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10. SEQUENCAGES L'analyse des séquences de molécules d'acide nucléique est faite selon la méthode de Sanger (Sanger et al. , 1977). Ces séquençages utilisent la T7-ADN polymèrase (Tabor et al. , 1987). Un séquençage se fait en cinq étapes: -Dénaturation de l'ADN à séquencer La dénaturation permet de séparer les deux brins d'ADN -Hybridation avec l'amorce Sur l'ADN monocaténaire qui sert de matrice on hybride une amorce complémentaire possédant un 3'OH à partir de laquelle l'ADN-polymèrase va polymèriser les quatre désoxyribonucléotides-triphosphates (dNTP) -Extension de l'ADN avec terminaison pour spécifier les bases L'ADN-polymérase permet ainsi de synthétiser alors un brin d'ADN complémentaire à la matrice. En pratique, on réalise séparément quatre réactions de polymérisation en introduisant dans chacune d'elles l'un des quatre didésoxyribonucléotides-triphosphates (ddNTP). Ces didésoxyribonucléotides-triphosphates ne possèdent pas de OH ni en position 3', ni en position 2' permettant la formation de la liaison phosphodiester suivante. Leur incorporation à la chaîne d'ADN va donc provoquer la tenninaison prématurée de la chaîne. -Séparation du produit sur gel d'électrophorèse Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide coulée entre deux plaques de verre pennet de séparer les produits. Les produits de la migration vont être recueillis sur une membrane se déroulant à une vitesse donnée à la limite des deux plaques de verre. -Détection du prod uit La détection d'une membrane de séquences se fait de la même manière que la détection d'une membrane d'hybridation en tenant compte du produit avec lequel les amorces ont été marquées. Séquençage du gène ARNr 168 Le séquençage est fait grâce au kit Amersham et suivant le protocole Amersham (Amersham hybond broschüre., 1987) légèrement modifié. Réactifs Amorces: La concentration des solutions d'amorces doit être comprise entre 1 et 2 pmolllll. Le séquençage complet du gène 16S rARN nécessite l'utilisation de 6 à 8 amorces suivant les souches. / 41 /
Tableau 11 : Amorces pour 1e sequençage comp1et du gene d'ARNr 16S Sonde 5'-Séquence-3' *Position 622RII -RAC(CT)(CT)ACCAACTAAGCTAAT- 97K -CTGCTGCCTCCCGTA- 342 607R -ACGTGTGTAGCCC- 1220 610RII -ACCGC(GT)(AG)CTGCTGGCAC- 514 609RII -ACTAC(CT)AGCGGGTATCTAAGT(GT)CC- 784 612RII -GTAAGGTT(CT)T(AGCT)CGCGT- 968 607V -GGGCTACACACGTGC- 1220 606RII -T(AG)ACGG(GC)C(AG)GTGTGTACA- .. *PosltlOn chez E.coli (Brosius et al., 1981). 1390 Pour la majorité des souches nous nous sommes limités au séquençage des 200 premières bases. Ce qui permet, dans bien des cas, d'identifier la souche en utilisant seulement l'amorce 622RlI. ADNà séquencer La concentration de la solution d'ADN doit être comprise entre 0,5 et 21lg/1l1. Les solutions de ddNTP Les quatre solutions de didésoxyribonuclétides-triphosphates (ddATP, ddCTP, ddGTP, et ddTTP) sont fournies dans le Kit Amersham mélangés avec la polymèrase. Huile minérale L'huile minérale est utilisée pour la réaction de PCR à la place de la paraffine Solution de formamide Une solution de formamide permet de stopper les réactions du PCR. Gel pour électrophorèse Composition du gel Solution d'urée* à 4% Solution 30% polyacrylamide (GATC) *Composition de la solution d'urée à 4% Urée ultra pure 10 x TEE* Eau bidistillée -Solution TEE dix fois concentrée (l0 x TEE) Tris lOM Acide borique lOM EDTA lOM ./ 22 ml 3ml 21 g 4,5 g 18,5 g ./ 42
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2-Leuconostoc Leuconostoc mesentero
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Les « non lactiques» Paenibacillu
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Collins, M.D., Rodrigues D., Ash c.
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Martinez Murcia A. J., and Collins
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