<br />
Figure 55 : Répartition de <strong>la</strong> radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de<br />
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu minéral (MM-Glucose), extrait aqueux d’écorce de<br />
pin, en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
sur les 22 à 38% de radioactivité résiduelle retrouvée dans l’écorce dans les essais inoculés avec<br />
Pseudomonas ADP sp.<br />
Dans les essais non inoculés (« Témoin Ecorce non stérile » et « Témoin écorce stérile »), <strong>la</strong><br />
radioactivité non extractible retrouvée dans l’écorce représente respectivement entre 74 et 92% de <strong>la</strong><br />
radioactivité totale en fin d’expérience à faible concentration et entre 63 et 81% <strong>pour</strong> les essais à forte<br />
concentration. On note ainsi, qu’en présence de <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin, le taux d’atrazine (ou<br />
autres résidus radioactifs) retenue sur l’écorce est moindre par rapport au taux observé en absence<br />
de cette microflore. D’autre part, <strong>la</strong> présence de Pseudomonas ADP sp. dans le milieu réduit de plus<br />
de <strong>la</strong> moitié le <strong>pour</strong>centage de radioactivité résiduelle retrouvée sur l’écorce de pin.<br />
Ces résultats montrent que l’atrazine (ou ses métabolites de dégradation) est globalement très<br />
difficilement extractible, rendant difficile sa disponibilité et donc sa consommation par les microorganismes.<br />
Après 15 jours d’incubation, une fraction importante est fortement liée à l’écorce (Figure<br />
54 et Figure 55) et le taux de minéralisation n’évolue plus.<br />
V.2.1.4<br />
Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du <strong>traitement</strong><br />
Le devenir de l’écorce en tant que déchet à l’issue du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> réalisé plus haut à été<br />
étudié sur une durée de 7 mois par suivi de <strong>la</strong> minéralisation (dégagement de 14 CO 2 ) puis combustion<br />
des écorces en fin d’expérience. Les essais ont été réalisés dans des <strong>bio</strong>mètres, tels qu’utilisés cidessus,<br />
en présence de milieu liquide (MM, ratio L/S=20 mL.g -1 ) et sur l’écorce humide issue des<br />
essais précédents. Le protocole de ces essais est détaillé au § V.1.1.3.<br />
Les Figure 57 et Figure 58 présentent les résultats obtenus en milieu liquide et en microcosme,<br />
respectivement, <strong>pour</strong> une concentration initiale en atrazine de 20 mg.L -1 et 44,2 µg.L -1 . Il s’agit de<br />
résultats cumulés avec ceux obtenus à t=350 h. Ces résultats sont également présentés sous fome de<br />
tableau récapitu<strong>la</strong>tif (Tableau 18).<br />
Globalement, on remarque que l’évolution de <strong>la</strong> radioactivité dans les <strong>bio</strong>mètres, que ce soit en<br />
microcosme ou en milieu liquide, est simi<strong>la</strong>ire au bi<strong>la</strong>n établi après 350 h d’incubation (Figure 56) ; <strong>la</strong><br />
Figure est de nouveau présentée ici <strong>pour</strong> faciliter <strong>la</strong> comparaison entre le bi<strong>la</strong>n à 15 jours et le bi<strong>la</strong>n à<br />
7 mois. Le processus d’évolution est donc très lent dans les conditions expérimentales traduisant une<br />
bonne stabilité du matériau.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
181
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Après 15 jours en milieu liquide L/S=20<br />
[Atrazine]i= 20g.mL-1<br />
[Atrazine]i= 44,2 µg.L-1<br />
100%<br />
100%<br />
Bi<strong>la</strong>n matière<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
Autres<br />
Résidus liés<br />
Résidus extractibles<br />
En solution<br />
Minéralisation<br />
Bi<strong>la</strong>n matière<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
Ec st. Ec non st. Tém st. Tém non st.<br />
0%<br />
Ec st. Ec non st. Tém. E st. Tém. E non st.<br />
Figure 56 : Répartition de <strong>la</strong> radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de<br />
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., après 15 jours d’incubation à 20 ± 2 °C ; [atrazine]i = 44,2 µg.L -1<br />
(Figure de Gauche) et [atrazine]i = 20 mg.L -1 (Figure de Droite)<br />
A forte concentration initiale en atrazine (20 mg.L -1 ) on observe que 2 à 3% supplémentaires<br />
d’atrazine (par rapport au bi<strong>la</strong>n établi après 350 h) sont minéralisés dans les témoins non inoculés<br />
avec Pseudomonas ADP sp. contenant l’écorce stérile, traduisant sans doute une contamination du<br />
milieu par des micro-organismes extérieurs.<br />
Après 7 mois supplémentaires en<br />
Evolution en milieu liquide L/S=20<br />
à 7 mois<br />
milieu liquide L/S=20<br />
Après 7 mois supplémentaires en<br />
Evolution en microcosme<br />
à 7 mois<br />
100%<br />
100%<br />
Bi<strong>la</strong>n matière<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
Ec st.<br />
Ec non<br />
st.<br />
Tém. Ec<br />
st.<br />
Tém. Ec<br />
non st.<br />
Autres<br />
Résidus liés<br />
Résidus extractibles<br />
En solution<br />
Mineralisation<br />
Bi<strong>la</strong>n matière<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
Ec st. Ec non st. Tém. Ec<br />
st.<br />
Tém. Ec<br />
non st.<br />
Figure 57 : Répartition de <strong>la</strong> radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de<br />
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
revanche, les Témoins non inoculés contenant initialement l’écorce stérile ou l’écorce non stérile<br />
continuent d’évoluer et des valeurs de minéralisation de 2 à 7% (Ecorce stérile) et 14 à 18% (Ecorce<br />
non stérile) sont observés au bout de 7 mois d’incubation, avec une minéralisation un peu plus<br />
importante en microcosme. La minéralisation observée dans les témoins d’écorce stérile non inoculés<br />
est attribuée à une contamination microbienne survenue en cours d’incubation après les 15 premiers<br />
jours d’incubation.<br />
Après 7 mois supplémentaires en<br />
Evolution en milieu liquide L/S=20<br />
à 7 mois<br />
milieu liquide L/S=20<br />
Après 7 mois supplémentaires en<br />
Evolution en microcosme<br />
à 7 mois<br />
microcosme<br />
100%<br />
100%<br />
Bi<strong>la</strong>n matière<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
Autres<br />
Résidus liés<br />
Résidus extractibles<br />
En solution<br />
Mineralisation<br />
Bi<strong>la</strong>n matière<br />
80%<br />
60%<br />
40%<br />
20%<br />
0%<br />
Ec st.<br />
Ec non<br />
st.<br />
Tém Ec<br />
st.<br />
Tém Ec<br />
non st.<br />
0%<br />
Ec st.<br />
Ec non<br />
st.<br />
Tém Ec<br />
st.<br />
Tém Ec<br />
non st.<br />
Figure 58 : Répartition de <strong>la</strong> radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de<br />
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
rapport au bi<strong>la</strong>n établi à 350h d’incubation (Tableau 18), on note un taux de résidus liés légèrement<br />
supérieur dans les essais à faible concentration initiale en atrazine. Dans les essais contenant<br />
l’écorce non stérile, on retrouve 37,5% de résidus liés après 15 jours d’incubation contre 42,2% de<br />
l’atrazine initialement apportée après 7 mois d’incubation (même observations <strong>pour</strong> les essais avec<br />
l’écorce stérile ou les Témoins avec écorce non stérile). Le vieillissement du déchet, que ce soit en<br />
milieu liquide ou en microcosme permet aux résidus de se lier plus fortement et irréversiblement au<br />
support, en pénétrant plus profondément dans <strong>la</strong> structure de l’écorce ou en établissant des liaisons<br />
<strong>chimique</strong>s plus fortes.<br />
Si l’on compare les essais à forte et à faibles concentrations (Tableau 18), <strong>la</strong> principale différence<br />
porte sur le <strong>pour</strong>centage de résidus liés : <strong>pour</strong> les essais en milieu liquide en présence d’écorce non<br />
stérile, les résidus non extractibles (ou résidus liés) représentent 17% de <strong>la</strong> radioactivité totale à forte<br />
concentration initiale en atrazine, contre 42% dans les essais à faible concentration en atrazine. On<br />
remarque le même phénomène dans les Témoins « Ecorce stérile » et « Ecorce non stérile ». Cette<br />
observation est logique puisque plus <strong>la</strong> concentration à l’équilibre C e sera petite, plus <strong>la</strong> proportion de<br />
substrat adsorbée (q e /C e ) sera grande ; a forte concentration, les sites d’adsorption sont rapidement<br />
saturés et <strong>la</strong> proportion de substrat adsorbée est donc moins grande. De plus, on peut imaginer que <strong>la</strong><br />
flore indigène de l’écorce consomme plus facilement l’atrazine lorsque celle-ci est présente à forte<br />
concentration ; ainsi, on retrouverait moins (en proportion) de résidus liés à l’écorce à forte<br />
concentration qu’à faible concentration.<br />
D’autre part, le Tableau 18 montre que le <strong>pour</strong>centage de résidus non extractibles dans l’écorce par<br />
rapport à <strong>la</strong> radioactivité totale retrouvée dans celle-ci est dans tous les cas compris entre 90 et 98%.<br />
Ces résultats montrent que l’atrazine au contact de l’écorce est principalement adsorbée<br />
irréversiblement, que ce soit après 15 jours d’incubation ou après 7 mois. Si l’on se réfère aux<br />
cinétiques d’adsorption établies en batch (Figure 11, p.102), on voit que ce phénomème est quasi<br />
