M2Tours_Octobre2008_etudiants.pdf
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Elimination de séquences<br />
germinales pendant la<br />
formation du noyau<br />
somatique chez les ciliés<br />
Mireille Bétermier<br />
CNRS<br />
Centre de Génétique Moléculaire<br />
Gif sur Yvette<br />
France
PLAN<br />
I. INTRODUCTION<br />
- Lignée germinale – lignée somatique<br />
- réarrangements génomiques programmés : exemple des gènes des IgG<br />
II. REARRANGEMENTS PROGRAMMES DU GENOME CHEZ LA<br />
PARAMECIE<br />
- Présentation des ciliés<br />
- Génome germinal, génome somatique<br />
- Assemblage des gènes par excision précise de séquences internes<br />
III. RECONNAISSANCE DES SEQUENCES ELIMINEES<br />
- Mise en évidence d’un contrôle épigénétique des réarrangements<br />
- Rôle d’ARN non codants: observations et modèles<br />
IV. RESUME - CONCLUSION
Réarrangements génomiques programmés pendant le<br />
développement ou la différenciation cellulaire<br />
lignée<br />
germinale<br />
lignée<br />
somatique<br />
Réarrangements<br />
génomiques<br />
Transcription et traduction
Différenciation des lymphocytes
Cellules souches<br />
hématopoïétiques:<br />
Moelle osseuse<br />
Différenciation des lymphocytes B<br />
Lymphocyte B mature:<br />
Sang et organes lymphoïdes<br />
Plasmocyte activé:<br />
Organes lymphoïdes et<br />
hématopoïétiques<br />
Tissu conjonctif lâche<br />
Génome germinal<br />
Réarrangements<br />
VDJ<br />
Réarrangements<br />
CSR
Différenciation des lymphocytes B: assemblage<br />
des gènes d’immunoglobulines<br />
-Locus IgH (1 Mb): chaînes lourdes<br />
des immunoglobulines<br />
- Loci Igκ (3 Mb) & Igλ (200 kb):<br />
chaînes légères<br />
Région variable<br />
Région constante<br />
Structure d’une immunoglobuline<br />
(IgG)
Réarrangements du locus IgH pendant la<br />
différenciation des lymphocytes B<br />
Cellules souches:<br />
génome germinal<br />
V(D)J Cµ<br />
Région variable Région constante<br />
V D J<br />
Recombinaison V(D)J<br />
Commutation isotypique<br />
(CSR)<br />
D’après Manis (2002) Trends Immunol. 23:31-39
Réarrangements du locus IgH pendant la<br />
différenciation des lymphocytes B<br />
Cellules souches:<br />
génome germinal<br />
Lymphocyte B mature:<br />
assemblage région variable +<br />
région constante Cµ<br />
Synthèse du répertoire primaire des<br />
IgM et IgD<br />
V(D)J Cµ<br />
Région variable Région constante<br />
V D J<br />
Recombinaison V(D)J<br />
Commutation isotypique<br />
(CSR)<br />
D’après Manis (2002) Trends Immunol. 23:31-39
Réarrangements du locus IgH pendant la<br />
différenciation des lymphocytes B<br />
Cellules souches:<br />
génome germinal<br />
Lymphocyte B mature:<br />
assemblage région variable +<br />
région constante Cµ<br />
Synthèse du répertoire primaire des<br />
IgM et IgD<br />
Plasmocyte activé:<br />
changement de la partie<br />
constante des chaînes lourdes<br />
Réponse immunitaire secondaire:<br />
synthèse des IgG, IgE et IgA<br />
V(D)J Cµ<br />
Région variable Région constante<br />
V D J<br />
Recombinaison V(D)J<br />
Commutation isotypique<br />
(CSR)<br />
D’après Manis (2002) Trends Immunol. 23:31-39
PLAN<br />
I. INTRODUCTION<br />
