THS-6596.pdf

estriction, réaction de ligation entre fragment d'ADN et un vecteur capable de se
répliquer,préparation des organismes receveurs et introduction de vecteurs recombinés
dans le cytoplasme d'organismes receveurs.
11.2.1 Extraction d'ADN
L'extraction et la purification d'ADN sont réalisées suivant la méthode de Mannur
(Mannur et al. ,1961, modifié). La titration de la solution d'ADN se fait par la méthode
spectrophotomètrique (voir 7.2)
11.2.2 Fragmentation des acides nucléiques par les enzymes de restriction
L'ADN à cloner doit être coupé en fragments de taille comprise entre 2000 et 6000 bases.
La fragmentation de l'ADN se fait par Sau 3A qui a comme site de reconnaissance la
séquence GATe.
Matériel
ADN de l'organisme donneur
Enzyme de restriction Sau 3A :
Solution de réaction pour Sau 3A :
Phénol/chlorofonne/alcool isoamylique :
EDTA:
Ethanol
Ethanol 70 %
Acétate de sodium:
Solution TE (Voir 6.1.1)
Matériel pour électrophorèse sur gel: (Voir 7.1.)
Mode opératoire
(Boehringer, Mannheim)
(Boehringer, Mannheim)
(25/2411) (v/v/v)
100 mM, pH 8,0
3M,pH4,8
Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml placé dans de la glace, dissoudre 10 Jlg d'ADN dans 90
III d'eau distillée et ajouter à la solution 10 JlI de solution de réaction pour Sau 3A. Bien
mélanger. Partager le mélange précédent dans 9 tubes Eppendorfde 500 JlI numérotés de 1
à 9 en mettant 20 III dans le tube numéro 1 et 10 III dans chacun des tubes restants (2 à 9).
Mettre lU Sau 3A dans le tube numéro 1. Ce qui correspond à une concentration
enzymatique égale à 0,5 U par Ilg d'ADN). On ajoute ensuite 10 III de cette solution au
tube numéro 2 et ainsi de suite, pour avoir une série de dilution.
Incuber les tubes 1 à 9 à 37°C pendant 1heure. Replacer ces tubes dans la glace et ajouter
la solution d'EDTA pour arrêter la réaction (concentration finale 20 mM EDTA)
La concentration enzymatique pour laquelle on obtient des fragments d'ADN de 2000 à
6000 bases sera déterminée par électrophorèse sur gel d'agarose. Hydrolyser partiellement
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