instantané et que l’atrazine est majoritairement adsorbée lors de <strong>la</strong> première heure avec contact<br />
l’écorce. Ceci explique, entre autre, que <strong>la</strong> distribution de l’atrazine (de <strong>la</strong> radioactivité plus<br />
exactement) évolue peu, entre les différents compartiments, entre 15 jours et 7 mois d’incubation.<br />
V.2.1.5<br />
Conclusions<br />
Concernant le suivi de minéralisation de l’atrazine en milieu dispersé, les résultats obtenus<br />
permettent de conclure qu’il existe une re<strong>la</strong>tion de proportionnalité entre <strong>la</strong> concentration initiale en<br />
atrazine et <strong>la</strong> vitesse initiale moyenne de minéralisation, suggérant une cinétique initiale de 1 er ordre<br />
dans le domaine de concentration étudié, avec une constante cinétique de l’ordre de 0,0022 h -1 .<br />
La présence d’écorce de pin dans le milieu diminue de 25 à 30% le taux de minéralisation par rapport<br />
aux taux observés en milieu liquide sans écorce (MM ou extrait aqueux d’écorce de pin).<br />
184<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Les essais confirment une faible activité minéralisatrice de <strong>la</strong> microflore indigène de l’écorce de pin :<br />
entre 12 et 14 % de l’atrazine sont minéralisés dans les témoins non inoculés avec Pseudomonas<br />
ADP sp.<br />
A forte concentration initiale en atrazine, dans les essais inoculés avec Pseudomonas ADP sp., cette<br />
microflore augmente significativement le taux global de minéralisation, alors qu’à faible concentration<br />
on n’observe pas d’effet significatif.<br />
Le bi<strong>la</strong>n matière réalisé après 15 jours d’incubation des <strong>bio</strong>mètres à température ambiante montre<br />
que le taux de radioactivité retrouvé en solution est moins élevé dans les témoins « Ecorce stérile »<br />
que dans les témoins « Ecorce non stérile », traduisant à nouveau le rôle de <strong>la</strong> microflore dans <strong>la</strong><br />
<strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine (confirmé par le suivi du 14 CO 2 ).<br />
Au bout de 15 jours, une grande proportion d’atrazine est liée à l’écorce de pin (22 à 38%) diminuant<br />
<strong>la</strong> <strong>bio</strong>disponibilité de celle-ci vis à vis des micro-organismes impliqués dans <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation. Parmi<br />
cette proportion d’atrazine liée, environ 1 à 2 % seulement sont extractibles (CaCl 2 et MeOH).<br />
L’atrazine est ainsi fortement liée à l’écorce de pin après 15 jours de mise en contact, et <strong>la</strong><br />
minéralisation n’évolue quasiment plus.<br />
Concernant le devenir à long terme de l’écorce de pin issue du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> en batch, on<br />
note peu d’évolution entre 15 jours et 7 mois, que ce soit en microcosme ou en milieu liquide (ratio<br />
L/S=20 mg.L -1 ). En fait, le phénomène d’adsorption qui régit principalement le devenir de l’atrazine a<br />
lieu au cours des premières heures de contact avec l’écorce de pin. Cependant, on note que l’atrazine<br />
est liée plus fortement à l’écorce au bout de 7 mois : le <strong>pour</strong>centage de résidus non extractibles parmi<br />
les résidus liés à l’écorce augmente légèrement (quelques %, essais Témoin avec écorce stérile) par<br />
rapport au bi<strong>la</strong>n établi à 15 jours.<br />
Cette interaction forte avec l’écorce limite <strong>la</strong> <strong>bio</strong>disponibilité de l’atrazine et donc l’évolution du déchet.<br />
On <strong>pour</strong>ra donc difficilement imaginer un <strong>traitement</strong> <strong>bio</strong>logique du déchet <strong>pour</strong> éliminer les résidus<br />
d’atrazine et régénérer le support <strong>pour</strong> une nouvelle utilisation. L’inocu<strong>la</strong>tion régulière des <strong>bio</strong>mètres<br />
tout au long des 7 mois, avec un plus grand nombre de micro-organismes <strong>pour</strong>rait être testé mais<br />
n’aurait sans doute aucun effet puisque l’atrazine migre dans les particules alors que les microorganismes<br />
apportés s’accumulent à l’extérieur.<br />
Par contre, cette forte interaction diminue <strong>la</strong> mobilité de l’atrazine, abaissant le risque environnemental<br />
et permettant ainsi d’envisager des filières de stockage ou de valorisation de l’écorce. Des tests<br />
d’écotoxicologie devraient être mis en œuvre <strong>pour</strong> vérifier cette possibilité.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
185
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Si <strong>la</strong> présence résiduelle de l’atrazine ou de ces produits de dégradation dans l’écorce était jugée<br />
inacceptable environnementalement <strong>pour</strong> valoriser ce matériau, <strong>la</strong> combustion serait alors <strong>la</strong> seule<br />
issue <strong>pour</strong> ces déchets d’écorce provenant du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong>.<br />
V.2.2 <strong>Etude</strong> en colonne du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
V.2.2.1<br />
<strong>Etude</strong> du développement de Pseudomonas ADP sp. en colonne d’écorce de pin<br />
Une observation au Microscope Electronique à Ba<strong>la</strong>yage (MEB) (voir préparation des échantillons §<br />
V.1.2.2.1) d’échantillons prélevés des cylindres d’écorce de pin (extraits des colonnes) préa<strong>la</strong>blement<br />
inoculés avec Pseudomonas ADP sp. selon le protocole décrit en V.1.2.2, a permis de vérifier <strong>la</strong><br />
capacité de Pseudomonas ADP sp. à survivre dans ce contexte et à coloniser le matériau. D’autre<br />
part, ces observations réalisées après différentes durées de circu<strong>la</strong>tion d’une culture cellu<strong>la</strong>ire ont<br />
permis d’évaluer une durée minimale d’inocu<strong>la</strong>tion <strong>pour</strong> le développement et <strong>la</strong> colonisation des<br />
cellules au sein de l’écorce de pin. De plus, ces essais ont été réalisés sur des colonnes d’écorce<br />
stériles ou non stériles ; l’influence de <strong>la</strong> microflore indigène de l’écorce sur <strong>la</strong> colonisation de celle-ci<br />
par Pseudomonas ADP sp. a ainsi pu être mise en évidence de manière qualitative.<br />
Deux durées de circu<strong>la</strong>tion ont été testées : 2 jours et 6 jours. Les observations au MEB ont été<br />
réalisées sur des échantillons prélevés en entrée de colonne et au centre de <strong>la</strong> colonne.<br />
Les clichés obtenus sont présentés en ANNEXE 5.<br />
Après deux jours de circu<strong>la</strong>tion d’une culture à travers les colonnes, on constate que Pseudomonas<br />
ADP sp. n’a pas proprement dit colonisé l’écorce de pin. Les cellules sont très c<strong>la</strong>irsemées sur le<br />
support ; cependant, on note que sur l’écorce non stérile les cellules sont présentes en plus grand<br />
nombre que sur l’écorce stérilisée. On peut différencier des cellules de tailles variables constituant<br />
une partie de <strong>la</strong> flore indigène de l’écorce : les grosses cellules (environ 5 µm) <strong>pour</strong>raient<br />
correspondrent aux levures nommées CP2 préa<strong>la</strong>blement identifiées au cours de l’isolement de <strong>la</strong><br />
microflore de l’écorce de pin par microscopie optique (IV.2.1p.150). On note également <strong>la</strong> présence<br />
de cellules possédant des fi<strong>la</strong>ments mycéliens.<br />
Deux jours d’inocu<strong>la</strong>tion ne sont pas suffisants <strong>pour</strong> coloniser l’écorce avec Pseudomonas ADP sp. et<br />
donc <strong>pour</strong> espérer obtenir une <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine efficace dans le cadre d’un <strong>traitement</strong><br />
<strong>combiné</strong> par <strong>bio</strong>filtration.<br />
Après 6 jours de circu<strong>la</strong>tion d’une culture de Pseudomonas ADP sp. à travers les colonnes, un <strong>bio</strong>film<br />
cellu<strong>la</strong>ire plus dense tapisse l’écorce de pin surtout en entrée de colonne, que ce soit sur l’écorce<br />
préa<strong>la</strong>blement stérilisée ou non stérilisée. Les cellules sont encrées dans une sorte de structure<br />
spongieuse vraisemb<strong>la</strong>blement constituée d’exo-polymères sécrétés par les cellules.<br />
Dans les colonnes d’écorce préa<strong>la</strong>blement stérilisée, les cellules sont toutes identiques d’une taille<br />
moyenne de 1 à 2 µm en forme de bâtonnet, caractéristiques de Pseudomonas ADP sp.<br />
186<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Dans les colonnes d’écorce non stérilisée, ces bâtonnets cohabitent avec d’autre formes cellu<strong>la</strong>ires<br />
(cellules plus grosses et fi<strong>la</strong>ments mycéliens). La présence de Pseudomonas ADP sp. semble tout de<br />
même plus limitée que dans l’écorce stérilisée, suggérant de nouveau un effet de compétition entre<br />
les différentes popu<strong>la</strong>tions microbiennes présentes dans l’écorce.<br />
On note également que, quelle que soit l’écorce (stérilisée ou non) les cellules sont en très grand<br />
nombre en entrée de colonne et qu’elles sont réparties de manière plus éparse au centre de <strong>la</strong><br />
colonne. La structure d’exo-polymères est absente du centre de <strong>la</strong> colonne et ne se retrouve que<br />
lorsque les cellules sont présentes en grand nombre.<br />
