THS-6596.pdf

avoir un résultat optimal. Aussi est-il souvent nécessaire de recourir à une amplification du
gène à tester par PCR après l'extraction.
Dénaturation des acides nucléiques
Dénaturation de l'ARN
Mélanger lllg d'ARN avec 3 volumes de solution dénaturante (Fonnamide 72%,
Fonnaldehyde 28%) incuber le mélange à 65°C pendant 10 mn.
Dénaturation de l'ADN
Mélanger lllg à 2 Ilg d'ADN avec 1 volume de solution dénaturante (Solution de soude 0,4
M), incuber le mélange pendant 10 mn à la température ambiante.
9.3 Transfert et fixation des acides nucléiques sur membrane
Les membranes utilisées sont: Porablot NY, (Machery-Nagel, Düren), Biodyne A PALL,
(Dreieich) et Membrane à charge positive, (Boehringer, Mannheim).
Il s'agit dans les trois cas de membranes de nylon hydrophiles avec des pores de
différents diamètres. Le séchage de ces membranes se fait à l'air libre, il est suivi de la
fixation des acides nucléiques. Cette fixation se tàit soit à l'étuve réglée à 80°C pendant 15
mn soit sous une lampe à lumière ultraviolette pendant 2 mn.
9.4 Préhybridation et hybridation
Chaque membrane séchée et fixée est placée dans une étuve d'hybridation. Pour chaque
tube on testera une seule sonde. Ces tubes sont ensuite placés dans une étuve où se font la
préhybridation et l'hybridation. L'étuve pour hybridation permet de soumettre les tubes
d'hybridation à la température convenable et à une rotation dont la vitesse est réglable. La
température d'hybridation est fixée à 42°C. Et la vitesse de rotation est réglée environ à 5
tours par minute.
Solutions de préhybridation et d'hybridation
Solution SSC (20 x concentrée): 3 M NaCI
0,3 M Citrate de sodium; pH 7,0
Solution d'acide maléique:
Solution de blocage:
Solution d'hybridation:
Solution de lavage:
0,1 M Acide maléique
0,15 M NaCI ; régler le pH à 7,5 avec de la soude
10 % (plv) de poudre (Boehringer-Mannheim) dans
une solution d'acide maléique. Autoclaver et conserver à 4°C.
5 x SSC
1 % (plv) Solution de blocage
0,02 % (plv) SDS
0,1 % (plv) N-Laurylsarcosinate
2 xSDS
0,02 % (plv) SDS
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