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9. HYBRIDATION AVEC SONDES GENETIQUES
L'hybridation des acides nucléiques est la formation d'une molécule duplex à partir de
deux chaînes d'acides nucléiques complémentaires. Il existe différentes techniques
d'hybridation. Dans cette étude nous avons utilisé la technique dite Dot Blot. Cette
technique permet de tester, pour une sonde donnée et sur une même membrane, un grand
nombre d'acides nucléiques. Un appareil MinifoldR-Apparatur (Schleicher et Schüll,
Dassel) permet de déposer séparément des quantités convenables de chaque solution
d'acide nucléique à tester sur la membrane. Pour chaque membrane on testera une ADN
donnant une réaction positive à la sonde.
9.1 Les sondes et le ma rquage
Les sondes d'acides nucléiques sont donc des fragments monocaténaires d'ADN qui sont
capables de reconnaître des fragments complémentaires et de s'hybrider à eux de manière
spécifique. Une sonde génétique doit être hautement spécifique. La longueur des sondes
est soit de 15 à 50 bases (oligonucléotides) de 50 à environ 1000 bases (polynucléotides ).
Ces sondes sont soit isolées d'organismes connus, soit synthétisées au laboratoire
(Schleifer et al., 1992; Schleifer et al., 1992). Un test avec sonde génétique comprend six
étapes qui sont: l'isolement du matériel nucléique à tester, la fabrication et le marquage
des sondes, le transfert et la fixation des acides nucléiques sur membrane, la
préhybridation, l'hybridation proprement dite et la détection des hybrides.
Tableau 10: Les sondes génétiques utilisées
Sonde S'-Séquence-3' Spécificité Référence
Lba GTAAATCTGTTGGTTCCGC Lb. acidophilus Hertel et al. (1993)
Lbb TGTTGAAATCAAGTGCAAG Lb. brevis Vogel et al. (1994)
Lbfe GCGACCAAAATCAATCAGG Lb. fermentum Vogel et al. (1994)
Lbfr CTCGCTGCTAACTTAAGTC Lb. fructivorans Vogel et al. (1994)
Lbl TCGGTCAGATCTATCGTC Lb.lindneri Ehrmann (1994)
Lbpe TCAAATGTAAATCATGATG Lb. pentosus/plantarum Ehnnann (1994)
Lbpo GGTAATCCATCGTCAAATC Lb. pontis Vogel et al. (1994)
Lbs TTAATGATAATACTCGATT Lb. sake Hertel et al. (1991)
Toutes ces sondes sont déduites de la séquence de nucléotides du gène 16S
Le marquage des sondes permet lors de la détection de rendre visible le complexe formé.
Les marquages les plus couramment utilisés sont ceux faits avec des isotopes radioactifs
surtout le 32p (phosphore-32). Ce marquage se fait sur la terminaison 5' des sondes. Ainsi
les signaux positifs sont facilement détectés lorsqu'on radiographie la membrane.
L'intensité de la bande radioactive correspondante sur l'autoradiogramme sera directement
proportionnelle à la quantité d'acide nucléique spécifique présente. Cette méthode n'est
pas, cependant, très commode du fait du temps de demi-vie du phosphore-32 qui est très
court et aussi du danger potentiel que représente l'utilisation de produits radioactifs.
9.1.1 Marquage des sondes à la digoxigenine (Amersham hybond broschure., 1987)
Les sondes d'oligonucléotide sont marquées grâce au DIG Oligonucléotide 3'-Tenninal
Kit (Boehringer, Mannheim) avec digoxigenine-ddUTP (Schmitz et al., 1991). Le
marquage consiste à la fixation d'une desoxynucléotide ou d'une didesoxynucléotide à la
position terminale 3'-OH de la sonde d'ADN.
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