Ces observations permettent de conclure qu’une durée d’inocu<strong>la</strong>tion de 6 jours est nécessaire <strong>pour</strong><br />
une bonne colonisation de l’écorce par Pseudomonas ADP sp. D’autre part, l’écorce stérilisée semble<br />
présenter un avantage par rapport à l’écorce contenant <strong>la</strong> microflore indigène intacte, <strong>pour</strong> le<br />
développement d’un <strong>bio</strong>film de Pseudomonas ADP sp.<br />
V.2.2.2<br />
Influence du <strong>bio</strong>film sur l’hydrodynamique de <strong>la</strong> colonne<br />
L’influence du <strong>bio</strong>film de Pseudomonas ADP sp., observé plus haut, sur l’hydrodynamique des<br />
colonnes d’écorce de pin a été testée par injection du traceur KCl, comme décrit au § V.1.2.2., avant<br />
et après colonisation des colonnes. La Figure 48 (p.170) résume les différentes étapes de ces<br />
expériences.<br />
Seuls les résultats <strong>pour</strong> une inocu<strong>la</strong>tion avec Pseudomonas ADP sp. de 6 jours sont présentés<br />
Figure 59. L’inocu<strong>la</strong>tion de 2 jours n’a pas été retenue à cause d’une colonisation trop faible de<br />
l’écorce. Les caractéristiques des colonnes d’écorce sont présentées en ANNEXE 6.<br />
La Figure 59 montre que les courbes d’élution du KCl avant et après inocu<strong>la</strong>tion avec Pseudomonas<br />
ADP sp. se superposent quasiment : La présence de Pseudomonas ADP sp. ne modifie pas le<br />
comportement hydrodynamique de <strong>la</strong> colonne (écorce stérile ou non stérile). L’écoulement a lieu dans<br />
les deux cas (avec et sans Pseudomonas ADP sp.) sans retard (courbe symétrique) et de façon<br />
homogène dans <strong>la</strong> colonne, sans emprunter de chemins préférentiels. Aucun signe caractéristique de<br />
<strong>la</strong> présence de zones mortes n’est observé (pas de pics).<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
187
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Ecorce non stérile<br />
Ecorce stérile<br />
C/Co<br />
0,7<br />
0,6<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
Without Sans <strong>bio</strong>film<br />
Sans Biofilm<br />
With Avec Pseudo <strong>bio</strong>film Biofilm<br />
C/Co<br />
0,7<br />
0,6<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
Sans Without <strong>bio</strong>film<br />
Sans Biofilm<br />
With Avec <strong>bio</strong>film<br />
Pseudo Biofilm<br />
0,2<br />
0,2<br />
0,1<br />
0<br />
0 1 2 3 4<br />
V/Vo<br />
0,1<br />
0<br />
0 1 2 3 4<br />
V/Vo<br />
Figure 59 : Courbe d’élution de KCl <strong>pour</strong> les colonnes d’écorce de pin stérile (gauche) ou non stérile<br />
(droite), avant (ronds) et après (carrés) circu<strong>la</strong>tion pendant 6 jours d’une culture de Pseudomonas ADP<br />
sp. ; 20 ± 2°C ; débit 1,0 mL.min -1 ; temps de contact 20 min<br />
V.2.2.3<br />
Traitement <strong>combiné</strong> en colonne<br />
Le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> « Adsorption + Biodégradation » a été testé sur les colonnes d’écorce de pin<br />
stérile ou non stérile, après inocu<strong>la</strong>tion de Pseudomonas ADP sp. pendant 6 jours, défini comme<br />
temps suffisant <strong>pour</strong> une bonne colonisation du support, selon les résultats obtenus au § V.2.2.1.<br />
Deux débits de circu<strong>la</strong>tion de <strong>la</strong> solution en atrazine ont été testés :<br />
1 mL.min -1 et 0,3 mL.min -1 , correspondant respectivement à des temps de contact d’environ 22 et<br />
100 minutes. Deux concentrations entrantes en atrazine ont également été testées : 0,2 mg.L -1 et<br />
2,34 µg.L -1 . La Figure 49 (p.172) résume les différentes étapes du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> testé cidessous.<br />
La photo illustre le montage expérimentale utilisé <strong>pour</strong> ces essais.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
188
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
Figure 60 : Montage expérimentale <strong>pour</strong> les essais d’adsorption en colonne composé d’une étuve<br />
climatisée à 20±2°C , d’un multianalyseur (pH, conductivité) ; de deux pompes peristaltiques et d’un<br />
collecteur de fractions<br />
La Figure 61 présente les courbes d’élution d’une solution d’atrazine à 0,2 mg.L -1 , injectée à un débit<br />
de 1 mL.min -1 , à travers les colonnes d’écorce préa<strong>la</strong>blement stérilisée ou non.<br />
Lors du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> (colonne inoculée avec Pseudomonas ADP sp.) <strong>la</strong> courbe d’élution<br />
exprimée par C/C 0 en fonction de V/V 0 (V 0 étant le volume d’eau dans <strong>la</strong> colonne ou volume de pore)<br />
tend plus lentement vers <strong>la</strong> saturation (C/C 0 =1) que lors d’une simple adsorption sans Pseudomonas<br />
ADP sp. Dans les colonne d’écorce stérilisée, <strong>la</strong> quantité d’atrazine retenue et/ou dégradée après une<br />
injection de 350 V 0 (calculée par <strong>la</strong> surface au dessus de <strong>la</strong> courbe) représente 0,070 mg par gramme<br />
d’écorce par « <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> » contre 0,046 mg.g -1 lorsque <strong>la</strong> colonne n’est pas inoculée avec<br />
Pseudomonas ADP sp. et que seule l’adsorption intervient dans le <strong>traitement</strong>. Les résultats sont<br />
résumés dans le Tableau 19 p.192).<br />
Des résultats simi<strong>la</strong>ires sont obtenus <strong>pour</strong> l’écorce non stérilisée : <strong>la</strong> quantité d’atrazine traitée est de<br />
0,041 mg.g -1 et 0,050 mg.g -1 <strong>pour</strong> les colonnes non inoculées et inoculées respectivement avec<br />
Pseudomonas ADP sp.. Ces résultats sont cohérents avec ceux obtenus en batch ; <strong>pour</strong> une<br />
concentration à l’équilibre C e = 0,2 mg.L -1 , <strong>la</strong> quantité d’atrazine retenue par l’écorce q e était de<br />
0,04 mg.g -1 (Figure 15 p.106) <strong>pour</strong> un ratio liquide/solide de 10 mL.g -1 . On note cependant que<br />
l’efficacité des colonnes d’écorce stérilisée est légèrement meilleure que celle des colonnes contenant<br />
l’écorce non stérilisée. Ce phénomène peut être expliqué d’une part par l’adsorption de l’atrazine sur<br />
l’écorce et d’autre part, par sa <strong>bio</strong>dégradation par Pseudomonas ADP sp. En effet, dans les essais en<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
189
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
batch nous avons pu mettre en évidence une légère différence entre à <strong>la</strong> capacité d’adsorption de<br />
l’atrazine sur l’écorce stérilisée et celle sur l’écorce non stérilisée :<br />
L’écorce stérilisée présente des coefficients d’adsorption <strong>pour</strong> l’atrazine légèrement supérieurs à ceux<br />
obtenus avec l’écorce non stérilisée. D’autre part, nous avons à plusieurs reprises évoqué des<br />
phénomènes de compétition entre Pseudomonas ADP sp. et <strong>la</strong> microflore indigène de l’écorce,<br />
pouvant également justifier de cette différence d’efficacité observée entre le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> avec<br />
l’écorce stérilisée et celui utilisant l’écorce non stérilisée.<br />
Ecorce non stérile<br />
Ecorce non stérilisée<br />
Ecorce stérile<br />
Ecorce stérilisée<br />
1,0<br />
1,0<br />
0,9<br />
0,9<br />
0,8<br />
0,8<br />
0,7<br />
0,7<br />
0,6<br />
0,6<br />
C/Co<br />
0,5<br />
0,4<br />
C/Co<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
Adsorption<br />
Traitement <strong>combiné</strong><br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
Adsorption<br />
Traitement <strong>combiné</strong><br />
0,0<br />
0 50 100 150 200 250 300 350 400<br />
V/Vo<br />
0,0<br />
0 50 100 150 200 250 300 350<br />
V/Vo<br />
Figure 61 : Courbe d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 0,2 mg.L -1 ) traversant une<br />
colonne d’écorce de pin non stérilisée (à gauche) ou d’écorce stérilisée (à droite) inoculée (<strong>traitement</strong><br />
<strong>combiné</strong>) ou non (adsorption) avec Pseudomonas ADP sp. pendant les 6 jours précédant le <strong>traitement</strong>. 20<br />
± 2°C ; débit 1 ml.min -1 ; temps de contact 22 min<br />
Suite à ces essais, le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> a été testé uniquement sur des colonnes d’écorce de pin<br />
préa<strong>la</strong>blement stérilisée. D’autre part, <strong>pour</strong> améliorer l’efficacité du <strong>traitement</strong>, le débit de circu<strong>la</strong>tion<br />
de <strong>la</strong> solution en atrazine a été diminué afin d’augmenter le temps de séjour de l’atrazine dans les<br />
colonnes. Un temps de séjour plus long dans les colonnes <strong>pour</strong>ra éventuellement permettre une<br />
meilleure <strong>bio</strong>dégradation de celle-ci par Pseudomonas ADP sp. et/ou une meilleure adsorption sur le<br />
support écorce/<strong>bio</strong>film. Nous avons vu plus haut que <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine avait lieu<br />
majoritairement dans les premières heures de contact avec Pseudomonas ADP sp. (voir par exemple,<br />
Figure 37 p.144).<br />
Les Figure 62 et Figure 63 présentent les courbes d’élution obtenues <strong>pour</strong> un débit de circu<strong>la</strong>tion de<br />
0,3 ml.min -1 (temps de contact environ 100 minutes) de solutions entrantes à 2,34 µg.L -1 ou<br />
0,2 mg. L -1 d’atrazine respectivement, traversant les colonnes d’écorce de pin stérilisée préa<strong>la</strong>blement<br />
