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10. SEQUENCAGES
L'analyse des séquences de molécules d'acide nucléique est faite selon la méthode de
Sanger (Sanger et al. , 1977). Ces séquençages utilisent la T7-ADN polymèrase (Tabor et
al. , 1987). Un séquençage se fait en cinq étapes:
-Dénaturation de l'ADN à séquencer
La dénaturation permet de séparer les deux brins d'ADN
-Hybridation avec l'amorce
Sur l'ADN monocaténaire qui sert de matrice on hybride une amorce complémentaire
possédant un 3'OH à partir de laquelle l'ADN-polymèrase va polymèriser les quatre
désoxyribonucléotides-triphosphates (dNTP)
-Extension de l'ADN avec terminaison pour spécifier les bases
L'ADN-polymérase permet ainsi de synthétiser alors un brin d'ADN complémentaire à la
matrice. En pratique, on réalise séparément quatre réactions de polymérisation en
introduisant dans chacune d'elles l'un des quatre didésoxyribonucléotides-triphosphates
(ddNTP). Ces didésoxyribonucléotides-triphosphates ne possèdent pas de OH ni en
position 3', ni en position 2' permettant la formation de la liaison phosphodiester suivante.
Leur incorporation à la chaîne d'ADN va donc provoquer la tenninaison prématurée de la
chaîne.
-Séparation du produit sur gel d'électrophorèse
Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide coulée entre deux plaques de verre pennet
de séparer les produits. Les produits de la migration vont être recueillis sur une membrane
se déroulant à une vitesse donnée à la limite des deux plaques de verre.
-Détection du prod uit
La détection d'une membrane de séquences se fait de la même manière que la détection
d'une membrane d'hybridation en tenant compte du produit avec lequel les amorces ont été
marquées.
Séquençage du gène ARNr 168
Le séquençage est fait grâce au kit Amersham et suivant le protocole Amersham
(Amersham hybond broschüre., 1987) légèrement modifié.
Réactifs
Amorces:
La concentration des solutions d'amorces doit être comprise entre 1 et 2 pmolllll.
Le séquençage complet du gène 16S rARN nécessite l'utilisation de 6 à 8 amorces suivant
les souches.
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