Préparation de lames porte-objets pour la cytologie ... - Hettich AG, CH

Préparation de lames porte-objets
pour la cytologie urinaire
Préparation d’urine native
Méthode Hettich

Préparation de lames porte-objets pour la cytologie urinaire
Il ne suffit pas de centrifuger de l’urine native sur
une lame porte-objets usuelle pour obtenir une bonne
préparation cytologique à partir de celle-ci. L’urine
contient peu de cellules, lesquelles adhèrent en outre
très mal à la lame porte-objets. Ainsi, il en résulterait
une préparation très pauvre en cellules et donc de
qualité insuffisante. Pour augmenter le rendement
cellulaire, il faut enduire la lame porte-objets ou utiliser
un liquide fixateur approprié. Pour cela, on utilise
en particulier la poly-L-lysine (PLL, société Sigma,
cat. n° P8920) comme agent de revêtement et le
liquide de Saccomano comme agent de fixation.
Avantages de la méthode Hettich
1. Haut rendement cellulaire
· grâce au revêtement de la lame porte-objets
· grâce au liquide de fixation qui améliore l‘adhésivité
des cellules
2. Bonne représentation des cellules
· La solution de Saccomano permet d’obtenir des
sédiments bien identifiables.
· Les cellules urothéliales s’étalent sur un niveau.
· Le revêtement PLL permet de représenter, en plus
des cellules, des particules de petite taille telles que
les bactéries.
Préparation
A) Obtention d’une préparation
cytologique avec une lame
porte-objets enduite
1. Préparation de la lame porte-objets
Deux procédés peuvent être utilisés pour enduire les
lames porte-objets de poly-L-lysine : le trempage ou
le revêtement en centrifugeuse. Le revêtement par
trempage est simple et rapide à réaliser, mais le film
obtenu sur la lame peut quelquefois être irrégulier.
À l’inverse, le revêtement en centrifugeuse dure un
peu plus longtemps mais permet d‘obtenir à chaque
fois de très bons résultats.
a) Trempage
· Diluer à 1:10 la PLL avec de l‘eau distillée
et verser dans une cuvette.
· Plonger des lames porte-objets usuelles sans traitement
préalable dans cette solution et laisser tremper
pendant 5 minutes. La PLL doit être à température
ambiante.
· Sortir les lames porte-objets et les laisser sécher dans
une étuve à env. 60 °C (pendant env. 15 minutes).
Pour le séchage à l‘air libre, rallonger la durée en
conséquence. La lame porte-objet peut être utilisée
dès que le film de PLL est sec.
b) Revêtement en centrifugeuse
· Diluer à 1:10 la PLL.
· Placer les lames porte-objets non lavées sur
la plaque de fixation (réf. 1662) puis y fixer une
chambre de 8 ml (réf. 1666).
· Verser 100 µl de PLL diluée dans la chambre
de cytologie.
· Centrifuger le système de cytologie à 1100 x g
pendant une heure (cela correspond à 3.000 min -1
avec le rotor 6 places, et à 3.200 min -1 avec le
rotor 4 places). L’échantillon peut ensuite être
directement versé dans ce système de cytologie.
2. Choix des accessoires adaptés
Pour la centrifugation de l’urine, il est recommandé
d‘utiliser nos plus grandes chambres de cytologie d’un
volume de 8 ml et d’une surface de sédimentation de
240 mm 2 . Dans beaucoup de cas, cela permet d‘éviter
la centrifugation préalable dans un tube.
3. Assemblage du système de cytologie
Pour l’assemblage du système de cytologie, veuillez
vous reporter à notre schéma « Des préparations
parfaites en un tour de main – le système de cytologie
HETTICH ». La préparation de lames porte-objets à
partir d’urine requiert en règle générale une fixation
humide. Pour cette raison, le système cytologique doit
être monté sans carte-filtre (cf. schéma, point A1).
Pour la centrifugation d’échantillons infectieux, il est
recommandé d’utiliser le couvercle réf. 1661
(cf. schéma, point A2).