colonisées ou non par Pseudomonas ADP sp. pendant les 6 jours précédant le <strong>traitement</strong>.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
190
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
[Atrazine]i = 2.34 µg.L -1<br />
C/Co<br />
1,0<br />
0,9<br />
0,8<br />
0,7<br />
0,6<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
0,0<br />
Adsorption<br />
Traitement <strong>combiné</strong><br />
0 50 100 150 200<br />
V/Vo<br />
Figure 62 : Courbes d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 2,34 µg.L -1 ) traversant une<br />
colonne d’écorce de pin stérile inoculée (<strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong>) ou non (adsorption) avec Pseudomonas<br />
ADP sp. pendant les 6 jours précédant le <strong>traitement</strong>. 20 ± 2°C ; débit 0,3 ml.min -1 ; temps de contact<br />
100 min<br />
[Atrazine]i= 0,2 mg.L-1<br />
1,0<br />
0,9<br />
0,8<br />
0,7<br />
C/C0<br />
0,6<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
0,0<br />
Adsorption<br />
Traitement <strong>combiné</strong><br />
0 50 100 150 200<br />
V/V0<br />
Figure 63 : Courbes d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 0,2 mg.L -1 ) traversant une<br />
colonne d’écorce de pin stérile inoculée (<strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong>) ou non (adsorption) avec Pseudomonas<br />
ADP sp. pendant les 6 jours précédant le <strong>traitement</strong>. 20 ± 2°C ; débit 0,3 ml.min -1 ; temps de contact<br />
100 min<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
191
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
La variabilité des résultats obtenus à faible concentration en atrazine (Figure 62) est due à l’utilisation<br />
de kit de dosage immunologique permettant de travailler à très petite concentration mais parfois peu<br />
précis dans cette gamme de concentrations (dosage colorimétrique).<br />
D’autre part, <strong>la</strong> Figure 63 présente une chute brutale de <strong>la</strong> concentration en atrazine en sortie de<br />
colonne au temps t=120h environ. Cette chute provoquée par un problème technique a impliqué <strong>la</strong><br />
stagnation de <strong>la</strong> solution d’atrazine dans <strong>la</strong> colonne pendant plusieurs heures. Cette observation<br />
montre qu’avec un temps de contact plus long que celui imposé par un débit de 0,3 mL.min -1 (soit<br />
100 minutes environ), <strong>la</strong> concentration en atrazine chute et donc que <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation peut avoir lieu<br />
de façon plus importante. Le temps de séjour dans les colonnes serait donc insuffisant <strong>pour</strong> une<br />
bonne <strong>bio</strong>dégradation.<br />
Le Tableau 19 résume les résultats obtenus <strong>pour</strong> les différents <strong>traitement</strong>s appliqués (différents<br />
débits, différentes concentrations initiales en atrazine, avec ou sans Pseudomonas ADP sp.) et<br />
permet d’évaluer l’éfficacité du <strong>traitement</strong> selon les différents paramètres d’étude choisis.<br />
Tableau 19 : Quantité d’atrazine retenue ou dégradée par gramme d’écorce par circu<strong>la</strong>tion des solutions<br />
polluées à 0,2 mg.L -1 ou 3 µg.L -1 à des débits de 1 ou 0,3 ml.min -1 dans des colonnes d’écorce de pin<br />
stérilisée, ayant ou non été colonisées par Pseudomonas ADP sp.<br />
Débit = 1 ml.min -1 Débit = 0,3 ml.min -1<br />
[Atrazine]= 0,2 mg.L -1 [Atrazine]= 3 µg.L -1 [Atrazine]= 0,2 mg.L -1 [Atrazine]= 3 µg.L -1<br />
Sans Pseudo. 0,046 mg.g -1 ND 0,046 mg.g -1 0,348 µg.g -1<br />
Avec Pseudo. 0,07 mg.g -1 ND 0,087mg.g -1 0,65 µg.g -1<br />
Lorsque Pseudomonas ADP sp. n’est pas inoculée dans les colonnes d’écorce de pin, l’efficacité du<br />
<strong>traitement</strong> est équivalente <strong>pour</strong> les débits de 1 mL.min -1 ou 0,3 mL.min -1 . L’augmentation du temps de<br />
séjour dans les colonnes (multiplié par 3) n’augmente pas l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce. En<br />
effet, les essais en batch ont montré que l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin était un<br />
phénomène quasi instantané (Figure 11, p.102) ; l’atrazine est majoritairement adsorbée lors des<br />
premières minutes de contact avec l’écorce.<br />
Lorsque les colonnes sont colonisées par Pseudomonas ADP sp., <strong>la</strong> présence du <strong>bio</strong>film améliore de<br />
50% <strong>la</strong> quantité d’atrazine éliminée de <strong>la</strong> solution par rapport aux colonnes non inoculées, lorsque <strong>la</strong><br />
concentration en atrazine de <strong>la</strong> solution à traiter est de 0,2 mg.L -1 <strong>pour</strong> un débit de 1 ml.min -1 .<br />
A faible débit (0,3 mL.min -1 ), <strong>la</strong> présence de Pseudomonas ADP sp. permet de doubler <strong>la</strong> masse<br />
d’atrazine éliminée, que ce soit <strong>pour</strong> une concentration entrante de 0,2 mg.L -1 ou 2,34 µg.L -1 .<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
192
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
La diminution du débit de 1 à 0,3 mL.min -1 , rend également le procédé de <strong>bio</strong>filtration plus efficace<br />
(+ 25 % d’atrazine éliminée à 0,3 mL.min -1 par rapport au débit de 1 mL.min -1 ), contrairement à ce qui<br />
a été observé plus haut dans les colonnes non inoculées. L’augmentation du temps de séjour permet<br />
donc d’obtenir un meilleur taux de <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine.<br />
Les études en batch (Figure 50, Figure 51, p.174) ont montré que <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine avait<br />
lieu majoritairement au cours des 15 premières heures. Il <strong>pour</strong>rait donc être intéressant de répéter ces<br />
expériences soit avec des débits plus faibles, afin d’atteindre des temps de séjour de plusieurs heures<br />
dans <strong>la</strong> colonne (alors, <strong>la</strong> diminution du débit <strong>pour</strong>rait entraîner des problèmes d’oxygénation ou<br />
d’apport en nutriments pouvant devenir limitant <strong>pour</strong> les micro-organismes) soit par recircu<strong>la</strong>tion de <strong>la</strong><br />
solution à traiter, ce qui augmenterait le temps de séjour de l’atrazine sans poser de problème<br />
d’aération des colonnes. Dans le cas de l’utilisation de débit plus faible, l’utilisation de colonnes<br />
aérées, type Airlift <strong>pour</strong>rait être <strong>la</strong> solution au problème d’oxygénation des bactéries.<br />
Les analyses de carbone organique dissous (COD) effectuées tout au long de ces expériences ont<br />
montré des concentrations toujours inférieures à 1g.L -1 , soit une charge organique acceptable <strong>pour</strong><br />
être rejetée dans le milieu naturel. De plus, ces analyses ont montré que cette concentration en COD<br />
en sortie de colonne variait très peu au cours du temps. L’activité <strong>bio</strong>logique (consommation de <strong>la</strong><br />
matière organique de l’écorce) à l’intérieur de <strong>la</strong> colonne <strong>pour</strong>rait être responsable du transfert de<br />
composés de l’écorce e solution et donc de <strong>la</strong> stabilité de <strong>la</strong> concentration en COD en sortie de<br />
colonne (équilibre entre consommation de <strong>la</strong> matière organique et dissolution de celle-ci dans <strong>la</strong><br />
phase aqueuse circu<strong>la</strong>nte).<br />
Si on calcule le volume d’élution par gramme d’écorce <strong>pour</strong> lequel on obtient en sortie de colonne <strong>la</strong><br />
concentration en atrazine maximale autorisée (soit 0,1 µg.L -1 ), on voit que <strong>pour</strong> traiter une eau<br />
naturelle polluée à 2,34 µg.L -1 cette concentration maximale est atteinte <strong>pour</strong> un volume d’environ<br />
40 ml <strong>pour</strong> 1 gramme d’écorce (débit de 0,3 ml.min -1 ) avec ou sans Pseudomonas ADP sp. Il faudrait<br />
donc 25 kg d’écorce <strong>pour</strong> traiter 1m 3 de cette eau, ce qui représente une masse considérable.<br />
L’efficacité du <strong>traitement</strong> étudié reste donc limitée par rapport à un <strong>traitement</strong> c<strong>la</strong>ssique sur charbon<br />
actif puisque <strong>la</strong> capacité d’adsorption de l’atrazine sur un charbon actif en poudre est d’environ de 10<br />
à 30 g.m -3 <strong>pour</strong> une concentration en atrazine de 0,1 µg.L -1 , et utilise donc environ 1000 fois moins<br />
d’adsorbant qu’un <strong>traitement</strong> sur écorce de pin (Detoc, 1998).<br />
Dans le cas du <strong>traitement</strong> d’une solution polluée à environ 0,2 mg.L -1 , correspondant à une forte<br />
pollution (eaux provenant de <strong>la</strong>vage de cuve contenant des pesticides, eaux accidentellement émises<br />
par une usine de production ou issues d’une mauvaise utilisation ou d’un mauvais stockage), on<br />
observe un taux d’abattement de 60% après circu<strong>la</strong>tion d’environ 3 litres de solution lorsque <strong>la</strong><br />
colonne ne contient pas Pseudomonas ADP sp. contre 6 litres lorsque <strong>la</strong> colonne a été inoculée avec<br />
Pseudomonas ADP sp. L’efficacité du <strong>traitement</strong> est doublée lorsque adsorption et <strong>bio</strong>dégradation<br />
sont <strong>combiné</strong>. La capacité de l’écorce <strong>pour</strong> abattre 60% de l’atrazine initialement présente à<br />