- Lignée germinale – lignée somatique<br />
- réarrangements génomiques programmés : exemple des gènes des IgG<br />
II. REARRANGEMENTS PROGRAMMES DU GENOME CHEZ LA<br />
PARAMECIE<br />
- Présentation des ciliés<br />
- Génome germinal, génome somatique<br />
- Assemblage des gènes par excision précise de séquences internes<br />
III. RECONNAISSANCE DES SEQUENCES ELIMINEES<br />
- Mise en évidence d’un contrôle épigénétique des réarrangements<br />
- Rôle d’ARN non codants: observations et modèles<br />
IV. RESUME - CONCLUSION
Les ciliés: un groupe monophylétique<br />
d’eucaryotes unicellulaires<br />
Baldauf, 2003
Les ciliés: un groupe monophylétique<br />
d’eucaryotes unicellulaires<br />
Stylonichia<br />
Prescott, 1994<br />
(SPIROTRICHES)<br />
Tetrahymena<br />
Paramecium
Le dimorphisme nucléaire chez les ciliés<br />
Paramecium aurelia<br />
(noyau somatique)<br />
MAC<br />
mic<br />
(noyau germinal)<br />
Division<br />
végétative<br />
Reproduction<br />
sexuée<br />
mic: mitose<br />
MAC:<br />
division<br />
amitotique<br />
mic: méiose<br />
MAC:<br />
dégradé
Séparation des fonctions germinales et<br />
somatiques chez les ciliés<br />
Micronoyaux<br />
«germen» 2n<br />
Macronoyau<br />
«soma»<br />
~800n<br />
Transmission de<br />
l’information génétique<br />
Expression des gènes
Le cycle sexuel de la<br />
paramécie<br />
Divisions<br />
végétatives<br />
Division<br />
caryonidale<br />
Elimination de séquences germinales<br />
méiose<br />
micronoyaux<br />
(2n)<br />
macronoyau<br />
(~800n)<br />
Noyau zygotique<br />
(2n)<br />
Nouveaux micronoyaux<br />
Nouveaux macronoyaux<br />
caryogamie
Un nouveau macronoyau se développe à chaque<br />
cycle sexuel<br />
Fragmentation de<br />
l’ancien macronoyau<br />
Nouveaux<br />
macronoyaux
Le génome somatique est une version réarrangée<br />
du génome germinal<br />
Amplification de l’ADN mic 2n MAC ~ 800-1000n<br />
Assemblage des gènes<br />
par excision précise de<br />
séquences internes<br />
Fragmentation<br />
des chromosomes<br />
et élimination<br />
imprécise de<br />
séquences<br />
germinales<br />
mic<br />
MAC<br />
mic<br />
MAC<br />
~60,000 Internal Eliminated Sequences (IES)<br />
50-60 chromosomes (1 –7 Mbp)<br />
~188 « chromosomes » (50 – 1000 kpb)
Assemblage des gènes par excision précise<br />
de séquences internes (IES)<br />
• Structure des IES (Internal Eliminated Sequences)<br />
• Mise en évidence de cassures double-brin aux<br />
bornes des IES<br />
• Recherche des protéines impliquées dans la<br />
coupure et la réparation
Structure générale des IES de paramécie<br />
TA TA<br />
26 - 882 bp<br />
TA<br />
75% des IES sont de taille<br />
inférieure à 80 bp<br />
Nombre d'IES<br />
12<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
28 bp<br />
•riches en A/T<br />
• copie unique<br />
• ~65.000 par génome haploïde<br />
• interrompent des ORFs et des<br />
régions non codantes<br />
44 bp<br />
0<br />
0 80 160 240 320 400<br />
Introns 18-33 nt<br />
taille (bp)<br />
Gratias & Bétermier, 2001
Les IES de paramécie pourraient dériver de<br />
transposons Tc1/mariner<br />
TA TA<br />
26 - 882 bp<br />
TA<br />
P. aurelia IESs<br />
Tc1 / mariner 5'<br />
E.crassus Tec<br />
