THS-6596.pdf
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de 500 Jlg d'ADN dans les conditions détenninées ci-dessus. Ajouter la solution d'EDTA<br />
pour stopper la réaction. Extraire l'ADN deux fois de suite avec le même volume de<br />
Phénol/chlorofonne/alcool isoamylique. Centrifuger 1 mn à chaque fois, pour séparer la<br />
phase liquide contenant l'ADN des restes d'enzyme. Ajouter 1/9 volume d'acétate de<br />
sodium et 2,5 volumes d'éthanol absolu pour précipiter l'ADN Incuber à -20°C pendant 1<br />
heure. Centrifuger à 12000 g pendant 30 mn à température ambiante puis éliminer la phase<br />
liquide. Laver le culot avec de l'éthanol à 70 % et sécher sous vide. Resuspendre l'ADN<br />
séché dans 500 III de solution T.E. et conserver à -20°C.<br />
11.2.3 Réaction de ligation entre fragment d'ADN et le vecteur<br />
Réactifs<br />
Vecteur pSUl en solution<br />
Solution d'ADN partiellement hydrolysée<br />
Solution de ligase<br />
Solution de réaction de la ligase<br />
Eau bidistillée stérile<br />
Technique<br />
On utilise un tube Eppendorf de 1,5 ml pour un volume total de réaction égal à 151l\.<br />
Pipetter 1111 pSUl dans le tube puis placer ce tube dans un bain-marie à 45°C pendant 5<br />
mn; cette opération à pour but de linéariser les vecteurs pour faciliter la réaction de<br />
Iigation.<br />
Ajouter ensuite dans le tube:<br />
-10JlI ADN<br />
-1,5Jll solution de Iigase<br />
-1,5Jll de solution de réaction<br />
-1111 eau bidistillée stérile<br />
Le tube est ensuite incubé à 16°C environ pendant 12 heures.<br />
11.2.4 Transformation<br />
La transfonnation consiste à introduire les vecteurs recombinés dans le cytoplasme<br />
d'organismes receveurs. Nous avons utilisé deux méthodes différentes dans cette étude.<br />
11.2.4.1 Transformation de E.coli par électroporation<br />
Solutions<br />
Milieu LB:<br />
Milieu SOC:<br />
Glycérine:<br />
/"<br />
(voir milieux de culture)<br />
(voir milieux de culture)<br />
/"<br />
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