0,2 mg.L - 1 est 1500 g.m -3 . On <strong>pour</strong>rait donc imaginer mettre en œuvre ce procédé de <strong>traitement</strong> dans<br />
193<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
le cadre d’une pollution ponctuelle, avec des quantités d’eau à traiter de quelques dizaines de mètres<br />
cube.<br />
Le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> <strong>pour</strong>rait dans ces conditions être utilisé comme un pré-<strong>traitement</strong> <strong>pour</strong> abattre<br />
<strong>la</strong> majeure partie de <strong>la</strong> pollution, avant d’être envoyée dans une filière de <strong>traitement</strong> c<strong>la</strong>ssique, en tête<br />
de station d’épuration ou de subir un <strong>traitement</strong> final sur charbon actif.<br />
V.2.2.4<br />
Conclusions<br />
Les résultats obtenus lors de l’étude du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> en colonne montrent qu’un temps<br />
d’inocu<strong>la</strong>tion de 6 jours est nécessaire <strong>pour</strong> coloniser <strong>la</strong> colonne d’écorce de pin avec<br />
Pseudomonas ADP sp., avant qu’elle ne soit utilisée comme <strong>bio</strong>filtre.<br />
D’autre part, <strong>la</strong> présence de <strong>la</strong> microflore de l’écorce de pin diminue faiblement <strong>la</strong> colonisation par<br />
Pseudomonas ADP sp. suggérant à nouveau l’existence d’une faible compétition entre cette flore<br />
indigène et Pseudomonas ADP sp. <strong>pour</strong> les nutriments à leur disposition.<br />
Lorsque le <strong>bio</strong>film est établi, celui-ci ne modifie pas le comportement hydrodynamique des colonnes<br />
d’écorce de pin.<br />
D’une manière générale, les quantités d’atrazine éliminées par le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> ne sont pas très<br />
importantes. On note cependant que <strong>la</strong> présence de Pseudomonas ADP sp. dans les colonnes<br />
améliore de 50 à 100 % l’efficacité du <strong>traitement</strong> par rapport au procédé d’adsorption seul. On note<br />
également que <strong>la</strong> diminution du débit de circu<strong>la</strong>tion de <strong>la</strong> solution polluée dans les colonnes (de 1 à<br />
0,3 ml.min -1 ), soit l’augmentation du temps de séjour de l’atrazine dans les colonnes augmente<br />
significativement le taux de <strong>bio</strong>dégradation de celle-ci.<br />
Globalement, les conditions testées dans ces essais n’ont pas été favorables à <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation. Il<br />
<strong>pour</strong>rait donc être intéressant d’optimiser ces conditions (diminution du débit circu<strong>la</strong>tion de <strong>la</strong> solution<br />
polluée ou recircu<strong>la</strong>tion de <strong>la</strong> solution afin d’augmenter le temps de contact entre atrazine et écorce)<br />
afin de provoquer <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de manière plus efficace. D’autre part, <strong>la</strong> connaissance de <strong>la</strong><br />
densité cellu<strong>la</strong>ire à l’intérieur des colonnes permettrait d’accéder aux valeurs de taux de croissance et<br />
de déterminer des vitesses de dégradation de l’atrazine dans les colonnes. En connaissant les<br />
vitesses de dégradation, un débit optimal (ou temps de séjour) <strong>pour</strong>rait être calculé <strong>pour</strong> traiter de<br />
façon optimisée l’eau polluée.<br />
Ces essais ont montré que le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> était d’une manière générale inexploitable <strong>pour</strong><br />
traiter des eaux contenant de faibles concentrations en atrazine. Cette méthode utiliserait des<br />
quantités considérables d’écorce de pin. Le <strong>traitement</strong> sur charbon actif (inoculé ou non) est dans ce<br />
cas beaucoup plus efficace et plus adapté malgré un coût supérieur du support d’adsorption.<br />
194<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
En revanche, dans le cas d’une forte pollution ponctuelle en atrazine, le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> sur<br />
écorce de pin inoculée peut être envisagé en tant que pré-<strong>traitement</strong>. L’eau serait ainsi<br />
débarrassée de <strong>la</strong> majeure partie de sa charge polluante avant d’être envoyée dans les filières de<br />
<strong>traitement</strong> c<strong>la</strong>ssique. Ainsi, on peut imaginer qu’un agriculteur <strong>la</strong>vant ses cuves de pesticides ou un<br />
producteur d’atrazine <strong>pour</strong>rait, sur site, être équipé de colonne ou de <strong>bio</strong>réacteur individuel <strong>pour</strong> traiter<br />
ses eaux fortement concentrées en atrazine, afin d’éliminer <strong>la</strong> plus grosse partie de <strong>la</strong> pollution. Cette<br />
solution est d’ailleurs en accord avec <strong>la</strong> politique actuelle qui tend à responsabiliser de plus en plus<br />
les pollueurs.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
195
RESULTATS ET DISCUSSION<br />
<strong>Etude</strong> du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong><br />
196<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
CONCLUSION GENERALE<br />
CONCLUSION GENERALE ET<br />
PERSPECTIVES<br />
A l’heure où les pays industrialisés sont conscients de <strong>la</strong> nécessité impérative de protection de <strong>la</strong><br />
qualité de l’environnement, de plus en plus de travaux sont mis en œuvre <strong>pour</strong> trouver, dans tous les<br />
domaines et des solutions économiquement, socialement et environnementalement sont proposées.<br />
Notre étude s’inscrit dans ce contexte de gestion durable de l’environnement, d’une part parce qu’elle<br />
prétend dépolluer des eaux contaminées par un pesticide et d’autre part parce qu’elle permet de<br />
valoriser un déchet abondement disponible dans les pays comme <strong>la</strong> France ou le Portugal.<br />
L’utilisation de l’écorce de pin <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> de l’eau permettrait d’économiser de l’énergie<br />
(consommée par exemple <strong>pour</strong> <strong>la</strong> fabrication de charbon actif) et des matières premières, que l’on se<br />
doit de protéger si l’on veut préserver notre p<strong>la</strong>nète. D’autre part, <strong>la</strong> connaissance et l’isolement de<br />
nombreux micro-organismes <strong>pour</strong> leur capacité à consommer les polluants permet aujourd’hui<br />
d’éliminer totalement un composé par minéralisation (soit transformation en CO 2 et H 2 O). Le polluant<br />
n’est plus stocké (pollution concentrée et dép<strong>la</strong>cée) ou incinéré (impliquant une éventuelle pollution de<br />
l’air par combustion) il peut être littéralement éliminé par ce type de <strong>traitement</strong> <strong>bio</strong>logique.<br />
Cette étude a engendré un grand nombre de travaux concernant séparément l’adsorption et <strong>la</strong><br />
<strong>bio</strong>dégradation avant de pouvoir mener à bien les essais concernant le <strong>traitement</strong> lui-même,<br />
combinant adsorption et <strong>bio</strong>dégradation. Ces essais ont permis d’étudier <strong>la</strong> faisabilité de ce <strong>traitement</strong><br />
<strong>combiné</strong> sur écorce de pin avec Pseudomonas ADP sp. Elles ont notamment servi à fixer certains<br />
paramètres d’études appliqués ensuite au <strong>traitement</strong> désiré.<br />
Nos études ont montré que :<br />
l’écorce de pin possédait une capacité d’adsorption très limitée par rapport à un charbon actif<br />
(couramment utilisé <strong>pour</strong> l’élimination de micro-polluants présents dans les eaux). Cependant,<br />
de par sa faible capacité adsorbante vis à vis de l’atrazine et dans le cadre d’une <strong>bio</strong>filtration,<br />
l’écorce présente l’avantage de rendre le polluant plus disponible <strong>pour</strong> les micro-organismes<br />
impliqués dans le <strong>traitement</strong>.<br />
L’écorce a de plus, l’avantage d’être peu onéreuse puisque qu’il est un déchet de l’industrie du<br />
bois, et disponible.<br />
Pseudomonas ADP sp. est capable de survivre et de minéraliser l’atrazine en présence<br />
d’écorce de pin en poudre, supportant le pH imposé par <strong>la</strong> présence de celle-ci en solution<br />
196<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
CONCLUSION GENERALE<br />
aqueuse (pH 4-5) et même d’utiliser les composés organiques solubles de l’écorce comme<br />
source de carbone <strong>pour</strong> son propre métabolisme. D’autre part, Pseudomonas ADP sp. peut<br />
se développer à <strong>la</strong> surface de l’écorce, et former un <strong>bio</strong>film conséquent <strong>pour</strong> une application<br />
en <strong>bio</strong>filtration.<br />
La présence dans l’écorce d’une concentration très faible d’azote favorise <strong>la</strong> minéralisation de<br />
l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. capable d’utiliser cette dernière comme source d’azote.<br />
La microflore indigène de l’écorce de pin a une faible influence sur Pseudomonas ADP sp. (en<br />
terme de croissance ou de capacité à minéraliser l’atrazine), les phénomènes de compétition<br />
étant <strong>la</strong> plupart du temps négligeables. Lorsque l’atrazine est présente à une forte<br />
concentration dans <strong>la</strong> solution à traiter (quelques mg.L -1 ), <strong>la</strong> présence de cette flore indigène<br />
