THS-6596.pdf

de 500 Jlg d'ADN dans les conditions détenninées ci-dessus. Ajouter la solution d'EDTA
pour stopper la réaction. Extraire l'ADN deux fois de suite avec le même volume de
Phénol/chlorofonne/alcool isoamylique. Centrifuger 1 mn à chaque fois, pour séparer la
phase liquide contenant l'ADN des restes d'enzyme. Ajouter 1/9 volume d'acétate de
sodium et 2,5 volumes d'éthanol absolu pour précipiter l'ADN Incuber à -20°C pendant 1
heure. Centrifuger à 12000 g pendant 30 mn à température ambiante puis éliminer la phase
liquide. Laver le culot avec de l'éthanol à 70 % et sécher sous vide. Resuspendre l'ADN
séché dans 500 III de solution T.E. et conserver à -20°C.
11.2.3 Réaction de ligation entre fragment d'ADN et le vecteur
Réactifs
Vecteur pSUl en solution
Solution d'ADN partiellement hydrolysée
Solution de ligase
Solution de réaction de la ligase
Eau bidistillée stérile
Technique
On utilise un tube Eppendorf de 1,5 ml pour un volume total de réaction égal à 151l\.
Pipetter 1111 pSUl dans le tube puis placer ce tube dans un bain-marie à 45°C pendant 5
mn; cette opération à pour but de linéariser les vecteurs pour faciliter la réaction de
Iigation.
Ajouter ensuite dans le tube:
-10JlI ADN
-1,5Jll solution de Iigase
-1,5Jll de solution de réaction
-1111 eau bidistillée stérile
Le tube est ensuite incubé à 16°C environ pendant 12 heures.
11.2.4 Transformation
La transfonnation consiste à introduire les vecteurs recombinés dans le cytoplasme
d'organismes receveurs. Nous avons utilisé deux méthodes différentes dans cette étude.
11.2.4.1 Transformation de E.coli par électroporation
Solutions
Milieu LB:
Milieu SOC:
Glycérine:
/"
(voir milieux de culture)
(voir milieux de culture)
/"
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