P. tetraurelia sardine<br />
P. primaurelia Tennessee<br />
5'<br />
5'<br />
5'<br />
5'<br />
•riches en A/T<br />
• copie unique<br />
• ~65.000 par génome haploïde<br />
• interrompent des ORFs et des<br />
régions non codantes<br />
T A Y A G Y N R<br />
T A C A G T K S<br />
T A T A G A G G<br />
T A T A G C T G<br />
T A C A G T C C<br />
Une mutation dans le TA conservé inhibe l’excision<br />
3'<br />
3'<br />
3'<br />
3'<br />
3'<br />
Klobutcher & Herrick, 1995; Gratias & Bétermier, 2001
mic<br />
Transposon<br />
excisase<br />
Transposon<br />
excisase<br />
Transposon<br />
excisase<br />
Scenario évolutif pour les IES:<br />
l’hypothèse « IBAF »<br />
Transposon<br />
excisase<br />
Transposon<br />
excisase<br />
Transposon<br />
excisase<br />
Transposon<br />
excisase<br />
IES IES IES<br />
Transposon<br />
EXCISASE<br />
EXCISASE<br />
Invasion<br />
Bloom<br />
Abdicate<br />
Fade<br />
Klobutcher & Herrick, 1997
Mécanisme d’excision des IES: initiation<br />
Cassures double<br />
brin<br />
TA<br />
AT<br />
TA<br />
AT
Détection des cassures double brin (CDB) aux<br />
bornes des IES<br />
Ligation d’un adaptateur puis PCR<br />
5’PO 4<br />
g TAT<br />
T4 DNA ligase<br />
g TAT<br />
c ATA<br />
gTAT<br />
*<br />
V<br />
Développement macronucléaire<br />
Bras gauche du<br />
chromosome<br />
Borne gauche de<br />
l’IES<br />
Borne droite de<br />
l’IES<br />
Bras droit du<br />
chromosome<br />
Gratias & Bétermier (2003) Mol. Cell. Biol.
wt<br />
Une mutation à une borne inhibe aussi le<br />
clivage de la borne sauvage<br />
TA TA<br />
Mutant TG TA<br />
Détection des cassures double-brin:<br />
Clivage efficace des<br />
deux bornes<br />
Inhibition de la coupure des bornes<br />
sauvage ET mutante<br />
Assemblage d’un complexe<br />
synaptique ?<br />
Gratias et al. (2008) Nucl. Acids Res.
Excision des IES et transposition par<br />
« couper – coller » des éléments Tc1/mariner<br />
•TA•<br />
•TA•<br />
•AT•<br />
P. aurelia<br />
TA<br />
+<br />
•AT•<br />
•TA•<br />
•AT•<br />
TA<br />
Tc1 / mariner<br />
TA TA<br />
footprint<br />
- Il existe des transposons de la famille Tc1/mariner dans le<br />
génome germinal de P. tetraurelia<br />
- Mais les géométries des coupures de l’ADN sont différentes<br />
dans les deux systèmes<br />
TA<br />
AT<br />
+<br />
TA<br />
AT<br />
Plasterk et al. (1999) TIG 15:326-332
Le génome MAC porte un gène codant pour une<br />
transposase domestiquée de la famille piggyBac<br />
(1065 aa)<br />
100 aa<br />
D401<br />
D491<br />
D609<br />
coiled coil<br />
PBL49p N C<br />
T. ni piggyBac<br />
(594 aa)<br />
piggyBac transposons<br />
are excised precisely<br />
TTAA TTAA<br />
TTAA<br />
C-rich<br />
domain<br />
Li et al. (2001) MGG 266:190-198<br />
Sarkar et al (2003) MGG 270: 173-80
Une autre source de transposase dans le génome<br />
macronucléaire de P. tetraurelia ?<br />
TTAA<br />
13 bp<br />
TIR IR<br />
D-D--D<br />
IR TIR<br />
spacer gauche : 3 bp<br />
Trichoplusia ni<br />
19 bp<br />
transposon PiggyBac (2472 bp)<br />
spacer droit: 19 bp<br />
TTAA<br />
Li et al. (2001) MGG; Sarkar et al (2003) MGG<br />
Une transposase piggyBac domestiquée dans le génome de la paramécie<br />
