Séparation des protéines par électrophorèse sur gel de ...

Rapport Exercice 2 Naomi Anderegg & Atsushi Kamada
Séparation des protéines
par électrophorèse
sur gel de
polyacrylamide-sodium
dodécyl sulfate
( SDS-PAGE)
Détection du récepteur à
la transferrine
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Naomi Anderegg
Atsushi Kamada

Rapport Exercice 2 Naomi Anderegg & Atsushi Kamada
Session Protéines Membranaires, 2 ème partie :
Séparation des protéines par électrophorèse sur gel
de polyacrylamide-sodium dodécyl sulfate
Détection du récepteur à la transferrine
1. Principe de cette expérience
Le but de l’expérience est de séparer une protéine donnée, d’un ensemble de
protéines cellulaires afin de savoir si elle est constituée de plusieurs sousunités
ou non.
En premier lieu, il faut préparer un gel de séparation compatible avec la taille
élevée de notre protéine, c’est-à-dire avec une densité relativement faible afin
qu’elle soit convenablement séparée des protéines de masses similaires. Il faut
de plus s’assurer que toutes les protéines aient le même point de départ pour la
migration, c’est pourquoi nous avons démarré la migration dans un gel de
concentration.
En suite, nous devons transférer les protéines séparées sur une membrane de
nitrocellulose afin de pouvoir utiliser des anticorps spécifiques interagissants
avec notre protéine cible. Avant cette étape, nous devons utiliser des protéines
de lait pour que ces anticorps ne puissent pas se lier avec la membrance de
nitrocellulose, mais uniquement avec la protéine visée.
Une fois ces étapes terminées nous ajoutons des anti-anticorps (HRP) qui se
couplent aux anticorps et qui émettent un signal de chimiluminescence
permettant ainsi de visualiser sur un film après révélation, grâce à un réactif
qui convertit ce signal en un signal photo.
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Rapport Exercice 2 Naomi Anderegg & Atsushi Kamada
2. A quoi sert l’étape de saturation des membranes de
nitrocellulose avec les protéines du lait ?
Cela permet de s’assurer que l’ensemble de la surface soit recouverte de
protéines, afin que les anticorps interagissent uniquement avec des protéines et
non avec la membrane (figure 2).
En effet, la membrane de nitrocellulose ayant une forte affinité pour les
protéines pourrait biaiser le test en liant les parties libres des anticorps
(figure1), et donc empêcher la liaison du deuxième anticorps (anti-anticorps).
De plus, cela permet aussi de garantir la haute spécificité de notre anticorps à
la protéine cible.
3. Sachant qu’il est possible de faire des gels de séparation à 5, 10
ou 20 % d’acrylamide, quel % pourcentage utiliseriez-vous
pour séparer des protéines d’environ 20 kDa ?
Pour le récepteur de la transferrine, qui est une grosse protéine de 190 kDa,
nous avons utilisé une solution à 10 % d’acrylamide. Ceci, afin que les mailles
du gel soit suffisamment grandes pour que cette protéine puisse y migrer. De
ce fait, pour une protéine de 20 kDa, ce qui nous intéresse est de conserver des
protéines de poids similaires et d’éliminer les protéines plus importantes.
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Rapport Exercice 2 Naomi Anderegg & Atsushi Kamada
Donc, en prenant une solution à 20 % la concentration est plus élevée et la
polymérisation est plus dense, c’est-à-dire les mailles plus petites, plus fines.
4. Que pouvez-vous dire sur la structure et le poids du TfR ?
Le TFR est une protéine d’environ 190 kDa et il est constitué de deux sousunités
d’environ 90kDa comme nous pouvons le constater sur le western blot.
5. Quelle est l’utilité du marquage contre l’actine ? Quelle
information vous apporte ce marquage sur votre
manipulation ?
L’actine est une protéine de 50 kDa dont la structure ne change pas que l’on
soit en condition non-dénaturée (-bêta mercapto éthanol) ou dénaturée (+bêta
mercapto éthanol) et est présente dans toutes les cellules de l’organisme. Ainsi
la révélation est proportionnelle à la quantité d’actines dans les deux
conditions, et est donc utile pour contrôler la quantité des protéines cibles
effectivement contenu dans les solutions que nous avons fait migrer. En effet,
nous ne pouvons jamais être totalement sûr de la parité des quantités de
protéines dans chacune des solutions (une erreur est toujours possible…).
Le contrôle à l’actine permet d’éviter de tirer de mauvaises conclusions à
partir d’une révélation d’intensités différentes dues à une erreur de
manipulation.
6. Quelles sont les limites de ce protocole ?
Avec ce type de révélation, il est nécessaire de travailler avec de grandes
quantités de protéines et surtout des anticorps de haute affinité pour la protéine
cible afin d’éviter qu’il ne se lie à d’autres protéines si nous voulons avoir des
résultats précis et diminuer le bruit de fond (éventuellement engendré par des
liaisons à d’autres protéines).
Ce type de protocole nous permet uniquement de détecter la présence de la
protéine et si elle est constituée de une ou plusieurs (sous-)unités et
accessoirement son poids moléculaire. Mais il ne nous permet pas de connaître
sa structure tridimensionnelle, ni sa composition globale en acides aminés (ce
qui est faisable en séparation 2D).
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