4. Centrifugation
a) Sédimentation
Centrifuger les chambres de cytologie pendant
5 minutes à 1100 x g (ce qui correspond à
3.000 min -1 avec le rotor 6 places, et à 3.200 min -1
avec le rotor 4 places).
b) Retrait du surnageant acellulaire
Après la centrifugation, le surnageant acellulaire
se trouve encore dans la chambre et doit être
déversé avec prudence ou aspiré. Il est important
de ne pas remuer le sédiment au cours de
l’aspiration, car cela pourrait influencer sa qualité
et entraîner une perte de cellules.
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Préparation de lames porte-objets pour la cytologie urinaire
c) Fixation et coloration
Une fois le surnageant retiré, la préparation humide
peut immédiatement être fixée (dans de l‘éthanol à
99 % par exemple) puis colorée.
B) Obtention d’une préparation
cytologique à l‘aide de la solution
de Saccomano
1. Travail préparatoire
a) Préparation de l’échantillon d’urine
· Centrifuger l’échantillon d’urine dans un tube
pendant 10 minutes à 1700 x g (ce qui correspond
à 3.600 min -1 avec le rotor 6 places, et à 4.000 min -1
avec le rotor 4 places).
· Déverser le surnageant.
Important : Aérer le culot se trouvant au fond du
tube avant d’y ajouter la solution de Saccomano
(de préférence en tapotant précautionneusement
le fond du tube contre une surface dure).
· Ajouter la solution de Saccomano et laisser agir
pendant 30 minutes à température ambiante.
b) Préparation de la solution de Saccomano
Pour préparer 100 ml de solution de Saccomano, il
faut mélanger 43 ml d’eau distillée, 53 ml d’éthanol à
95 % et 4 ml de solution mère de polyéthylène glycol.
c) Préparation de la solution mère de
polyéthylène glycol :
· Chauffer le polyéthylène glycol 1500 (Merck Darmstadt,
réf. 807489) et l’eau distillée à 60 °C.
· Mélanger des volumes respectivement égaux
(par exemple 50 ml de polyéthylène glycol et 50 ml
d’eau distillée) lorsque ceux-ci ont atteint la bonne
température.
· Laisser refroidir la solution mère à température
ambiante avant de l’utiliser pour préparer la solution
de Saccomano.
2. Choix des accessoires adaptés
4. Centrifugation
a) Sédimentation
Centrifuger les chambres de cytologie pendant
5 minutes à 1100 x g (ce qui correspond à
3.000 min -1 avec le rotor 6 places, et à 3.200 min -1
avec le rotor 4 places).
b) Retrait du surnageant acellulaire
Après la centrifugation, le surnageant acellulaire
se trouve encore dans la chambre et doit être
entièrement déversé.
c) Fixation et coloration
Une fois le surnageant vidé, retirer la chambre de
cytologie et laisser sécher le sédiment à l’air libre
jusqu’à ce qu’un dépôt cireux se soit formé. La
préparation peut être envoyée en l’état. Avant la
coloration, le dépôt cireux formé sur le sédiment
doit être retiré par trempage dans de l’éthanol à
50 % (pendant env. 10 minutes).
Références pour la commande
Centrifugeuse
Réf.
ROTOFIX 32 A 1206
UNIVERSAL 320 / UNIVERSAL 320 R 1401 / 1406
Accessoires sélectionnés 1)
Réf.
Rotor 4 places 1624
Rotor 6 places 1626
Nacelle de cytologie 1660
Couvercle pour réf. 1660 1661
Plaque de fixation avec bague de serrage 1662
Chambre de cytologie 1 x 4 ml (120 mm²) 1665
Chambre de cytologie 1 x 8 ml (240 mm²) 1666
1) Vous trouverez notre gamme complète d’accessoires pour la cytologie dans notre
catalogue de cytologie que vous pouvez obtenir gratuitement sur demande.
Cf. page 2.
3. Assemblage du système de cytologie
Cf. page 2.