Sophie Malinsky, Mathieu Restituito, Eric Meyer, Mireille Bétermier
Le gène PBL49 gene est transcrit pendant le<br />
développement du MAC<br />
Cassures<br />
double brin<br />
(LMPCR)<br />
PBl49<br />
Pt-Spo11<br />
17S rRNA<br />
V<br />
Méiose<br />
du MIC<br />
-4.5<br />
-1<br />
1.8<br />
6.8<br />
Développement du<br />
nouveau MAC<br />
11.8<br />
21.8<br />
31.8<br />
41.8<br />
16.8<br />
Sophie Malinsky, Aurélie Kapusta<br />
(hrs)<br />
Hybridation<br />
Northern blot
Expression d’une fusion GFP-PBl49<br />
Construction<br />
d'un gène de fusion<br />
par introduction de la<br />
séquence codante de la<br />
GFP<br />
Introduction<br />
par injection dans<br />
le MACRONOYAU<br />
Visualisation de<br />
l'expression de la<br />
protéine<br />
recombinante pendant<br />
le cycle sexuel<br />
Sophie Malinsky
Une fusion GFP-PBl49 est localisée dans les<br />
nouveaux macronoyaux<br />
PBl49<br />
DAPI GFP<br />
Sophie Malinsky
Inactivation de gènes pendant les événements<br />
sexuels: stratégie expérimentale<br />
feeding<br />
avec des<br />
bactéries E. coli<br />
produisant de<br />
l’ARN db<br />
Conversion des ARNdb en siARN<br />
de 23nt dans les paramécies<br />
Croissance<br />
végétative<br />
Pas de<br />
phénotype<br />
Méiose<br />
fécondation<br />
Événements sexuels<br />
La descendance sexuelle<br />
est-elle viable ?<br />
Galvani & Sperling, 2002
Efficacité de l’extinction du gène PBL49<br />
D401 D491 D609<br />
HN<br />
(559 bp)<br />
Céline Baudry, Matthieu Restituito, Sophie Malinsky<br />
CB1<br />
(347 bp)<br />
V 0 5 10 15 20 30 40 Vk V 0 5 10 15 20 30 40<br />
Control PBL49
% survie<br />
L’expression du gène PBl49 est essentielle<br />
pour le développement du macronoyau<br />
RNAi<br />
Méiose<br />
fécondation<br />
Spo11<br />
PBl49<br />
Dév. MAC<br />
ND7<br />
Contrôle<br />
Spo11<br />
Méiose<br />
fécondation<br />
PBl49<br />
RNAi<br />
ND7<br />
Dév. MAC<br />
Contrôle<br />
Céline Baudry, Sarah Rosa
Contrôle<br />
PBL49<br />
Les nouveaux MAC ont une apparence normale<br />
dans les cellules inactivées pour PBL49<br />
Céline Baudry, Sarah Rosa, Matthieu Restituito, Sophie Malinsky<br />
Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4<br />
Mort cellulaire
PBl49p est requise pour l’excision des IES<br />
L’inactivation de PBL49 bloque l’excision des IES :<br />
V<br />
0<br />
5<br />
10<br />
15<br />
Contrôle<br />
20<br />
30<br />
40<br />
Absence de cassures détectables<br />
V<br />
K<br />
V<br />
N<br />
T0<br />
N<br />
T5<br />
N<br />
T10<br />
N<br />
Contrôle<br />
T15<br />
N<br />
T20<br />
N<br />
51A1835<br />
T30<br />
N<br />
T40<br />
N<br />
V<br />
P<br />
V<br />
0<br />
T0<br />
P<br />
T5<br />
P<br />
Sophie Malinsky, Céline Baudry<br />
5<br />
10<br />
Inactivation de PBl49<br />
T10<br />
P<br />
15<br />
T15<br />
P<br />
20<br />
30<br />
40<br />
T20<br />
P<br />
T30<br />
P<br />
Inactivation de PBl49<br />
T40<br />
P
Mécanisme d’excision des IES: initiation<br />
Cassures double<br />
brin<br />
TA<br />
AT<br />
Rôle d’une protéine apparentée à la transposase des<br />
transposons piggyBac<br />
TA<br />
AT<br />
Est-ce bien LA nucléase des IES ?<br />
Un nouveau cas de domestication ?