améliore même <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine.<br />
En terme d’application, les travaux ont permis de faire des choix (qualité de l’écorce en poudre fine,<br />
<strong>traitement</strong>s éventuels à réaliser avant utilisation (stérilisation de l’écorce ou non), etc.), et d’envisager<br />
le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong>, sous forme d’essais en batch ou de <strong>bio</strong>filtration en colonne. Ces études ont<br />
notamment montré que ce procédé pouvait être mis en oeuvre de façon simple et rustique notamment<br />
par le fait des exigences très réduites de <strong>la</strong> souche bactérienne utilisée : pas de nécessité d’un apport<br />
de source de carbone supplémentaire, possibilité de travailler à des températures basses (12°C)<br />
pouvant correspondre à <strong>la</strong> température d’une eau à traiter (pas de chauffage nécessaire), pas de<br />
nécessité non plus de tamponner <strong>la</strong> solution à traiter. Pseudomonas ADP sp. s’adapte à ces<br />
conditions environnementales contraignantes sans que sa capacité à minéraliser l’atrazine ne soit trop<br />
fortement affectée.<br />
L’étude du <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> a montré que, dans tous les cas, <strong>la</strong> présence de Pseudomonas ADP<br />
sp. améliorait le taux d’abattement de l’atrazine dans l’eau, présente aussi bien à faible (quelques<br />
µg.L -1 ) qu’à forte concentration (quelques mg.L -1 ) initiale.<br />
Les essais en batch permettent de conclure qu’en 4 jours environ, 50 % de l’atrazine peut être<br />
minéralisée (faible ou forte concentration initiale en atrazine) ; les 50 autres % étant adsorbés sur<br />
l’écorce de manière irréversible à 95% et donc non disponibles <strong>pour</strong> les bactéries.<br />
Les expériences de <strong>bio</strong>filtration en colonne ont montré que le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> était difficilement<br />
envisageable <strong>pour</strong> traiter des eaux contenant de faibles concentrations en atrazine. Cette méthode<br />
utiliserait des quantités considérables d’écorce de pin.<br />
En revanche, dans le cas d’une forte pollution ponctuelle en atrazine, touchant un volume réduit<br />
d’eau, le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> sur écorce de pin inoculée <strong>pour</strong>rait être envisagé après optimisation en<br />
tant que pré-<strong>traitement</strong> <strong>pour</strong> débarrasser l’eau polluée de <strong>la</strong> majeure partie de sa charge polluante<br />
avant d’être envoyée dans les filières de <strong>traitement</strong>s c<strong>la</strong>ssiques.<br />
197<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
CONCLUSION GENERALE<br />
Le <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> par <strong>bio</strong>filtration sur écorce de pin en présence de Pseudomonas ADP sp.<br />
<strong>pour</strong>rait être exploité sur site chez les agriculteurs, sous forme de <strong>bio</strong>réacteur mobile, ou directement<br />
sur les usines de productions de pesticides.<br />
Des études restent à mener avant d’envisager l’utilisation de ce <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> sur site. Elles<br />
concernent notamment le devenir de l’écorce après son utilisation dans le <strong>traitement</strong>. Des tests ecotoxicologiques<br />
seraient souhaitables afin de définir l’évolution de ce déchet et sa compatibilité avec<br />
une mise en décharge, une incinération ou une éventuelle valorisation. D’autre part une optimisation<br />
du <strong>traitement</strong> <strong>pour</strong>rait être envisagée, principalement par re-circu<strong>la</strong>tion de <strong>la</strong> solution, permettant<br />
l’augmentation du temps de séjour de l’atrazine dans les <strong>bio</strong>filtres et donc l’augmentation de <strong>la</strong><br />
<strong>bio</strong>dégradation par les micro-organismes.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
198
235<br />
235<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ANNEXE 1<br />
ANNEXE 1 : Spectre IR de l’écorce de pin en poudre - Identification<br />
des fonctions de surface<br />
C=C aromatique<br />
C=N cyclique<br />
C=O<br />
C=C phenyl conjugué<br />
(CH=CH 2 )<br />
(CH 2 ), (CH)<br />
proche d’un OH<br />
C=O Aldéhyde<br />
ou acide saturé aliphatique<br />
ou substitution sur noyau<br />
aromatique<br />
Phénol<br />
Noyau aromatique<br />
substitué<br />
- OH alcool ou phénol<br />
lié, intermolecu<strong>la</strong>ire<br />
- NH 2 primaire ou<br />
amine secondaire<br />
Le spectre est présenté en détail à <strong>la</strong> page suivante.<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
200
ANNEXE 2<br />
ANNEXE 2 : Observation au MEB d’écorce de pin et de charbon<br />
actif en poudre<br />
Figure 1 : Observation de <strong>la</strong> structure de surface du charbon actif (à gauche) et de l’écorce de pin (à<br />
droite (échelle 100 µm)<br />
Figure 2 : Fibre de charbon actif (à gauche) et d’écorce de pin (à droite)<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
201
ANNEXE 2<br />
Figure 3 : Observation de <strong>la</strong> structure longitudinale interne de particules d’écorce de pin<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
202
ANNEXE 3<br />
ANNEXE 3 : Caractéristiques des colonnes - <strong>Etude</strong> hydrodynamique<br />
Colonne d’écorce non stérile :<br />
Paramètres colonne Symbole Unité<br />
Diamètre interne d 2,50 cm<br />
Section S 4,91 cm 2<br />
Hauteur du lit L 6,70 cm<br />
Masse de milieu poreux m 9,60 g<br />
Volume du lit V t 32,87 cm 3<br />
Volume de pore V e ou V 0 19,70 cm 3<br />
Indice de vide e (V e /V s ) 11,60<br />
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,60<br />
Flux D 59,40 cm 3 .h -1<br />
Vitesse de Darcy q (D/S) 12,11 cm.h -1<br />
Vitesse de pore V (q/ ε) 20,20 cm.h -1<br />
Colonne d’écorce de pin stérile :<br />
Paramètres colonne Symbole Unité<br />
Diamètre interne d 2,50 cm<br />
Section S 4,91 cm 2<br />
Hauteur du lit L 7,00 cm<br />
Masse de milieu poreux m 10,00 g<br />
Volume du lit V t 34,37 cm 3<br />
Volume de pore V e ou V 0 21,00 cm 3<br />
Indice de vide e (V e /V s ) 11,67<br />
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,61<br />
Flux D 64,80 cm 3 .h -1<br />
Vitesse de Darcy q (D/S) 13,20 cm.h -1<br />
Vitesse de pore V (q/ ε) 21,60 cm.h -1<br />
Colonne de charbon actif :<br />
Paramètres colonne Symbole Unité<br />
Diamètre interne d 2,50 cm<br />
Section S 4,91 cm 2<br />
Hauteur du lit L 5,00 cm<br />
Masse de milieu poreux m 9,90 g<br />
Volume du lit V t 24,53 cm 3<br />
Volume de pore V e ou V 0 21,20 cm 3<br />
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,86<br />
Flux D 60,00 cm 3 .h -1<br />
Vitesse de Darcy q (D/S) 12,23 cm.h -1<br />
Vitesse de pore V (q/ ε) 14,15 cm.h -1<br />
203<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004
ANNEXE 4<br />
ANNEXE 4 : Caractéristiques des colonnes - Adsorption de<br />
l’atrazine en conditions a<strong>bio</strong>tiques<br />
Colonne d’écorce non stérile :<br />
Paramètres colonne Symbole Unité<br />
Diamètre interne d 2,50 cm<br />
Section S 4,91 cm 2<br />
Hauteur du lit L 7,00 cm<br />
Masse de milieu poreux m 10,00 g<br />
Volume du lit V t 34,37 cm 3<br />
Volume de pore V e ou V 0 25,00 cm 3<br />
Indice de vide e (V e /V s ) 13,90<br />
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,73<br />
Flux D 58,20 cm 3 .h -1<br />
Vitesse de Darcy q (D/S) 11,83 cm.h -1<br />
Vitesse de pore V (q/ ε) 16,20 cm.h -1<br />
Colonne d’écorce de pin stérile :<br />
Paramètres colonne Symbole Unité<br />
Diamètre interne d 2,50 cm<br />
Section S 4,91 cm 2<br />
Hauteur du lit L 7,00 cm<br />
Masse de milieu poreux m 10,00 g<br />
Volume du lit V t 34,37 cm 3<br />
Volume de pore V e ou V 0 18,00 cm 3<br />
Indice de vide e (V e /V s ) 10,00<br />
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,52<br />
Flux D 58,20 cm 3 .h -1<br />
Vitesse de Darcy q (D/S) 11,85 cm.h -1<br />
Vitesse de pore V (q/ ε) 22,79cm.h -1<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
204
ANNEXE 5<br />
ANNEXE 5 : Observation au MEB de Pseudomonas ADP sp. en<br />
colonne d’écorce de pin<br />
I. Circu<strong>la</strong>tion d’une culture de Pseudomonas ADP sp. 2 jours<br />
I.1 Ecorce préa<strong>la</strong>blement stérilisée<br />
Entrée de colonne<br />
I.2 Ecorce non stérilisée<br />
Fi<strong>la</strong>ment mycélien<br />
Grosses cellules<br />
Entrée de colonne<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
205
ANNEXE 5<br />
Fi<strong>la</strong>ment mycélien<br />
Milieu de colonne<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
206
ANNEXE 5<br />
II. Circu<strong>la</strong>tion d’une culture de Pseudomonas ADP sp. 6 jours<br />
II.1<br />
Ecorce stérile<br />
II.1.1 Entrée de colonne<br />
Structure spongieuse<br />
sous-jacente<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
207
ANNEXE 5<br />
II.1.2 Milieu de colonne<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
208
ANNEXE 5<br />
II.2 Ecroce non stérile<br />
II.2.1 Entrée de colonne<br />
Structure spongieuse Fi<strong>la</strong>ment mycélien Grosses cellules<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
209
ANNEXE 5<br />
II.2.2 Milieu de colonne<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
210
ANNEXE 6<br />
ANNEXE 6 : Caractéristiques des colonnes - Influence d’un <strong>bio</strong>film<br />
sur l’hydrodynamique des colonnes<br />
