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7. CONCENTRATION DES ACIDES NUCLEIQUES
7.1 Electrophorése sur gel d'agarose
A l'aide d'un gel d'agarose il est possible de séparer différents fragments d'acides
nucléiques suivant leur taille, de purifier, d'isoler et d'identifier ces fragments.
Les réactifs
-Solution TAE 50 x concentrée :(EDTA 0,1 M+Acide acétique 1 M+Tris 2M, pH 8,2).
-Solution de migration :(Saccharose 40% (plv ) dans de l'eau+EDTA 50mM+Bleu de
bromophénol 0,25%+Xylénecyanol 0,25%).
-Bromure d'ethidium : Imglml dans de l'eau distillée. Le bromure d'ethidium permet de
colorer le gel. L'intensité des bandes d'acides nucléiques après coloration est
proportionnelle à la concentration.
Les marqueurs
Des marqueurs standards sont utilisés pour mesurer la taille des acides nucléiques. La
taille des fragments des marqueurs de gel est donnée en bases paires. Les marqueurs
utilisés dans cette étude sont:
-Standard 111 (Boehringer, Mannheim)
-Standard III marqué au dioxigénine (Boehringer, Mannheim)
-Standard VIlI (Boehringer, Mannheim)
Gel d'agarose
On utilisera des gels de 0,8 à 1,2% d'agarose (Boehringer, Mannheim ). Le volume total du
gel est de 80 ml pour une petite électrophorése et de 200 ml pour une grande
électrophorése.
Appareillage
Un appareil MWG-Biotech, 12x14 cm permet de fournir un courant continu de 100 mA et
80V. Un appareil Herolab E.A.S.Y. Store (Gel Documentation Système) muni d'une
caméra 429K à lumière U. V. permet de photographier le gel. La durée de l'électrophorése
est de 45 mn à 1h pour un screening simple et 3h pour un gel de PCR avec l'amorce
arbitraire M13. Le temps de coloration au bromure d'éthidium est de 20 mn.
7.2 Spectrophotométrie
Le principe de cette spectrophotométrie repose sur le fait que les acides nucléiques
présentent un maximum d'absorption dans l'U.V. On peut ainsi déterminer la
concentration et la pureté d'un échantillon:
-1,0 unité à 260 nm correspond à une concentration de 50 Jlglml d'ADN bicaténaire ou de
40Jlglml pour une ADN monocaténaire (Maniatis et al., 1982).
-L'ADN donne un pic d'absorption spécifique à 280 nm. La présence de tout autre pic
témoigne de l'existence d'impuretés.
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