THS-6596.pdf
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Mode opératoire<br />
Les quatre réactions sont effectuées dans des tubes Eppendorfde 500 Jll.<br />
Tahleau 12 : SI' o utIOns a<br />
,<br />
rea<br />
, 1·<br />
Iser pour le séquençage<br />
Tube A C G T<br />
Solution d'amorce lui 1!-lI lui lui<br />
ddNTP + T7 polymèrase 2!-l1 (ddATP) 2JlI (ddCTP) 2JlI (ddGTP) 2ul (ddTTP)<br />
Solution d'ADN 5!-lI Sul 5!-lI Sul<br />
Huile minérale 50ul 50ul 50!-l1 50ul<br />
-Les tubes sont ensuite placés dans le thermocycleur pour le PCR<br />
.<br />
Tahleau 13 . Programme<br />
pour e sequençage du<br />
gene d'ARN16S r<br />
Réaction TempératurelDurée cycles<br />
Dénaturation initiale: 95°C pendant 3mn 1<br />
Hybridation: 50 à 55°C / 30s<br />
Dénaturation: 95°C /30 s 25<br />
Après la PCR additionner 2JlI de solution de fonnamide pour arrêter toute réaction.<br />
Eliminer l'huile minérale. Dénaturer les solutions à séquencer à 90°C pendant 2mn.<br />
Les solutions de PCR aussitôt après dénaturation sont séparées par électrophorèse. Cette<br />
électrophorèse se fait en deux phases:<br />
-première phase de 30 mn a 1200 V<br />
-deuxième phase de 2 à 3 heures a 1750 V avec un courant de 23 mA.<br />
La vitesse de déroulement de la membrane est de 19 cm/heure<br />
L'analyse, la classification des séquences de gènes ARNr 16S et la confection d'arbres<br />
phylogénétiques ont été faites à l'aide du programme LNUX.<br />
./<br />
./<br />
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