Colonne d’écorce non stérile :<br />
Paramètres colonne Symbole Unité<br />
Diamètre interne d 2,50 cm<br />
Section S 4,91 cm 2<br />
Hauteur du lit L 5,3 cm<br />
Masse de milieu poreux m 10,10 g<br />
Volume du lit V t 26,03 cm 3<br />
Volume de pore V e ou V 0 18,20 cm 3<br />
Indice de vide e (V e /V s ) 9,29<br />
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,70<br />
Flux D 58,20 cm 3 .h -1<br />
Vitesse de Darcy q (D/S) 11,83 cm.h -1<br />
Vitesse de pore V (q/ ε) 16,90 cm.h -1<br />
Colonne d’écorce de pin stérile :<br />
Paramètres colonne Symbole Unité<br />
Diamètre interne d 2,50 cm<br />
Section S 4,91 cm 2<br />
Hauteur du lit L 6,00 cm<br />
Masse de milieu poreux m 9,60 g<br />
Volume du lit V t 29,46 cm 3<br />
Volume de pore V e ou V 0 19,50 cm 3<br />
Indice de vide e (V e /V s ) 11,47<br />
Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (V e/ V t ) 0,66<br />
Flux D 58,20 cm 3 .h -1<br />
Vitesse de Darcy q (D/S) 11,85 cm.h -1<br />
Vitesse de pore V (q/ ε) 17,95 cm.h -1<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
211
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LISTE DES FIGURES<br />
<strong>Etude</strong> Bibliographique<br />
Figure 1 : Comportement des pesticides dans les sols ........................................................................ 16<br />
Figure 2 : Evolution de <strong>la</strong> capacité d’adsorption de l’atrazine sur les acides humiques (AH) (0,4 g/L) en<br />
fonction du pH, d’après Wang et al. (1991) ................................................................................... 20<br />
Figure 3 : Exemple de mécanisme de dégradation <strong>bio</strong>logique et <strong>chimique</strong> de l’atrazine, d’après<br />
Giardini et al., 1985........................................................................................................................ 26<br />
Figure 4 : Différentes voies de dégradation de l’atrazine par ozonation selon Acero et al. (2000)...... 33<br />
Figure 5 : Echange d’ions entre <strong>la</strong> procyanidine (tanin de l’écorce) et un ion métalique divalent<br />
(Vazquez et al. 2002)..................................................................................................................... 41<br />
Figure 6 : Exemple de dégradation de l’atrazine par une communauté bactérienne, selon Orstrofsky et<br />
al. (2002)........................................................................................................................................ 45<br />
Figure 7 : Schéma du procédé de <strong>traitement</strong> imaginé par McKin<strong>la</strong>y et Kasperek (1997) .................... 46<br />
Figure 8 : Dégradation de l’atrazine au cours du temps avec 4 additions successives d’atrazine (6<br />
mg/l) dans le système de McKin<strong>la</strong>y et Kasperek (1999) <strong>pour</strong> les 4 macrophytes étudiés. ........... 47<br />
Figure 9 : Developpement idéal d’un <strong>bio</strong>film (Melo, 1997) ................................................................... 51<br />
Figure 10 : Les différentes étapes de formation d’un <strong>bio</strong>film (adapté de Melo, 1994) ......................... 52<br />
Figure 11 : Influence de <strong>la</strong> charge organique sur l’épaisseur du <strong>bio</strong>film (inspiré de Characklis 1990) 58<br />
Figure 12 : Effet de <strong>la</strong> vitesse de circu<strong>la</strong>tion sur <strong>la</strong> formation du <strong>bio</strong>film (inspiré de Pinheiro et al.,<br />
1988).............................................................................................................................................. 59<br />
Figure 13 : Mécanisme de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.selon Martinez et al.<br />
(2001)............................................................................................................................................. 67<br />
Figure 14 : Représentation des différentes phases d’un milieu poreux................................................ 74<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
227
<strong>Etude</strong> Expérimentale<br />
Figure 1 : Distribution de Pinus pinaster en Europe et en Afrique du Nord (Rato<strong>la</strong>, 2002)...................79<br />
Figure 2: Répartition des espèces forestière du Portugal (Inventaire National des forets – 3 ème édition,<br />
1998)...............................................................................................................................................79<br />
Figure 3 : Ecorce de pin Pinus pinaster .................................................................................................80<br />
Figure 4 : Ecorce brute de pin Pinus Pinaster .......................................................................................88<br />
Figure 5 : Formule développée de l’atrazine..........................................................................................90<br />
Figure 6 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en présence de MeOH (A) ou sans<br />
MeOH (B) ; diamètre des particules d’écorce :d
Figure 14 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine ([atrazine] i = 2,6 à 749 µg.L -1 ) sur l’écorce de pin en<br />
poudre (d
Figure 26 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM-glucosé à 1 g.L -1 ) avec<br />
atrazine (30 mg.L -1 ) additionnée au milieu à partir d’une solution mère concentrée dans le<br />
méthanol ou dissoute directement en poudre dans le milieu MM ; 30°C ; agitation 150 rpm ......125<br />
Figure 27 : Photo d’un <strong>bio</strong>mètre <strong>pour</strong> l’étude de <strong>la</strong> minéralisation de l’atrazine ..................................126<br />
Figure 28 : Représentation schématique d’un <strong>bio</strong>mètre utilisé dans les essais de minéralisation en<br />
« Batch ».......................................................................................................................................127<br />
Figure 29 : Influence de <strong>la</strong> température sur <strong>la</strong> croissance (A) de Pseudomonas ADP sp. et sa capacité<br />
à dégrader l’atrazine (B) en milieu minéral (MM), avec atrazine (environ 50 mg.L - 1) comme seule<br />
source d’azote et glucose (1 g.L -1 ) comme source de carbone ; agitation orbitale (150 rpm) ; pH 7133<br />
Figure 30 : Influence du pH sur <strong>la</strong> croissance de Pseudomonas ADP sp. (A) et sa capacité à dégrader<br />
l’atrazine (B) en milie minéral (MM) ; atrazine comme seule source d’azote (environ 15 mg.L -1 ) ;<br />
glucose (1g mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation orbitale (150 rpm)..............................................................134<br />
Figure 31 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et dégradation primaire de l’atrazine présente ou<br />
non (50 mg.L -1 ) en milieu minéral (MM) en présence ou non d’une source additionelle d’azote<br />
(sulfate d’ammonium 1 g.L -1 ) ; Glucose (1 g.L -1 ) ; 30°C ; agitation orbitale 150 rpm ...................136<br />
Figure 32 : Minéralisation de l’atrazine (concentration initiale environ 20 mg.L -1 ) par Pseudomonas<br />
ADP sp. en milieu riche (LB) ou en milieu minéral (MM ; glucose 1 g.L -1 ) contenant ou non une<br />
source additionnelle d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 ) ; 30°C ; Agitation 150 rpm ; 14 C-<br />
atrazine à 1 µCi/fiole .....................................................................................................................138<br />
Figure 33 : Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) en présence de 1<br />
ou 0,25 g.L -1 de glucose comme source de carbone, 1 g.L -1 de sulfate d’ammonium ; en extrait<br />
aqueux d’écorce de pin (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 comme source d’azote) en présence ou non<br />
de sels minéraux ; 30°C ; agitation 150 rpm.................................................................................139<br />
Figure 34 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait stérile d’écorce de pin ou en milieu<br />
minéral (MM) contenant ou non une source additionnelle de carbone (glucose 1g.L -1 noté Glc)<br />
et/ou une source d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L -1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm..........141<br />
Figure 35 : Activité respiratoire (exprimée en mg de O 2 .L -1 ) de Pseudomonas ADP sp. en extrait<br />
aqueux d’écorce de pin contenant (0,25 mg.L -1 ; 0,5 mg.L -1 ou 1 mg.L -1 ) ou non du glucose ;<br />
30°C ; agitation 150 rpm. .............................................................................................................142<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
230
Figure 36 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine en extrait aqueux<br />
d’écorce de pin stérile ou en milieu minéral MM (glucose 1 g.L -1 ) en présence d’atrazine (50 mg.L -<br />
1 ) avec ou sans sulfate d’ammonium (1 g.L -1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm.........................143<br />
Figure 37 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp en extrait aqueux d’écorce de pin<br />
stérile ou en milieu minéral MM (glucose 0,25 g.L -1 ) ; concentration initiale en atrazine 20 mg.L -1 ;<br />
22°C ; agitation lente.....................................................................................................................144<br />
