THS-6596.pdf

Mode opératoire
Les quatre réactions sont effectuées dans des tubes Eppendorfde 500 Jll.
Tahleau 12 : SI' o utIOns a
,
rea
, 1·
Iser pour le séquençage
Tube A C G T
Solution d'amorce lui 1!-lI lui lui
ddNTP + T7 polymèrase 2!-l1 (ddATP) 2JlI (ddCTP) 2JlI (ddGTP) 2ul (ddTTP)
Solution d'ADN 5!-lI Sul 5!-lI Sul
Huile minérale 50ul 50ul 50!-l1 50ul
-Les tubes sont ensuite placés dans le thermocycleur pour le PCR
.
Tahleau 13 . Programme
pour e sequençage du
gene d'ARN16S r
Réaction TempératurelDurée cycles
Dénaturation initiale: 95°C pendant 3mn 1
Hybridation: 50 à 55°C / 30s
Dénaturation: 95°C /30 s 25
Après la PCR additionner 2JlI de solution de fonnamide pour arrêter toute réaction.
Eliminer l'huile minérale. Dénaturer les solutions à séquencer à 90°C pendant 2mn.
Les solutions de PCR aussitôt après dénaturation sont séparées par électrophorèse. Cette
électrophorèse se fait en deux phases:
-première phase de 30 mn a 1200 V
-deuxième phase de 2 à 3 heures a 1750 V avec un courant de 23 mA.
La vitesse de déroulement de la membrane est de 19 cm/heure
L'analyse, la classification des séquences de gènes ARNr 16S et la confection d'arbres
phylogénétiques ont été faites à l'aide du programme LNUX.
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