THS-6596.pdf

Mode opératoire
Mouiller la membrane avec la solution 2 x SSc. Préhybrider avec 20 ml de solution
d'hybridation pendant une heure. Hybrider pendant 3 heures au minimum avec 2 ml de
Solution d'hybridation et 20 ml de solution d'oligonucléotide marquée (sonde). Laver avec
10 ml de solution de lavage pendant 10 mn à 142°C, puis avec 150 ml de solution de
lavage pendant 10 mn à 45°C afin d'éliminer les hybridations non spécifiques. La
membrane peut être alors séchée ou directement soumise à la détection.
9.5 Détection des hybrides
Nous avons donc utilisé la possibilité qu'offre les conjugats enzymatiques (Complexes
enzymatiques spécifiques) pour détecter les réactions positives. Deux complexes sont
utilisés:
-Biotine- Phosphatase alcaline /Streptavidine-Phosphatase alcaline
-Digoxigenine-Phosphatase alcaline/Anti-Digoxigenine-Phosphatase alcaline
La détection se fera dans un tambour en Plexiglas. On peut détecter des membranes
hybridées avec différentes sondes dans un même tambour de détection si ces sondes sont
marquées avec le même matériel.
Solutions de détection pour sondes marquées à la digoxigénine
Solution Anti-DIG
Solution d'acide maléique:
Solution de blocage:
Solution de réaction:
Solution NBT :
Solution X-Phosphate:
(Boehringer-Mannheim)
(Voir solutions de préhybridation et d'hybridation)
1,5 % (p/v) de poudre dans la solution d'acide maléique.
0,1 MNaCI
50 mM MgCIz
0,1 M Tris-HCl
Nitrobleu-Sel de tétrazolium dissous dans 70 % de
DMF(75mglml)
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate, Sel de toluidine
dissout dans 100 % DMF O,
Pour la détection des sondes marquées à la streptavidine la solution anti-DIG est
remplacée par une solution SA-AP (GATC)
Mode opératoire
Les étapes de la détection dépendent du marquage utilisé pour la sonde.
/
39