Figure 38 : Croissance du consortium isolé à partir de l’écorce de pin et <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine<br />
en milieu LB ou en extrait aqueux d’écorce de pin inoculé avec environ 10 6 cfu.mL -1 de chaque<br />
iso<strong>la</strong>t (CP1 à CP4) ; atrazine comme source d’azote (55 mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation 150 rpm ......151<br />
Figure 39 : Biodégradation de l’atrazine en milieu LB par les micro-organismes isolés de l’écorce de<br />
pin (inoculé avec environ 10 6 cfu.mL -1 de CP1, CP2, CP3 ou CP4) ; atrazine comme source<br />
d’azote (environ 55 mg.L -1 ) ; 30°C ; agitation 150 rpm.................................................................152<br />
Figure 40 : Minéralisation de l’atrazine en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de<br />
pin stériles ou non stériles (d
Figure 47 : Lits d’écorce de pin issus des colonnes après inocu<strong>la</strong>tion de Pseudomonas ADP sp.<br />
pendant 2 ou 6 jours ; prélèvements <strong>pour</strong> analyses au MEB.......................................................168<br />
Figure 48 : Montage expérimental : Hydrodynamique des colonnes avant et après inocu<strong>la</strong>tion avec<br />
Pseudomonas ADP sp..................................................................................................................170<br />
Figure 49 : Montage expérimental <strong>pour</strong> les essais en colonne de <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> d’une solution<br />
polluée à l’atrazine après inocu<strong>la</strong>tion des colonnes avec Pseudomonas ADP sp. pendant 6 jours.172<br />
Figure 50 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM- Glucose<br />
1,25 g.L -1 ), en présence ou non d’écorce en poudre (d
Figure 56 : Répartition de <strong>la</strong> radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de<br />
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., après 15 jours d’incubation à 20 ± 2 °C ;<br />
[atrazine]i = 44,2 µg.L -1 (Figure de Gauche) et [atrazine]i = 20 mg.L -1 (Figure de Droite)............182<br />
Figure 57 : Répartition de <strong>la</strong> radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de<br />
minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
235
LISTE DES TABLEAUX<br />
<strong>Etude</strong> Bibliographique<br />
Tableau 1 : Toxicité de l’atrazine ; DL50 par voie orale sur quelques animaux (Trotter et al., 1990)..14<br />
Tableau 2 : Exemples de temps de demi-vie de l’atrazine dans différents sols ...................................23<br />
Tableau 3 : Elimination d’atrazine par nano-filtration (d’après Gaid et Ravarini, 1996)........................38<br />
Tableau 4 : Exemple de matériaux naturels utilisés <strong>pour</strong> l’adsorption de métaux lourds dans des<br />
procédés de <strong>traitement</strong> des eaux usées ou effluents ....................................................................40<br />
Tableau 5 : Supports utilisés dans les systèmes de <strong>bio</strong>filtration (selon Métivier, 2001).......................54<br />
Tableau 6 : Liste non exhaustive des micro-organismes isolés capables de dégrader l’atrazine ........63<br />
Tableau 7 : Principales caractéristiques taxonomiques de Pseudomonas sp.ADP..............................65<br />
Tableau 8 : Pourcentage d’identité de l’ARN16S de Pseudomonas ADP sp. avec d’autres souche de<br />
Pseudomonas et E. coli (Mandelbaum et al., 1995) ......................................................................65<br />
Tableau 9 : Demi-vie de l’atrazine dans différentes conditions.............................................................66<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
234
<strong>Etude</strong> Expérimentale<br />
Tableau 1 : Caractéristiques physiques de l’écorce de pin (d
Tableau 16 : Table d’élution <strong>pour</strong> analyse HPLC de l’atrazine et des métabolites de dégradation.... 164<br />
Tableau 17 : Taux de minéralisation d’atrazine (en %) en 320h d’incubation de Pseudomonas ADP sp.<br />
en <strong>bio</strong>mètre à 20 °C avec [atrazine]i= 44,2 µg.L -1 ou 20 mg.L -1 (st.=stérile) ............................... 176<br />
Tableau 18 : % de résidus liés à l’écorce de pin après 15 jours ou 7 mois d’incubation par rapport à <strong>la</strong><br />
radioactivité retrouvée dans l’écorce............................................................................................ 183<br />
Tableau 19 : Quantité d’atrazine retenue ou dégradée par gramme d’écorce par circu<strong>la</strong>tion des<br />
solutions polluées à 0,2 mg.L -1 ou 3 µg.L -1 à des débits de 1 ou 0,3 ml.min -1 dans des colonnes<br />
d’écorce de pin stérilisée, ayant ou non été colonisées par Pseudomonas ADP sp................... 192<br />
Thèse S.GENDRAULT 2004<br />
236
FOLIO ADMINISTRATIF<br />
THESE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE<br />
LYON<br />
NOM : GENDRAULT DERVEAUX DATE de SOUTENANCE : 22 septembre 2004<br />
(avec précision du nom de jeune fille, le cas échéant)<br />
Prénoms : Sophie<br />
TITRE :<br />
<strong>Etude</strong> d’un <strong>traitement</strong> <strong>combiné</strong> <strong>bio</strong>-<strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong> <strong>pour</strong> <strong>la</strong> décontamination des eaux polluées en atrazine<br />
NATURE : Doctorat<br />
Numéro d'ordre : 03 ISAL<br />
Ecole doctorale : Chimie de Lyon (Chimie, Procédés et Environnement)<br />
Spécialité : Sciences de l’Environnement Industriel et Urbain<br />
Cote B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 / et bis CLASSE :<br />
RESUME :<br />
Ce travail concerne l’étude d’un procédé <strong>bio</strong>-<strong>physico</strong>-<strong>chimique</strong> <strong>pour</strong> le <strong>traitement</strong> d’eaux polluées par de l’atrazine. Le procédé<br />
étudié consiste en une <strong>bio</strong>filtration, utilisant l’écorce de pin comme support d’adsorption et comme agent de <strong>bio</strong>dégradation <strong>la</strong><br />
souche bactérienne Pseudomonas ADP sp., connue <strong>pour</strong> sa capacité à minéraliser l’atrazine en tant que source d’azote. Cette<br />
technique vise à éliminer totalement le polluant par minéralisation, valorisant l’écorce de pin, un déchet de l’industrie du bois, le<br />
tout à faible coût.<br />
Dans un premier temps, les essais d’adsorption ont montré que l’atrazine était retenue en faible quantité sur l’écorce de pin,<br />
comparé à <strong>la</strong> capacité d’adsorption d’un charbon actif, rendant le pesticide disponible <strong>pour</strong> les micro-organismes engagés dans<br />
le <strong>traitement</strong>.<br />
L’approche <strong>bio</strong>logique en milieu liquide a montré que <strong>la</strong> <strong>bio</strong>dégradation de l’atrazine pouvait avoir lieu à pH acide (jusqu’à<br />
pH 4,4) imposé par <strong>la</strong> présence de l’écorce en solution aqueuse et à des températures re<strong>la</strong>tivement basses (jusqu’à 12°C)<br />
permettant d’exploiter ce procédé de manière rustique : pas de chauffage ni besoin de tamponner l’eau à traiter. Pseudomonas<br />
ADP sp. a prouvé qu’elle était capable de survivre en présence des composés organiques de l’écorce de pin et de les<br />
consommer en tant que source unique de carbone. D’autre part, aucune source d’azote supplémentaire à l’atrazine ne doit être<br />
apportée au cours du <strong>traitement</strong> sous peine de voir <strong>la</strong> minéralisation de celle-ci diminuer.<br />
La microflore indigène de l’écorce de pin a montré une légère capacité à minéraliser l’atrazine <strong>pour</strong> des concentrations en<br />
atrazine comprises entre 45 µg.L -1 et 20 mg.L -1 permettant, à forte concentration uniquement, d’augmenter le rendement global<br />
du <strong>traitement</strong>. D’une manière générale, <strong>la</strong> présence de cette microflore n’aurait qu’un très léger effet inhibiteur vis à vis de <strong>la</strong><br />
croissance de Pseudomonas ADP sp. et de sa capacité à minéraliser l’atrazine.<br />
L’étude du <strong>traitement</strong> combinant adsorption et <strong>bio</strong>dégradation a été réalisée en essais batch et en colonnes. En batch, 50% de<br />
l’atrazine sont minéralisés en 4 jours ; 50% restent adsorbés irréversiblement à l’écorce et donc non disponibles <strong>pour</strong> les<br />
bactéries. En colonne, l’apport de Pseudomonas ADP sp. améliore l’efficacité du <strong>traitement</strong> de 50% à 100% par rapport au<br />
procédé d’adsorption seul.<br />
Le <strong>traitement</strong> étudié semble inexploitable <strong>pour</strong> traiter des eaux contenant une faible concentration en atrazine (quelques µg . L -<br />
1 ). En revanche, ce procédé <strong>combiné</strong> <strong>pour</strong>rait être envisagé comme pré-<strong>traitement</strong> <strong>pour</strong> des eaux fortement polluées (quelques<br />
mg.L -1 ).<br />
MOTS-CLES :<br />
Atrazine, Ecorce de pin, Adsorption, Biodégradation, Minéralisation, Pseudomonas ADP sp., Biofiltration<br />
Laboratoire de recherches :<br />
Laboratoire d’Analyse Environnementale des Procédés et des Systèmes Industriels (LAEPSI) INSA de Lyon<br />
Directeur de thèse:<br />
Prof. Rémy GOURDON<br />
Président de jury : Professeur J. BOURGOIS<br />
Composition du jury :<br />
Professeur A. PAUSS<br />
Professeur B. FABRE<br />
Professeur R. GOURDON<br />
Professeur J.M. BLANCHARD<br />
Docteur R. BAYARD<br />
(Rapporteur)<br />
(Rapporteur)