THS-6596.pdf

Préparation des cellules compétentes pour électroporation
Ensemencer un litre de milieu de culture LB avec 200 ml d'une préculture de 12 heures sur
milieu LB. Incuber la culture à 37°C sous agitation jusqu'à une densité optique comprise
entre 0,5 et 0,6 à 600 nm. Placer ensuite la culture dans de la glace ou à une température
de 4°C pour la refroidir. Centrifuger à 6000 g, 4°C pendant 10 mn. Laver les sédiments à
deux reprises avec 200 ml d'eau distillée et une fois avec 30 ml de la solution de glycérine.
Incuber ensuite les cellules dans de la glycérine à une température de 4°C. Centrifuger
comme précédemment et resuspendre les cellules dans 400 III de glycérine à répartir par
tube de lOOfl!. On peut directement utiliser ces cellules pour l'électroporation ou les
conserver à -70°e.
Electroporation
Ajouter 10fll de la solution de ligation (voir.) dans un tube contenant 90 ml de cellules
compétentes. Prélever le mélange et l'introduire dans une cuvette pour électroporation
(BioRad, München) préalablement refroidie à O°e.
-L'électroporation est faite à l'aide d'un appareil ("Gene-pulser" de la firme BioRad,
Muenchen). Les paramètres du choc électrique sont 2500 V, 200 Q et 2flF.
Ensemencer les "cellules électroporées" dans 1ml de milieu SOC et incuber 1 heure à
37°C sous agitation pour l'expression phénotypique. Etaler la culture est ensuite sur milieu
LB-agar + Ampicilline et sur milieu pour amylase test + Ampicilline et incuber pendant 12
à 18 heures à 37°e.
10.2.4.2 Transformation de E. coli par choc thermique
Solutions
Milieu Trypton lextrait de levure:
Solution de MgCIz :
Solution de CaClz :
(voir milieux de culture)
100 mM
100 mM
Préparation de cellules compétentes pour choc thermique
Ensemencer 30 ml de milieu Trypton Extrait de levure. Incuber à 37°C en aérobiose
jusqu'à une densité optique de 0,6 (phase logarithmique) à 578 nm. Centrifuger à 5000g,
4°C pendant 10mn et resuspendre les sédiments dans 10 ml de solution de chlorure de
magnésium refroidie. Centrifuger à nouveau à 5000 g, 4°C pendant lOmn et récupérer les
sédiments. Resuspendre les sédiments dans 10 ml de solution de chlorure de calcium
refroidie. Incuber 30 mn dans de la glace. Centrifuger comme précédemment. Resuspendre
les cellules dans 1 ml de solution de chlorure de calcium et conserver à O°C
Transformation
Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 100 nù de cellules compétentes ajouter 2 III
de la solution de ligation. Incuber le mélange 20 mn dans de la glace ou à O°C.
Placer aussitôt le tube dans le bain-marie à 42°C pendant. Replacer le tube 2 mn dans la
glace. Ensemencer ensuite ces cellules dans 900 III de milieu SOC et incuber 90 mn à
37°C sous agitation. Etaler la culture sur milieu LB-agar + Ampicilline et sur milieu pour
amylase test + Ampicilline et incuber à 37°C pendant 12 à 18 heures.
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