THS-6596.pdf
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Préparation des cellules compétentes pour électroporation<br />
Ensemencer un litre de milieu de culture LB avec 200 ml d'une préculture de 12 heures sur<br />
milieu LB. Incuber la culture à 37°C sous agitation jusqu'à une densité optique comprise<br />
entre 0,5 et 0,6 à 600 nm. Placer ensuite la culture dans de la glace ou à une température<br />
de 4°C pour la refroidir. Centrifuger à 6000 g, 4°C pendant 10 mn. Laver les sédiments à<br />
deux reprises avec 200 ml d'eau distillée et une fois avec 30 ml de la solution de glycérine.<br />
Incuber ensuite les cellules dans de la glycérine à une température de 4°C. Centrifuger<br />
comme précédemment et resuspendre les cellules dans 400 III de glycérine à répartir par<br />
tube de lOOfl!. On peut directement utiliser ces cellules pour l'électroporation ou les<br />
conserver à -70°e.<br />
Electroporation<br />
Ajouter 10fll de la solution de ligation (voir.) dans un tube contenant 90 ml de cellules<br />
compétentes. Prélever le mélange et l'introduire dans une cuvette pour électroporation<br />
(BioRad, München) préalablement refroidie à O°e.<br />
-L'électroporation est faite à l'aide d'un appareil ("Gene-pulser" de la firme BioRad,<br />
Muenchen). Les paramètres du choc électrique sont 2500 V, 200 Q et 2flF.<br />
Ensemencer les "cellules électroporées" dans 1ml de milieu SOC et incuber 1 heure à<br />
37°C sous agitation pour l'expression phénotypique. Etaler la culture est ensuite sur milieu<br />
LB-agar + Ampicilline et sur milieu pour amylase test + Ampicilline et incuber pendant 12<br />
à 18 heures à 37°e.<br />
10.2.4.2 Transformation de E. coli par choc thermique<br />
Solutions<br />
Milieu Trypton lextrait de levure:<br />
Solution de MgCIz :<br />
Solution de CaClz :<br />
(voir milieux de culture)<br />
100 mM<br />
100 mM<br />
Préparation de cellules compétentes pour choc thermique<br />
Ensemencer 30 ml de milieu Trypton Extrait de levure. Incuber à 37°C en aérobiose<br />
jusqu'à une densité optique de 0,6 (phase logarithmique) à 578 nm. Centrifuger à 5000g,<br />
4°C pendant 10mn et resuspendre les sédiments dans 10 ml de solution de chlorure de<br />
magnésium refroidie. Centrifuger à nouveau à 5000 g, 4°C pendant lOmn et récupérer les<br />
sédiments. Resuspendre les sédiments dans 10 ml de solution de chlorure de calcium<br />
refroidie. Incuber 30 mn dans de la glace. Centrifuger comme précédemment. Resuspendre<br />
les cellules dans 1 ml de solution de chlorure de calcium et conserver à O°C<br />
Transformation<br />
Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 100 nù de cellules compétentes ajouter 2 III<br />
de la solution de ligation. Incuber le mélange 20 mn dans de la glace ou à O°C.<br />
Placer aussitôt le tube dans le bain-marie à 42°C pendant. Replacer le tube 2 mn dans la<br />
glace. Ensemencer ensuite ces cellules dans 900 III de milieu SOC et incuber 90 mn à<br />
37°C sous agitation. Etaler la culture sur milieu LB-agar + Ampicilline et sur milieu pour<br />
amylase test + Ampicilline et incuber à 37°C pendant 12 à 18 heures.<br />
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