mic<br />
Scenario évolutif pour les IES: révision<br />
de l’hypothèse « IBAF »<br />
Transposon<br />
Transposon Transposon Transposon<br />
Transposon Transposon Transposon<br />
IES IES IES<br />
Transposon<br />
EXCISASE<br />
EXCISASE<br />
EXCISASE<br />
EXCISASE<br />
EXCISASE<br />
Invasion<br />
Bloom<br />
Abdicate<br />
Fade<br />
Klobutcher & Herrick, 1997
Mécanisme d’excision des IES: refermeture<br />
précise des chromosomes<br />
Chromosome<br />
cassé<br />
5’ PO 4<br />
TA<br />
AT<br />
AT<br />
5’ PO 4<br />
Réparation précise de la<br />
jonction macronucléaire<br />
TA<br />
?<br />
TA<br />
5’ PO 4<br />
TA<br />
AT<br />
5’ PO 4<br />
Jonction circulaire<br />
AT
Détections de formes circulaires excisées des IES<br />
V S<br />
Développement macronucléaire<br />
IES 51A 6649 (370 bp)<br />
Southern blot<br />
chrom.<br />
oc<br />
ccc<br />
IES<br />
circulaire<br />
TA TA<br />
TA<br />
Bétermier et al.,<br />
2000; Gratias &. Bétermier, 2001
Réparation des chromosomes cassés par la voie<br />
NHEJ (Non Homologous End Joining)<br />
2 DSBs (one at each boundary)<br />
CTAC G TAG<br />
GATG C ATC<br />
GATG<br />
G<br />
TAG<br />
GAT<br />
CTAG<br />
GATC<br />
G TAG<br />
Alignment of broken chromosome ends<br />
Processing and ligation<br />
G<br />
DSB<br />
Alignment of ends<br />
Processing and ligation<br />
Repair<br />
junction<br />
Ku70/Ku80<br />
DNA-PKcs<br />
Processing factors<br />
Ligase IV / XRCC4<br />
XLF
Effet de l’inactivation de la Ligase IV sur<br />
la réparation des chromosomes<br />
V K V N 0 5 10 15 20 30 40<br />
51A1835<br />
CONTROLE<br />
Développement MAC<br />
mic mac<br />
51A4404<br />
51A1835<br />
INACTIVATION DE LIG4<br />
Développement MAC<br />
VK VL St 0 5 10 15 2030 40 53<br />
Pas de formation de jonctions chromosomiques<br />
CONTROLE INACTIVATION DE LIG4<br />
V K S N 0 5 10 15 2030 40 V K S L 0 5 10 15 2030 40<br />
Accumulation de cassures double-brin non réparées<br />
mic mac<br />
Aurélie Kapusta<br />
51A4404<br />
51A1835
L’assemblage des gènes est assurée par une<br />
machinerie cellulaire de réparation<br />
• Rôle essentiel du complexe Ligase IV/XRCC4 dans la<br />
refermeture des sites d’excision et dans la<br />
circularisation des IES excisées<br />
• Comment est contrôlée la précision de la réparation ?
PLAN<br />
I. INTRODUCTION<br />
- Lignée germinale – lignée somatique<br />
- réarrangements génomiques programmés : exemple des gènes des IgG<br />
II. REARRANGEMENTS PROGRAMMES DU GENOME CHEZ LA<br />
PARAMECIE<br />
- Présentation des ciliés<br />
- Génome germinal, génome somatique<br />
- Assemblage des gènes par excision précise de séquences internes<br />
III. RECONNAISSANCE DES SEQUENCES ELIMINEES<br />
- Mise en évidence d’un contrôle épigénétique des réarrangements<br />
- Rôle d’ARN non codants: observations et modèles<br />
IV. RESUME - CONCLUSION
Injection d’un<br />
fragment<br />
d’ADN portant<br />
une IES<br />
Contrôle maternel de l’excision des IES<br />
mic<br />
MAC<br />
mic<br />
perdu<br />
Génération n Génération n+1<br />
Génération n<br />
perdu<br />
1/3 des IES testées sont soumises à<br />
ce contrôle maternel<br />
Génération n+1<br />
Lignée<br />
sauvage<br />
IES-<br />
Lignée IES+<br />
(mic sauvage)<br />
Inhibition de la<br />
coupure<br />
Duharcourt et al, Genes & Dev. (1995)<br />
Duharcourt et al, Mol. Cell. Biol (1998)<br />
Gratias et al., Nucl Acids Res (2008)
Une information séquence-spécifique est transmise<br />
de l’ancien vers le nouveau macronoyau<br />
ARN du MAC maternel ?<br />
Ce transfert d’information dépend de l’homologie de séquence ET<br />
est sensible à l’ARN interférence
RESUME - CONCLUSION<br />
1°) Stratégie originale des ciliés en réponse à l’invasion de leur<br />
génome germinal par des transposons<br />
- élimination imprécise de séquences germinales englobant les transposons<br />
- excision précise de courtes séquences internes (les IES)<br />
2°) Facteurs impliqués dans la reconnaissance des séquences à<br />
éliminer:<br />
- comparaison des versions germinale (non réarrangée) et somatique<br />
(réarrangée) des génomes via des molécules d’ARN non codants<br />
- pour les IES : existence d’autres déterminants (séquence nucléotidique,<br />
interaction entre les bornes)<br />
3°) Les machineries enzymatiques impliquées sont encore mal<br />
connues:<br />
- mise en évidence de cassures double-brin aux bornes des IES<br />
- implication d’une voie générale de réparation des cassures: le NHEJ
RESUME - CONCLUSION<br />
1°) Stratégie originale des ciliés en réponse à l’invasion de leur<br />
génome germinal par des transposons<br />
- élimination imprécise de séquences germinales englobant les transposons<br />
- excision précise de courtes séquences internes (les IES)<br />
2°) Facteurs impliqués dans la reconnaissance des séquences à<br />
éliminer:<br />
- comparaison des versions germinale (non réarrangée) et somatique<br />
(réarrangée) des génomes via des molécules d’ARN non codants<br />
- pour les IES : existence d’autres déterminants (séquence nucléotidique,<br />
interaction entre les bornes)<br />
3°) Les machineries enzymatiques impliquées sont encore mal<br />
connues:<br />
- mise en évidence de cassures double-brin aux bornes des IES<br />
- implication d’une voie générale de réparation des cassures: le NHEJ
RESUME - CONCLUSION<br />
1°) Stratégie originale des ciliés en réponse à l’invasion de leur<br />
génome germinal par des transposons<br />
- élimination imprécise de séquences germinales englobant les transposons<br />
- excision précise de courtes séquences internes (les IES)<br />
2°) Facteurs impliqués dans la reconnaissance des séquences à<br />
éliminer:<br />
- comparaison des versions germinale (non réarrangée) et somatique<br />
(réarrangée) des génomes via des molécules d’ARN non codants<br />
- pour les IES : existence d’autres déterminants (séquence nucléotidique,<br />
interaction entre les bornes)<br />
3°) Recherche des machineries enzymatiques impliquées:<br />
- une transposase domestiquée impliquée dans l’introduction de cassures<br />
double-brin aux bornes des IES<br />
- implication d’une voie générale de réparation des cassures: le NHEJ
UPR 2167 CNRS<br />
Centre de Génétique Moléculaire<br />
Gif sur Yvette<br />
Céline Baudry<br />
Aurélie Kapusta<br />
Jacek Nowak<br />
Sarah Rosa<br />
Aude Silve<br />
Mireille Bétermier<br />
UMR 8541 CNRS<br />
Ecole Normale Supérieure<br />
Paris<br />
Ariane Gratias<br />
Thibault Mesplede<br />
Hervé Seitz<br />
Sophie Malinsky<br />
Gersende Lepère<br />
Sandra Duharcourt<br />
Eric Meyer<br />
Olivier Garnier<br />
Anne Le Mouël<br />
Małgorzata Prajer<br />
Mariusz Nowacki<br />
Vincent Serrano<br />
Khaled Bouhouch<br />
Et les laboratoires de J. Cohen (CGM, Gif), J. Forney (Purdue University, USA),<br />
M. Zagulski (IBB, Varsovie)
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